CN110403916B - 一种纳米治疗剂及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种纳米治疗剂及其制备方法与应用。所述纳米治疗剂包括：葡萄糖氧化酶，及位于所述葡萄糖氧化酶疏水腔中的疏水化疗药物。本发明所述纳米治疗剂是葡萄糖氧化酶与疏水化疗药物结合的复合物，其中所述葡萄糖氧化酶与所述疏水化疗药物通过疏水作用结合，所述纳米治疗剂能够同时实现肿瘤的靶向递送、化疗和类饥饿的联合治疗。

Description

一种纳米治疗剂及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及生物医学纳米材料领域，尤其涉及一种纳米治疗剂及其制备方法与应用。
背景技术
肿瘤的类饥饿治疗是一种新的治疗方式，主要通过切断肿瘤细胞的血液和营养供应使其饿死，达到一定的治疗效果。目前大量的研究证明，这种疗法可以有效地抑制肿瘤的快速生长，且对机体毒副作用小，所以近年来越来越受到科学家们的广泛关注。其中，葡萄糖氧化酶(GOx)在过去的几年里，由于其固有的生物相容性和生物降解性以及其对β-d-葡萄糖的独特催化性质而在癌症治疗的背景下引起了极大的研究兴趣。GOx可有效催化葡萄糖氧化成葡萄糖酸和过氧化氢，从而消耗了肿瘤内大量的能源供应。但是，单纯的GOx的肿瘤靶向性较差，且治疗效果有限。
化疗药物，是一种治疗肿瘤的药物，主要作用在肿瘤细胞生长繁殖的不同环节上，抑制或杀死肿瘤细胞。化疗药物治疗是目前治疗肿瘤的主要手段之一。但是，大部分疏水化疗药物本质是一种具有强疏水性以及无肿瘤靶向能力的有机小分子，限制了其在肿瘤治疗中的作用效果，因此开发出一种可递送疏水化疗药物且易降解的载体的问题需要解决。
因此，现有技术还有待于改进和发展。
发明内容
鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种纳米治疗剂及其制备方法与应用，旨在解决现有的疏水化疗药物和葡萄糖氧化酶的靶向性，治疗效果较低的问题。
本发明的技术方案如下：
一种纳米治疗剂，其中，包括：葡萄糖氧化酶，及位于所述葡萄糖氧化酶疏水腔中的疏水化疗药物。
进一步地，所述葡萄糖氧化酶和所述疏水化疗药物的质量比为5:1-7:1。
进一步地，所述疏水化疗药物位于所述葡萄糖氧化酶疏水腔的中心。
进一步地，所述纳米治疗剂为直径100-150nm的球形颗粒。
进一步地，所述疏水化疗药物选自索拉菲尼、紫杉醇、香豆素、芹菜素、替拉扎明、喜树碱、长春新碱、柔红霉素和噻替哌中的一种或多种。
一种制备本发明所述的纳米治疗剂的方法，其中，包括步骤：
将葡萄糖氧化酶与疏水化疗药物进行搅拌混合，得到所述纳米治疗剂。
进一步地，具体包括：将β-巯基乙醇、葡萄糖氧化酶(GOx)和水溶液混合，然后边搅拌边逐滴加入疏水化疗药物，最后通过离心收集，得到所述纳米治疗剂。
更进一步地，所述逐滴加入疏水化疗药物的时间控制在1-2min。
更进一步地，所述离心转速控制在6000-8000rpm，离心时间为5-10min。
一种本发明所述的纳米治疗剂在制备治疗肿瘤制剂中的应用。
有益效果：本发明所述纳米治疗剂是葡萄糖氧化酶与疏水化疗药物结合的复合物，其中所述葡萄糖氧化酶与所述疏水化疗药物通过疏水作用结合，所述纳米治疗剂能够同时实现肿瘤的靶向递送、化疗和类饥饿的联合治疗。
附图说明
图1为本发明实施例1中葡萄糖氧化酶与索拉菲尼结合(SRF@GOx)的TEM图。
图2为本发明实施例2中SRF@GOx合成前后的Zeta电位变化图。
图3为本发明实施例3中GOx在不同处理后的圆二色谱图。
图4为本发明实施例4中GOx与SRF@GOx产生的双氧水对比图。
图5为本发明实施例5中不同处理后SRF@GOx的SRF释放对比图。
图6为本发明实施例6中不同处理组的细胞内GSH含量的对比图。
图7为本发明实施例7中不同处理组的细胞内ROS荧光成像图。
图8为本发明实施例8中不同药物处理组的细胞存活率图。
图9为本发明实施例9中不同抑制剂处理组的细胞存活率改善图。
图10为本发明实施例10中SRF@GOx的小鼠肿瘤靶向荧光成像图。
具体实施方式
本发明提供一种纳米治疗剂及其制备方法与应用，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明提供一种纳米治疗剂，其中，包括：葡萄糖氧化酶，及位于所述葡萄糖氧化酶疏水腔中的疏水化疗药物。
本发明所述纳米治疗剂是葡萄糖氧化酶与疏水化疗药物结合的复合物。葡萄糖氧化酶作为载体，疏水化疗药物位于所述葡萄糖氧化酶疏水腔中，所述葡萄糖氧化酶与所述疏水化疗药物通过疏水作用结合，所述纳米治疗剂能够同时实现肿瘤的靶向递送、化疗和类饥饿的联合治疗。
进一步地，所述葡萄糖氧化酶和所述疏水化疗药物的质量比为5:1-7:1，以提高载体葡萄糖氧化酶的利用率，进而达到良好的治疗效果。
进一步地，所述疏水化疗药物位于所述葡萄糖氧化酶疏水腔的中心。
进一步地，所述纳米治疗剂为直径100-150nm的球形颗粒。该粒径范围内的纳米颗粒具有实体瘤的高通透性和滞留(EPR)效应。
进一步地，所述疏水化疗药物选自索拉菲尼、紫杉醇、香豆素、芹菜素、替拉扎明、喜树碱、长春新碱、柔红霉素和噻替哌等不限于此中的一种或多种。
更进一步地，所述疏水化疗药物为索拉菲尼(SRF)，一方面索拉菲尼疏水性较强，与葡萄糖氧化酶结合性更好，另一方面，索拉菲尼既具有铁死亡治疗效果，又具有抗血管生成的治疗效果，可与葡萄糖氧化酶的类饥饿治疗联合。
在实验测试中，发明人首次发现索拉菲尼(SRF)与葡萄糖氧化酶具有较强的结合作用，主要通过自身的强疏水性，与葡萄糖氧化酶疏水腔结合形成纳米治疗剂。索拉菲尼与葡萄糖氧化酶结合得到的所述纳米治疗剂，其中葡萄糖氧化酶自身作为酶与索拉菲尼递送的载体，靶向到肿瘤部位，在酸性环境中可促进释放。
本发明将疏水化疗药物与葡萄糖氧化酶疏水结合得到疏水化疗药物-葡萄糖氧化酶，不仅能改善疏水化疗药物的水溶性，降低葡萄糖氧化酶的毒性，而且做成纳米粒子能改善药物在血液中的循环时间，利于药物累积到肿瘤部位。
一种制备本发明所述的纳米治疗剂的方法，其中，包括步骤：
将葡萄糖氧化酶与疏水化疗药物进行搅拌混合，得到所述纳米治疗剂。
本发明利用化疗药物的强疏水性，与葡萄糖氧化酶(GOx)的疏水腔结合，从而被葡萄糖氧化酶包封，形成纳米颗粒状的所述纳米治疗剂。本发明利用疏水化疗药物与葡萄糖氧化酶具有良好的疏水结合力，通过搅拌混合即可实现纳米治疗剂的制备。所述纳米治疗剂是疏水化疗药物与葡萄糖氧化酶结合的复合物，可实现肿瘤的化疗和类饥饿治疗的联合治疗。所述纳米治疗剂可递送到肿瘤部位，在肿瘤微环境下被促进释放，用于肿瘤的类饥饿疗法与化疗的联合治疗。所述纳米治疗剂制备简单，可大批量生产，易于实现工业化，在肿瘤的治疗领域具有良好的应用前景。
进一步地，具体包括将β-巯基乙醇(用于断开葡萄糖氧化酶的二硫键，打开其结构，便于葡萄糖氧化酶与疏水化疗药物疏水结合)、葡萄糖氧化酶(GOx)和水溶液混合，然后边搅拌边逐滴加入疏水化疗药物，最后通过离心收集，得到所述纳米治疗剂。
更进一步地，所述逐滴加入疏水化疗药物的时间控制在1-2min。在所述时间内，疏水化疗药物与所述葡萄糖氧化酶相结合的过程能够充分完成。
更进一步地，所述离心转速控制在6000-8000rpm，离心时间为5-10min。
一种本发明所述的纳米治疗剂在制备治疗肿瘤制剂中的应用。
本发明纳米治疗剂还可以与其他药物一起制备肿瘤制剂。所述纳米治疗剂在肿瘤治疗中的应用，其中所述肿瘤治疗为同时采用铁死亡治疗和类饥饿治疗的联合疗法。
通过本发明所述制备方法制备的纳米治疗剂可实现肿瘤的铁死亡治疗与类饥饿治疗相结合的联合治疗，因此在肿瘤治疗领域将具有良好的应用前景。同时，本发明的制备工艺简单、操作方便，不需要复杂昂贵的设备，易于实现工业化生产。
下面通过具体的实施例对本发明进一步说明。
实施例1：合成索拉菲尼-葡萄糖氧化酶纳米治疗剂(SRF@GOx)
在10mL磷酸盐缓冲液(PBS，pH 7.4)中加入20mg葡萄糖氧化酶(GOx)使得获得的混合液中葡萄糖氧化酶的浓度为2mg/mL，搅拌加入β-巯基乙醇,然后缓慢滴加600μL 5mg/mL的索拉菲尼(SRF，溶于乙醇)，滴加完毕后将上述混合液以6000rpm转速离心5min，收集沉淀进行复溶，获得索拉菲尼-葡萄糖氧化酶纳米颗粒。
合成的索拉菲尼-葡萄糖氧化酶纳米治疗剂(SRF@GOx)的TEM图如图1所示。从图1可知，所合成的索拉菲尼-葡萄糖氧化酶纳米治疗剂为圆球形状，所述纳米治疗剂的粒径为100nm到150nm之间。
实施例2：合成索拉菲尼-葡萄糖氧化酶纳米治疗剂(SRF@GOx)前后Zeta电位变化分析
利用Zeta电位仪检测索拉菲尼，葡萄糖氧化酶以及索拉菲尼-葡萄糖氧化酶纳米治疗剂的Zeta电位变化。
合成的索拉菲尼-葡萄糖氧化酶纳米治疗剂(SRF@GOx)的Zeta电位图如图2所示。从图2可知，索拉菲尼带正电(约5.5mV)，葡萄糖氧化酶带负电(约-23.2mV)，所合成的索拉菲尼-葡萄糖氧化酶纳米治疗剂的电位值约为-8.7mV，说明形成的纳米颗粒是索拉菲尼和葡萄糖氧化酶结合的产物。
实施例3：不同处理对葡糖糖氧化酶二级结构的影响鉴定
利用圆二色谱仪，评价不同处理对葡萄糖氧化酶的二级结构影响。分别测定单纯葡萄糖氧化酶，索拉菲尼-葡萄糖氧化酶纳米治疗剂以及其释放液中的酶的二级结构。结果如图3所示，形成的索拉菲尼-葡萄糖氧化酶纳米治疗剂基本测不到葡萄糖氧化酶的二级结构，但是，在索拉菲尼-葡萄糖氧化酶纳米治疗剂释放后的上清中，可检测到葡萄糖氧化酶二级结构被恢复。
实施例4：索拉菲尼-葡萄糖氧化酶纳米治疗剂的酶活性评价
选择不同浓度的葡萄糖溶液作为反应底物，分别为0，0.01，0.05，0.1，1，5和10mM。加入相同酶浓度的葡萄糖氧化酶与索拉菲尼-葡萄糖氧化酶纳米治疗剂，1小时后利用双氧水试剂盒测定产生的双氧水含量。如图4可见，低浓度葡萄糖下索拉菲尼-葡萄糖氧化酶纳米治疗剂的酶活性有一点降低，较高浓度下和单纯葡萄糖氧化酶的活性基本无差异。说明制备得到的索拉菲尼-葡萄糖氧化酶纳米治疗剂的酶活性基本保持。
实施例5：索拉菲尼-葡萄糖氧化酶纳米治疗剂的释放效果评价
采用标准的透析法，评价不同刺激下对索拉菲尼-葡萄糖氧化酶纳米治疗剂中的索拉菲尼释放程度的影响。分别用中性磷酸盐缓冲液(pH 7.4)，含葡萄糖(5mM)的中性磷酸盐缓冲液(pH 7.4)以及酸性磷酸盐缓冲液(pH 5.0)作为透析液刺激索拉菲尼-葡萄糖氧化酶纳米治疗剂释放索拉菲尼，所有透析液均加入0.5％的吐温80增加索拉菲尼的溶解性。通过高效液相分析得到的结果如图5所示。图5结果说明酸性条件能够明显刺激索拉菲尼从治疗剂中释放，进一步表明索拉菲尼-葡萄糖氧化酶纳米治疗剂在肿瘤微环境中克促进释放。
实施例6：不同处理对细胞内谷胱甘肽(GSH)水平的影响。
4T1细胞以每孔2×105密度接种到6孔板中，并置于37℃、5％CO2条件下培育24h。接着，吸出6孔板中的旧培养基，分别加入含有相同索拉菲尼浓度的索拉菲尼，索拉菲尼-白蛋白以及含(不含)铁死亡抑制剂(Fer-1)的索拉菲尼-葡萄糖氧化酶纳米治疗剂的培养基，其中白蛋白无毒，继续培养24h后，收集每个处理组的细胞，在冰上用细胞裂解液裂解20min。然后，加入5,5-二硫代双(2-硝基苯甲酸)进行显色，在30min后，Bio-Tel EL×800型酶标仪上检测每孔的OD值(检测波长为412nm)，用如下公式计算GSH相对水平。谷胱甘肽含量(GSHlevel)(％)＝(样品的OD412值/空白OD412值)×100％，实验结果见图6。
如图6所示，加入含索拉菲尼的药物后，由于索拉菲尼会间接下调GSH的含量，所以细胞内GSH都会一定程度的降低。其中SRF@GOx药物组的细胞GSH水平最低，说明索拉菲尼-葡萄糖氧化酶纳米治疗剂严重下调GSH，而加入铁死亡抑制剂后，细胞内GSH水平有所提高，而铁死亡抑制剂可减弱索拉菲尼-葡萄糖氧化酶纳米治疗剂下调GSH的能力。
实施例7：不同处理对细胞内活性氧(ROS)水平的作用评价
4T1细胞以每孔1×105密度接种到12孔板中，并置于37℃、5％CO2条件下培育24h。接着，吸出12孔板中的旧培养基，分别加入含有相同索拉菲尼浓度的索拉菲尼，索拉菲尼-白蛋白以及含(不含)铁死亡抑制剂(Fer-1)的索拉菲尼-葡萄糖氧化酶纳米治疗剂的培养基，继续培养24h后，吸出就培养基，加入ROS探针(DCFH-DA)孵育30min后，用PBS洗去多余的探针，在荧光显微镜下观察，实验结果见图7。
如图7所示，索拉菲尼-葡萄糖氧化酶纳米治疗剂处理组的ROS探针荧光轻度最强，说明纳米治疗剂组产生更多的活性氧，而铁死亡抑制剂本质是一种活性氧清除剂，可明显降低ROS含量。
实施例8：评价铁死亡治疗/类饥饿联合治疗作用对4T1细胞存活率的影响。
采用标准的MTT法，4T1细胞以每孔5×103个的密度接种到96孔板中，并置于37℃、5％CO2条件下培育24h。接着，吸出96孔板中的旧培养基，分别加入含有0，0.1，0.5，1，2，5，10和20μg/mL的索拉菲尼溶液、SRF@HSA溶液和SRF@GOx的DMEM培养基。继续培养24h后，吸出96孔板中的旧培养基，在每个孔中加入100μL MTT的培养基溶液，继续培养4h，小心吸出96孔板中的含MTT培养基，在每个孔中加入150μL DMSO溶液，轻轻摇晃后，在Synergy H1型酶标仪上检测每孔的OD值(检测波长为490nm)，用如下公式计算细胞存活率。细胞存活率(cell viability)(％)＝(样品的OD570值/空白OD570值)×100％。
图8表示不同样品组与4T1细胞共孵育的细胞存活率图(反应细胞毒性)。从图8中可以看出，SRF与SRF@HSA的细胞毒性相对较低，毒性来源于SRF诱导的铁死亡。而SRF@GOx的毒性明显增加，负载葡萄糖氧化酶(GOx)之后产生一定的类类饥饿治疗效果，4T1细胞存活率有所下降，故SRF@GOx的治疗效果最好。
实施例9：评价加入抑制剂后的铁死亡治疗/类饥饿联合治疗作用对4T1细胞存活率的影响。
同样采用采用标准的MTT法，4T1细胞以每孔5×103个的密度接种到96孔板中，并置于37℃、5％CO2条件下培育24h。接着，吸出96孔板中的旧培养基，分别加入仅含有0，0.1，0.5，1，2，5，10和20μg/mL索拉菲尼的SRF@GOx溶液以及额外添加铁死亡抑制剂(Fer-1)或者凋亡抑制剂(Apo)的培养基。继续培养24h后，吸出96孔板中的旧培养基，在每个孔中加入100μL MTT的培养基溶液，继续培养4h，小心吸出96孔板中的含MTT培养基，在每个孔中加入150μL DMSO溶液，轻轻摇晃后，在Synergy H1型酶标仪上检测每孔的OD值(检测波长为490nm)，用如下公式计算细胞存活率。细胞存活率(cell viability)(％)＝(样品的OD570值/空白OD570值)×100％。
结果见图9，表明加入铁死亡抑制剂或者凋亡抑制剂能够明显改善细胞的凋亡，说明索拉菲尼-葡萄糖氧化酶纳米治疗剂(SRF@GOx)具有铁死亡治疗效果。
实施例10：索拉菲尼-葡萄糖氧化酶纳米治疗剂(SRF@GOx)在4T1皮下瘤蓄积的效果评价
雌性Balb/c小白鼠(4周,15-20g)，在小白鼠右后腿皮下注射1×106 4T1肿瘤细胞，建立小鼠皮下瘤模型。当皮下肿瘤体积超过100mm3时，进行荧光成像实验。通过在GOx上共价修饰IR800荧光探针，对SRF@GOx纳米治疗剂进行小鼠体内荧光成像，观测其肿瘤蓄积的变化情况，结果见图10。
图10中，尾静脉给药后，开始1小时内，药物在肿瘤中开始大量蓄积，说明SRF@GOx纳米治疗剂可靶向到肿瘤部位。但由于GOx可与葡萄糖产生双氧水，双氧水破坏IR800分子，导致随后的时间里，肿瘤部位的荧光开始衰弱。因此，说明索拉菲尼-葡萄糖氧化酶纳米治疗剂(SRF@GOx)具有肿瘤靶向性，同时可在肿瘤部位产生双氧水。
本发明所述的索拉菲尼-葡萄糖氧化酶纳米治疗剂(SRF@GOx)可实现肿瘤的铁死亡治疗与类饥饿治疗相结合的联合治疗。
本发明中，所述SRF@GOx具有良好的临床应用前景，SRF是已经批准应用于临床的药物，而GOx也是正在进行大量研究实验的药物。GOx自身作为载体的应用很少，制备成的SRF@GOx纳米颗粒后既可以递送GOx与SRF靶向到肿瘤，又具有良好的生物降解性。
本发明具有如下优点：通过本发明所述制备方法制备的疏水化疗药物与葡萄糖氧化酶结合的纳米治疗剂可用于肿瘤的化疗与类饥饿治疗相结合的联合治疗，在肿瘤的治疗领域将具有良好的应用前景。同时，本发明的制备工艺简单、操作方便，不需要复杂昂贵的设备，易于实现工业化生产。
应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims (7)

1.一种纳米治疗剂，其特征在于，包括：葡萄糖氧化酶，及位于所述葡萄糖氧化酶疏水腔中的化疗药物，所述化疗药物选自索拉菲尼、香豆素、芹菜素、替拉扎明、长春新碱、柔红霉素和噻替哌中的一种或多种，所述葡萄糖氧化酶和所述化疗药物的质量比为5:1-7:1，所述纳米治疗剂为直径100-150nm的球形颗粒。
2.根据权利要求1所述的纳米治疗剂，其特征在于，所述化疗药物位于所述葡萄糖氧化酶疏水腔的中心。
3.一种制备如权利要求1-2任一项所述的纳米治疗剂的方法，其特征在于，包括步骤：
将葡萄糖氧化酶与化疗药物进行搅拌混合，得到所述纳米治疗剂，所述化疗药物选自索拉菲尼、香豆素、芹菜素、替拉扎明、长春新碱、柔红霉素和噻替哌中的一种或多种，所述葡萄糖氧化酶和所述化疗药物的质量比为5:1-7:1。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，具体包括：
将β-巯基乙醇、葡萄糖氧化酶和水溶液混合，然后边搅拌边逐滴加入化疗药物，最后通过离心收集，得到所述纳米治疗剂。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述逐滴加入化疗药物的时间控制在1-2min。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述离心转速控制在6000-8000rpm，离心时间为5-10min。
7.一种如权利要求1-2任一项所述的纳米治疗剂在制备治疗肿瘤制剂中的应用。
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