CN108226048B - 具有聚集诱导光吸收增强现象的纳米颗粒及其合成方法 - Google Patents
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Abstract
具有聚集诱导光吸收增强现象的纳米颗粒及其合成与应用,涉及纳米颗粒。所述具有聚集诱导光吸收增强现象的纳米颗粒由内核和外层组成,内核为克酮酸菁类似物,外层为蛋白颗粒,内核装载在外层内腔,形成克酮酸菁类似物为内核、蛋白颗粒为外层的复合纳米结构。将乙肝核心蛋白颗粒稀释加到解聚缓冲液搅拌;将染料在DMSO中混匀得克酮酸菁类似物染料;将克酮酸菁类似物染料加入得到的混合物中搅拌得混合液;将混合液加入透析袋,在组装缓冲液1中进行透析,磁力搅拌反应;将混合液加入透析袋,在组装缓冲液2中进行透析,磁力搅拌反应,载药蛋白纳米颗粒;将得到的载药蛋白纳米颗粒进行125I标记,获得具有聚集诱导光吸收增强现象的纳米颗粒。
Description
技术领域
本发明涉及一种纳米颗粒,尤其是涉及具有聚集诱导光吸收增强现象的纳米颗粒及其合成方法。
背景技术
对肿瘤的早期诊断可以帮助医生较早识别肿瘤组织,减少病人的痛苦。光声成像技术结合了光学的高对比度与超声的穿透深度,通过靶向探针,特异识别肿瘤组织和正常组织,帮助医生快速、精准地监控癌变组织,并减少对正常组织的伤害,因此靶向肿瘤组织成像的二区光声探针受到人们的广泛关注。光声成像技术是一种新型的无损实时成像方法,结合了光学成像的高对比度和超声成像的高穿透深度,从原理上避免了传统光学散射的影响,为研究生物组织的结构形态、生理特征、代谢功能成及病理特征提供重要检测手段。通过外源性造影剂的加入,比如金棒、碳量子点、有机染料等,通过改变局部组织的声学和光学特性,可以提高成像对比度和分辨率,可以显著增强光声成像的效果。近年来,有机功能染料作为光声外源造影剂引起了人们的极大关注。
有机功能染料在光学领域应用广泛,同时在荧光检测、抗癌剂、生物分子标记等生物和医学方面也有着广泛的应用。克酮酸菁染料是目前正在研究的一种有机功能染料,它在近红外区吸收峰强烈且尖锐、摩尔吸光系数高、荧光发射能力强、光热稳定性好,这些特点使其具有广阔的应用前景。长波长近红外光具有在体内性穿透深、散射少以及荧光干扰小等特点,但是大多数有机小分子染料不溶于水,容易通过疏水作用容易在生物大分子表面聚集,使染料小分子局部浓度增加,发生荧光淬灭,极大程度上限制了进一步的生物应用。聚集诱导光吸收增强型分子(AIAE)很好的解决了这一问题,它在高浓度或聚集态时,光吸收明显增强。基于AIAE型的探针,可以通过增加分子的含量增强其光强信号。
蛋白质载体基于本身所具有的可生物降解、无毒、无免疫原性、病人耐受和生物利用度高等特点,备受生物医药研究者的高度重视,已被广泛用作药物载体和诊断试剂等。蛋白载药包括化学偶联和物理结合的载药,能够提高材料的溶解性,稳定性等。另外,由于细胞表面存在各种受体,利用配体与受体的特异性结合,在蛋白表面进行修饰,可使蛋白纳米直接靶向于肿瘤细胞,从而改变纳米粒的生物分布。由于蛋白表明的可修饰性,用放射性125I进行标记,可以对小动物进行全身多层面成像,具有很高的空间分辨率。蛋白纳米载药体系具有高度靶向、药物控制释放、提高难溶药物的溶解度和吸收率、容易修饰优点,而且能够提高药物疗效和降低毒副作用。因此设计一个有效蛋白载体能实现有机小分子染料的AIAE效应从而增强光声信号,并且能特异性识别肿瘤组织,生物相容性好、生物毒性低,尺寸合适、细胞穿透性好以及防止体内环境对光声信号产生干扰,在生物成像领域是至关重要的。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种具有聚集诱导光吸收增强现象的纳米颗粒及其合成方法。
本发明的第二目的在于结合多种成像手段,提供荧光/光声/单光子发射断层三模态成像探针。
所述具有聚集诱导光吸收增强现象的纳米颗粒由内核和外层组成,所述内核为克酮酸菁类似物,外层为蛋白颗粒,内核装载在外层内腔,形成克酮酸菁类似物为内核、蛋白颗粒为外层的复合纳米结构。
所述蛋白颗粒为病毒蛋白颗粒,所述克酮酸类似物可以是单个分子或是聚集状态,病毒蛋白颗粒可以是任意尺寸的乙肝核心蛋白颗粒。
具有近红外二区吸收和发射性质材料,其化学结构式单体如下:
所述克酮酸菁的单体a:
其中,R1=R2=n-C3H7,n-C4H9,CH2CH(CH3)2,PEG-n,n=2,4,6,8,12。
所述具有近红外二区吸收和发射性质材料单体,由蛋白包裹紫外吸收峰值明显增强。
所述具有近红外二区吸收和发射性质材料单体,所述单体在溶剂为二氯甲烷,紫外吸收峰在1094nm,其荧光光谱的激发峰波长为808nm,发射波长1000nm,荧光量子产率以IR26为内参测得3.125%。
所述具有近红外二区吸收和发射性质材料单体由蛋白包裹后原近红外二区紫外吸收峰值明显增强。
所述具有近红外二区吸收和发射性质材料单体作为荧光成像/光声成像/单光子发射断层成像造影剂在脑胶质瘤精准成像监控中的应用。
所述克酮酸菁类似物在蛋白载体中以聚集体形式存在,产生聚集诱导的光吸收增强现象。所述蛋白颗粒为RGD修饰的乙肝核心蛋白颗粒,所述RGD修饰的乙肝核心蛋白颗粒由以下方法制备:
首先通过质粒构建,将RGD修饰到蛋白颗粒表面,实现靶向胶质瘤细胞功能。
所述具有聚集诱导光吸收增强现象的纳米颗粒的合成方法包括以下步骤:
1)将乙肝核心蛋白颗粒稀释加到解聚缓冲液搅拌,得混合物;
在步骤1)中,所述乙肝核心蛋白颗粒与解聚缓冲液的体积比可为1:3,所述搅拌的条件可在4℃下搅拌0.5小时;所述解聚缓冲液可由6M尿素,150mM的NaCl,1%甘氨酸,50mMTris-HCl pH 8.0组成。
2)将克酮酸菁类似物在DMSO中溶解,得克酮酸菁类似物的DMSO溶液;
在步骤2)中,所述克酮酸菁类似物与DMSO的配比可为1mg︰50μL,克酮酸菁类似物以质量计算,DMSO以体积计算。
3)将步骤2)中得到的克酮酸菁类似物溶液加入步骤1)得到的混合物中搅拌,得混合液;
在步骤3)中,所述搅拌条件可在500rpm下搅拌20分钟。
4)将步骤3)得到的混合液加入透析袋,在组装缓冲液1中进行透析,磁力搅拌反应;
在步骤4)中,所述组装缓冲液1可由150mM的NaCl,1%甘氨酸,10mM Tris-HClpH8.0,10%的甘油组成;所述磁力搅拌反应的时间可为12小时。
5)将步骤4)中的混合液加入透析袋,在组装缓冲液2中进行透析,磁力搅拌反应,得到载药蛋白纳米颗粒;
在步骤5)中,所述组装缓冲液2可由150mM的NaCl,1%甘氨酸,10mM Tris-HClpH8.0组成;所述磁力搅拌反应的时间可为12小时。
6)将步骤5)得到的载药蛋白纳米颗粒进行125I标记,获得具有聚集诱导光吸收增强现象的纳米颗粒。
所述具有聚集诱导光吸收增强现象的纳米颗粒在体内靶向肿瘤成像和疾病检测等领域具有很广泛的应用前景。
所述具有聚集诱导光吸收增强现象的纳米颗粒结合多种成像手段,提供荧光/光声/单光子发射断层三模态成像探针。
所述蛋白颗粒在正常生理环境pH=7.4及肿瘤环境pH=6.5时稳定存在,通过蛋白表面的RGD主动靶向进入癌细胞。细胞毒性测试结果表明此纳米颗粒具有较低的生物毒性,并且细胞成像实验表明RGD靶向的蛋白纳米探针具有高效的选择性。小动物活体实验表明荧光成像、光声成像、SPECT成像三种模态相互结合,提高了成像分辨率和对比度,在体内靶向肿瘤成像和疾病检测等领域具有很广泛的应用前景。
本发明涉及乙肝核心蛋白颗粒、克酮酸菁类似物。所构建的纳米结构是将克酮酸菁类似物装载到蛋白颗内腔,形成克酮酸菁类似物为内核、蛋白颗粒为外层的复合纳米结构。克酮酸菁类似物在蛋白载体中以聚集体形式存在,产生聚集诱导的光吸收增强现象。本发明中,设计制备了RGD修饰的乙肝核心蛋白颗粒。首先通过质粒构建,将RGD修饰到蛋白颗粒表面,实现了靶向胶质瘤细胞功能。该种蛋白纳米颗粒在正常生理环境pH=7.4及肿瘤环境pH=6.5时稳定存在,通过蛋白表面的RGD主动靶向进入癌细胞。细胞毒性测试结果表明此纳米颗粒具有较低的生物毒性,并且细胞成像实验表明RGD靶向的蛋白纳米探针具有高效的选择性。小动物活体实验表明荧光成像、光声成像、SPECT成像三种模态相互结合,提高了成像分辨率,对比度,在体内靶向肿瘤成像和疾病检测等领域具有很广泛的应用前景。
本发明具有以下优点:
1、该具有靶向胶质瘤的蛋白纳米颗粒合成方法简单,合成的纳米颗粒尺寸均一、分散性好;在正常生理环境pH=7.4中能稳定存在、均匀分散,粒径保持在25~30nm。
2、蛋白纳米颗粒具有优良的聚集诱导吸收增强(aggregation-inducedabsorption enhancement,AIAE)效应,当染料分子复合装载到蛋白纳米颗粒中,其光吸收强度比复合前增强了约5倍。
3、该聚集诱导增强型蛋白纳米颗粒在具有较低的生物毒性,利于其生物应用。
4、该聚集诱导增强型蛋白纳米颗粒具有优良的靶向胶质瘤的光声成像功能,提高光声成像的深度。
5、该聚集诱导增强型蛋白纳米颗粒具有多模态成像功能,是一种优良的荧光/光声/单光子发射三模态成像探针。
附图说明
图1为实施例制备的具有RGD靶向性的蛋白纳米颗粒的透射电子显微镜照片(TEM),微球粒径约为30nm。
图2为实施例制备的具有RGD靶向性的蛋白纳米颗粒与小分子染料复合前后吸收光谱图(染料分子浓度相同),表明复合后荧光强度增强约5倍,显示AIAE效应。
图3为实施例制备的具有AIE现象的靶向蛋白纳米颗粒对胶质瘤细胞U87细胞毒性测试图,细胞存活率大于80%,当激光照射时(980nm,0.5W cm-2,10分钟),60%肿瘤细胞被杀死,表明蛋白纳米颗粒具有较低毒性很好的光热性能。
图4为实施例制备的具有AIAE现象的靶向蛋白纳米颗粒在尾静脉注射胶质瘤动物模型2小时后的光声图,证明借助该纳米探针,通过光声成像技术可以探测到脑皮下5.9mm的深度。
图5为实施例制备的具有AIAE现象的靶向蛋白纳米颗粒在尾静脉注射胶质瘤动物模型2小时后的SPECT图,可以监测该纳米颗粒在脑胶质瘤中的靶向富集效果以及此纳米颗粒具有多模态成像能力。
图6为实施例制备的具有AIAE现象的靶向蛋白纳米颗粒在尾静脉注射胶质瘤动物模型后的荧光图,可以监测该纳米颗粒在脑胶质瘤中的靶向富集效果以及此纳米颗粒具有多模态成像能力。
具体实施方式
以下实施例将结合附图对本发明作进一步的说明。
所述具有聚集诱导光吸收增强现象的纳米颗粒由内核和外层组成,所述内核为克酮酸菁类似物,外层为蛋白颗粒,内核装载在外层内腔,形成克酮酸菁类似物为内核、蛋白颗粒为外层的复合纳米结构。
所述克酮酸菁类似物在蛋白载体中以聚集体形式存在,产生聚集诱导的光吸收增强现象。所述蛋白颗粒为RGD修饰的乙肝核心蛋白颗粒,所述RGD修饰的乙肝核心蛋白颗粒由以下方法制备:
首先通过质粒构建,将RGD修饰到蛋白颗粒表面,实现靶向胶质瘤细胞功能。
所述具有聚集诱导光吸收增强现象的纳米颗粒的合成方法包括以下步骤:
1)将乙肝核心蛋白颗粒稀释加到解聚缓冲液搅拌,得混合物;所述乙肝核心蛋白颗粒与解聚缓冲液的体积比为1︰3,所述搅拌的条件可在4℃下搅拌0.5小时;所述解聚缓冲液可由6M尿素,150mM的NaCl,1%甘氨酸,50mM Tris-HCl pH 8.0组成。
2)将克酮酸菁类似物在DMSO中溶解,得克酮酸菁类似物溶液;所述克酮酸菁类似物与DMSO的配比可为1mg︰50μL,克酮酸菁类似物以质量计算,DMSO以体积计算。
3)将步骤2)中得到的克酮酸菁类似物溶液加入步骤1)得到的混合物中搅拌,得混合液;所述搅拌条件可在500rpm下搅拌20分钟。
4)将步骤3)得到的混合液加入透析袋,在组装缓冲液1中进行透析,磁力搅拌反应;所述组装缓冲液1由150mM的NaCl,1%甘氨酸,10mM Tris-HCl pH 8.0,10%的甘油组成;所述磁力搅拌反应的时间为12小时。
5)将步骤4)中的混合液加入透析袋,在组装缓冲液2中进行透析,磁力搅拌反应,得到载药蛋白纳米颗粒;所述组装缓冲液2由150mM的NaCl,1%甘氨酸,10mM Tris-HClpH8.0组成;所述磁力搅拌反应的时间可为12小时。
6)将步骤5)得到的载药蛋白纳米颗粒进行125I标记,获得具有聚集诱导光吸收增强现象的纳米颗粒。
所述具有聚集诱导光吸收增强现象的纳米颗粒在体内靶向肿瘤成像和疾病检测等领域具有很广泛的应用前景。
所述具有聚集诱导光吸收增强现象的纳米颗粒结合多种成像手段,提供荧光/光声/单光子发射断层三模态成像探针。
所述蛋白颗粒在正常生理环境pH=7.4及肿瘤环境pH=6.5时稳定存在,通过蛋白表面的RGD主动靶向进入癌细胞。细胞毒性测试结果表明此纳米颗粒具有较低的生物毒性,并且细胞成像实验表明RGD靶向的蛋白纳米探针具有高效的选择性。小动物活体实验表明荧光成像、光声成像、SPECT成像三种模态相互结合,提高了成像分辨率和对比度,在体内靶向肿瘤成像和疾病检测等领域具有很广泛的应用前景。
本发明涉及乙肝核心蛋白颗粒、克酮酸菁类似物。所构建的纳米结构是将克酮酸菁类似物装载到蛋白颗内腔,形成克酮酸菁类似物为内核、蛋白颗粒为外层的复合纳米结构。克酮酸菁类似物在蛋白载体中以聚集体形式存在,产生聚集诱导的光吸收增强现象。本发明中,设计制备了RGD修饰的乙肝核心蛋白颗粒。首先通过质粒构建,将RGD修饰到蛋白颗粒表面,实现了靶向胶质瘤细胞功能。该种蛋白纳米颗粒在正常生理环境pH=7.4及肿瘤环境pH=6.5时稳定存在,通过蛋白表面的RGD主动靶向进入癌细胞。细胞毒性测试结果表明此纳米颗粒具有较低的生物毒性,并且细胞成像实验表明RGD靶向的蛋白纳米探针具有高效的选择性。小动物活体实验表明荧光成像、光声成像、SPECT成像三种模态相互结合,提高了成像分辨率,对比度,在体内靶向肿瘤成像和疾病检测等领域具有很广泛的应用前景。
具有靶向胶质瘤的蛋白纳米颗粒合成方法简单,合成的纳米颗粒尺寸均一、分散性好(参见图1);在正常生理环境pH=7.4中能稳定存在、均匀分散,粒径保持在25~30nm。
蛋白纳米颗粒具有优良的聚集诱导吸收增强AIAE效应,当染料分子复合装载到蛋白纳米颗粒中,其光吸收强度比复合前增强了5倍(参见图2)。
聚集诱导增强型蛋白纳米颗粒在具有较低的生物毒性,利于其生物应用(参见图3)。
聚集诱导增强型蛋白纳米颗粒具有优良的靶向胶质瘤的光声成像功能,提高光声成像的深度(参见图4)。
聚集诱导增强型蛋白纳米颗粒具有多模态成像功能,是一种优良的荧光/光声/单光子发射三模态成像探针(参见图5和6)。
Claims (5)
1.具有聚集诱导光吸收增强现象的纳米颗粒,其特征在于所述纳米颗粒由内核和外层组成,所述内核为克酮酸菁染料在DMSO中混匀得到的克酮酸菁类似物染料,外层为125I标记的蛋白颗粒,内核装载在外层内腔,形成克酮酸菁类似物染料为内核、125I标记的蛋白颗粒为外层的复合纳米结构;
所述蛋白颗粒为病毒蛋白颗粒,所述克酮酸菁类似物为聚集状态,病毒蛋白颗粒为任意尺寸的RGD修饰的乙肝核心蛋白颗粒。
3.如权利要求1所述具有聚集诱导光吸收增强现象的纳米颗粒,其特征在于所述克酮酸菁类似物由蛋白包裹后紫外吸收峰值增强。
4.如权利要求1所述具有聚集诱导光吸收增强现象的纳米颗粒,其特征在于所述克酮酸菁的单体在溶剂二氯甲烷中的紫外吸收峰位于1094nm,其荧光光谱的激发峰波长为808nm,发射波长为1000nm,荧光量子产率以IR26为内参测得3.125%。
5.如权利要求1所述具有聚集诱导光吸收增强现象的纳米颗粒的合成方法,其特征在于包括以下步骤:
1)将乙肝核心蛋白颗粒稀释加到解聚缓冲液搅拌,得混合物;所述乙肝核心蛋白颗粒与解聚缓冲液的体积比为1︰3,所述搅拌的条件是在4℃下搅拌0.5h;所述解聚缓冲液由6M尿素,150mM的NaCl,1%甘氨酸,50mM Tris-HCl pH 8.0组成;
2)将染料在DMSO中混匀,得克酮酸菁类似物染料;所述染料与DMSO的配比为1mg︰50μL,染料以质量计算,DMSO以体积计算;
3)将步骤2)中得到的克酮酸菁类似物染料加入步骤1)得到的混合物中搅拌,得混合液;所述搅拌条件是在500rpm下搅拌20min;
4)将步骤3)得到的混合液加入透析袋,在组装缓冲液1中进行透析,磁力搅拌反应;所述组装缓冲液1由150mM的NaCl,1%甘氨酸,10mM Tris-HCl pH 8.0,10%的甘油组成;所述磁力搅拌反应的时间为12h;
5)将步骤4)中的混合液加入透析袋,在组装缓冲液2中进行透析,磁力搅拌反应,得到载药蛋白纳米颗粒;所述组装缓冲液2由150mM的NaCl,1%甘氨酸,10mM Tris-HCl pH 8.0组成;所述磁力搅拌反应的时间为12h;
6)将步骤5)得到的载药蛋白纳米颗粒进行125I标记,获得具有聚集诱导光吸收增强现象的纳米颗粒。
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