CN104162172A - 一种包含紫杉醇的多聚体白蛋白纳米球及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种包含紫杉醇的多聚体白蛋白纳米球及其制备方法和应用，所述多聚体白蛋白纳米球包括含巯基和/或二硫键的白蛋白分子，所述白蛋白分子之间通过二硫键相互连接，所述多聚体白蛋白纳米球中包载有目标投递物；所述目标投递物包括抗癌药物和造影剂；所述多聚体白蛋白纳米球的粒径为10～1000nm。该多聚体白蛋白纳米球是一种安全、稳定的生物相容性纳米载体，可以包载药物或者造影剂等目标投递物，且其储存稳定性高，有利于长时间有效、稳定地释放目标投递物；此外，该多聚体白蛋白纳米球的粒径小，且尺寸均一，分散性好；本发明还提供了该多聚体白蛋白纳米球的制备方法及应用。

Description

一种包含紫杉醇的多聚体白蛋白纳米球及其制备方法和应用
本申请要求于2013年9月27日提交中国专利局的申请号为201310449770.X，其发明名称为“一种多聚体白蛋白纳米球及其制备方法和应用”的中国专利申请的优先权，其部分内容通过引用结合在本申请中。
技术领域
本发明涉及生物医药材料领域，具体涉及一种多聚体白蛋白纳米球及其制备方法和应用。
背景技术
纳米技术的兴起使得基于高分子纳米微粒的药物输送得到了广泛的关注，白蛋白具有可生物降解、无毒、无抗原性等诸多特点，被认为是一个理想的药物载体。而通常单个白蛋白分子的尺寸在几个纳米以内，不适合直接用于载药，超声乳化法和去溶剂法可制得粒径小于1μm的白蛋白纳米球，可用于运载药物，但由于白蛋白分子的水溶性高，该类方法制得的白蛋白纳米球载体的释药性能不易于控制，如何使白蛋白纳米颗粒在水中有良好的稳定性，且在稀释条件下不溶解是目前制备技术上的难点。
戊二醛等交联剂常被用来稳定得到的纳米球，但戊二醛会非选择性的结合白蛋白表面的氨基位点，在生物体内会释放出醛类残基，对生物体有着显著毒副作用。因此，有必要提供一种制备安全、稳定性高的白蛋白纳米球的方法。
近年来，随着分子影像学技术的不断发展，近红外荧光成像由于实验成本低，实验简便，操作安全，测量快速，灵敏度高，无背景干扰，可方便实现对实验动物的长期跟踪测量而倍受关注。但是近红外荧光成像得到的是平面二维图像，无法得到深度信息，因此动物脏器堆积在一起时，无法确切判定荧光信号的来源。光声层析成像是近年来发展起来的一种3-D成像方法，它结合了纯光学成像的高对比度和纯超声成像的高穿透深度特性，可以提供高分辨率和高对比度的组织成像。
对于肿瘤的早期诊断、治疗及预后评价，迫切需要发展高灵敏、特异性的成像技术。因此可以将近红外荧光和光声层析成像二者的融合以增加诊断信息，使患者病灶的定位更准确，使肿瘤形态结构显示得更直观可见。目前，外源性近红外荧光-光声层析分子成像探针主要是有机小分子，包括吲哚菁绿等。吲哚菁绿是一种功能性的染料分子，具有一系列独特的光物理、光化学和光生物学特性，但由于它本身所具有的缺陷性，包括浓度依赖的聚集、较差的分子稳定性、与蛋白的非特异性结合以及缺少靶向特异性，限制了其在生物医学领域的应用；因此，制备稳定性好和靶向性好的近红外荧光-光声层析分子成像探针成为研究重点。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种多聚体白蛋白纳米球，该多聚体白蛋白纳米球包括含巯基和/或二硫键的白蛋白分子，所述白蛋白分子之间通过二硫键相互连接，在稀释条件下有较高的稳定性；此外，该多聚体白蛋白纳米球的粒径为10～1000nm，且其尺寸均一，分散性好，是运载药物或造影剂等目标投递物的良好载体，有利于在患者体内长时间有效、安全、稳定地释放投递物；本发明还提供了一种多聚体白蛋白纳米球的制备方法和应用。
第一方面，本发明提供了一种多聚体白蛋白纳米球，所述多聚体白蛋白纳米球包括含巯基和/或二硫键的白蛋白分子，所述白蛋白分子之间通过二硫键相互连接，所述多聚体白蛋白纳米球的粒径为10～1000nm。
优选地，所述含巯基和/或二硫键的白蛋白分子为人血清白蛋白、牛血清白蛋白、猪血清白蛋白、重组血清白蛋白和血红蛋白中的至少一种。
优选地，所述多聚体白蛋白纳米球中包载有目标投递物。
进一步优选地，所述目标投递物为抗癌药物和造影剂中的至少一种。
进一步优选地，所述抗癌药物为铂及铂的配合物、5β,20-环氧-1,2α,4,7β,10β,13α-六羟基紫杉烷-11-烯-9-酮-4,10-二乙酸酯-2-苯甲酸酯-13[(2’R,3’S)-N-苯甲酰-3-苯基异丝氨酸酯](紫杉醇)、(7S：9S)-9-羟乙酰基-4-甲氧基-7,8,9,10-四氢-6,7,9,11-四羟基-7-0-(2’,3’,6’,-三去氧-3’-氯基-a-1-来苏已吡喃基)-5,12-萘二酮(阿霉素)、(E,E)-1,7-双(4-羟基-3-甲氧基苯基)-1,6-庚二烯-3,5-二酮(姜黄素)、1,3,5,8-四甲基-2,4-二(a-羟乙基)卟酚-6,7-二丙酸(血卟啉)、4-乙基-4，12-二氧-4-羟-1H-吡喃(3'，4'，6，7)吡吲哚(1，2-6)喹啉-3，14-二酮(喜树碱)、(2S-反式)-18-羧基-20-(羧甲基)-13-乙基-2,3-二氢3,7,12,17-四甲基-8-乙烯基-21H,23H-卟吩-2-丙酸(二氢卟吩e6)、IR700碘化物和11-氯-1,1'-二正丙基-3,3,3',3'-四甲基-10,12-三亚甲基吲哚三碳花青碘盐(IR780)中的至少一种。
进一步优选地，所述造影剂为2,7-双[1,3-二氢-1,1-二甲基-3-(4-磺丁基)-1,3,5-庚三烯单钠盐(吲哚青绿)、对-[(2,4-二氨基喋啶-6)-N-甲基甲氨基]苯甲酰谷氨酸(甲氨蝶呤)、3,7-双(二甲氨基)吩噻嗪-5-翁氯化物(美蓝)、6,6'-[[3,3'-二甲基(1,1'-二苯基)-4,4'-二基]双(偶氮基)]双(4-氨基-5-羟基-1,3-萘二磺酸)四钠盐(伊文思蓝)、2-((4-二乙氨基)苯)(4-(二乙氨基)环己烷-2,5-二烯)甲烷)苯基-1,4-二磺酸盐(异硫蓝)、4,4'-双(二乙氨基)三苯脱水甲醇-2'',4''-二磺酸单钠(专利蓝)和金属纳米粒子中的至少一种。
由于白蛋白单体分子易溶性，物理方法团聚的白蛋白纳米球容易解体，纳米球中包载的药物很容易被过早地释放，不利于药物等目标投递物在人体循环系统内的运输，即物理方法团聚的白蛋白纳米球载体的释药性能的可控性不高，而本发明提供的多聚体白蛋白纳米球由多个白蛋白单体分子通过分子间的二硫键相互连接，这种化学键稳定的多聚体结构比通过物理方法聚集的蛋白纳米球更稳定，不易被人体体液稀释、溶解而解体，有助于保证靶向部位足够的给药浓度。
在生物医学应用中，纳米粒子药物的粒径比较重要，不同的粒径代谢路径也不一样，小粒径通过肾代谢，大粒径通过肝代谢；其中，20～200nm的粒子对肿瘤有被动靶向作用，在此粒径范围内的纳米粒子药物可以降低药物本身的毒副作用，同时也增加了疗效。
此外，纳米粒子药物的分散性是比较重要的，分散性不好，粒子容易团聚，甚至沉淀，导致应用较为困难，特别是其生物医学应用，分散性尤其重要。
本发明提供的多聚体白蛋白纳米球粒径小且尺寸均一，分散性好，用该纳米球包括投递药物在生物医学应用有较大优势，有利于纳米球通过EPR效应进入肿瘤内部并通过gp60通路靶向到肿瘤细胞。
另外，一般自由蛋白质分子的分子量大都小于60KDa，本发明提供的多聚体白蛋白纳米球由多个白蛋白单体分子聚集而成，分子量高于60KDa，不易被肾小球滤过(由于肾小球的滤过作用下，一般分子量小于60KDa的蛋白质分子会在代谢的过程中被清除掉，而不能达到靶向位置)，能提高药物等目标投递物的投递效率。
第二方面，本发明提供了一种多聚体白蛋白纳米球的制备方法，包括以下步骤：
(1)制备体积质量浓度为0.01～300mg/mL的含巯基的白蛋白水溶液，并调节所述白蛋白水溶液的pH值为7～12；
(2)向步骤(1)所得的所述pH值为7～12的白蛋白水溶液中加入带巯基的还原剂得反应液，然后在0～60℃下轻轻摇动反应0.05～12小时，在所述反应液中，所述带巯基的还原剂的摩尔数为白蛋白摩尔数的10～5000倍；
(3)将步骤(2)反应后的溶液在0～60℃的条件下进行超声，所述超声的功率范围为1～100KW，同时在搅拌的条件下在所述进行超声的溶液中以0.01～1000mL/s的速度加入有机溶剂得到微乳溶液，所述微乳溶液在0～60℃的条件下反应5～240min后，静置分层，然后去除有机相，得到含多聚体白蛋白纳米球的悬浊液，其中，所述有机溶剂加入的体积为所述步骤(2)反应后的溶液的1～100倍；
(4)将步骤(3)所得的含多聚体白蛋白纳米球的悬浊液在0～60℃以及pH值为7～12的条件下进行透析，得到多聚体白蛋白纳米球溶液；
(5)将步骤(4)所得的多聚体白蛋白纳米球溶液进行干燥脱水处理，得到多聚体白蛋白纳米球，所述多聚体白蛋白纳米球包括含巯基和/或二硫键的白蛋白分子，所述白蛋白分子之间通过二硫键相互连接，所述多聚体白蛋白纳米球的粒径为10～1000nm。
优选地，所述步骤(1)中，所述含巯基和/或二硫键的白蛋白分子为人血清白蛋白、牛血清白蛋白、猪血清白蛋白、重组血清白蛋白和血红蛋白中的至少一种。
优选地，所述步骤(1)中，所述白蛋白水溶液中含有体积分数为0％～20％的二甲基亚砜、甲醇、乙醇、丙醇和叔丁醇中的至少一种。
本发明采用的二甲基亚砜、甲醇、乙醇、丙醇或叔丁醇能提高药物或造影剂在溶液中的溶解度，使药物或造影剂充分溶解均匀。
优选地，所述步骤(1)中，所述白蛋白水溶液中含有目标投递物，所述目标投递物的质量为所述白蛋白质量的0.0002～0.5倍。
进一步优选地，所述目标投递物为抗癌药物和造影剂中的至少一种。
进一步优选地，所述抗癌药物为铂及铂的类似物、紫杉醇、阿霉素、姜黄素、血卟啉、喜树碱、二氢卟吩e6、IR700碘化物和IR780中的至少一种。
进一步优选地，所述造影剂为吲哚青绿、甲氨蝶呤、美蓝、伊文思蓝、异硫蓝、专利蓝和金属纳米粒子中的至少一种。
本发明采用的二甲基亚砜、甲醇、乙醇、丙醇或叔丁醇还能提高目标投递物(如药物或造影剂)在溶液中的溶解度，使目标投递物与蛋白质充分溶解并混合均匀，且目标投递物与白蛋白分子可以充分接触，为下一步超声过程中白蛋白包载目标投递物做准备。
优选地，所述步骤(2)中，所述带巯基的还原剂为谷胱甘肽、半胱氨酸、巯基乙醇或二硫苏糖醇。
优选地，所述步骤(3)中，所述有机溶剂为甲醇、乙醇、丙醇和叔丁醇中的至少一种。
进一步优选地，所述有机溶剂中还含有二甲基亚砜、三氯甲烷、二氯甲烷和正己烷中的至少一种。
优选地，步骤(2)所述反应液在4～60℃下轻轻摇动反应，步骤(3)中步骤(2)反应后的溶液在4～60℃的条件下进行超声，所述微乳溶液在4～60℃的条件下反应5～240min，步骤(4)所述含多聚体白蛋白纳米球的悬浊液在4～60℃下进行透析。
优选地，步骤(3)所述有机溶剂加入的体积为所述步骤(2)反应后的溶液的2～50倍。
更优选地，步骤(3)所述有机溶剂加入的体积为所述步骤(2)反应后的溶液的2～20倍。
优选地，所述步骤(4)中，所述进行透析的方法为：先将步骤(3)所得的含多聚体白蛋白纳米球的悬浊液置于pH值为7～12的PBS缓冲液中透析10～300小时，然后在双蒸水内透析12小时，得到含多聚体白蛋白纳米球的溶液。
本发明采用pH值为7～12的PBS缓冲液进行透析，一方面可以去除多聚体白蛋白纳米球的悬浊液中的无机小分子等杂质，另一方面，在碱性条件下，某些存在于多聚体白蛋白纳米球之间的二硫键断开，然后和各自纳米球中的蛋白质分子形成新的二硫键，从而使得聚集的多聚体白蛋白纳米球分离，达到分散多聚体白蛋白纳米球的目的，进而形成单个的分散的多聚体白蛋白纳米球。
如本文所述的，所述单个的分散的多聚体白蛋白纳米球为粒径范围在10～1000nm之间的多聚体白蛋白纳米球。碱性条件下透析处理之前，有些多聚体白蛋白纳米球之间会团聚，导致团聚后的纳米球的粒径偏大，经过碱性条件下透析处理后，团聚的纳米球得到分散，形成粒径更小的纳米球。
本发明采用pH值为7～12的缓冲液进行透析，一方面可以去除纳米探针的悬浊液中的无机小分子等杂质，更重要的是，团聚的纳米探针在碱性条件下能分散为粒径更小的纳米球，从而获得分散、粒径均匀的多聚体白蛋白纳米球。
优选地，所述步骤(5)中，所述多聚体白蛋白纳米球中包载有目标投递物。
优选地，所述对步骤(4)所得的多聚体白蛋白纳米球溶液进行干燥脱水处理的方式为：将步骤(4)所得的多聚体白蛋白纳米球溶液置于0～-20℃下预冻1～48小时后转移至-20～-80℃下冷冻2～48小时，然后在冷冻干燥机中冷冻干燥12～120小时。
本发明提供的多聚体白蛋白纳米球的制备方法，采用了边超声边将有机溶剂(乙醇或含氯仿等非极性溶剂的乙醇)注入白蛋白溶液的超声乳化-去溶剂法的方式制备纳米球，一方面，乙醇等有机溶剂注入白蛋白溶液时能将蛋白质分子析出，与此同时，白蛋白分子间因二硫键的形成而聚集形成多聚体白蛋白纳米球。另一方面，控制好超声功率的大小和乙醇等有机溶剂的注入速度，可以控制所制备的多聚体白蛋白纳米球的粒径。这是因为，当超声功率的大，乙醇等有机溶剂的注入速度大，所得的多聚体白蛋白纳米球的粒径就小；反之，当超声功率的小，乙醇等有机溶剂的注入速度小，所得的多聚体白蛋白纳米球的粒径就大。因此，本发明提供的多聚体白蛋白纳米球的制备方法不但能获得多聚体白蛋白纳米球，而且能得到粒径可控的多聚体白蛋白纳米球，本发明提供的方法可以制备出粒径在10～1000nm之间的多聚体白蛋白纳米球。
此外，本发明提供的多聚体白蛋白纳米球的制备方法，将白蛋白水溶液和目标投递物先充分混合，使得白蛋白在包载目标投递物之前就与目标投递物充分接触，能提高白蛋白包载目标投递物的效率。
第三方面，本发明提供了如第一方面所述的多聚体白蛋白纳米球或如第二方面所述的多聚体白蛋白纳米球的制备方法在制备预防、治疗或诊断癌症的药物中的应用。
如本文所用的，“癌症”包括肿瘤。
本发明提供了的多聚体白蛋白纳米球及其制备方法和应用具有如下有益效果：
(1)本发明提供的多聚体白蛋白纳米球由不同的白蛋白分子通过分子之间二硫键相互连接形成纳米球团，在水、磷酸盐缓冲液、乙醇、血清或培养基等溶剂稀释条件下，比物理结合的白蛋白载体具有更高的稳定性；
(2)与使用化学交联剂如戊二醛等稳定的白蛋白载体相比，本发明提供的白蛋白纳米球采用了蛋白质分子本身的二硫键来获得稳定的纳米球，因此本分明提供的白蛋白纳米球更加安全；
(3)本发明提供的多聚体白蛋白纳米球的粒径为10～1000nm，且其尺寸均一，分散性好，是运载药物或造影剂等目标投递物的良好载体，有利于在患者体内长时间有效、安全、稳定地释放投递物；
(4)本发明提供的多聚体白蛋白纳米球可用于制备预防、治疗或诊断癌症的药物。
第四方面，本发明提供了一种多聚体白蛋白纳米球，所述多聚体白蛋白纳米球包括含巯基和/或二硫键的白蛋白分子，所述白蛋白分子之间通过二硫键相互连接，
所述多聚体白蛋白纳米球中包载有目标投递物；
所述目标投递物包括抗癌药物和造影剂；
所述抗癌药物包括5β,20-环氧-1,2α,4,7β,10β,13α-六羟基紫杉烷-11-烯-9-酮-4,10-二乙酸酯-2-苯甲酸酯-13[(2’R,3’S)-N-苯甲酰-3-苯基异丝氨酸酯](紫杉醇)；
所述造影剂包括2,7-双[1,3-二氢-1,1-二甲基-3-(4-磺丁基)-1,3,5-庚三烯单钠盐(吲哚菁绿)；
所述多聚体白蛋白纳米球的粒径为10～1000nm。
如本文所用的，“吲哚青绿”又称吲哚菁绿。
优选地，本发明所采用的ICG优选为医用等级的无残留碘的ICG。
如本发明所述的，“多聚体白蛋白纳米球”由白蛋白分子之间通过二硫键相互连接，由于单体白蛋白分子中含有至少一个巯基或二硫键，若该白蛋白单体分子中的巯基或二硫键在形成多聚体白蛋白纳米球时没有发生反应，则有可能保留在了多聚体白蛋白球中，因此，本发明提供的多聚体白蛋白纳米球可含有巯基、二硫键、或者同时含有巯基和二硫键，即本发明提供的多聚体白蛋白纳米球可含有巯基和/或二硫键。
优选地，所述多聚体白蛋白纳米球的粒径为60～200nm。
优选地，所述多聚体白蛋白纳米球的粒径为100～300nm。
优选地，所述多聚体白蛋白纳米球的粒径为300～500nm。
优选地，所述多聚体白蛋白纳米球的粒径为400～600nm。
优选地，所述多聚体白蛋白纳米球的粒径为100～200nm。
优选地，所述多聚体白蛋白纳米球的粒径为500～700nm。
优选地，所述多聚体白蛋白纳米球的粒径为700～1000nm。
如本文所述的，所述多聚体白蛋白纳米球中包裹目标投递物指所述多聚体白蛋白作为载体，包载所述目标投递物。
优选地，所述多聚体白蛋白包载目标投递物的方式为：部分目标投递物被所述白蛋白分子包裹，剩余部分的目标投递物镶嵌在所述白蛋白分子间。
优选地，所述紫杉醇被所述白蛋白分子包裹，所述吲哚菁绿部分被所述白蛋白分子包裹，剩余部分镶嵌在所述白蛋白分子间。
优选地，所述含巯基和/或二硫键的白蛋白分子为人血清白蛋白、牛血清白蛋白、猪血清白蛋白、重组血清白蛋白和血红蛋白中的至少一种。
优选地，所述目标投递物的质量为所述含巯基和/或二硫键的白蛋白质量的0.0002～0.5倍。
优选地，所述目标投递物的质量为所述含巯基和/或二硫键的白蛋白质量的0.0008～0.5倍。
优选地，所述目标投递物的质量为所述含巯基和/或二硫键的白蛋白质量的0.008～0.5倍。
改变多聚体白蛋白纳米球中各组分的摩尔比，可制得适合于不同药代动力学的多聚体白蛋白纳米球，本技术领域内普通技术人员可根据不同需要调整目标投递物与白蛋白的摩尔比。
白蛋白是一种生物内源性蛋白，具有可生物降解、无毒等优点，但是白蛋白在稀释条件下会溶解，在生物体内不稳定，不能有效负载药物分子进入靶器官。
本发明多聚体白蛋白包括含巯基和/或二硫键的白蛋白分子，所述白蛋白分子之间通过二硫键相互连接，多聚体白蛋白稳定性良好，可以在水溶液中稳定存在，可以作为良好的药物载体。
本发明将疏水性紫杉醇包载在亲水性的多聚体白蛋白中，可以提高紫杉醇的水溶性，有助于紫杉醇快速、有效地进入细胞以提高化学治疗的疗效。本发明多聚体白蛋白纳米球可以稳定存在于生物体内血液循环系统中，从而避免紫杉醇在血液循环系统传输过程中的无效释放；同时，由于肿瘤组织的生长失控增加了大分子类物质和脂质粒子的选择性、高通透性和滞留性(EPR效应)，为多聚体白蛋白纳米球提供了一种被动靶向肿瘤组织的能力；肿瘤组织细胞膜表面富含gp60、gp30和gp18等白蛋白受体，为多聚体白蛋白纳米球提供了一种主动靶向肿瘤组织的能力，从而提高了多聚体白蛋白纳米球的靶向性。
吲哚菁绿(ICG)是目前唯一被美国食品药品管理局(FDA)和中国食品药品监督管理总局(SFDA)批准临床使用的近红外染料，本发明提供的多聚体白蛋白纳米球中含有ICG，因此，本发明提供的多聚体白蛋白纳米球能作为荧光活体成像以及光声成像探针，具有生物相容性好，代谢途径明确等优点。
然而，作为一种有机小分子，ICG在临床应用过程中也存在不稳定、易分解、缺乏肿瘤主动靶向性等不足。
本发明采用二硫键稳定的多聚体白蛋白纳米球包载ICG，可以避免ICG在血液循环系统传输过程中的无效释放和分解，提高ICG在生物体内血液循环系统中的稳定性。
此外，ICG是一种具有近红外特征吸收峰的三碳花菁染料，在光照和氧存在下能够产生单线态氧和/或自由基而用于肿瘤的光动力学治疗，同时可将吸收的光能部分转化为热能而用于肿瘤的光热治疗，因此，本发明提供的多聚体白蛋白纳米球还可用于癌症、肿瘤的光热治疗。
所述多聚体白蛋白纳米球还具有良好的近红外荧光和光声成像能力，可用于实时、无创地监测治疗前纳米粒子在体内的输送行为，治疗后可通过成像对疗效进行实时评估，实现成像引导的治疗。
本发明多聚体白蛋白纳米球粒径较小，粒子分散性良好。
第五方面，本发明提供了一种多聚体白蛋白纳米球的制备方法，包括以下步骤：
(1)制备体积质量浓度为0.01～300mg/mL的含巯基和/或二硫键的白蛋白水溶液，并调节所述白蛋白水溶液的pH值为7～12；
其中，所述白蛋白水溶液中含有目标投递物；
所述目标投递物包括抗癌药物和造影剂；
所述抗癌药物包括5β,20-环氧-1,2α,4,7β,10β,13α-六羟基紫杉烷-11-烯-9-酮-4,10-二乙酸酯-2-苯甲酸酯-13[(2’R,3’S)-N-苯甲酰-3-苯基异丝氨酸酯]；
所述造影剂包括2,7-双[1,3-二氢-1,1-二甲基-3-(4-磺丁基)-1,3,5-庚三烯单钠盐；
(2)向步骤(1)所得的所述pH值为7～12的白蛋白水溶液中加入带巯基的还原剂得反应液，然后在0～60℃下轻轻摇动反应0.05～12小时，在所述反应液中，所述带巯基的还原剂的摩尔数为白蛋白摩尔数的10～5000倍；
(3)将步骤(2)反应后的溶液在0～60℃的条件下进行超声，所述超声的功率范围为1～100KW，同时在搅拌的条件下在所述进行超声的溶液中以0.01～1000ml/s的速度加入有机溶剂得到微乳溶液，所述微乳溶液在0～60℃的条件下反应5～240min后，静置分层，然后去除有机相，得到含多聚体白蛋白纳米球的悬浊液，其中，所述有机溶剂加入的体积为所述步骤(2)反应后的溶液的1～100倍；
(4)将步骤(3)所得的含多聚体白蛋白纳米球的悬浊液在0～60℃以及pH值为7～12的条件下进行透析，得到多聚体白蛋白纳米球溶液；
(5)将步骤(4)所得的多聚体白蛋白纳米球溶液进行干燥脱水处理，得到多聚体白蛋白纳米球，所述多聚体白蛋白纳米球包括含巯基和/或二硫键的白蛋白分子，所述白蛋白分子之间通过二硫键相互连接，
所述多聚体白蛋白纳米球中包载有目标投递物；
所述目标投递物包括抗癌药物和造影剂；
所述抗癌药物包括5β,20-环氧-1,2α,4,7β,10β,13α-六羟基紫杉烷-11-烯-9-酮-4,10-二乙酸酯-2-苯甲酸酯-13[(2’R,3’S)-N-苯甲酰-3-苯基异丝氨酸酯]；
所述造影剂包括2,7-双[1,3-二氢-1,1-二甲基-3-(4-磺丁基)-1,3,5-庚三烯单钠盐；
所述多聚体白蛋白纳米球的粒径为10～1000nm。
优选地，所述ICG与紫杉醇的质量比为1:0.02～50。
优选地，所述步骤(1)中，所述含巯基和/或二硫键的白蛋白分子为人血清白蛋白、牛血清白蛋白、猪血清白蛋白、重组血清白蛋白和血红蛋白中的至少一种。
优选地，所述步骤(1)中，所述目标投递物的质量为所述含巯基和/或二硫键的白蛋白质量的0.0002～0.5倍。
进一步优选地，所述目标投递物的质量为所述含巯基和/或二硫键的白蛋白质量的0.0008～0.5倍。
进一步优选地，所述步骤(1)中，所述目标投递物的质量为所述含巯基和/或二硫键的白蛋白质量的0.008～0.5倍。
优选地，所述步骤(2)中，所述带巯基的还原剂的摩尔数为白蛋白摩尔数的10～100倍。
优选地，所述步骤(2)中，所述带巯基的还原剂的摩尔数为白蛋白摩尔数的100～2500倍。
优选地，所述步骤(2)中，所述带巯基的还原剂为谷胱甘肽、半胱氨酸、巯基乙醇或二硫苏糖醇。
优选地，所述步骤(2)中，所述带巯基的还原剂的浓度为0.01～2mol/L。
优选地，所述步骤(3)中，所述超声的功率范围为50～100KW。
优选地，所述步骤(3)中，所述有机溶剂为甲醇、乙醇、丙醇和叔丁醇中的至少一种。
可替代的，所述步骤(3)中，所述反应后的微乳溶液可以不经过去除有机相的步骤就能得到含多聚体白蛋白纳米球的悬浊液。静置分层是当采用的有机溶剂与水互不相溶时，才需要进行静置分层，并去除掉，相反，如果采用乙醇等与水互溶的有机溶剂，是不需要静置分层，去除有机相的步骤的。
进一步优选地，所述步骤(3)中，所述有机溶剂中还含有二甲基亚砜、三氯甲烷、二氯甲烷和正己烷中的至少一种。
优选地，所述步骤(3)中，所述有机溶剂中含有目标投递物，所述目标投递物为紫杉醇和ICG。
本发明可在步骤(1)的白蛋白溶液中加入目标投递物；可替代的，还可以在步骤(3)的有机溶剂中加入目标投递物；可替代的，可以同时在步骤(1)的白蛋白溶液中，以及步骤(3)的有机溶剂中加入目标投递物。
在步骤(1)白蛋白溶液中和/或步骤(3)有机溶剂中加入紫杉醇时，可以再加入二甲基亚砜(DMSO)、甲醇、乙醇和丙醇中的一种或几种，以提高紫杉醇在白蛋白溶液/或有机溶剂中的溶解度。
优选地，所述步骤(3)中，所述有机溶剂加入的体积为所述步骤(2)反应后的溶液的2～50倍。
更优选地，所述步骤(3)中，所述有机溶剂加入的体积为所述步骤(2)反应后的溶液的2～20倍。
可替代的，本发明步骤(3)中所述的对溶液进行超声的目的是为了增加溶液中白蛋白、目标投递物的分散性，并使之充分接触，该超声步骤可以采用行业内其他混合方式，比如搅拌。
优选地，所述步骤(3)中，所述有机溶剂的速度加入为50～1000mL/s。
本发明提供的多聚体白蛋白纳米球的制备方法将有机相(有机溶剂)加入水相(白蛋白溶液)中，可替代的，也可将水相加入有机相中。
优选地，所述步骤(4)中，所述进行透析的方法为：将步骤(3)所得的含多聚体白蛋白纳米球的悬浊液置于pH值为7～12的缓冲液中透析，得到多聚体白蛋白纳米球溶液。
进一步优选地，所述步骤(4)中，所述用于透析的缓冲液的pH为9～12。
进一步优选地，所述步骤(4)中，所述用于透析的缓冲液为PBS缓冲液或Tris缓冲液。
进一步优选地，所述步骤(4)中，所述含多聚体白蛋白纳米球的悬浊液在缓冲液中的透析时间为10～300小时。
进一步优选地，所述步骤(4)中，含多聚体白蛋白纳米球的悬浊液置于pH值为7～12的缓冲液中透析后，再置于双蒸水内透析。
更进一步优选地，置于双蒸水内透析的时间为1～24小时。
本发明采用pH值为7～12的PBS缓冲液进行透析，一方面可以去除含多聚体白蛋白纳米球的悬浊液中的无机小分子等杂质，更重要的是，团聚的含多聚体白蛋白纳米球在碱性条件下能分散为粒径更小的纳米球，从而获得分散、粒径均匀的多聚体白蛋白纳米球。
本发明提供的多聚体白蛋白纳米球粒径范围在10～1000nm之间，然而，这不是同一批次制备的纳米探针的粒径分布，相反，采用本发明提供的制备方法获得的每个批次的纳米探针的粒径分布范围较窄，比如在20～250nm之间，因此，本发明制备的纳米探针的粒径比较均匀，大小可控。
优选地，所述多聚体白蛋白包载目标投递物的方式为：部分目标投递物被所述白蛋白分子包裹，剩余部分的目标投递物镶嵌在所述白蛋白分子间。
更优选地，所述紫杉醇被所述白蛋白分子包裹，所述吲哚菁绿部分被所述白蛋白分子包裹，剩余部分镶嵌在所述白蛋白分子间。
优选地，步骤(2)所述反应液在4～60℃下轻轻摇动反应，步骤(3)中步骤(2)反应后的溶液在4～60℃的条件下进行超声，所述微乳溶液在4～60℃的条件下反应5～240min，步骤(4)所述含多聚体白蛋白纳米球的悬浊液在4～60℃下进行透析。
优选地，所述步骤(5)中，所述对步骤(4)所得的多聚体白蛋白纳米球溶液进行干燥脱水处理的方式为冷冻干燥、喷雾干燥或减压蒸馏。
进一步优选地，所述步骤(5)中，所述冷冻干燥的步骤为：将步骤(4)所得的多聚体白蛋白纳米球溶液置于0～-20℃下预冻1～48小时后转移至-20～-80℃下冷冻2～48小时,然后在冷冻干燥机中冷冻干燥12～120小时。
本发明通过控制白蛋白和还原剂的摩尔比，白蛋白和目标投递物的摩尔比，各步骤的pH，尤其是透析缓冲液的pH，以及有机相和水相混合的速度获得了粒径小、粒径分布范围较窄、粒径可控的多聚体白蛋白纳米球。
本发明第五方面制得的多聚体白蛋白纳米球具有以下有益效果：
(1)无残留：采用多聚体白蛋白为载体，ICG为光学试剂，紫杉醇为化疗药物，三者均具有安全无毒、无免疫原性、可生物降解、生物相容性好等优点。多聚体白蛋白分子间以二硫键连接，该粒子可以稳定存在于生物体内血液循环系统中，从而避免ICG和紫杉醇在血液循环系统传输过程中的无效释放，并在细胞中还原型谷胱甘肽(GSH)的作用下降解并释放出单体白蛋白、ICG和紫杉醇，白蛋白在体内通过自然的新陈代谢进行降解，从而不会在体内引入任何外源性物质；
(2)靶向性好：一方面，肿瘤组织的生长失控增加了大分子类物质和脂质粒子的选择性、高通透性和滞留性(EPR效应)，为多聚体白蛋白纳米球提供了一种被动靶向肿瘤组织的能力；另一方面，肿瘤组织细胞膜表面富含gp60、gp30、gp18等白蛋白受体，为多聚体白蛋白纳米球提供了一种主动靶向肿瘤组织的能力。二者的结合，提高了多聚体白蛋白纳米球的靶向性；
(3)可视化：多聚体白蛋白纳米球同时具有良好的近红外荧光和光声成像能力，可用于实时、无创地监测治疗前纳米粒子体内输送行为，治疗后可通过成像对疗效进行实时评估，实现成像引导的治疗。
本发明采用吲哚菁绿为近红外荧光-光声层析分子成像造影剂和热疗药物，采用紫杉醇作为化疗药物，得到了多聚体白蛋白纳米球，该多聚体白蛋白纳米球是一种近红外荧光-光声层析分子成像探针、化疗和热疗于一体的多功能靶向探针，其中光声层析分子成像具有更高的空间分辨率，近红外荧光成像具有更高的灵敏性，将近红外荧光和光声层析分子成像结合可以提高成像的灵敏性和空间分辨率，将化疗和热疗结合在一起可以提高抗肿瘤效果，本发明有助于推动成像引导光学治疗和化疗热疗联合治疗的研究与发展，同时为癌症的临床诊断和治疗提供新理论和新方法。
本发明制备方法简单，反应条件温和，反应重现性良好，制得的多聚体白蛋白纳米球粒径小，分散性好。
第六方面，本发明提供了如第四方面所述的多聚体白蛋白纳米球或如第五方面所述的多聚体白蛋白纳米球的制备方法在制备预防、治疗或诊断癌症的药物中的应用。
优选地，所述应用为多聚体白蛋白纳米球或多聚体白蛋白纳米球的制备方法在制备肿瘤光动力治疗药物、肿瘤光热治疗药物、荧光成像探针和光声成像探针中的应用。
如本文所用的，“癌症”包括肿瘤。
附图说明
图1为本发明实施例一制得的多聚体白蛋白纳米球的扫描电子显微镜图像；
图2为本发明实施例一制得的多聚体白蛋白纳米球的透射电镜图像；
图3为本发明实施例一制得的多聚体白蛋白纳米球在不同溶剂中的稀释实验；
图4为本发明实施例一制得的多聚体白蛋白纳米球在还原型条件下溶解实验；
图5为实施例八制得的多聚体白蛋白纳米球的扫描电子显微镜图像；
图6为实施例八制得的多聚体白蛋白纳米球注射入荷瘤裸鼠后的荧光和光声成像图；
图7为注射实施例八制备的多聚体白蛋白纳米球的肿瘤切片图。
具体实施方式
以下所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。
实施例一
一种多聚体白蛋白纳米球的制备方法，包括以下步骤：
(1)取1mL体积质量浓度为0.01(w/v，mg/mL)的吲哚青绿的二甲基亚砜溶液和1mL体积质量浓度为0.02(w/v，mg/mL)的牛血清白蛋白混合，得到白蛋白混合液，然后采用0.1mol/L的NaOH溶液调节所述白蛋白混合液的pH值到7；
(2)向步骤(1)所得的所述pH值为7的白蛋白混合液中加入谷胱甘肽得反应液，然后在0℃下轻轻摇动反应1小时，在所述反应液中，所述谷胱甘肽的摩尔数为白蛋白摩尔数的10倍；
(3)将步骤(2)反应后的溶液在0℃的条件下进行超声，超声功率为100KW，同时在所述进行超声的溶液中以1000mL/s的速度注入的4mL无水乙醇得到微乳溶液，所述微乳溶液在0℃的条件下反应5min后，得到含多聚体白蛋白纳米球的悬浊液；
(4)将步骤(3)所得的含多聚体白蛋白纳米球的悬浊液移入透析袋，保持温度为0℃的条件下，将透析袋置于5L pH为10的PBS缓冲液内透析10小时，期间每12个小时换液1次，每次都采用5L pH为10的PBS缓冲液，然后再将透析袋置于5L双蒸水内透析1小时，得到多聚体白蛋白纳米球溶液；
(5)将步骤(4)所得的多聚体白蛋白纳米球溶液置于负20℃下预冻2小时后转移至负80℃下冷冻12小时，然后在冷冻干燥机中冷冻干燥12小时，得到多聚体白蛋白纳米球，所述多聚体白蛋白纳米球包括含巯基和/或二硫键的白蛋白分子，所述白蛋白分子之间通过二硫键相互连接，所述多聚体白蛋白纳米球的粒径为10～100nm。
为充分说明本发明实施例制备的多聚体白蛋白纳米球的有益效果，本实施例还提供了该多聚体白蛋白纳米球的扫描电子显微镜图像，如图1所示，图1为本发明实施例一制得的多聚体白蛋白纳米球的扫描电子显微镜图像，由该图像可知，本实施例制备的多聚体白蛋白纳米球尺寸均一，颗粒较为分散。
本实施例还提供了该多聚体白蛋白纳米球的透射电镜图像，如图2所示，图2为本发明实施例一制得的多聚体白蛋白纳米球的透射电镜图像，由该图像可知，本实施例制备的多聚体白蛋白纳米球的粒径为10～100nm，尺寸均一，颗粒较为分散。
此外，本实施例还提供了该多聚体白蛋白纳米球在不同溶剂中的稀释实验，具体操作为：将该多聚体白蛋白纳米球溶液分别溶解在磷酸盐缓冲液(pH为7.4)、血清(pH为7.4)和细胞培养基(pH为7.4)中，随后在不同的时间点取样观察该多聚体白蛋白纳米球的粒径，结果如图3所示。
图3为本发明实施例一制得的多聚体白蛋白纳米球在不同溶剂中的稀释实验，由图3可知：该多聚体白蛋白纳米球在磷酸盐缓冲液、血清和细胞培养基中的粒径随时间变化不明显，即本发明提供的多聚体白蛋白纳米球能在接近生理条件下的稀释实验中稳定存在，具有医学应用前景。
其次，本实施例还提供了该多聚体白蛋白纳米球在还原型条件下的溶解实验，具体操作为：将该多聚体白蛋白纳米球溶液分别溶解在浓度为20mM的二硫苏糖醇，2小时，8小时和24小时后，分别跑SDS-PAGE电泳，检测该多聚体白蛋白纳米球在还原型条件下的溶解规律，其中，a、b、c泳道分别对应多聚体白蛋白纳米球在还原2小时、8小时、24小时后的样品，d泳道为白蛋白单体分子的对照，结果如图4所示。
图4为本发明实施例一制得的多聚体白蛋白纳米球在还原型条件下溶解实验，由图4可知，框1中的条带为本实施例制备的多聚体白蛋白纳米球，框2中的条带为组成该多聚体白蛋白纳米球的白蛋白低聚物的条带，框3中的条带为组成该多聚体白蛋白纳米球的白蛋白二聚体和三聚体的条带，框4中的条带为组成该多聚体白蛋白纳米球的白蛋白单分子的条带；该结果显示，即白蛋白二聚体和三聚体对应的框3中的条带浓度随还原时间的延长而升高，此外，蛋白质单体对应的框4中的条带浓度随还原时间的延长也有明显的提高；即本实施例提供的该多聚体白蛋白纳米球可以在还原剂存在的条件下溶解，并随还原时间的延长，其二硫键被还原的程度越高，因此，当采用该多聚体白蛋白纳米球进行药物投递时，可以被细胞中的还原性谷胱甘肽等还原性物质降解，从而释放药物。
实施例二
一种多聚体白蛋白纳米球的制备方法，包括以下步骤：
(1)取0.1mL体积质量浓度为0.1(w/v，mg/mL)阿霉素的二甲基亚砜溶液和2mL体积质量浓度为300(w/v，mg/mL)的猪血清白蛋白混合，得到白蛋白混合液，然后采用1mol/L的NaOH溶液调节所述白蛋白混合液的pH值到7；
(2)向步骤(1)所得的所述pH值为7的白蛋白混合液中加入二硫苏糖醇得反应液，然后在60℃下轻轻摇动反应0.05小时，在所述反应液中，所述二硫苏糖醇的摩尔数为白蛋白摩尔数的5000倍；
(3)将步骤(2)反应后的溶液在60℃的条件下进行超声，超声功率为1KW，同时在所述进行超声的溶液中以0.01ml/s的速度注入的200mL乙醇溶液得到微乳溶液，所述微乳溶液在60℃的条件下反应20min后，得到含多聚体白蛋白纳米球的悬浊液；
(4)将步骤(3)所得的含多聚体白蛋白纳米球的悬浊液移入透析袋，保持温度为30℃的条件下，将透析袋置于1L pH为7的PBS缓冲液内透析300小时，期间每12个小时换液1次，每次都采用1L pH为7的PBS缓冲液，然后再将透析袋置于5L双蒸水内透析24小时，得到多聚体白蛋白纳米球溶液，
(5)将步骤(4)所得的多聚体白蛋白纳米球溶液置于0℃下预冻1小时后转移至负20℃下冷冻2小时,然后在冷冻干燥机中冷冻干燥72小时,得到多聚体白蛋白纳米球，所述多聚体白蛋白纳米球包括含巯基和/或二硫键的白蛋白分子，所述白蛋白分子之间通过二硫键相互连接，所述多聚体白蛋白纳米球的粒径为900～1000nm。
实施例三
一种多聚体白蛋白纳米球的制备方法，包括以下步骤：
(1)取0.5mL体积质量浓度为0.5(w/v，mg/mL)美篮的水溶液和1.5mL200(w/v，mg/mL)的重组血清白蛋白混合，得到白蛋白混合液，然后采用2mol/L的NaOH溶液调节所述白蛋白混合液的pH值到12；
(2)向步骤(1)所得的所述pH值为12的白蛋白混合液中加入β-巯基乙醇得反应液，然后在30℃下轻轻摇动反应12小时，在所述反应液中，所述β-巯基乙醇的摩尔数为白蛋白摩尔数的100倍；
(3)将步骤(2)反应后的溶液在30℃的条件下进行超声，超声功率为100KW，同时在所述进行超声的溶液中以1000ml/s的速度注入的100mL乙醇溶液得到微乳溶液，所述微乳溶液在30℃的条件下反应240min后，得到含多聚体白蛋白纳米球的悬浊液；
(4)将步骤(3)所得的含多聚体白蛋白纳米球的悬浊液移入透析袋，保持温度为60℃的条件下，将透析袋置于1L pH为12的PBS缓冲液内透析144小时，每次都采用1L pH为12的PBS缓冲液，期间每12个小时换液1次，然后再将透析袋置于5L双蒸水内透析12小时，得到多聚体白蛋白纳米球溶液，
(5)将步骤(4)所得的多聚体白蛋白纳米球溶液置于负4℃下预冻48小时后转移至负50℃下冷冻48小时,然后在冷冻干燥机中冷冻干燥96小时,得到多聚体白蛋白纳米球，所述多聚体白蛋白纳米球包括含巯基和/或二硫键的白蛋白分子，所述白蛋白分子之间通过二硫键相互连接，所述多聚体白蛋白纳米球的粒径为100～200nm。
实施例四
一种多聚体白蛋白纳米球的制备方法，包括以下步骤：
(1)取1mL体积质量浓度为1(w/v，mg/mL)二氢卟吩e6溶液的二甲基亚砜溶液和1mL300(w/v，mg/mL)的血红蛋白溶液混合，得到白蛋白混合液，然后采用0.5mol/L的NaOH溶液调节所述白蛋白混合的pH值到9；
(2)向步骤(1)所得的所述pH值为9的白蛋白混合液中加入谷胱甘肽得反应液，然后在60℃下轻轻摇动反应0.05小时，在所述反应液中，所述谷胱甘肽的摩尔数为白蛋白摩尔数的2500倍；
(3)将步骤(2)反应后的溶液在60℃的条件下进行超声，超声功率为10KW，同时在所述进行超声的溶液中以50ml/s的速度注入的22mL乙醇溶液得到微乳溶液，所述微乳溶液在60℃的条件下反应30min后，得到含多聚体白蛋白纳米球的悬浊液；
(4)将步骤(3)所得的含多聚体白蛋白纳米球的悬浊液移入透析袋，保持温度为60℃的条件下，将透析袋置于1L pH为9的PBS缓冲液内透析36小时，期间每12个小时换液1次，每次都采用1L pH为9的PBS缓冲液，然后再将透析袋置于5L双蒸水内透析18小时，得到多聚体白蛋白纳米球溶液，
(5)将步骤(4)所得的多聚体白蛋白纳米球溶液置于负10℃下预冻24小时后转移至负80℃下冷冻24小时,然后在冷冻干燥机中冷冻干燥120小时,得到多聚体白蛋白纳米球，所述多聚体白蛋白纳米球包括含巯基和/或二硫键的白蛋白分子，所述白蛋白分子之间通过二硫键相互连接，所述多聚体白蛋白纳米球的粒径为600～700nm。
实施例五
一种多聚体白蛋白纳米球的制备方法，包括以下步骤：
(1)取2mL体积质量浓度为0.01(w/v，mg/mL)的猪血清白蛋白溶液，然后采用1mol/L的NaOH溶液调节所述白蛋白混合液的pH值到7；
(2)向步骤(1)所得的所述pH值为7的白蛋白混合液中加入半胱氨酸得反应液，然后在60℃下轻轻摇动反应0.05小时，在所述反应液中，所述半胱氨酸的摩尔数为白蛋白摩尔数的10倍；
(3)将步骤(2)反应后的溶液在60℃的条件下进行超声，超声功率为1KW，同时在所述进行超声的溶液中以50ml/s的速度注入的4mL乙醇溶液得到微乳溶液，所述微乳溶液在60℃的条件下反应20min后，得到含多聚体白蛋白纳米球的悬浊液；
(4)将步骤(3)所得的含多聚体白蛋白纳米球的悬浊液移入透析袋，保持温度为30℃的条件下，将透析袋置于1L pH为7的PBS缓冲液内透析10小时，期间每12个小时换液1次，每次都采用1L pH为7的PBS缓冲液，然后再将透析袋置于5L双蒸水内透析1小时，得到多聚体白蛋白纳米球溶液，
(5)将步骤(4)所得的多聚体白蛋白纳米球溶液置于0℃下预冻1小时后转移至负20℃下冷冻2小时,然后在冷冻干燥机中冷冻干燥12小时,得到多聚体白蛋白纳米球，所述多聚体白蛋白纳米球包括含巯基和/或二硫键的白蛋白分子，所述白蛋白分子之间通过二硫键相互连接，所述多聚体白蛋白纳米球的粒径为700～800nm。
实施例六
一种多聚体白蛋白纳米球的制备方法，包括以下步骤：
(1)取2mL300(w/v，mg/mL)的重组血清白蛋白溶液，然后采用2mol/L的NaOH溶液调节所述白蛋白混合液的pH值到12；
(2)向步骤(1)所得的所述pH值为12的白蛋白混合液中加入二硫苏糖醇得反应液，然后在30℃下轻轻摇动反应12小时，在所述反应液中，所述二硫苏糖醇的摩尔数为白蛋白摩尔数的5000倍；
(3)将步骤(2)反应后的溶液在30℃的条件下进行超声，超声功率为100KW，同时在所述进行超声的溶液中以1000ml/s的速度注入的200mL乙醇溶液得到微乳溶液，所述微乳溶液在30℃的条件下反应240min后，得到含多聚体白蛋白纳米球的悬浊液；
(4)将步骤(3)所得的含多聚体白蛋白纳米球的悬浊液移入透析袋，保持温度为60℃的条件下，将透析袋置于1L pH为12的PBS缓冲液内透析300小时，每次都采用1L pH为12的PBS缓冲液，期间每12个小时换液1次，然后再将透析袋置于5L双蒸水内透析24小时，得到多聚体白蛋白纳米球溶液，
(5)将步骤(4)所得的多聚体白蛋白纳米球溶液置于负4℃下预冻48小时后转移至负80℃下冷冻36小时,然后在冷冻干燥机中冷冻干燥96小时,得到多聚体白蛋白纳米球，所述多聚体白蛋白纳米球包括含巯基和/或二硫键的白蛋白分子，所述白蛋白分子之间通过二硫键相互连接，所述多聚体白蛋白纳米球的粒径为10～100nm。
实施例七
一种多聚体白蛋白纳米球的制备方法，包括以下步骤：
(1)取2mL150(w/v，mg/mL)的白蛋白溶液，然后采用2mol/L的NaOH溶液调节所述白蛋白混合液的pH值到9；
(2)向步骤(1)所得的所述pH值为9的白蛋白混合液中加入β-巯基乙醇得反应液，然后在0℃下轻轻摇动反应17小时，在所述反应液中，所述β-巯基乙醇的摩尔数为白蛋白摩尔数的2500倍；
(3)将步骤(2)反应后的溶液在0℃的条件下进行超声，超声功率为10KW，同时在所述进行超声的溶液中以0.01ml/s的速度注入的100mL乙醇溶液得到微乳溶液，所述微乳溶液在0℃的条件下反应5min后，得到含多聚体白蛋白纳米球的悬浊液；
(4)将步骤(3)所得的含多聚体白蛋白纳米球的悬浊液移入透析袋，保持温度为0℃的条件下，将透析袋置于1L pH为9的PBS缓冲液内透析144小时，每次都采用1L pH为12的PBS缓冲液，期间每12个小时换液1次，然后再将透析袋置于5L双蒸水内透析12小时，得到多聚体白蛋白纳米球溶液，
(5)将步骤(4)所得的多聚体白蛋白纳米球溶液置于负20℃下预冻24小时后转移至负50℃下冷冻48小时,然后在冷冻干燥机中冷冻干燥120小时,得到多聚体白蛋白纳米球，所述多聚体白蛋白纳米球包括含巯基和/或二硫键的白蛋白分子，所述白蛋白分子之间通过二硫键相互连接，所述多聚体白蛋白纳米球的粒径为700～900nm。
对比实施例一
一种多聚体白蛋白纳米球的制备方法，包括以下步骤：
(1)取2mL0.01(w/v，mg/mL)的牛血清白蛋白溶液；
(2)向步骤(1)所得的牛血清白蛋白水溶液中加入半胱氨酸得反应液，然后在60℃下轻轻摇动反应0.05小时，在所述反应液中，所述半胱氨酸的摩尔数为白蛋白摩尔数的10倍；
(3)在所述步骤(2)所得的溶液中加入10mL无水乙醇溶液得到微乳溶液，所述微乳溶液在0℃的条件下反应10min后，得到含多聚体白蛋白纳米球的悬浊液；
(4)将步骤(3)所得的含多聚体白蛋白纳米球的悬浊液移入透析袋，保持温度为25℃的条件下，将透析袋置于5L双蒸水内透析12小时，得到多聚体白蛋白纳米球溶液，
(5)将步骤(4)所得的多聚体白蛋白纳米球溶液置于负20℃下预冻2小时后转移至负80℃下冷冻24小时,然后在冷冻干燥机中冷冻干燥48小时,得到多聚体白蛋白纳米球，所述多聚体白蛋白纳米球包括含巯基和/或二硫键的白蛋白分子，所述白蛋白分子之间通过二硫键相互连接，所述多聚体白蛋白纳米球的粒径为10～600nm。
对比实施例二
一种多聚体白蛋白纳米球的制备方法，包括以下步骤：
(1)取1mL体积质量浓度为1(w/v，mg/mL)的吲哚青绿和1mL300(w/v，mg/mL)的牛血清白蛋白混合，得到白蛋白混合液；
(2)向步骤(1)所得的白蛋白混合液中加入谷胱甘肽得反应液，然后在60℃下轻轻摇动反应0.05小时，在所述反应液中，所述谷胱甘肽的摩尔数为白蛋白摩尔数的5000倍；
(3)在所述步骤(2)所得的溶液中加入10mL无水乙醇溶液得到微乳溶液，所述微乳溶液在0℃的条件下反应10min后，得到含多聚体白蛋白纳米球的悬浊液；
(4)将步骤(3)所得的含多聚体白蛋白纳米球的悬浊液移入透析袋，保持温度为25℃的条件下，将透析袋置于5L双蒸水内透析12小时，得到多聚体白蛋白纳米球溶液，
(5)将步骤(4)所得的多聚体白蛋白纳米球溶液置于负20℃下预冻2小时后转移至负80℃下冷冻24小时,然后在冷冻干燥机中冷冻干燥48小时,得到多聚体白蛋白纳米球，所述多聚体白蛋白纳米球包括含巯基和/或二硫键的白蛋白分子，所述白蛋白分子之间通过二硫键相互连接，所述多聚体白蛋白纳米球的粒径为100～1000nm。
相对于本发明实施例提供的多聚体白蛋白纳米球，对比实施例1和对比实施例2提供的多聚体白蛋白纳米球粒径分布集中度不高，不利于其在生物医学上的应用。
实施例八
一种多聚体白蛋白纳米球的制备方法，包括以下步骤：
(1)取体积质量浓度为50mg/mL(w/v)的牛血清白蛋白水溶液，然后采用0.1mol/L的NaOH溶液调节所述白蛋白水溶液的pH值到7；
(2)向步骤(1)所得的所述pH值为7的白蛋白水溶液中加入谷胱甘肽得反应液，然后在4℃下轻轻摇动反应2小时，在所述反应液中，所述谷胱甘肽的摩尔数为白蛋白摩尔数的10倍；
(3)将步骤(2)反应后的溶液在4℃的条件下进行超声，超声功率为100KW，同时在所述进行超声的溶液中以1000mL/s的速度注入乙醇溶液，该乙醇溶液中含浓度为1mg/mL的紫杉醇和浓度为1mg/mL的ICG，得到微乳溶液，该微乳溶液在4℃的条件下反应10min后得到含多聚体白蛋白纳米球的悬浊液；乙醇溶液加入的体积为所述步骤(2)反应后的溶液体积的2倍；
(4)将步骤(3)所得的含多聚体白蛋白纳米球的悬浊液移入透析袋，保持温度为4℃的条件下，将透析袋置于1L pH为9的PBS缓冲液内透析24小时，期间每8个小时换液1次，每次都采用1L pH为9的PBS缓冲液，然后再将透析袋置于1L双蒸水内透析12小时，得到多聚体白蛋白纳米球溶液；
(5)将步骤(4)所得的多聚体白蛋白纳米球溶液置于负20℃下预冻2小时后转移至负80℃下冷冻24小时，然后在冷冻干燥机中冷冻干燥48小时，得到多聚体白蛋白纳米球，所述多聚体白蛋白纳米球中包载有目标投递物；所述目标投递物包括紫杉醇和ICG；多聚体白蛋白包括含巯基和/或二硫键的白蛋白分子，白蛋白之间通过二硫键相互连接，多聚体白蛋白纳米球的粒径为100～200nm。
图5为实施例8所得到的多聚体白蛋白纳米球的扫描电镜图，从图中可以看出，多聚体白蛋白纳米球的粒径范围为100nm～200nm，粒径较小且纳米粒子分散性良好。
实施例九
一种多聚体白蛋白纳米球的制备方法，包括以下步骤：
(1)取白蛋白混合液，白蛋白混合液含有浓度为300mg/mL(w/v)的猪血清白蛋白和浓度为0.1mg/mL的ICG，然后采用10mol/L的NaOH溶液调节所述白蛋白混合液的pH值到12；
(2)向步骤(1)所得的所述pH值为12的白蛋白混合液中加入二硫苏糖醇得反应液，然后在60℃下轻轻摇动反应240小时，在所述反应液中，所述二硫苏糖醇的摩尔数为白蛋白摩尔数的5000倍；
(3)将步骤(2)反应后的溶液在60℃的条件下进行超声，超声功率为1KW，同时在所述进行超声的溶液中以1000ml/s的速度注入乙醇溶液，乙醇溶液中含体积质量浓度为0.1mg/mL的紫杉醇和体积质量浓度为2mg/mL的ICG，得到微乳溶液，所述微乳溶液在60℃的条件下反应5min后，得到含多聚体白蛋白纳米球的悬浊液；乙醇溶液加入的体积为所述步骤(2)反应后的溶液体积的50倍；
(4)将步骤(3)所得的含多聚体白蛋白纳米球的悬浊液移入透析袋，室温下，将透析袋置于5L pH为12的PBS缓冲液内透析300小时，期间每12个小时换液1次，每次都采用5L pH为12的PBS缓冲液，然后再将透析袋置于5L双蒸水内透析12小时，得到多聚体白蛋白纳米球溶液；
(5)将步骤(4)所得的多聚体白蛋白纳米球溶液置于0℃下预冻1小时后转移至负20℃下冷冻2小时，然后在冷冻干燥机中冷冻干燥72小时，得到多聚体白蛋白纳米球，所述多聚体白蛋白纳米球中包载有目标投递物；所述目标投递物包括紫杉醇和ICG；多聚体白蛋白包括含巯基和/或二硫键的白蛋白分子，白蛋白分子之间通过二硫键相互连接，多聚体白蛋白纳米球的粒径为300～500nm。
实施例十
一种多聚体白蛋白纳米球的制备方法，包括以下步骤：
(1)取白蛋白混合液，白蛋白混合液含有浓度为200mg/mL(w/v)的猪血清白蛋白和浓度为5mg/mL的ICG，然后采用0.1mol/L的NaOH溶液调节所述白蛋白水溶液的pH值到9；
(2)向步骤(1)所得的所述pH值为9的白蛋白混合液中加入β-巯基乙醇得反应液，然后在30℃下轻轻摇动反应0.05小时，在所述反应液中，所述β-巯基乙醇的摩尔数为白蛋白摩尔数的100倍；
(3)将步骤(2)反应后的溶液在30℃的条件下进行超声，超声功率为50KW，同时在所述进行超声的溶液中以0.01ml/s的速度注入乙醇溶液，乙醇溶液中含体积质量浓度为1mg/mL的紫杉醇，得到微乳溶液，所述微乳溶液在30℃的条件下反应240min后，得到含多聚体白蛋白纳米球的悬浊液；乙醇溶液加入的体积为步骤(2)反应后的溶液体积的50倍；
(4)将步骤(3)所得的含多聚体白蛋白纳米球的悬浊液移入透析袋，保持温度为60℃的条件下，将透析袋置于100mL pH为7的PBS缓冲液内透析2小时，每次都采用100mL pH为7的PBS缓冲液，期间每1个小时换液1次，然后再将透析袋置于100mL双蒸水内透析12小时，得到多聚体白蛋白纳米球溶液；
(5)将步骤(4)所得的多聚体白蛋白纳米球溶液置于负4℃下预冻48小时后转移至负50℃下冷冻48小时,然后在冷冻干燥机中冷冻干燥96小时，得到多聚体白蛋白纳米球，所述多聚体白蛋白纳米球中包载有目标投递物；所述目标投递物包括紫杉醇和ICG；多聚体白蛋白包括含巯基和/或二硫键的白蛋白分子，白蛋白分子之间通过二硫键相互连接，多聚体白蛋白纳米球的粒径为400～600nm。
实施例十一
(1)取白蛋白混合液，白蛋白混合液含有浓度为100mg/mL(w/v)的猪血清白蛋白、浓度为1mg/mL的ICG、浓度为1mg/mL的紫杉醇和DMSO，二甲基亚砜和白蛋白混合液中溶剂水的体积比是0.1:1，然后采用0.1mol/L的NaOH溶液调节混合液的pH值到9；
(2)向步骤(1)混合液中加入谷胱甘肽得反应液，然后在30℃下轻轻摇动反应1小时，在反应液中，谷胱甘肽的摩尔数为白蛋白摩尔数的10倍；
(3)将步骤(2)反应后的溶液在4℃的条件下进行超声，超声功率为100KW，同时将进行超声的溶液中以50mL/s的速度注入到无水乙醇中，得到微乳溶液，所述微乳溶液在4℃的条件下反应10min后，得到含多聚体白蛋白纳米球的悬浊液；无水乙醇加入的体积为步骤(2)反应后的溶液体积的50倍；
(4)将步骤(3)所得的含多聚体白蛋白纳米球的悬浊液移入透析袋，保持温度为4℃的条件下，将透析袋置于100mL pH为7的PBS缓冲液内透析2小时，期间每1个小时换液1次，每次都采用100mL pH为7的PBS缓冲液，然后再将透析袋置于100mL双蒸水内透析12小时，得到多聚体白蛋白纳米球溶液；
(5)将步骤(4)所得的多聚体白蛋白纳米球溶液置于负20℃下预冻2小时后转移至负80℃下冷冻24小时，然后在冷冻干燥机中冷冻干燥48小时，得到多聚体白蛋白纳米球，所述多聚体白蛋白纳米球中包载有目标投递物；所述目标投递物包括紫杉醇和ICG；多聚体白蛋白包括含巯基和/或二硫键的白蛋白分子，白蛋白分子之间通过二硫键相互连接，多聚体白蛋白纳米球的粒径为200～300nm。
实施例十二
(1)取白蛋白混合液，白蛋白混合液含有浓度为200mg/mL(w/v)的猪血清白蛋白和浓度为1mg/mL的紫杉醇和DMSO，二甲基亚砜和白蛋白混合液中溶剂水的体积比是0.1:1，然后采用0.1mol/L的NaOH溶液调节混合液的pH值到9；
(2)向步骤(1)所得混合液中加入谷胱甘肽得反应液，然后在30℃下轻轻摇动反应1小时，在所述反应液中，所述谷胱甘肽的摩尔数为白蛋白摩尔数的10倍；
(3)将步骤(2)反应后的溶液在4℃的条件下进行超声，超声功率为100KW，同时将进行超声的溶液中以0.01mL/s的速度注入到乙醇溶液中，该乙醇溶液含体积质量浓度为1mg/mL的ICG和乙醇，得到微乳溶液，所述微乳溶液在4℃的条件下反应10min后，得到含多聚体白蛋白纳米球的悬浊液；乙醇溶液加入的体积为步骤(2)反应后的溶液体积的20倍；
(4)将步骤(3)所得的含多聚体白蛋白纳米球的悬浊液移入透析袋，保持温度为0℃的条件下，将透析袋置于100mL pH为7的PBS缓冲液内透析2小时，期间每1个小时换液1次，每次都采用100mL pH为7的PBS缓冲液，然后再将透析袋置于100mL双蒸水内透析12小时，得到多聚体白蛋白纳米球溶液；
(5)将步骤(4)所得的多聚体白蛋白纳米球溶液置于负20℃下预冻2小时后转移至负80℃下冷冻24小时，然后在冷冻干燥机中冷冻干燥48小时,得到多聚体白蛋白纳米球，所述多聚体白蛋白纳米球中包载有目标投递物；所述目标投递物包括紫杉醇和ICG；多聚体白蛋白包括含巯基和/或二硫键的白蛋白分子，白蛋白分子之间通过二硫键相互连接，多聚体白蛋白纳米球的粒径为300～400nm。
应用实施例
为了验证本发明实施例提供的多聚体白蛋白纳米球在制备预防、治疗或诊断癌症的药物中的应用效果，本应用实施例以MCF-7荷瘤小鼠为模型，通过尾静脉注射实施例8制备的多聚体白蛋白纳米球水溶液，研究多聚体白蛋白纳米球在小鼠体内的传输过程及对乳腺癌肿瘤组织识别的特异性和灵敏度，并设置不同的实验组验证实施例提供的多聚体白蛋白纳米球抑制肿瘤生长的效果，结果见图6和图7。
以MCF-7荷瘤小鼠为模型，通过尾静脉注射实施例8制备的多聚体白蛋白纳米球水溶液(浓度为0.2mg/mL)，然后利用利用荧光活体成像系统(型号MaestroTM2MaestroTMEX-RRO，公司为美国CRi MaestroTM)和光声成像平台(光源为可调谐光学参量振荡器，波长范围从400nm-2500nm，型号Vibrant355II HE,Opotek,Carlsbad，USA，光源脉冲重复频率10Hz，脉宽5ns；超声探头中心频率10MHz，型号V315,Panametrics，Waltham，US)来研究多聚体白蛋白纳米球在小鼠体内的传输过程及对乳腺癌肿瘤组织识别的特异性和灵敏度，图6为实施例8制得的多聚体白蛋白纳米球用于荷瘤裸鼠肿瘤组织的荧光和光声成像图，图6中，a和c图分别为没有注射多聚体白蛋白纳米球的荧光成像图和光声成像图，b和d图分别为注射有多聚体白蛋白纳米球的荧光成像图和光声成像图，从图6中可以看出，没有注射多聚体白蛋白纳米球时肿瘤部位均没有荧光和光声信号，注射有多聚体白蛋白纳米球的荷瘤小鼠24h后肿瘤部位的荧光和光声信号得以增强，说明多聚体白蛋白纳米球对肿瘤组织具有很强的靶向性。
图7为注射实施例8制备的多聚体白蛋白纳米球的肿瘤切片图，其中，图7中a为注射有空白白蛋白纳米粒子(浓度为0.2mg/ml)的肿瘤切片图(空白白蛋白纳米粒子没有包载目标投递物，制备方法可参考实施例5，空白白蛋白纳米粒子的注射量为每1kg小鼠注射2mg空白白蛋白纳米粒子)，图b为仅包含紫杉醇的多聚体白蛋白纳米球(浓度为0.2mg/ml)的切片图(仅包含紫杉醇的多聚体白蛋白纳米球的制备方法可参考实施例8，制备过程中不加入ICG，紫杉醇的注射量为2mg/kg，即每1kg小鼠注射含有2mg紫杉醇的多聚体白蛋白纳米球)，图c为注射实施例8制备的多聚体白蛋白纳米球水溶液(浓度为0.2mg/ml)的肿瘤切片图(紫杉醇的注射量为1mg/kg，ICG的注射量为1mg/kg，即每1kg小鼠注射含有1mg紫杉醇和1mgICG的多聚体白蛋白纳米球)，对荷瘤老鼠进行治疗，注射24小时后采用808nm的激光照射5min，48小时取老鼠的肿瘤进行切片，并进行HE染色(苏木精-伊红染色)，从图中可以看出，相比于图a和图b，只有c中肿瘤组织大量坏死。本发明多聚体白蛋白纳米球的肿瘤抑制效果要好于仅包含紫杉醇的多聚体白蛋白纳米球。
综上，本发明实施例提供的多聚体白蛋白纳米球是一种近红外荧光-光声层析分子成像探针、化疗和热疗于一体的多功能靶向探针，化疗和热疗结合在一起可以提高抗肿瘤效果。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种多聚体白蛋白纳米球，其特征在于，所述多聚体白蛋白纳米球包括含巯基和/或二硫键的白蛋白分子，所述白蛋白分子之间通过二硫键相互连接，
所述多聚体白蛋白纳米球中包载有目标投递物；
所述目标投递物包括抗癌药物和造影剂；
所述抗癌药物包括5β,20-环氧-1,2α,4,7β,10β,13α-六羟基紫杉烷-11-烯-9-酮-4,10-二乙酸酯-2-苯甲酸酯-13[(2’R,3’S)-N-苯甲酰-3-苯基异丝氨酸酯]；
所述造影剂包括2,7-双[1,3-二氢-1,1-二甲基-3-(4-磺丁基)-1,3,5-庚三烯单钠盐；
所述多聚体白蛋白纳米球的粒径为10～1000nm。
2.如权利要求1所述的一种多聚体白蛋白纳米球，其特征在于，所述含巯基和/或二硫键的白蛋白分子为人血清白蛋白、牛血清白蛋白、猪血清白蛋白、重组血清白蛋白和血红蛋白中的至少一种。
3.一种多聚体白蛋白纳米球的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)制备体积质量浓度为0.01～300mg/mL的含巯基和/或二硫键的白蛋白水溶液，并调节所述白蛋白水溶液的pH值为7～12；
其中，所述白蛋白水溶液中含有目标投递物；
所述目标投递物包括抗癌药物和造影剂；
所述抗癌药物包括5β,20-环氧-1,2α,4,7β,10β,13α-六羟基紫杉烷-11-烯-9-酮-4,10-二乙酸酯-2-苯甲酸酯-13[(2’R,3’S)-N-苯甲酰-3-苯基异丝氨酸酯]；
所述造影剂包括2,7-双[1,3-二氢-1,1-二甲基-3-(4-磺丁基)-1,3,5-庚三烯单钠盐；
(2)向步骤(1)所得的所述pH值为7～12的白蛋白水溶液中加入带巯基的还原剂得反应液，然后在0～60℃下轻轻摇动反应0.05～12小时，在所述反应液中，所述带巯基的还原剂的摩尔数为白蛋白摩尔数的10～5000倍；
(3)将步骤(2)反应后的溶液在0～60℃的条件下进行超声，所述超声的功率范围为1～100KW，同时在搅拌的条件下在所述进行超声的溶液中以0.01～1000mL/s的速度加入有机溶剂得到微乳溶液，所述微乳溶液在0～60℃的条件下反应5～240min后，静置分层，然后去除有机相，得到含多聚体白蛋白纳米球的悬浊液，其中，所述有机溶剂加入的体积为所述步骤(2)反应后的溶液的1～100倍；
(4)将步骤(3)所得的含多聚体白蛋白纳米球的悬浊液在0～60℃以及pH值为7～12的条件下进行透析，得到多聚体白蛋白纳米球溶液；
(5)将步骤(4)所得的多聚体白蛋白纳米球溶液进行干燥脱水处理，得到多聚体白蛋白纳米球，所述多聚体白蛋白纳米球包括含巯基和/或二硫键的白蛋白分子，所述白蛋白分子之间通过二硫键相互连接，
其中，所述多聚体白蛋白纳米球中包载有目标投递物；
所述目标投递物包括抗癌药物和造影剂；
所述抗癌药物包括5β,20-环氧-1,2α,4,7β,10β,13α-六羟基紫杉烷-11-烯-9-酮-4,10-二乙酸酯-2-苯甲酸酯-13[(2’R,3’S)-N-苯甲酰-3-苯基异丝氨酸酯]；
所述造影剂包括2,7-双[1,3-二氢-1,1-二甲基-3-(4-磺丁基)-1,3,5-庚三烯单钠盐；
所述多聚体白蛋白纳米球的粒径为10～1000nm。
4.如权利要求3所述的一种多聚体白蛋白纳米球的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述含巯基和/或二硫键的白蛋白分子为人血清白蛋白、牛血清白蛋白、猪血清白蛋白、重组血清白蛋白和血红蛋白中的至少一种。
5.如权利要求3所述的一种多聚体白蛋白纳米球的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述目标投递物的质量为所述含巯基和/或二硫键的白蛋白质量的0.0002～0.5倍。
6.如权利要求3所述的一种多聚体白蛋白纳米球的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述带巯基的还原剂为谷胱甘肽、半胱氨酸、巯基乙醇或二硫苏糖醇。
7.如权利要求3所述的一种多聚体白蛋白纳米球的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中，在搅拌的条件下在所述进行超声的溶液中以50～1000mL/s的速度加入有机溶剂得到微乳溶液。
8.如权利要求3所述的一种多聚体白蛋白纳米球的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述反应液在4～60℃下轻轻摇动反应，步骤(3)中步骤(2)反应后的溶液在4～60℃的条件下进行超声，所述微乳溶液在4～60℃的条件下反应5～240min，步骤(4)所述含多聚体白蛋白纳米球的悬浊液在4～60℃下进行透析。
9.如权利要求3所述的一种多聚体白蛋白纳米球的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中，所述有机溶剂为甲醇、乙醇、丙醇和叔丁醇中的至少一种。
10.如权利要求1或2所述的多聚体白蛋白纳米球在制备预防、治疗或诊断癌症的药物中的应用。
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