CN105585872B - 一种不对称近红外菁染料及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种不对称近红外菁染料及其制备方法与应用。所述不对称近红外菁染料的结构式如式Ⅰ所示。本发明提供的所述不对称近红外菁染料的制备方法，包括如下步骤：(1)式Ⅱ所示化合物与式Ⅲ所示化合物经缩合反应得到式Ⅴ所示化合物；(2)式Ⅴ所示化合物与式Ⅳ所示化合物经缩合反应即得到式Ⅰ所示不对称近红外菁染料。本发明提供的不对称近红外菁染料，其共轭体系大，具有较强的近红外吸收，而荧光量子产率较低，非辐射跃迁的几率较大，因此具较好的光热转化效率；本发明进一步通过生物相容性好的BSA的包裹，既提高了染料的水溶性也延长了体内的保留时间，可作为光热治疗剂用于光热治疗，在肿瘤治疗方面有着非常重要的作用。

Description

一种不对称近红外菁染料及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及一种不对称近红外菁染料及其制备方法与应用，属于生物医用材料技术领域。

背景技术

光热治疗是近年来发展的一种微创肿瘤治疗技术，这种治疗方法是利用特殊的光热治疗剂对近红外光的吸收，并将吸收的光能转化为热量，使肿瘤部位温度升高，从而诱导细胞凋亡或对细胞产生直接致死效应的一种治疗方法。与传统手术治疗方法相比，大大降低了全身系统毒性，被看作是非常有潜力的肿瘤治疗技术之一。与传统的技术相比，该技术还具有过程简便、恢复快、并发症少、住院时间短等潜在优势。光热治疗的核心是光热试剂这一介质，研究者发现很多材料在近红外有很好的吸收，并且能很好的将近红外光的能量转变为热能。其光热原理是：材料吸收光子后，一部分能量以光子的形式释放出去，一部分则转变为材料自身的热能，以热量的形式释放出去。

目前报道的光热治疗剂主要为无机材料如纳米金、石墨烯、碳纳米管等，还有一些有机高聚物，但是都存在着在体内不可降解的问题。具有高荧光量子产量的小分子有机荧光染料在过去的几十年里被广泛用于荧光标记探针用于成像研究当中，因此有必要对有机荧光染料进行光热治疗方面的研究。

发明内容

本发明的目的是提供一种不对称近红外菁染料及其制备方法与应用，所提供的不对称近红外染料具有强的近红外吸收，低的荧光量子产率，较高的光热转换效率，经过BSA包裹制备成纳米颗粒，提高了水溶性及其在活体内的保留时间，有望用于肿瘤光热治疗研究中。

本发明所提供的不对称近红外菁染料的结构式如式Ⅰ所示，

本发明请求保护的不对称近红外菁染料，是一种基于罗丹明和菁染料桥环共轭偶联的染料，该染料具有大的共轭体系，吸收波长可延伸至近红外区，且分子中存在的部分“C-C”容易引发旋转发生骨架扭曲，增加非辐射跃迁几率。

本发明进一步提供了式Ⅰ所示不对称近红外菁染料的制备方法，为一种罗丹明与菁染料桥环共轭偶联的合成方法，具体包括如下步骤：

(1)式Ⅱ所示化合物与式Ⅲ所示化合物经缩合反应得到式Ⅴ所示化合物；

(2)式Ⅴ所示化合物与式Ⅳ所示化合物经缩合反应即得到式Ⅰ所示不对称近红外菁染料；

反应结束后，减压旋蒸除去溶剂，乙醚洗涤干燥后得到式Ⅰ所示化合物的粗产品，采用中性氧化铝柱，流动相为V(二氯)/V(甲醇)＝30：1进行层析分离得到橙色粉末状的式Ⅰ所示化合物的纯品。

上述的制备方法中，步骤(1)中，式Ⅱ所示化合物与式Ⅲ所示化合物的摩尔比可为1：1～1.1，具体可为1：1；

所述缩合反应的温度可为135～145℃，具体可为135℃，时间可为2～4小时，具体可为2小时；

所述缩合反应可在正丁醇与环己烷的混合溶剂中进行，所述正丁醇与所述环己烷的体积比可为7：3。

上述的制备方法中，步骤(2)中，式Ⅳ所示化合物与式Ⅲ所示化合物的摩尔比可为1：1～1.1，具体可为1：1；

所述缩合反应的温度可为135～145℃，具体可为135℃，时间可为10～12小时，具体可为10小时；

所述缩合反应可在正丁醇与环己烷的混合溶剂中进行，所述正丁醇与所述环己烷的体积比可为7：3。

上述的制备方法中，式Ⅱ所示化合物按照下述方法制备：

环己酮与三氯氧磷经维尔斯迈尔－哈克－阿诺德反应即得到式Ⅱ所示化合物；

所述维尔斯迈尔－哈克－阿诺德反应在无水DMF中进行；

所述环己酮与所述三氯氧磷的摩尔比可为1：4～5，具体可为1：4；

所述维尔斯迈尔－哈克－阿诺德反应之前，先对所述三氯氧磷进行活化，所述活化的温度可为50℃，时间可为0.5小时；所述活化后加入所述环己酮进行所述维尔斯迈尔－哈克－阿诺德反应；

所示维尔斯迈尔－哈克－阿诺德反应的温度可为60～65℃，时间可为8～10小时，如在60℃下反应8小时。

上述的制备方法中，式Ⅲ所示化合物按照下述方法制备：

2-(4-二乙氨基-2-羟基苯甲酰基)苯甲酸与环己酮在浓硫酸的催化下进行反应即得式Ⅲ所示化合物，

所述2-(4-二乙氨基-2-羟基苯甲酰基)苯甲酸与所述环己酮的摩尔比可为1：1～2，具体可为1：2；

所述反应的温度可为90～95℃，时间可为2～3小时，如在90℃下反应2小时；

所述反应结束后采用高氯酸进行后处理，具体为：将反应结束后的体系倒入碎冰中，然后加入高氯酸，经过滤、洗涤和真空干燥即可。

上述的制备方法中，式Ⅳ所示化合物按照下述方法制备：

2,3,3-三甲基-4,5-苯并-3H-吲哚与碘乙烷在乙腈中进行反应即得式Ⅳ所示化合物；

所述2,3,3-三甲基-4,5-苯并-3H-吲哚与所述碘乙烷的摩尔比可为1：5～6，具体可为1：5；

所述反应的温度可为80～85℃，时间可为10～12小时，如在85℃下反应10小时；

式Ⅳ所示化合物不经过进一步的提纯步骤，即可与式Ⅴ所示化合物进行反应。

由于不对称近红外菁染料的水溶性较差，为了提高其水溶性，本发明进一步提供了通过生物相容性好的牛血清白蛋白(BSA)将染料进行包裹制成纳米颗粒的方法，包括如下步骤：在超声条件下，式Ⅰ所示不对称近红外菁染料的醇溶液滴加至BSA的水溶液中，然后在戊二醛存在的条件下进行交联即得所述复合纳米颗粒；

式Ⅰ所示不对称近红外菁染料与BSA的摩尔比可为1：1～1.1，具体可为1：1；

所述醇溶液具体可为甲醇溶液或乙醇溶液；

所述方法还包括如下步骤：所述复合纳米颗粒的悬浮液在pH 7.4的磷酸缓冲液中透析2天，以除去戊二醛以及醇。

上述制备方法制备得到的复合纳米颗粒也属于本发明的保护

本发明提供的式Ⅰ所示不对称近红外菁染料或所述复合纳米颗粒可用于制备光热治疗剂用于肿瘤光热治疗中；

式Ⅰ所示不对称近红外菁染料制成的纳米颗粒用于抑制肿瘤细胞的生长，如乳腺癌细胞，具体可为4T1细胞；

本发明建立了小鼠肿瘤模型，通过给药光照，验证了上述光热治疗效果—采用瘤内注射法向小鼠体内注射复合纳米颗粒的水溶液，具有较好的肿瘤抑制效果。

以式Ⅰ所示不对称近红外菁染料或所述复合纳米颗粒为活性成分的光热治疗剂也属于本发明的保护范围。

本发明提供的不对称近红外菁染料，其共轭体系大，具有较强的近红外吸收，而荧光量子产率较低，非辐射跃迁的几率较大，因此具较好的光热转化效率；本发明进一步通过生物相容性好的BSA的包裹，既提高了染料的水溶性也延长了体内的保留时间，可作为光热治疗剂用于光热治疗，在肿瘤治疗方面有着非常重要的作用。

附图说明

图1是式Ⅰ所示不对称近红外菁染料在甲醇中的吸收光谱和荧光发射光谱。

图2是实施例6中式Ⅰ所示不对称近红外菁染料采用BSA包裹的示意图。

图3是实施例6中式Ⅰ所示不对称近红外菁染料包裹前后相同染料浓度下的吸收光谱。

图4是实施例6中BSA包裹后形成的纳米颗粒的粒径分布图。

图5是实施例6中BSA包裹后形成的纳米颗粒的TEM图。

图6是实施例6中BSA-染料纳米颗粒悬浮液在915nm(1.0W/cm²)激光照射下的光热升温图。

图7是实施例7中BSA-染料纳米颗粒的细胞暗毒性示意图。

图8是实施例7中BSA-染料纳米颗粒的细胞光热测试示意图。

图9是实施例8中治疗期间不同组小组小鼠的肿瘤体积变化示意图。

图10是实施例8中治疗期间不同时间不同组小鼠的照片。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

制备式Ⅰ所示不对称近红外菁染料的反应方程式：

实施例1、式Ⅱ所示中间体的合成

在20mL干燥的DMF中，缓慢加入18.5mL(200mmol)三氯氧磷，加热至50℃，30min后缓慢加入5g(51mmol)环己酮之后升温至60℃，反应8h。反应结束后，用冰水冷却到室温，然后分四次倒入100g碎冰中。室温下搅拌，放置过夜，得到黄色固体，过滤，二氯甲烷重结晶，得到针状黄色晶体的式Ⅱ所示中间体。

¹H NMR(600MHz,DMSO-D6)δ10.06(s,1H),4.06(s,1H),3.25(t,4H),2.63(m,2H).

经确认，结构正确。

实施例2、式Ⅲ所示中间体的合成

2.0g(20mmol)环己酮搅拌下加入10mL浓硫酸中并冷却到0℃之后，称取3.13g(10mmol)2-(4-二乙氨基-2-羟基苯甲酰基)苯甲酸加入以上反应液，90℃下搅拌加热反应2h，反应结束冷却至室温后，倒入200g碎冰中，加入4mL高氯酸，过滤，冷水洗涤，真空干燥，得到式Ⅲ所示中间体，不经提纯直接用于下一步反应。

¹H NMR(600MHz,DMSO-D6)δ8.17(d,J＝7.9Hz,1H),7.83(t,J＝7.5Hz,1H),7.74(t,J＝7.7Hz,1H),7.29(t,J＝9.2Hz,2H),7.17(d,J＝16.1Hz,1H),7.00(d,J＝9.6Hz,1H),3.63(d,J＝6.9Hz,4H),3.18–2.98(m,2H),2.44(d,J＝26.4Hz,2H),2.12(dt,J＝16.4,13.3Hz,2H),1.84(s,2H),1.67(ddd,J＝26.1,12.8,6.9Hz,2H),1.17(t,J＝6.7Hz,6H),0.98(t,J＝7.0Hz,1H).

经确认，结构正确。

实施例3、式Ⅳ所示中间体的合成

氮气保护下，原料2,3,3-三甲基-4,5-苯并-3H-吲哚(4.0g，19.1mmol)溶于干燥的乙腈，用注射器加入碘乙烷(14.9g，95.5mmol)，85℃下加热搅拌反应10h。待反应液冷却到室温后，过滤得到紫色的固体式Ⅳ所示中间体，丙酮洗涤，真空下干燥，不做进一步提纯，直接用于下步反应。

实施例4、式I所示化合物的合成

将0.516g(3mmol)的式Ⅱ所示中间体和1.425g(3mmol)式Ⅲ所示中间体加到40mL正丁醇和环己烷混合溶剂中(体积比为7：3)。135℃下加热搅拌2h，冷却到室温后，加入1.095g(3mmol)式Ⅳ所示中间体的10mL正丁醇和环己烷混合溶剂(体积比为7：3)悬浮液，继续135℃下加热搅拌10h。反应结束后减压旋蒸出去溶剂，乙醚洗涤干燥后得到式Ⅰ所示化合物的粗产品，采用中性氧化铝柱层析，流动相为V(二氯)/V(甲醇)＝30：1分离提纯得到橙红色粉末状化合物Ⅰ纯品。

¹H NMR(600MHz,DMSO-D6)δ8.00(d,J＝8.8Hz,1H),7.90(d,J＝7.7Hz,1H),7.84–7.71(m,3H),7.64(t,J＝7.5Hz,1H),7.40(t,J＝7.3Hz,1H),7.35(d,J＝12.0Hz,1H),7.31(d,J＝7.6Hz,1H),7.24(d,J＝8.7Hz,1H),7.22–7.14(m,2H),6.40(d,J＝10.7Hz,2H),6.34(d,J＝8.8Hz,1H),5.47(d,J＝12.7Hz,1H),3.81(dd,J＝12.6,6.2Hz,2H),3.34–3.30(m,2H),2.54(dd,J＝39.4,11.9Hz,6H),1.84(s,6H),1.73(d,J＝4.9Hz,2H),1.57(s,4H),1.36(s,2H),1.14(t,J＝6.9Hz,3H),1.06(t,J＝7.0Hz,6H).13C NMR(151MHz,DMSO-D6)δ169.48,158.72,152.20,149.59,147.27,142.12,135.74,133.21,130.38,130.21,130.00,129.74,129.13,128.78,128.17,127.36,127.30,126.45,125.22,124.26,123.90,122.41,121.82,110.13,109.55,107.96,104.87,97.17,92.43,47.66,44.24,40.63,36.80,32.09,28.15,27.19,26.55,24.17,23.31,22.56,12.89,11.70.ESI-HRMS m/z calcd forC49H50ClN2O3+:749.3510,found 749.3510.

经确认，结构正确。

式I所示化合物在甲醇中的吸收光谱和荧光发射光谱如图1所示，甲醇中化合物Ⅰ的吸收处于近红外区，最大吸收峰为868nm，954nm处有个肩峰；最大发射峰处于1026nm，经测定化合物Ⅰ868nm处的摩尔消光系数为9.0×10⁴M^-1cm^-1，而荧光量子产率<0.01％，说明化合物Ⅰ在吸收光能量之后非辐射几率很大，具有着潜在良好光热转换效率。

实施例6、BSA包裹式I所示化合物

按照下述方法对式I所示化合物进行包裹，包裹过程的示意图如图2所示：

100mg BSA溶于5mL蒸馏水中，0.9mL的式I所示化合物的甲醇溶液(化合物I：BSA＝1：1(摩尔比))在超声下滴加入BSA溶液中，形成BSA包裹染料的纳米颗粒，之后加入5μL戊二醛溶液(25wt％)室温下交联12h。所得纳米颗粒悬浮液在pH7.4的磷酸缓冲液中透析2天，得到BSA包裹染料的纳米颗粒悬浮液。

本实施例BSA包裹式I所示化合物的纳米颗粒和式I所示化合物在相同染料浓度下的吸收光谱如图3所示，由图3可以看出，BSA包裹后形成的纳米颗粒悬浮液的吸收光谱与化合物I在甲醇中的吸收光谱相似，最大吸收峰仍处868nm，只是右边的肩峰红移到992nm，且900～980nm区间的吸收略有下降。

本实施例BSA包裹式I所示化合物的纳米颗粒的粒径分布图如图4所示，由图4可以看出，形成的纳米颗粒水合粒径在135nm左右。

本实施例BSA包裹式I所示化合物的纳米颗粒的TEM图如图5所示，由图5可以看出，形成较均匀的纳米颗粒呈实心球状，直径大约为110nm。

本实施例BSA包裹式I所示化合物的纳米颗粒悬浮液在915nm(1.0W/cm²)激光照射下的光热升温图如图6所示，由图6可以看出，形成的纳米颗粒具有较好的光热转化性能。

实施例7、

细胞铺板：将处于对数生长期的小鼠乳腺癌细胞4T1细胞(1.0×10⁵)接种于96孔板，分成2组，光照组和不光照组培养，24h后加入含不同浓度染料的BSA纳米颗粒，光照组孵育1h后用915nm激光器1W/cm²照射10min后继续孵育12h用CCK8测定细胞存活率，不光照组则12h后直接用CCK8测定细胞存活率。

BSA-染料纳米颗粒的细胞暗毒性如图7所示，BSA-染料纳米颗粒的细胞光热测试结果如图8所示，由图7和图8可以看出，形成的纳米颗粒具有较好的生物相容性和光热杀死癌细胞的能力。

实施例8、

将接种了4T1小鼠乳腺癌细胞的Balb/c裸鼠进行随机分组，分为4组，每组5只，采用瘤内注射法：

(1)对照组，无光照；

(2)不加药光照915nm(1.0W/cm²，10min)；

(3)注射200μL包裹染料的BSA纳米颗粒(250ppm)，无光照；

(4)注射200μL包裹染料的BSA纳米颗粒(250ppm)，2h后，915nm光照(1.0W/cm²，10min)；

治疗过程中，肿瘤体积和体重隔天测一次，IR照相机监控光照过程，肿瘤体积计算公式为宽^2×(长/2)。

上述各处理的处理结果如下：

治疗期间不同组小组小鼠的肿瘤体积变化如图9所示，治疗期间不同时间不同组小组小鼠的照片如图10所示，由图9和图10可以看出，BSA-染料纳米颗粒作为光热剂用于肿瘤治疗具有较好的治疗效果，能够有效地将肿瘤组织消融。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种不对称近红外菁染料，其结构式如式Ⅰ所示，

2.式Ⅰ所示不对称近红外菁染料的制备方法，包括如下步骤：

(1)式Ⅱ所示化合物与式Ⅲ所示化合物经缩合反应得到式Ⅴ所示化合物；

(2)式Ⅴ所示化合物与式Ⅳ所示化合物经缩合反应即得到式Ⅰ所示不对称近红外菁染料；

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，式Ⅱ所示化合物与式Ⅲ所示化合物的摩尔比为1：1～1.1；

所述缩合反应的温度为135～145℃，时间为2～3小时；

所述缩合反应在正丁醇与环己烷的混合溶剂中进行；

步骤(2)中，式Ⅳ所示化合物与式Ⅲ所示化合物的摩尔比为1：1～1.1；

所述缩合反应的温度为135～145℃，时间为10～12小时；

所述缩合反应在正丁醇与环己烷的混合溶剂中进行。

4.根据权利要求2或3所述的制备方法，其特征在于：式Ⅱ所示化合物按照下述方法制备：

环己酮与三氯氧磷经维尔斯迈尔－哈克－阿诺德反应即得到式Ⅱ所示化合物；

式Ⅲ所示化合物按照下述方法制备：

2-(4-二乙氨基-2-羟基苯甲酰基)苯甲酸与环己酮在浓硫酸的催化下进行反应即得式Ⅲ所示化合物，

所述维尔斯迈尔－哈克－阿诺德反应结束后加入高氯酸进行后处理。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：式Ⅳ所示化合物按照下述方法制备：

2,3,3-三甲基-4,5-苯并-3H-吲哚与碘乙烷在乙腈中进行反应即得式Ⅳ所示化合物。

6.一种复合纳米颗粒的制备方法，包括如下步骤：在超声条件下，式Ⅰ所示不对称近红外菁染料的醇溶液滴加至BSA的水溶液中，然后在戊二醛存在的条件下进行交联即得所述复合纳米颗粒。

7.权利要求6所述方法制备的复合纳米颗粒。

8.式Ⅰ所示不对称近红外菁染料或权利要求7所述复合纳米颗粒在制备光热治疗剂中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述光热治疗剂抑制肿瘤细胞的生长；

所述肿瘤细胞为乳腺癌细胞。

10.一种光热治疗剂，其活性成分为式Ⅰ所示不对称近红外菁染料或权利要求7所述复合纳米颗粒。