CN112741903B - 一种dna/纳米复合物及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种DNA/纳米复合物及其制备方法与应用，所述DNA/纳米复合物包括聚多巴胺纳米粒，二氧化锰纳米粒和DNAzyme；所述DNA/纳米复合物为核壳纳米粒，以聚多巴胺纳米粒为核，二氧化锰纳米粒为壳，DNAzyme吸附于壳表面；其中，所述DNAzyme为针对HSP70蛋白的mRNA设计的DNAzyme。本发明的DNA/纳米粒复合物中，聚多巴胺核是良好的光热试剂，可以用来进行光热治疗，其表面的二氧化锰在肿瘤细胞内高表达的谷胱甘肽作用，可以降解为Mn2+，从而激活DNAzyme，下调HSP70蛋白的表达，达到提高肿瘤细胞对于光热治疗的敏感性，增强光热治疗的目的。

Description

一种DNA/纳米复合物及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及一种纳米生物技术领域，具体涉及一种DNA/纳米复合物及其制备方法与应用。
背景技术
光热治疗系利用光热制剂将近红外光转化为热量达到杀伤肿瘤细胞的目的。由于这种治疗方法的时间和空间可控制性，其被认为是一种具有潜力的肿瘤治疗方法。光热治疗中所使用的纳米制剂需要具备良好的光热转换能力，常见的比如聚多巴胺纳米粒，金纳米粒，普鲁士蓝纳米粒等等。但是，狡猾的肿瘤细胞可以通过上调热休克蛋白(HSPs)来获得耐热性，从而减弱了光热的治疗和预后效果。HSPs是一种由各种环境或病理生理应激诱导的高度保守的分子伴侣蛋白。其中，HSP70是保护细胞免受热应激损害的最活跃的耐热蛋白之一。最近的研究表明，HSP70可以保护细胞免受热应激的损害。也通过直接抑制caspase-3激活来抑制PTT介导的凋亡。因此，HSP70的过表达代表了有效PTT的最显着障碍之一。为此，研究者已经开发了多种HSP70抑制剂以整合到光热系统中以改善肿瘤治疗功效。
通过使用小干扰RNA(siRNA)进行RNA干扰已被广泛用作调节基因表达的通用工具。16由于其高基因沉默效率，最近已设计出针对HSP70的siRNA，在治疗HSP70时显着改善了肿瘤治疗效果与PTA结合使用。但是siRNA的临床转化受到体内应用缺陷的严重限制，因为siRNA基于RNA的结构，极易在循环和细胞内递送过程中被核酸酶，酸性环境和溶酶体酶降解。另外，siRNA可能诱导脱靶效应和免疫反应，从而引起非特异性副作用。为缓解这些问题，研究者开发了功能性纳米载体装载siRNA，保护和递送其至目标作用组织。然而，纳米平台包含siRNA传递和光热转换功能的蛋白质通常需要复杂的材料设计和复杂的制备程序，从而难以实现经济高效，可重复生产和批量生产的目的。因此，寻找替代RNA干扰工具用于基因沉默已引起了的极大关注。
DNAzyme(DZ)是一种可以催化RNA裂解的DNA序列。与siRNA不同，DZ可以重复裂解mRNA，而无需任何细胞内机制进行激活。此外，由于DZ的脱氧核糖含量相对于siRNA的核糖含量，其在体内的稳定性要高得多，且具有最小的脱靶效应。因此DZ可以替代siRNA用于基因沉默治疗。但是由于其活性具有金属依赖性，因此可以设计含有金属辅因子库的纳米粒系统在靶位点进行DZ的原位活化和随后的mRNA切割，继而下调相应蛋白的表达。
发明内容
为解决上述问题，本发明的目的在于提供一种DNA/纳米复合物及其制备方法与应用，所述纳米复合物主要包括聚多巴胺，二氧化锰和DNAzyme，形成以聚多巴胺纳米粒为核，二氧化锰纳米粒为壳，DNAzyme吸附于壳表面的纳米核壳结构。所述聚多巴胺核是良好的光热试剂，可以用来进行光热治疗，其表面的二氧化锰在肿瘤细胞内高表达的谷胱甘肽作用，可以降解为Mn2+，从而激活DNAzyme，下调HSP70蛋白的表达，达到提高肿瘤细胞对于光热治疗的敏感性，增强光热治疗的目的。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为：提供一种DNA/纳米复合物，其所述DNA/纳米复合物包括聚多巴胺纳米粒，二氧化锰纳米粒和DNAzyme；所述DNA/纳米复合物为核壳纳米粒，以聚多巴胺纳米粒为核，二氧化锰纳米粒为壳，DNAzyme吸附于壳表面；其中，所述DNAzyme为针对HSP70蛋白的mRNA设计的DNAzyme，序列如SEQ ID NO.1所示。
基于一个总得发明构思，本发明还提供了上述DNA/纳米复合物的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
S1、将多巴胺单体溶于Tris缓冲液与乙醇的混合溶液中，在碱性条件下制备聚多巴胺纳米粒；
S2、在S1聚多巴胺纳米粒溶液中加入高锰酸钾溶液，搅拌、离心，收集沉淀得到聚多巴胺与二氧化锰核壳纳米粒；
S3、将聚多巴胺与二氧化锰核壳纳米粒溶于缓冲液中，再加入DNAzyme孵育，离心，收集沉淀得到DNA/纳米复合物。
上述制备方法，进一步的S1中所述Tris缓冲液的浓度为5-20mM，所述Tris缓冲液与乙醇的体积比为1-10:1。优选的，所述Tris缓冲液的浓度为10mM，所述Tris缓冲液与乙醇的体积比为5:1。
上述制备方法，进一步的，S2中所述聚多巴胺纳米粒浓度为50-400μg/mL，高锰酸钾浓度为100-500μg/ml，常温条件下搅拌，反应时间为0.5-4h。优选的，S2中所述聚多巴胺纳米粒浓度为200μg/mL，高锰酸钾浓度为250μg/ml，常温条件下搅拌，反应时间为0.5h。
上述制备方法，进一步的，S3中所述缓冲液为HEPES缓冲液。
上述制备方法，进一步的，S3中所述聚多巴胺与二氧化锰核壳纳米粒溶液浓度为50-400μg/mL。优选的，S3中所述聚多巴胺与二氧化锰核壳纳米粒溶液浓度为200μg/mL。
上述制备方法，进一步的，S3中所述DNAzyme浓度为0.1-2μM，吸附时间为0.5-24h。优选的，S3中所述DNAzyme浓度为1μM，吸附时间为12h。
基于一个总得发明构思，本发明还提供了上述DNA/纳米复合物在制备治疗肿瘤药物中的应用。
基于一个总得发明构思，本发明还提供了上述DNA/纳米复合物在制备恶性肿瘤光热治疗药物中的应用。优选的，所说恶性肿瘤为三阴性乳腺癌细胞。
上述的药物，进一步的，所述药物为外用制剂、口服制剂或注射剂。作为优选，所述的外用制剂为外用凝胶剂。所述的口服制剂为包含所述的复合纳米粒的颗粒剂、片剂、口服溶液剂等。所述的注射剂为包含所述的复合纳米粒的静脉注射液。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1、本发明提供了一种DNA/纳米复合物，主要包括聚多巴胺，二氧化锰和DNAzyme，形成以聚多巴胺纳米粒为核，二氧化锰纳米粒为壳，DNAzyme吸附于壳表面的纳米核壳结构，DNAzyme是针对HSP70设计的DNAzyme(DZ)可以有效剪切mRNA，从而下调HSP70的表达。本发明中聚多巴胺与二氧化锰的杂化纳米粒同时作为光热制剂和金属离子库，聚多巴胺具有良好的光热转换效率，可以用来进行光热治疗，二氧化锰在肿瘤细胞内的高谷胱甘肽条件下被降解成Mn2+，用以激活DNAzyme降解HSP70mRNA，进一步可以下调HSP70蛋白的表达，从而减弱肿瘤的耐热能力，增强光热治疗的效果。
2、本发明提供了一种DNA/纳米复合物的制备方法，碱性条件下让多巴胺单体自聚为聚多巴胺纳米粒，然后利用其表面的氨基和酚羟基等具有还原性的性质，在其表面原位还原高锰酸钾得到二氧化锰，形成以聚多巴胺纳米粒为核，二氧化锰为壳的核壳纳米粒，最后利用二氧化锰外壳与核酸的物理吸附作用，将针对HSP70蛋白设计的DNAzyme吸附于纳米粒表面，得到PDA@MnO2/DZ的纳米粒复合物，其制备过程简单可控，为增强光热治疗提供了新思路。
3、本发明提供了一种DNA/纳米复合物在肿瘤光热治疗中的应用，复合纳米粒可靶向富集于肿瘤病灶部位，通过增强光热治疗导致肿瘤细胞死亡，对心、肝、脾、肾等无损伤，可以对肿瘤治疗提供依据和思路。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1和实施例2制备流程示意图。
图2为本发明实施例1中PDA和PDA@MnO2 NPs的粒径和电位图。
图3为本发明实施例1中PDA和PDA@MnO2 NPs的TEM图。
图4为本发明实施例1中PDA和PDA@MnO2 NPs的紫外光谱图。
图5为本发明实施例1中PDA@MnO2/的XPS图。
图6为本发明实施例2中PDA@MnO2和PDA@MnO2/DZ NPs的粒径和电位图。
图7为本发明实施例3中PDA@MnO2 NPs的光热效率计算图。
图8为本发明实施例4中PDA@MnO2/DZ NPs的光热效应图。
图9为本发明实施例5中PDA@MnO2 NPs吸附DNAzyme的吸附量图
图10为本发明实施例6中PDA@MnO2 NPs在不同条件下Mn2+的释放曲线图。
图11为本发明实施例7中PDA@MnO2 NPs在DNAzyme存在的条件下对底物的切割效率图。
图12为本发明实施例8中MDA-MB-231细胞对于PDA@MnO2/DZFAM NPs的摄取图。
图13为本发明实施例9中MDA-MB-231细胞在摄取PDA@MnO2/DZ NPs且进行光照之后HSP70蛋白的表达情况。
图14为本发明实施例10中PDA@MnO2/DZ NPs的细胞存活率结果。
图15为药物在体内的分布研究。图15A为尾静脉注射后，1h和24h的小鼠体内荧光分布图；图15B为注射24h后，将小鼠处死，心、肝、脾、肺、肾和肿瘤的荧光分布图。
图16为本发明实施例12中为各组肿瘤体积变化曲线图。
图17为本发明实施例12中为各组小鼠肿瘤实体图。
图18为本发明实施例12中为第14天各组肿瘤重量。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段；若未特别指明，实施例中所用试剂均为市售。
本发明涉及到的百分号“％”，若未特别说明，是指质量百分比；但溶液的百分比，除另有规定外，是指100ml溶液中含有溶质的克数。
本发明所述重量份可以是μg、mg、g、kg等本领域公知的重量单位，也可以是其倍数，如1/10、1/100、10倍、100倍等。
以下实施例中，所采用的仪器及生产厂家的详细信息参见表1：
表1主要仪器名称及生产厂家
仪器名称 生产厂家
CP225D型电子天平 德国赛多利斯(Sartorius)公司
BP224S型电子天平 德国赛多利斯(Sartorius)公司
XW-80A型旋涡混合器 上海青浦沪西分析仪器厂
掌上离心机 美国Scilogex公司
DF-101S恒温加热磁力搅拌器 巩义市予华仪器有限公司
UV-2600紫外分光光度计 日本岛津公司
TGL16M低温高速离心机 长沙英泰仪器责任有限公司
TD4A台式低速离心机 长沙英泰仪器责任有限公司
SHA-B水浴恒温振荡器 常州澳华仪器有限公司
MIN4-UVF纯水机 湖南科尔顿水务有限公司
UV-2600紫外分光光度计 日本岛津公司
Infinite <sup>2</sup>00PRO多功能酶标仪 奥地利TECAN公司
Nano-ZS90粒径分析仪 英国Malvern仪器有限公司
Tecnai G2 F20型透射电子显微镜 美国FEI公司
TGL20M台式高速冷冻离心机 长沙英泰仪器责任有限公司
1×70型倒置荧光显微镜 日本Olympus公司
Forma Series II型C<sub>2</sub>细胞培养箱 美国Thermo Fisher公司
SW-CJ-2FD型垂直净化工作台 苏州净化设备有限公司
DSX-30L高压灭菌锅 上海申安医疗器械厂
4℃冰箱 中国海尔医用冷藏冰箱
-20℃冰箱 中国海尔医用低温保存冰箱
-80℃冰箱 中国海尔医用低温保存冰箱
Q5000微量紫外分光光度计 美国QUAWELL公司
激光共聚焦显微镜 美国Thermo Fisher公司
以下实施例中，所采用的主要试剂名称及生产厂家参见表2：
表2主要试剂名称及生产厂家
Figure BDA0002896069710000051
Figure BDA0002896069710000061
实施例1
一种DNA/纳米复合物，包括聚多巴胺，二氧化锰。
本实施例的聚多巴胺与二氧化锰杂化纳米粒(PDA@MnO2)采用以下方法制备得到：
14mg盐酸多巴胺溶于20mL tris缓冲液(10mM)中，加入4mL无水乙醇，常温搅拌24h，16000rpm离心10min，得到聚多巴胺纳米粒(PDA NPs)。在上述1mL溶液中加入1mLKMnO4溶液(1mg/mL)，常温搅拌0.5h，16000rpm离心10min，得到聚多巴胺与二氧化锰杂化纳米粒(PDA@MnO2 NPs)收集沉淀，冻干称重备用。
实施例2
一种DNA/纳米复合物，包括聚多巴胺，二氧化锰，DNAzyme(SEQ ID NO.1：AACAAAAACAGCAATTCCGAGCCGGTCGAATGGAAAGGCCCCTAA)。
本实施例的DNA/纳米复合物采用以下方法制备得到：
将PDA@MnO2纳米粒溶于HEPES缓冲液(20mM,pH 7.2,包含150mM NaCl和2mMMgCl2)，纳米粒溶液为200μg/mL,继而加入1μM DNAzyme孵育12h。16000rpm离心10min，收集沉淀，用去离子水复溶，即得到DNA/纳米复合物：PDA@MnO2/DZ NPs。
实验例：
一、粒径与电位：分别检测PDA、PDA@MnO2和PDA@MnO2/DZ NPs的粒径和电位，测量方法为：取样品溶液置于Marlven Nano ZS仪器，采用动态光激光散射法检测粒径和电位，测定池温度设定为25℃，每个样品平行操作3份。图2，6分别为PDA、PDA@MnO2、PDA@MnO2/DZ NPs的粒径及电位变化图，从图的结果可知：PDA粒径为120nm，电位为-30mV，包裹MnO2之后，PDA@MnO2粒径为144nm，电位为-19.8mV，而吸附DNAzyme之后，PDA@MnO2/DZ粒径增至151nm，电位增至-31.2mV。
三、形态：观察PDA@MnO2 NP的形态，形态的检测方法：样品滴加在覆盖碳膜的400目铜网上，置于干燥器中，待其自然干燥后置于透射电镜Titan G2-F20下观察。图3A，图3B分别为PDA NPs和PDA@MnO2/DZ NPs的透射电镜图。
四、紫外光谱：分别对PDA，PDA@MnO2 NPs进行紫外光谱扫描，测定方法为：以蒸馏水为空白对照液，测定PDA，PDA@MnO2 NPs的紫外吸收图谱。图4为PDA，PDA@MnO2NPs的紫外吸收图谱，从图中可知：在PDA NPs包裹MnO2之后，300-400nm出现MnO2的特征吸收峰，证明PDA表面成功包裹MnO2。
五、X射线光电子能谱：对PDA@MnO2 NPs进行X射线光电子能谱扫描，图5为PDA@MnO2NPs的X射线光电子能谱图。如图所示，654.2eV和642.4eV分别是MnO2中Mn(IV)2p2/3和Mn(IV)2P1/2的自旋轨道峰，证明PDA表面成功包裹MnO2。
六：质量浓度比：对应PDA@MnO2/DZ NPs的粒径和电位，其制备过程中PDA@MnO2 NPs浓度为200μg/mL,DZ浓度为1μM。
实施例3
考察实施例1中PDA@MnO2 NPs的光热转换效率：
取200μg/mL的PDA@MnO2 NPs至于离心管中，用近红外激光(808n，2W/cm2)照射740s后移除激光源，期间利用近红外成像相机每10s测定一次温度，并根据以下公式计算光热转换效率。
Figure BDA0002896069710000071
其中h是传热系数，A是容器的表面积，Tmax是平衡温度，Tsurr是周围环境的温度，ΔTmax＝Tmax-Tsurr，I是入射激光功率(2W/cm2)，Aλ是PDA@MnO2 NP在波长λnm处的吸光度。Qs是与溶剂的吸光度有关的热量。
由图7得出PDA@MnO2 NPs的光热转换效率为36.4％。
实施例4
考察DNAzyme的吸附量:
取200μg/mL的PDA@MnO2 NPs置于HEPES缓冲液(20mM,pH 7.2,包含150mM NaCl和2mM MgCl2)中，分别加入不同浓度(10nM,100nM,200nM,500nM,800nM,1000nM)荧光基团FAM标记的DZFAM与纳米粒孵育12h，16000rpm离心10min，取上清，测量荧光强度，计算DNAzyme吸附量。由图8知，当DZ投放量达到1μM时，达到最大吸附量2.5μmol/g。
实施例5
考察实施例2中PDA@MnO2/DZ NPs的光热转化性能：
取200μg/mL的PDA@MnO2 NPs和PDA@MnO2/DZ NPs分别至于离心管中，用近红外激光(808n，2W/cm2)照射500s，利用近红外成像相机每10s测定一次温度，并绘制升温曲线。
由图9知，吸附DNAzyme之后，对于PDA@MnO2 NPs的光热性能并无影响。
实施例6
考察实施例1中PDA@MnO2 NPs在不同条件下Mn2+的释放：
将纳米粒1mL离心管中，释放介质分别为：pH 7.4、pH 5.5、pH 5.5+10mM GSH。分别于0.5、1、2、4、8、12h离心，收集上清，利用ICP-MS测定上清中Mn2+浓度。图10分别为PDA@MnO2NPs在不同条件下释放曲线图。结果表明PDA@MnO2 NPs具有一定的酸敏性和较强的谷胱甘肽响应性。
实施例7
考察实施例1中PDA@MnO2 NPs在不同条件下对靶mRNA的剪切效率：
分别移取5μL FAM-Sub(10nM)溶液、10μL DZ(10nM)溶液加入200μL无酶EP管中涡旋混匀，再分别加入不同pH的PBS缓冲液与GSH溶液，且二者终浓度为10mM，，最后加入PDA@MnO2 NPs至总体积为50μL，涡旋混匀，37℃水浴锅中孵育30min，加入50μL尿素(16mM)溶液终止反应。EP管中加入同体积(3μL)的Loading Buffer缓冲液，涡旋混匀。移取相同体积的溶液加入预先制备的变性聚丙烯酰胺凝胶上样孔中，220V电压分离30min。30min后，停止分离，取出聚丙烯凝胶荧光显微镜下显影并拍照，采用ImageJ软件分析电泳条带。图11表明PDA@MnO2 NPs在肿瘤微环境中可以有效催化DZ对底物进行切割。
实施例8
(1)制备PDA@MnO2/DZFAM NPs。具体步骤为：取200μg/mL的PDA@MnO2 NPs置于HEPES缓冲液(20mM,pH 7.2,包含150mM NaCl和2mM MgCl2)中，加入1μM荧光基团FAM标记的DZFAM与纳米粒孵育12h，16000rpm离心10min,收集沉淀。
(2)取对数生长的MDA-MB-231细胞(人源性三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231细胞，购自中南大学湘雅医学实验中心)，消化计数，适量DMEM完全培养基稀释至2×105cells/mL的细胞悬液，每孔2mL接种于24孔板，总共接种3个孔。贴壁培养24h后吸弃培基，PBS润洗3次。
(3)取一个孔加入游离DANzyme 400nM(Free DZ)，另一孔加入PDA@MnO2/DZ NPs孵育4h后，吸弃培基，PBS润洗3次。
(4)每孔加入1mL多聚甲醛避光固定20min，吸弃上清，PBS洗涤三次。
(5)每孔加入0.5mL 1μg/mL DAPI，避光染核15min，吸弃上清，PBS洗涤3次，激光共聚焦显微镜下观察各孔荧光强弱。
图12为PDA@MnO2/DZFAM NPs的细胞摄取。其中，DAPI通道表明细胞核染为蓝色荧光，FAM通道表明NPs标记为绿色荧光，Merged表明叠加DAPI和FAM通道。标尺＝20μm。
从图中可知：荧光显微镜下仅PDA@MnO2/DZFAM NPs处理组可见细胞内有明显的绿色荧光，表明纳米粒被细胞摄取，结果说明PDA@MnO2/DZFAM NPs可有效将DNAzyme递送至肿瘤细胞内。
实施例9
考察实施例2中PDA@MnO2/DZ NPs对肿瘤细胞中HSP70蛋白的调控：
(1)取MDA-MB-231细胞以400000/孔种于6孔板，并分别进行不同的处理，光照组在加入纳米复合物24h进行光照，并额外孵育48h。
(2)使用Western裂解液裂解MDA-MB-231细胞，收集细胞中的蛋白样品，测定蛋白样品的蛋白浓度。
(3)配制SDS-PAGE凝胶，在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，100℃或沸水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白。
(4)冷却至室温后把蛋白样品直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内进行电泳，溴酚蓝到达胶的底端处附近停止电泳。
(5)选用PVDF膜进行转膜，使用Bio-Rad的标准湿式转膜装置，转膜完毕后，加入5％脱脂牛奶室温封闭1h。
(6)吸尽封闭液，加入稀释好的一抗，室温孵育过夜。回收一抗，加入Western洗涤液，洗涤3次。
(7)按照适当比例用Western二抗稀释液稀释辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗。吸尽洗涤液，加入稀释好的二抗，室温孵育1h。洗涤3次。
(8)最后使用BeyoECL Plus(P0018)等ECL类试剂检测蛋白。
图13为浓各种处理组的HSP70蛋白表达水平。分组具体为：(1)PBS,(2)PDA@MnO2,(3)PDA@MnO2/DZ,(4)PDA@MnO2+Laser,(5)PDA@MnO2/DZ+Laser.。由结果可以看出，PDA@MnO2/DZ可以明显下调HSP70蛋白的表达。
实施例10
考察实施例1和实施例2的纳米复合物对肿瘤细胞的细胞毒性：
(1)取胰酶消化对数生长的MDA-MB-231细胞，用含10％胎牛血清的DMEM培养基稀释成密度为50000cells/mL细胞悬液，以每孔100μL接种到96孔培养板中。在二氧化碳培养箱内(37℃、5％C2、饱和湿度)培养24h后移弃培养液。
(2)每孔加入100μL用培养基稀释至不同浓度的PDA@MnO2 NPs和PDA@MnO2/DZ NPs孵育24h.然后加入新鲜培养基，808nm激光光照5min(2W/cm2)，再额外孵育24h。
(3)每孔加入10μL MTT溶液(5mg/mL)，继续孵育4h后终止培养，吸弃上清液。
(4)每孔加入DMSO溶液150μL，置摇床上低速振摇10min使结晶溶解完全，用酶标仪测定570nm波长处的吸光值(OD)。
图14用MTT法测定细胞存活率结果。由图可看出本发明的PDA@MnO2 NPs和PDA@MnO2/DZ NPs的细胞存活率均为剂量依赖性，且没有NIR激光照射时，PDA@MnO2NPs具有良好的生物相容性，光照条件下，PDA@MnO2/DZ NP在每种浓度下均具有增强的细胞毒性。
实施例11
考察实施例2的纳米复合物在体内的分布研究：
(1)建立荷瘤裸鼠模型：收集对数生长的231细胞分散于PBS中，细胞密度为1×107/100μL，等体积与基质胶混合，注射于BALB/c裸鼠(雌性，6周)的腋下部位。雌性BALB/c裸鼠，6周龄，购自常州卡文斯实验动物有限公司。
(2)处理：待小鼠肿瘤增长至200mm3时(肿瘤体积计算公式：V＝长×宽2/2)，给小鼠尾静脉注射PDA@MnO2/DZCy5.5NPs(10mg/kg)给药剂量为5mg/kg，同时设置对照组，对照组给与当量的DZCy5.5尾静脉注射。
(3)检测：分别在注射后1h和24h麻醉小鼠，活体成像系统对小鼠进行成像。24h活体成像后，将小鼠处死，取出心肝脾肺肾和肿瘤，成像系统进行成像。
图15为药物在体内的分布研究。图15A为尾静脉注射后，1h和24h的小鼠体内荧光分布图；图15B为注射24h后，将小鼠处死，心、肝、脾、肺、肾和肿瘤的荧光分布图。
从图15A中可知：1h时，注射游离DZ的小鼠荧光强度强于注射纳米粒的小鼠，24h后两只小鼠荧光强度相反。24h后，注射纳米粒的小鼠肿瘤部位荧光强度要强于其他部位，而注射游离DZ的小鼠无此趋势。图15B所示，离体肿瘤中，注射PDA@MnO2/DZCy5.5的小鼠肿瘤荧光强度明显强于注射游离DZ的荧光强度。表明本发明的DNA/纳米复合物可在肿瘤部位蓄积，对肿瘤具有靶向性。
实施例12
考察实施例2的纳米复合物体内抗肿瘤活性：
按照实施例11的方法处理小鼠，待荷瘤小鼠肿瘤长至200mm3左右时，将小鼠随机分成5组(n＝6)：(1)PBS,(2)PDA@MnO2(10mg/kg),(3)PDA@MnO2/DZ(10mg/kg),(4)PDA@MnO2+Laser,(5)PDA@MnO2/DZ+Laser.，分别在第0、3、6、9天尾静脉注射药物，光照组在24后加以激光照射5min(808nm，2W/cm2)。每两天给小鼠称重并用游标卡尺测量肿瘤的体积至第14天，通过各组肿瘤的相对体积与肿瘤体积大小比较各组抗肿瘤效率。
图16为各组肿瘤体积变化曲线图；图17为各组小鼠肿瘤实体图；图18为第14天各组肿瘤重量。所有结果均显示PDA@MnO2/DZ比PDA@MnO2具有更好的抗肿瘤效果，而这可以归因于DZ介导的HSP70沉默增强了PTT。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
序列表
<110> 长沙医学院
<120> 一种DNA/纳米复合物及其制备方法与应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aacaaaaaca gcaattccga gccggtcgaa tggaaaggcc cctaa 45

Claims (10)

1.一种DNA/纳米复合物，其特征在于，所述DNA/纳米复合物包括聚多巴胺纳米粒，二氧化锰纳米粒和DNAzyme；所述DNA/纳米复合物为核壳纳米粒，以聚多巴胺纳米粒为核，二氧化锰纳米粒为壳，DNAzyme吸附于壳表面；其中，所述DNAzyme为针对HSP70蛋白的mRNA设计的DNAzyme，序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述DNA/纳米复合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、将多巴胺单体溶于Tris缓冲液与乙醇的混合溶液中，在碱性条件下制备聚多巴胺纳米粒；
S2、在S1聚多巴胺纳米粒溶液中加入高锰酸钾溶液，搅拌、离心，收集沉淀得到聚多巴胺与二氧化锰核壳纳米粒；
S3、将聚多巴胺与二氧化锰核壳纳米粒溶于缓冲液中，再加入DNAzyme孵育，离心，收集沉淀得到DNA/纳米复合物。
3.根据权利要求2 所述的DNA/纳米复合物的制备方法，其特征在于，S1中所述Tris缓冲液的浓度为5-20mM，所述Tris缓冲液与乙醇的体积比为1-10∶1。
4.根据权利要求2 所述的DNA/纳米复合物的制备方法，其特征在于，S2中所述聚多巴胺纳米粒浓度为50-400μg/mL，高锰酸钾浓度为100-500μg/ml，常温条件下搅拌，反应时间为0.5-4h。
5.根据权利要求2 所述的DNA/纳米复合物的制备方法，其特征在于，S3中所述缓冲液为HEPES缓冲液。
6.根据权利要求2 所述的DNA/纳米复合物的制备方法，其特征在于，S3中所述聚多巴胺与二氧化锰核壳纳米粒溶液浓度为50-400μg/mL。
7.根据权利要求2 所述的DNA/纳米复合物的制备方法，其特征在于，S3中所述DNAzyme浓度为0.1-2μM，吸附时间为0.5-24h。
8.一种权利要求1所述DNA/纳米复合物在制备治疗肿瘤药物中的应用。
9.一种权利要求1所述DNA/纳米复合物在制备恶性肿瘤光热治疗药物中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，所说恶性肿瘤为三阴性乳腺癌细胞。
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