一种蛋白-染料复合物及其应用
技术领域
本发明涉及一种蛋白-染料复合物及其应用,属于生物医药领域。
背景技术
癌症是威胁人类健康的重大恶性疾病之一。虽然从上世纪50年代起,数十年中大量的人力、物力、财力被投入到癌症的预防和治疗中,但在这方面人类所取得的进展十分有限。
最近发展的光热治疗越来越引起人们广泛的关注。主要的原理是一些具有很好的光吸收性的物质被细胞所吞噬后在激光的照射下会产生很高的热量,可以杀死肿瘤细胞。由于近红外光对人体自身组织的穿透能力较强,人体组织的主要组成成分如水等对近红外光的吸收能力较差,因而,与传统的治疗方法相比,光热治疗不会对其他正常的组织造成损伤,副作用较小。目前研究比较多的主要集中在一些在近红外区有很好光吸收的无机纳米材料上,主要分为两类:一类是以金纳米结构的材料;另一类主要是碳基材料,如碳纳米管、石墨烯等。目前已经有一些文献报道关于这类无机材料在细胞水平和活体水平上的光热治疗,但是还存在一些问题需要解决,如金纳米材料的稳定性能问题,在激光的照射下,金纳米棒发生溶解;碳材料的长期毒性以及大部分无机纳米材料的降解性。这些问题大大限制了无机纳米材料在生物医学中的应用。因此需要寻求新的低毒、稳定性好的并且具有很强的光学吸收的材料。
吲哚青绿(ICG)由于在近红外区具有很好的光学吸收性质在生物医学中有应用潜力,最近几年人们也在利用它的吸收性质应用在光热治疗中;然而一些物理的特征,如早高浓度下聚集,稳定性差,非特异性吸附和靶向能力差等限制了其在生物医学中的发展和应用。
七甲川吲哚菁染料结构和ICG 和类似,在近红外区具有很强的光学吸收性质,荧光量子产率非常低(<1%),已经有文献报道将七甲川吲哚菁染料分子用于光热治疗;然而将其与白蛋白结合,制备一种可代谢无毒小颗粒并将该颗粒同时用于制备癌症的成像诊断和治疗制剂未曾见报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种蛋白-染料复合物及其在肿瘤成像与治疗中的应用。该纳米颗粒在近红外区具有较高的光学吸收性能,而在可见光区具有较强的荧光,同时具有较好的分散性;可在细胞和活体水平上实现治疗与成像。
为达到上述的目的,本发明采取的技术方案是:一种蛋白-染料复合物,包括人血清白蛋白与七甲川吲哚菁衍生物,其中人血清白蛋白为载体,七甲川吲哚菁衍生物通过疏水作用力吸附于载体之中;所述人血清白蛋白与七甲川吲哚菁衍生物的摩尔比为1∶1;所述人血清白蛋白的分子量为69KDa;所述七甲川吲哚菁衍生物的分子量是983.5 Da;所述蛋白-染料复合物的粒径为8~10纳米;所述七甲川吲哚菁衍生物的结构式为:
本发明还公开了上述蛋白-染料复合物的制备方法,包括以下步骤:将七甲川吲哚菁衍生物溶于含有三乙胺的甲醇溶液得到七甲川吲哚菁衍生物的甲醇溶液,将人血清白蛋白溶于磷酸盐缓冲液中得到人血清白蛋白的磷酸盐缓冲液溶液;然后将七甲川吲哚菁衍生物的甲醇溶液与人血清白蛋白的磷酸盐缓冲液溶液混合得到混合液,将混合液在生理盐水中透析6~8小时即得到蛋白-染料复合物;其中七甲川吲哚菁衍生物与人血清白蛋白的摩尔比为1∶1。
上述技术方案中,制备七甲川吲哚菁衍生物的甲醇溶液时的搅拌时间为24h。
上述技术方案中,三乙胺与甲醇的体积比为1∶100。
本发明中七甲川吲哚菁衍生物称为IR825,是一种有机小分子,其制备方法属于现有技术(参见:L. Cheng, W. He, H. Gong, C. Wang, Q. Chen, Z. Cheng, Z. Liu, Advanced Functional Materials2013),本发明优先采用如下方法:
(1) 以2,3,3-三甲基-4-2,5-苯并-3H-吲哚(TMBI)和α-溴-对-甲苯甲酸(BTA)为原料,经过反应纯化后得到反应中间体1;
(2) 以磷酰氯和无水二氯甲烷为原料,经过反应纯化后得到反应中间体2;
(3) 将上述得到的中间体1和中间体2混合加热反应后,纯化得到有机小分子染料IR825。
本发明将有机小分子染料七甲川吲哚菁衍生物IR825装载到人血清白蛋白(HSA)上,得到的蛋白-染料复合物的纳米颗粒HSA-IR825在近红外区具有很好的光学吸收,量子产率很低(0.33%),被细胞吞噬后在激光的照射下会产生很高的热量,可以杀死肿瘤细胞,是理想的光热治疗试剂;在600nm波长激发下有很强的荧光,量子产率可以达到42%,是一种很好的成像剂,可用于活体细胞水平的荧光成像。因此本发明还公开了上述蛋白-染料复合物在制备同时作为肿瘤的成像与光热治疗药物中的应用。
本发明中,IR825本身是一种没有荧光只在近红外区有吸收的染料,人血清白蛋白HSA能使IR825保持在近红外区具有较高吸光度的同时,在可见光区还具有很强的荧光性能,从而可以通过荧光活体成像技术研究生物分布,监测HSA-IR825达到肿瘤部位的量,可以在荧光成像模式下指导光热治疗;同时HSA可以使IR825具有很好的水溶性和生物相容性,从而使HSA-IR825最大量的到达肿瘤而减少对正常组织的伤害,达到治愈肿瘤的目的。
由于上述技术方案运用,本发明与现有技术相比具有下列优点:
1.本发明制备的蛋白-染料复合物HSA-IR825具有非常好的水溶性和生物相容性,在水和生理条件下都具有很好的分散性;不仅在近红外光区具有非常好的光学吸收,量子产率很低,被细胞所吞噬后在激光的照射下会产生很高的热量,可以杀死肿瘤细胞,在可见光区还具有很强的荧光性能,分离了成像和治疗波长,可以在荧光成像模式下指导光热治疗癌症;
2. 本发明公开的蛋白-染料复合物HSA-IR825中,载体HSA极大的增强IR825在可见光波长激发下的荧光并且不影响IR825在近红外区的吸收,避免了通常荧光成像需要高的量子产率,而这将导致光热转化率降低的现象;这是由于HSA-IR825复合物这种独特的光学性质使得它的荧光成像及光热治疗可以在两个不同的波长,从而使两种应用都能最优化;
3.利用本发明制备的蛋白-染料复合物纳米颗粒,对小鼠通过尾静脉注射,并由荧光成像技术对其进行监测;发现纳米颗粒能够在肿瘤的部位具有很高的富集,然后用激光进行光热治疗,效果显著,并且不会对其他的部位造成损失,治愈后不复发,从而提供了一种新型的荧光成像模式下指导光热治疗癌症的试剂。
附图说明
图1是实施例一中的HSA-IR825与单独的IR825分别在不同pH下的激光粒径分布图;
图2是实施例一中HSA-IR825和IR825分散在水中的紫外吸收光谱图;
图3是实施例一中HSA-IR825和IR825分散在水及甲醇溶液的荧光光谱图;
图4是实施例二中HSA-IR825与罗丹明B(RHB)的荧光光谱和紫外吸收光谱图;
图5是实施例二中HSA-IR825与ICG的荧光光谱和紫外吸收光谱图;
图6是实施例三中不同浓度的HSA-IR825与水在808nm的激光照射下的升温曲线;
图7是实施例四中4T1细胞相对活性与HSA-IR825浓度的关系图;
图8是实施例五中HSA-IR825在小鼠肿瘤部位的富集情况图;
图9是实施例六中HSA-IR825在小鼠肿体内的富集情况图;
图10是实施例七中小鼠肿瘤部位温度与激光照射时间关系图;
图11为实施例七中小鼠肿瘤体积的变化图;
图12是实施例七中小鼠成活率图。
具体实施方式
下面结合附图及实施例对本发明作一步描述:
实施例一:制备装载着有机小分的蛋白HSA-IR825蛋白-染料复合物
以白蛋白HSA为基底,通过疏水作用将有机小分子吸附到HSA中,形成HSA-IR825。具体包括以下步骤:
1、合成一定量的有机小分子IR825,其制备方法如下:
(1) 将2,3,3-三甲基-4-2,5-苯并-3H-吲哚(TMBI,10.0g,48mmol)和α-溴对甲苯甲酸(BTA,12.3g,57 mmol)溶解在40ml的二氯苯和110℃下搅拌4h,过滤后,将粗产物进行纯化,用甲醇进行重结晶,得到中间体1;
(2) 烧瓶中加入磷酰氯(37ml)和无水二氯甲烷(35ml),搅拌下,冰/水浴条件下,溶液逐滴加到80ml DMF/二氯甲烷混合物中(1/1,V/V),随后滴加环己酮。除去冰/水,并加热该溶液中,并回流3 h。将混合物倾入冰中,通过过滤收集固体产物,并用冰水乙醚洗涤。将所得的黄色产物,记为中间体2,直接使用;
(3) 中间体1(1.64g,3.9 mmol)和中间体2(0.34g,1.9mmol)在260ml正丁醇/甲苯(7/3,V/V)中进行混合,并于115℃时搅拌4h。旋转蒸发除去溶剂,粗产物通过溶解在DMF中,并在乙醚中沉淀纯化。过滤后,将产物在真空下干燥得到有机小分子染料IR825。
2、称取2mg的有机小分子染料IR825溶于1ml甲醇并加入10μl 三乙胺充分溶解,在避光的条件下搅拌24h后避光保存在4℃。称取10mg的人血清蛋白HSA,溶于2ml的磷酸盐缓冲溶液中,将HSA的磷酸盐缓冲溶液加入透析袋中并加入150μl之前溶解好的IR825的甲醇溶液。在0.9%NaCl溶液中避光透析6~8小时,最后稀释至5ml,得到了物质的量比为1:1的HSA-IR825的溶液(2mg/ml)。然后,进行表征(动态光散射、紫外吸收、荧光光谱)。
附图1是上述HSA-IR825与单独的IR825分别在不同pH下的激光粒径分布,如图1所示,IR825在酸性溶液中的水化半径约为几千纳米,在碱性条件下也有几百纳米,而HSA-IR825在不同pH的水溶液中水化半径约为10nm,说明当IR825吸附到HSA上后,IR825的水溶性大大提高,达到单分散;图2是相同浓度(0.2mg/ml)的IR825和HSA-IR825的紫外吸收光谱图,从图中可以看到,IR825和HSA-IR825在700nm到900nm近红外区具有非常好的光学吸收,更加令人兴奋的是当IR825吸附到HSA上后,它在近红外区的吸收有了明显的增强,是非常好的光热治疗试剂。图3是相同浓度(0.2mg/ml)的IR825和HSA-IR825的荧光光谱图,从图中可以看到,HSA-IR825在近红外区具有非常弱的荧光,但是在600nm波长的激发下产生远大于IR825的非常强的荧光,可以通过荧光活体成像技术研究生物分布,监测HSA-IR825达到肿瘤部位的量,可以在荧光成像模式下指导光热治疗。
实施例二:HSA-IR825在不同激光下的量子产率的研究
为了进一步研究HSA-IR825在不同激光照射下的荧光强度,我们分别测量了在600nm和808nm的激光激发下的量子产率。我们分别选取了在这两种激光照射下已知量子产率为89%的罗丹明B(RHB)和量子产率为4%的吲哚青绿ICG作为标准物,由量子产率的公式YHI=YRhB*(FHI/FRhB)*(ARhB/AHI)、 YHI=YICG*(FHI/FICG )*(AICG/AHI)来计算HSA-IR825分别在两种激光激发下的量子产率;YHI、FHI、AHI分别为HSA-IR825的量子产率、荧光强度、吸光度,YRhB、FRhB、ARhB分别为罗丹明的量子产率、荧光强度、吸光度,YICG、FICG、AICG分别为吲哚青绿的量子产率、荧光强度、吸光度。
结果如附图4、附图5所示,图4(a) 为罗丹明B(RHB)和HSA-IR825水溶液在600 nm波长激发下的荧光光谱,图4(b)为罗丹明B(RHB)和HSA-IR825水溶液的紫外吸收光谱,已知RHB的量子产率为89%,由公式可知HSA-IR825的量子产率为:89%* 0.244 * 1.94= 42.13%;图5(a)为ICG和HSA-IR825水溶液的紫外吸收光谱,图5(b)为ICG和HSA-IR825水溶液在808nm激光激发下的荧光光谱,已知ICG的量子产率为4%,同样由量子产率的公式,我们得到HSA-IR825在808nm激光照射下的量子产率为:4%*0.05*1.67=0.334%。我们从定量的角度进一步说明HSA-IR825在可见光区具有很强的荧光,可以利用荧光来指导光热治疗;在近红外区的量子产率还是很低,少部分能量转换成荧光发射出去,而绝大部分能量会以热能的形式散发出去,产生热效应,是一种理想的光热治疗的试剂。
实施例三:HSA-IR825在激光照射下的升温曲线的测试
将2ml 不同浓度HSA-IR825 水溶液置于比色皿中,将808nm 的激光(功率为0.8 W/cm2)直接照射在样品上,利用红外热成像仪测试其温度变化的曲线。结果如附图6所示,在5分钟之内,随着HSA-IR825的浓度的增加,溶液的温度升高越显著,说明HSA-IR825光热性质具有很强的浓度依赖性;而对照组水在同样的激光照射下基本上没有发生变化。这说明HSA-IR825复合物具有比较强的光学吸收性质,可以作为光热治疗的材料。
实施例四HSA-IR825纳米粒子在细胞水平上的毒性研究
取不同浓度的HSA-IR825水溶液与4T1细胞孵育24 h。细胞活性检测采用标准的MTT试剂进行检测。结果如附图7所示,HSA-IR825与4T1细胞培养后基本上没有发现明显的毒性。即使浓度达到16 μM mg/mL时,细胞的活力仍然保持90%以上。
实施例五:HSA-IR825通过尾静脉注射到活体内的活体成像实验
将HSA-IR825通过尾静脉注射到小鼠体内,在小动物成像系统(CRI)上进行在不同的时间点进行实时采集图片,观察HSA-IR825在肿瘤部位的富集量。选用的激发光源是595nm,曝光时间是50 ms。
附图8为HSA-IR825在小鼠肿瘤部位的富集情况图;如图8(a)所示,随着时间的推移,肿瘤区域的HSA-IR825的荧光信号先逐渐增强,大约2小时后,HSA-IR825通过被动靶向的作用,在肿瘤部位的富集量达到最大值。之后肿瘤区域的荧光信号又逐渐减弱,表明HSA-IR825被逐渐代谢出去;图8(b)是肿瘤部位的荧光信号值随时间变化的曲线,进一步说明HSA-IR82经过2小时的循环在肿瘤部位的富集量会达到最大值。
实施例六:HSA-IR825在生物体内的分布实验
将HSA-IR825通过尾静脉注射到小鼠体内,2小时后,实验小鼠牺牲,取出重要的器官置于表面皿中,在小动物成像系统上拍摄荧光照片,观察各个器官及肿瘤部位HSA-IR825的富集量。
附图9为HSA-IR825在小鼠体内的富集情况图;如图9(a)所示,在2h时间点,肿瘤部位的荧光最强,其次是肝和肾,表明HSA-IR825在肿瘤部位有超高的富集量,由于肾中的富集量也很高,说明HSA-IR825可以从小鼠体内代谢出去,这一结果与活体成像的结果相符;图9(b)为由小动物成像系统半定量地得到的不同器官及肿瘤部位的荧光信号值,实验数据进一步说明HSA-IR825在小鼠体内的分布。
实施例七:HSA-IR825在活体水平的光热治疗实验
选取5只背部带有4T1肿瘤的小鼠作为实验组,从尾静脉注射HSA-IR825,经过2小时后,HSA-IR825在肿瘤部位的富集量达到最大,然后将肿瘤部位暴露在808 纳米激光下照射5 min,激光功率为0.8W/cm2。另外三组背部带有肿瘤的小鼠(每组5只)做为对照组试验,分别是(1)没有经过任何处理的健康小鼠;(2)只有激光照射组;(3)注射同样剂量的IR825-PEG有机小分子纳米胶束溶液但是没有加激光照射。当处理完每组小鼠之后,小鼠背部的肿瘤体积每隔二天测量一次。
附图10为小鼠肿瘤部位温度与激光照射时间的关系;如图10所示,注射HSA-IR825的小鼠肿瘤部位的温度有明显的升高,很快就能升到五十几度,从而可以消除肿瘤;而对照组(只有激光照射组)的小鼠肿瘤的温度仅升到四十几度,不会影响小鼠肿瘤的生长。
附图11为肿瘤体积的变化图,如图11所示,实验组小鼠的肿瘤在光热治疗作用下,两天后全部消除,而其他的对照组肿瘤在不断的生长;当肿瘤的体积超过1cm3时,认为小鼠死亡,附图12为各组小鼠的存活率,可以看出在18~22天时对照组小鼠全部死亡,而实验组小鼠在50天后仍然全部活着,并且肿瘤部位没有重新再生。
以上结果充分说明,本发明公开的蛋白-染料复合物可以在荧光成像模式下指导光热治疗癌症。