CN115304534A - 一种光动力光敏剂及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于荧光探针技术领域，具体涉及一种光动力光敏剂及其制备方法和应用。为解决目前报道的光敏剂的激发波长位于可见区，不利于活体肿瘤光动力治疗的问题，本发明选取在近红外区具有强吸收的花菁染料作为母体发色团，基于重原子促进的系间窜越机理设计合成了一个光敏剂“溴代Cy7(Cy7Br)”，该光敏剂具有吸收波长位于近红外区、光子利用率高、生物兼容性好、单线态氧产生效率高等特点，具有潜在的生物应用价值。

Description

一种光动力光敏剂及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于荧光探针技术领域，具体涉及一种光动力光敏剂及其制备方法和应用。
背景技术
光动力疗法(PDT)是近年来发展并临床应用的一种新型癌症治疗手段，其基本原理是利用光敏剂(PS)吸收的光能将氧气(3O2)转化为高活性的单线态氧(1O2)，从而杀死癌细胞；其特点是无耐药性、可反复治疗、时空分辨率高。然而，目前临床使用的光敏剂主要是卟啉及其衍生物，该类光敏剂的1O2产生效率低、肿瘤靶向性差，仅对少数几个癌症的治疗有效。除了卟啉及其衍生物，目前最广泛采用的光敏剂构建方法是在荧光团分子结构中引入重原子，利用“自旋-轨道偶合效应(SOC)”(重原子效应)来促进单线态向三线态系间窜越(S1→T1)，从而促进1O2的产生。然而，目前报道的大部分该类光敏剂的激发波长位于可见区，不利于活体肿瘤光动力治疗。
PS的核心是荧光染料，理想的该类染料应具有近红外的吸收和发射波长以增加肌肉穿透深度，大的消光系数以提高光子利用度，良好的细胞膜穿透性和低的细胞毒性以提高生物兼容性。在众多的荧光染料中，Cy7染料除了具有近红外的激发和发射波长以外，其另一个特点是具有相当大的摩尔消光系数(ε：通常大于2×105M-1cm-1)，远大于大部分其它荧光染料(ε：一般小于1×105M-1cm-1)，鉴于上述特点，Cy7是用于构建光敏剂的理想荧光染料。为了克服传统光动力试剂在临床实践中暴露的缺点，构建性质优良的光动力治疗试剂，对于肿瘤光动力治疗技术的推广和进步具有重要意义。
发明内容
针对上述问题，本发明选取在近红外区具有强吸收的Cy7染料作为母体发色团，基于重原子促进的系间窜越机理设计合成了一个光动力光敏剂“溴代Cy7(Cy7Br)”，并将该光敏剂用于癌细胞的光动力治疗。
为了达到上述目的，本发明采用了下列技术方案：
一种光动力光敏剂，其结构式为：
Figure BDA0003768500860000021
一种光动力光敏剂的对比化合物，其结构式为：
Figure BDA0003768500860000022
一种光动力光敏剂的制备方法，包括以下步骤：
Figure BDA0003768500860000023
步骤1，在氮气保护下，将三溴氧磷溶于N,N-二甲基甲酰胺与二氯甲烷的混合溶液中反应，将环己酮逐滴加入上述反应液中回流反应，反应结束后冷却至室温，随后在冰水浴条件下，加入苯胺的乙醇溶液，维持该温度继续反应，继续加入H2O和浓HBr反应，产物中有紫色结晶出现，过滤得化合物2；
步骤2，在氮气保护下，将化合物2、化合物3和醋酸钠溶于超干乙醇中，反应液在充分搅拌下回流反应，反应结束后蒸干溶剂得到粗产品，将粗产品重新溶于甲醇中，超声、过滤，得到黄绿色结晶固体，即所述光敏剂Cy7Br；
进一步，所述步骤1中三溴氧磷、环己酮和苯胺的摩尔比为2.5：1：2.3。
进一步，所述步骤1中反应的温度为0℃，时间为30min，所述回流反应的温度为100℃，时间为5h，所述继续反应的时间为1h。
进一步，所述步骤1中H2O和浓HBr的体积比为10：1。
进一步，所述步骤2中合物2、化合物3和醋酸钠的摩尔比为1：2：2。
进一步，所述步骤2中回流反应1h，所述超声的时间为5min。
一种光动力光敏剂的应用，在近红外光照射下杀死癌细胞的应用
与现有技术相比本发明具有以下优点：
与目前报道的基于重原子促进系间窜越机理设计的光敏剂相比，本发明提供的光敏剂具有吸收波长位于近红外区、光子利用率高、生物兼容性好、单线态氧产生效率高等特点。因此，本发明提供的光敏剂能够在近红外光照射下产生活性氧化物，从而杀死癌细胞，具有潜在的生物应用价值。
附图说明
图1为化合物2的HRMS图；
图2为光敏剂Cy7Br的1H NMR图(CD3OD,600MHz)；
图3为光敏剂Cy7Br的HRMS图；
图4为1,3-二苯基异苯并呋喃(DPBF)在激光(750nm，30mW/cm2)光照下捕获光敏产生单线态氧的紫外可见吸收光谱变化图，每照射30秒记录一次，其中(A)为DPBF和光敏剂Cy7Br；(B)为DPBF和对比化合物Cy7；(C)为DPBF和参比化合物ICG；(D)为DPBF在414nm处吸光度值随时间的变化图；
图5为光敏剂Cy7Br的细胞毒性实验，其中(黑色)A549细胞用不同浓度(0μM、0.5μM、1.0μM、2.0μM、5.0μM和10.0μM)的Cy7Br处理1小时后，继续孵化24小时；(灰色)A549细胞先用不同浓度(0μM、0.5μM、1.0μM、2.0μM、5.0μM和10.0μM)的Cy7Br处理1小时，再用750nm激光(30mW/cm2，20min)照射后继续孵化24小时。
具体实施方式
实施例1
一种光动力光敏剂，其结构式为：
Figure BDA0003768500860000041
一种所述光动力光敏剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)在氮气保护下，将三溴氧磷(1.48g，5.1mmol，2.5eq)溶于2mL的DMF与4mL二氯甲烷的混合溶液中，反应液在0℃条件下反应30分钟；将环己酮(200mg，2.04mmol，1.0eq)逐滴加入上述反应液中，混合物在100℃下回流反应5h，反应结束后冷却至室温；随后，在冰浴中向上述溶液中加入苯胺的乙醇溶液(V/V＝1:1，437μL，2.3eq)，维持该温度继续反应1小时后，继续加入H2O:浓HBr(1mL:0.1mL)反应1h，反应瓶中有紫色结晶出现，过滤得到紫色晶体，即化合物2(383mg，52％)。
ESI-MS[M+H]+:calcd for 367.0810,Found 367.0803.
(2)在氮气保护下，将化合物2(100mg，0.272mmol，1eq)、化合物3(172mg，0.545mmol，2eq)以及醋酸钠(45mg，0.545mmol，2eq)溶于超干乙醇(5mL)中，反应液在充分搅拌下回流反应1小时，反应结束后蒸干溶剂得粗产品，将粗产品重新溶于甲醇中，反应液在超声仪中超声5分钟有固体析出，过滤得黄绿色结晶固体，即探针Cy7Br(85mg，43％)。
1H NMR(600MHz,CD3OD)δ8.48(m,2H),7.56(d,J＝7.2Hz,2H),7.45(t,J＝7.2Hz,2H),7.37(d,J＝7.8Hz,2H),7.31(t,J＝7.2Hz,2H),6.32(m,J＝6.6Hz,2H),4.25(m,J＝7.2Hz,4H),2.78(m,J＝6Hz,4H),1.98(m,2H),1.76(d,J＝9.6Hz,12H),1.43(t,J＝7.2Hz,6H)；ESI-MS[M]+:calcd for 555.2370,Found555.2375.
实施例2
1.测试溶液配制
将光敏剂Cy7Br用DMSO配成2mM的储存液，随后用待测溶剂稀释至测试浓度。
2.单线态氧量子产率的计算
光敏剂Cy7Br及其对比化合物Cy7的单线态氧量子产率，是以ICG(ΦΔ＝0.7％inDCM)为参比测定的，计算公式如下：
Figure BDA0003768500860000051
其中，
Figure BDA0003768500860000052
为参比的单线态氧量子产率，msam与mstd分别为含有Cy7Br、Cy7或参比的DPBF(1,3-二苯基异苯并呋喃)溶液用激光(750nm，30mW/cm2)照射后在415nm处吸光度值与光照时间的拟合曲线的斜率值，Fstd和Fsam通过公式F＝1-10-OD(OD值为750nm处Cy7Br、Cy7与参比的吸光度值)计算获得。要求DPBF在415nm处的初始吸光度值应调整为1.0左右，Cy7Br、Cy7或参比的吸光度值应调整为0.2～0.3左右。
3.光敏剂体外性能研究
为了验证基于重原子的引入将有效促进系间窜越过程，即本发明开发的光敏剂在光照条件下具有更强的单线态氧产生能力，选取经典的花菁染料(Cy7)作为对比化合物，检测了Cy7Br和Cy7在光照下产生单线态氧的情况(图4)。以DPBF为单线态氧捕获剂，ICG为参比化合物(ΦΔ＝0.7％in DCM)，750nm(30mW/cm2)作为激发光，经计算可得，Cy7Br和其对比化合物Cy7在二氯甲烷中的单线态氧产生效率分别为0.12和1.86。上述结果说明，与Cy7染料相比，Cy7Br在光激发下发生了有效的系间窜越，单线态氧产生效率提高了15.5倍。
4.光敏剂光动力治疗效果研究
为了进一步验证光敏剂Cy7Br的生物应用效果，通过CCK8实验测试了光敏剂的生物毒性以及光动力治疗效果。A549细胞用不同浓度的Cy7Br孵化1小时，对照组置于细胞培养箱内继续培养24小时，光照组用750nm的激光照射20分钟后置于细胞培养箱内继续培养24小时。如图5所示，Cy7Br具有可接受的暗度性，其光毒性随着浓度的增大逐渐增大，光照下半致死浓度(EC50)值为1.17μM。实验结果表明，光敏剂Cy7Br具有高的光毒性和低的暗度性，是一种有效的光动力治疗试剂。
综上所述，本发明利用重原子促进的系间窜越机理，基于Cy7染料构建了一个光动力光敏剂Cy7Br，该光敏剂具有吸收波长位于近红外区、光子利用率高、生物兼容性好、单线态氧产生效率高的优点，光照下对癌细胞的半致死浓度(EC50)值为1.17μM，具有潜在的生物应用价值。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种光动力光敏剂，其特征在于，其结构式为：
Figure FDA0003768500850000011
2.一种权利要求1所述光动力光敏剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1，在氮气保护下，将三溴氧磷溶于N,N-二甲基甲酰胺与二氯甲烷的混合溶液中反应，将环己酮逐滴加入上述反应液中回流反应，反应结束后冷却至室温，随后在冰水浴条件下，加入苯胺的乙醇溶液，维持该温度继续反应，继续加入H2O和浓HBr反应，产物中有紫色结晶出现，过滤得化合物2；
步骤2，在氮气保护下，将化合物2、化合物3和醋酸钠溶于超干乙醇中，反应液在充分搅拌下回流反应，反应结束后蒸干溶剂得到粗产品，将粗产品重新溶于甲醇中，超声、过滤，得到黄绿色结晶固体，即所述光敏剂；
所述化合物2的结构式为：
Figure FDA0003768500850000012
所述化合物3的结构式为：
Figure FDA0003768500850000013
3.根据权利要求2所述的一种光动力光敏剂的制备方法，其特征在于，所述步骤1中三溴氧磷、环己酮和苯胺的摩尔比为2.5：1：2.3。
4.根据权利要求2所述的一种光动力光敏剂的制备方法，其特征在于，所述步骤1中反应的温度为0℃，时间为30min，所述回流反应的温度为100℃，时间为5h，所述继续反应的时间为1h。
5.根据权利要求2所述的一种光动力光敏剂的制备方法，其特征在于，所述步骤1中H2O和浓HBr的体积比为10：1。
6.根据权利要求2所述的一种光动力光敏剂的制备方法，其特征在于，所述步骤2中合物2、化合物3和醋酸钠的摩尔比为1：2：2。
7.根据权利要求2所述的一种光动力光敏剂的制备方法，其特征在于，所述步骤2中回流反应1h，所述超声的时间为5min。
8.一种权利要求1所述光动力光敏剂的应用，其特征在于，应用于制备杀死癌细胞的试剂。
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