CN111759808B - 一种脂质体-石墨烯-金复合纳米材料及其制备方法和应用 - Google Patents

一种脂质体-石墨烯-金复合纳米材料及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种脂质体‑石墨烯‑金复合纳米材料及其制备方法和应用，复合纳米材料包括脂质体和包覆在所述脂质体内的还原石墨烯‑金纳米材料；所述脂质体由正电磷脂、中性磷脂和叶酸修饰的二油酰基磷脂酰乙醇胺按照摩尔比为5～7:3～5:0.25溶解在氯仿中，干燥，水化，超声得到；正电磷脂选自二甲基二(十八烷基)溴化铵等；中性磷脂选自二油酰基磷脂酰乙醇胺等；脂质体、还原石墨烯和金纳米材料的质量比为30～50:1:1～3。材料既有光热治疗能力，也有基因递送能力，两者协同治疗，大大提高其治疗效果，实现光热及基因协同治疗目的。生物相容性好，尺寸小，光热稳定性较好。

Description

一种脂质体-石墨烯-金复合纳米材料及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于纳米材料技术领域，尤其涉及一种脂质体-石墨烯-金复合纳米材料及其制备方法和应用。
背景技术
癌症是影响全球人类健康的几种重大疾病之一，给人类健康带来了严重的威胁。在过去的几十年中，手术、化疗和放疗等癌症治疗手段在临床上得到了广泛的应用。在与癌症的斗争中，常见的治疗策略，如化疗、放疗和手术在临床癌症治疗中最为常见。目前，首选的治疗方式也是最直接的方式是外科手术，但大多数患者到医院就诊时已处于晚期，不适于单纯进行手术治疗，需要通过放疗或者化疗等手段进行辅助治疗，但由于上述手段其对肿瘤细胞缺乏选择性，所以往往对正常组织造成较强的毒副作用，或诱导肿瘤细胞产生多耐药性，最终导致治疗失败。因此，开发具有肿瘤靶向性、降低对正常组织的毒性，克服肿瘤细胞多耐药性的新型高效的癌症治疗手段逐渐引起广大科研和医学工作者的重视，各种新型癌症治疗方法的不断出现，目前的临床应用逐渐采用多手段综合治疗，以期更大幅度地提高治愈率和治疗效率，并最终改善癌症患者的生活质量。
癌症的基因治疗(Cancer Gene Therapy)一般是指将目的基因导入肿瘤细胞，继而介导对肿瘤细胞的杀伤、生长抑制或者诱导凋亡等作用。此外，基因疗法在提高机体对化疗药物的敏感性，减少肿瘤复发和转移等方面也发挥着重要的作用。肿瘤大部分源于体内的基因突变，肿瘤的发生原因相对复杂，所以基因治疗的策略也很多：如癌症基因的表达；导入抑癌基因；增强机体的免疫力；增强机体对放疗或化疗的敏感性等多个方面。2003年中国国家食品药品监督管理局批准的世界第一个基因治疗药物“今又生”是一种在细胞内表达的抑制癌症基因(P53)，临床治疗结果显示，重组人p53腺病毒注射液对40余种实体瘤均有明确疗效。由于外源基因常常借助某些物理、化学或者生物学的方法进入癌症细胞。而进入细胞的外源基因因为容易被细胞内的生物酶消化降解，而影响基因治疗的效果，基因载体可以有效地保护治疗基因，是基因治疗的关键。基因载体主要分为病毒基因载体和非病毒基因载体两大类。脂质体作为代表性非病毒类的基因载体，本身具有很多的优良性质，包括较好的组织相容性、细胞亲和性，对携带基因的大小没有限制，易于制备等优势。脂质体虽然表现出较好的转基因效率，但在体内表达时间短、自身稳定性差被动靶向、稳定性差且阳离子脂质体达到一定浓度还会产生一定的细胞毒性，因此在临床应用中具有一定的局限性。随着纳米科技的发展，纳米材料因自身特有的声、光、电、磁，热力学性质，被用做合成与脂质体复合的纳米基因载体。金纳米脂质体复合材料生物相容性好，易于制备和靶向修饰等优点，在靶向给药、光热治疗、基因递送等领域展现广阔的应用前景。汪尔康小组近年来在脂质体金纳米作为基因载体方面进行了一系列的研究：合成了多种脂质体包覆的金纳米材料作为基因装载和递送的载体，这些载体具有较脂质体高的稳定性(Biomaterials2008,29,3617)，更高的基因递送以及从溶酶体中释放的效率(Biomaterials,2010,31,1850；Small,2015,11,2333)。
针对癌细胞比正常细胞对高温更敏感这一特点，人们开发出了一种通过提高身体尤其是肿瘤部位温度的方式来诱导癌细胞凋亡或直接杀死癌细胞的肿瘤热疗方法。光热疗法(Photothermal Therapy，PTT)也是热疗的一种，它是利用具有较高光热转换效率的材料，在外部光源(一般是近红外光，波长为750-1350nm)的照射下将光能快速转化为热能来杀死癌细胞的一种治疗方法。光热治疗技术具有应用范围广、无创伤、过程简单、选择性较强、对病灶周围正常组织损伤小等优点。可作为光热转换的纳米材料主要包括金纳米颗粒、金属硫化物、碳纳米管、石墨烯、纳米片、黑磷等。特别值得注意的是2010年诺贝尔奖的石墨烯材料，它具有许多独特的特性，包括较大的表面体积比和优异的电学和光学性能，具有易于表面功能化、癌症靶向性、良好的稳定性和生物相容性等优势。石墨烯脂质体纳米材料可作为基因或者药物的递送平台(Small2014,10,117；Colloids and Surfaces B:Biointerfaces,2016,147,315)。此外，石墨烯本身具有较强的近红外光吸收能力，是一种良好的纳米光热治疗的试剂(Photothermal Therapy Agent，PTA)，与碳纳米管相比，石墨烯具有更好的光热抗癌活性。与氧化石墨烯相比，还原后的氧化石墨烯在可见光区和近红外区均有明显的吸收。2010年刘庄课题组利用石墨烯原位注射到肿瘤部位，用近红外激光以2.0W/cm2的功率密度对肿瘤进行照射，肿瘤的消除效率达到100％(Nano Lett,2010,10,3318)。在癌症治疗中，基因治疗可以诱导癌细胞凋亡，下调热的表达休克蛋白，保护细胞免受由光热引起的热疗，或细胞的升高有毒的免疫细胞因子。结合PTT基因治疗有没有可能达到类似的治疗效果与较低激光强度。因此，PTT与基因的结合治疗可达到协同作用。李子刚课题组合成了叶酸分子和聚合物修饰氧化石墨烯，可以同时将两种基因的SiRNA高选择性的运送到胰腺癌细胞中，抑制靶基因的表达，体内抑瘤率大幅度提升(Theranostics 2017,7,1133)。研究结果表明，光热疗法与基因疗法结合，可显著提升抗肿瘤治疗的效果。目前常见的光热纳米材料大多需要在功率密度高于1.0W/cm2的近红外光的照射下，才能够显示出光热治疗的效果。设计和合成具有较高光热转换效率，并且具有快速光热转换的光热材料是开发新型癌症光热治疗系统的关键。
因此，研究一个安全、高效并且既可以转染基因又可以进行光热治疗的材料成为研究人员关注的热点之一，未来也有可能成为治疗癌症的重要突破。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种脂质体-石墨烯-金复合纳米材料及其制备方法和应用，该复合纳米材料既有光热治疗能力，也有基因递送能力。
本发明提供了一种脂质体-石墨烯-金复合纳米材料，包括脂质体和包覆在所述脂质体内的还原石墨烯-金纳米材料；
所述脂质体由正电磷脂、中性磷脂和叶酸修饰的二油酰基磷脂酰乙醇胺按照摩尔比为5～7:3～5:0.25溶解在氯仿中，干燥，水化，超声得到；所述正电磷脂选自二甲基二(十八烷基)溴化铵、(2,3-二油酰基-丙基)-三甲胺、双十二烷基二甲基溴化铵或1,2-二油醇-3-二甲基氨基-丙烷；所述中性磷脂选自二油酰基磷脂酰乙醇胺、二油酰基卵磷脂、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱或胆固醇；
所述脂质体和还原石墨烯的质量比为30～50:1。
优选地，所述还原石墨烯-金材料中金纳米材料选自具有近红外吸收性质的金纳米材料；所述近红外吸收性质的金纳米材料选自金纳米星、金纳米棒、金纳米壳和金纳米笼中的一种或多种。
本发明提供了一种上述技术方案所述脂质体-石墨烯-金复合纳米材料的制备方法，包括以下步骤：
a)将氧化石墨烯溶液和氯金酸在4-羟乙基哌嗪乙磺酸溶液中混合，搅拌，得到氧化石墨烯-金纳米材料；
采用正电磷脂、中性磷脂和叶酸修饰的二油酰基磷脂酰乙醇胺按照摩尔比为5～7:3～5:0.25溶解在氯仿中，干燥，水化，超声，得到澄清透明的正电磷脂-中性磷脂-叶酸修饰的二油酰基磷脂酰乙醇胺溶液；所述正电磷脂选自二甲基二(十八烷基)溴化铵、(2,3-二油酰基-丙基)-三甲胺、双十二烷基二甲基溴化铵或1,2-二油醇-3-二甲基氨基-丙烷；所述中性磷脂选自二油酰基磷脂酰乙醇胺、二油酰基卵磷脂、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱或胆固醇；
b)向澄清透明的正电磷脂-中性磷脂-叶酸修饰的二油酰基磷脂酰乙醇胺溶液中加入氧化石墨烯-金纳米材料，在还原剂存在下搅拌，离心，弃上清，水洗，得到脂质体-石墨烯-金复合纳米材料。
优选地，所述步骤a)中氧化石墨烯和氯金酸的质量比为1:1～3；
所述步骤a)中搅拌的速率为200～800rpm，搅拌的时间为55～65min。
优选地，所述步骤b)中澄清透明的正电磷脂-中性磷脂-叶酸修饰的二油酰基磷脂酰乙醇胺溶液按照以下方法制得：
将叶酸采用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺激活后与二油酰磷脂酰乙醇胺避光反应，再加入氯仿水溶液，震荡，离心，水洗，得到叶酸修饰的二油酰基磷脂酰乙醇胺；
将正电磷脂、中性磷脂和叶酸修饰的二油酰基磷脂酰乙醇胺按照质量比为5～7:3～5:0.25溶解在氯仿中，震荡均匀后，氮气吹干，过夜干燥，水化，超声直至得到澄清透明的正电磷脂-中性磷脂-叶酸修饰的二油酰基磷脂酰乙醇胺溶液。
优选地，所述叶酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和二油酰磷脂酰乙醇胺的质量比为0.0088:0.0192～0.0384:0.0035～0.0045；
所述避光反应的时间为4～5h。
优选地，所述步骤b)中还原剂选自抗坏血酸、硼氢化钠或柠檬酸钠；
所述在还原剂存在下搅拌的温度为32～37℃，时间为23～25h。
本发明提供了一种上述技术方案所述脂质体-石墨烯-金复合纳米材料或上述技术方案所述制备方法制备的脂质体-石墨烯-金复合纳米材料在制备用于胰腺癌的基因-光热治疗复合材料中的应用。
本发明提供了一种脂质体-石墨烯-金复合纳米材料，包括脂质体和包覆在所述脂质体内的还原石墨烯-金纳米材料；所述脂质体由正电磷脂、中性磷脂和叶酸修饰的二油酰基磷脂酰乙醇胺按照摩尔比为5～7:3～5:0.25溶解在氯仿中，干燥，水化，超声得到；所述正电磷脂选自二甲基二(十八烷基)溴化铵、(2,3-二油酰基-丙基)-三甲胺、双十二烷基二甲基溴化铵或1,2-二油醇-3-二甲基氨基-丙烷；所述中性磷脂选自二油酰基磷脂酰乙醇胺、二油酰基卵磷脂、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱或胆固醇；所述脂质体、还原石墨烯和金纳米材料的质量比为30～50:1:1～3。本发明采用上述脂质体包覆还原石墨烯-金纳米材料，使得复合纳米材料既有光热治疗能力，也有基因递送能力，两者协同治疗，大大提高其治疗效果，实现光热及基因协同治疗目的。该复合纳米材料生物相容性好，尺寸小，光热稳定性较好。实验结果表明：复合材料的水合粒径为50nm。在0.05W/cm2的功率密度下即可达到良好的治疗效果，并且在0.33W/cm2的功率密度下循环光热转换6次后，材料的光热转换能力基本也没有受到影响。
附图说明
图1为本发明实施例1制备的rGADA的透射电镜和动态光散射图；
图2为本发明实施例1制备的rGADA的琼脂糖凝胶电泳图；
图3为本发明实施例1制备的rGADA材料的细胞相容性测试结果
图4为本发明实施例1制备的rGADA的靶向能力测试图；
图5为本发明实施例1制备的rGADA纳米材料的光热能力与光稳定性测试图；
图6为处理48h后癌细胞的存活率。
具体实施方式
本发明提供了一种脂质体-石墨烯-金复合纳米材料，包括脂质体和包覆在所述脂质体内的还原石墨烯-金纳米材料；
所述脂质体由正电磷脂、中性磷脂和叶酸修饰的二油酰基磷脂酰乙醇胺按照摩尔比为5～7:3～5:0.25溶解在氯仿中，干燥，水化，超声得到；所述正电磷脂选自二甲基二(十八烷基)溴化铵、(2,3-二油酰基-丙基)-三甲胺、双十二烷基二甲基溴化铵或1,2-二油醇-3-二甲基氨基-丙烷；所述中性磷脂选自二油酰基磷脂酰乙醇胺、二油酰基卵磷脂、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱或胆固醇；
所述脂质体、还原石墨烯和金纳米材料的质量比为30～50:1:1～3。
本发明提供的脂质体-石墨烯-金复合纳米材料包括脂质体；所述脂质体由正电磷脂、中性磷脂和叶酸修饰的二油酰基磷脂酰乙醇胺按照摩尔比为5～7:3～5:0.25溶解在氯仿中，干燥，水化，超声得到。具体实施例中，所述脂质体由二甲基二(十八烷基)溴化铵、二油酰基磷脂酰乙醇胺和叶酸修饰的二油酰基磷脂酰乙醇胺制得。
本发明提供的脂质体-石墨烯-金复合纳米材料包括包覆在所述脂质体内的还原石墨烯-金纳米材料。所述还原石墨烯-金纳米材料由氧化石墨烯和氯金酸在4-羟乙基哌嗪乙磺酸溶液中搅拌，得到氧化石墨烯-进纳米材料，再还原，制得还原石墨烯-金纳米材料。在本发明中，所述还原石墨烯-金纳米材料中金纳米材料选自具有近红外吸收性质的金纳米材料；所述近红外吸收性质的金纳米材料选自金纳米星、金纳米棒、金纳米壳和金纳米笼中的一种或多种。所述金纳米材料具有近红外吸收能力，激光照射后能将光能转换成热能。
本发明提供了一种上述技术方案所述脂质体-石墨烯-金复合纳米材料的制备方法，包括以下步骤：
a)将氧化石墨烯溶液和氯金酸在4-羟乙基哌嗪乙磺酸溶液中混合，搅拌，得到氧化石墨烯-金纳米材料；
采用正电磷脂、中性磷脂和叶酸修饰的二油酰基磷脂酰乙醇胺按照摩尔比为5～7:3～5:0.25溶解在氯仿中，干燥，水化，超声，得到澄清透明的正电磷脂-中性磷脂-叶酸修饰的二油酰基磷脂酰乙醇胺溶液，即脂质体溶液；所述正电磷脂选自二甲基二(十八烷基)溴化铵、(2,3-二油酰基-丙基)-三甲胺、双十二烷基二甲基溴化铵或1,2-二油醇-3-二甲基氨基-丙烷；所述中性磷脂选自二油酰基磷脂酰乙醇胺、二油酰基卵磷脂、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱或胆固醇；
b)向澄清透明的正电磷脂-中性磷脂-叶酸修饰的二油酰基磷脂酰乙醇胺溶液中加入氧化石墨烯-金纳米材料，在还原剂存在下搅拌，离心，弃上清，水洗，得到脂质体-石墨烯-金纳米复合纳米材料。
本发明将氧化石墨烯溶液和氯金酸在4-羟乙基哌嗪乙磺酸溶液中混合，搅拌，得到氧化石墨烯-金纳米材料。在本发明中，所述氧化石墨烯和氯金酸的质量比为1:1～3。
所述氧化石墨烯是石墨采用Hummers方法制得。将氧化石墨烯置于60℃真空干燥箱中充分干燥；再取干燥后的氧化石墨烯溶解于水中，超声分散，得到氧化石墨烯溶液。所述氧化石墨烯溶液置于4℃保存，待用。所述氧化石墨烯为支撑分子，能够提高材料的稳定性，还能增加材料的光热转换能力。
本发明优选将氧化石墨烯(GO)溶液和氯金酸(HAuCl4)依次加入到4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)溶液中。氧化石墨烯和氯金酸的质量比为1:1～3。氧化石墨烯溶液、氯金酸和4-羟乙基哌嗪乙磺酸溶液混合后搅拌的速率为200～800rpm，搅拌的时间为55～65min，更优选为60min。具体实施例中，所述氧化石墨烯溶液的浓度为0.5mg/mL；氯金酸的浓度为100mmol/L；4-羟乙基哌嗪乙磺酸溶液的浓度为100mmol/L，pH值为7.4。搅拌结束后离心，弃上清，再水洗，再和水混合，得到氧化石墨烯-金纳米材料，备用。具体实例中，搅拌结束后12000rpm转速下离心10min，弃上清，再水洗2～3次，再和水混合。
本发明采用正电磷脂、中性磷脂和叶酸修饰的二油酰基磷脂酰乙醇胺溶液按照摩尔比为5～7:3～5:0.25溶解在氯仿中，干燥，水化，超声，得到澄清透明的正电磷脂-中性磷脂-叶酸修饰的二油酰基磷脂酰乙醇胺溶液；所述正电磷脂选自二甲基二(十八烷基)溴化铵、(2,3-二油酰基-丙基)-三甲胺、双十二烷基二甲基溴化铵或1,2-二油醇-3-二甲基氨基-丙烷；所述中性磷脂选自二油酰基磷脂酰乙醇胺、二油酰基卵磷脂、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱或胆固醇。
所述叶酸修饰的二油酰基磷脂酰乙醇胺优选按照以下方法制得：
将叶酸溶解后再与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)混合，置于避光处旋转反应，激活后，再与二油酰基磷脂酰乙醇胺避光反应，再加入氯仿水溶液，震荡，离心，水洗，得到叶酸修饰的二油酰基磷脂酰乙醇胺。
本发明优选将叶酸溶解于二甲基亚砜(DMSO)中，超声溶解后再与二油酰基磷脂酰乙醇胺混合，置于避光处旋转反应110～130min，激活叶酸。具体实施例中，本发明优选将二油酰磷脂酰乙醇胺溶于氯仿中，再加入到激活的叶酸溶液中，避光反应。所述避光反应温度为18～30℃；所述避光反应的时间为4～5h。
在本发明中，所述叶酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和二油酰基磷脂酰乙醇胺的质量比为0.0088:0.0192～0.0384:0.0035～0.0045。
避光反应结束后，加入氯仿水溶液，震荡，离心，水洗，得到叶酸修饰的二油酰基磷脂酰乙醇胺。具体实例中，加入氯仿水溶液后，震荡，混合物自发形成两相，10000rpm下离心5min收集氯仿中的DOPE-FA，水洗3～6次，得到叶酸修饰的二油酰基磷脂酰乙醇胺。
得到叶酸修饰的二油酰基磷脂酰乙醇胺后，本发明将正电磷脂、中性磷脂和叶酸修饰的二油酰基磷脂酰乙醇胺按照质量比为5～7:3～5:0.25溶解在氯仿中，震荡均匀后，氮气吹干，过夜干燥，水化，超声直至得到澄清透明的正电磷脂-中性磷脂-叶酸修饰的二油酰基磷脂酰乙醇胺溶液，即脂质体。
具体实施例中，二甲基二(十八烷基)溴化铵、二油酰基磷脂酰乙醇胺和叶酸修饰的二油酰基磷脂酰乙醇胺的质量比具体为7:3:0.25、或6:4:0.25或5:5:0.25。具体实施例中，二甲基二(十八烷基)溴化铵、二油酰基磷脂酰乙醇胺和叶酸修饰的二油酰基磷脂酰乙醇胺的总质量和氯仿的体积比为10mg:2mL。本发明优选在50～60℃下超声直至得到澄清透明的正电磷脂-中性磷脂-叶酸修饰的中性磷脂溶液，即脂质体溶液。
本发明向澄清透明的正电磷脂-中性磷脂-叶酸修饰的二油酰基磷脂酰乙醇胺溶液中加入氧化石墨烯-金纳米材料，在还原剂存在下搅拌，离心，弃上清，水洗，得到脂质体-石墨烯-金纳米复合纳米材料。
在本发明中，所述还原剂优选选自抗坏血酸溶液、硼氢化钠或柠檬酸钠。在还原剂存在下搅拌的温度为32～37℃，时间为23～25h。还原剂存在下搅拌结束后优选在12000rpm下离心12min，弃上清，水洗两次，得到脂质体-石墨烯-金纳米复合纳米材料。
本发明提供的方法简单，制备的复合纳米材料尺寸小，是一种既可转染又可光热治疗的材料，两个功能协同作用下能使细胞活性降至20％以下。
本发明提供了一种上述技术方案所述脂质体-石墨烯-金复合纳米材料在制备用于胰腺癌的基因-光热治疗复合材料中的应用。
为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种脂质体-石墨烯-金复合纳米材料及其制备方法和应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
(1)石墨烯@金纳米星(GO@AuNS)的制备
氧化石墨烯(GO)采用Hummers方法由石墨(购买的)制得。最后，将GO产物置于60℃的真空干燥箱中充分干燥。取一定量的GO溶解于去离子水中，浓度为1.0mg/mL，超声处理分散GO，将制备的GO溶液放在4℃保存。取660μLGO溶液(0.5mg/mL)和11μL氯金酸(HAuCl4,100mM)依次加入至10mLHEPES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)溶液中(pH＝7.4,100mM)。于450rpm转速下搅拌1小时(h)后，所形成的墨绿色溶液即为GO@AuNS溶液；此时，AuNS吸附到GO表面。12000rpm离心10min，弃上清，加入一定量的二次水清洗，摇匀，重复清洗2-3次，加入4mL二次水，置于4℃冰箱中备用。
(2)叶酸(FA)修饰的脂质体的制备
叶酸(FA)0.0088g溶于0.5mL DMSO二甲基亚砜中，超声溶解后加入0.020g EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺)，摇匀，至于避光处，18～30℃下旋转反应2h，激活FA后，称取0.004g DOPE(二油酰磷脂酰乙醇胺)溶于0.5mL氯仿中，加入至上述溶液，避光反应4.5h，然后加入1mL氯仿和1mL水，震荡摇匀后，混合物自发形成两相。10000rpm离心5min收集氯仿中的DOPE-FA，然后将1mL二次水加入所获得的氯仿溶液中，重复3～6次，对DOPE-FA进行纯化。
(3)脂质体的制备
将总质量为10mg的质量比为6:4:0.25的DODAB/DOPE/DOPE-FA溶解在2mL的氯仿中，震荡混合均匀后，通入氮气吹干，并进一步用真空干燥箱对其进行过夜干燥处理。然后，取4.5mL二次水加入干燥后的磷脂中，并于50-60℃的环境中进行超声直至溶液澄清透明。
(4)脂质体包覆的还原石墨烯@金纳米星(rGO@AuNS/DODAB/DOPE-FA,缩写为rGADA)的制备
向步骤(3)中澄清透明的DODAB/DOPE/DOPE-FA溶液加入2mL GO@AuNS溶液，室温下超声20min，加入10mg/mL的抗坏血酸溶液32-37℃下搅拌24h，12 000rpm离心12min，弃上清，加入一定量的二次水清洗，摇匀，重复清洗2次，加入200μL二次水备用。
图1为本发明实施例1制备的rGADA的透射电镜和动态光散射图，其中a为rGADA的透射电镜图，b为rGADA的动态光散射。由图1中a可以看出粒子表面形态为星状，图1中b可以看出材料的水合粒径大概为50nm。还测得其电势为+26.3mV，说明带正电的磷脂已经吸附在石墨烯和金纳米星复合材料的表面，而且带正电的材料有助于携带负电的DNA进入细胞。
为了研究材料对DNA装载能力，申请人利用琼脂糖凝胶电泳实验，对rGADA材料与质粒DNA的相互作用研究。所述质粒DNA为含有突变Kras基因的干扰序列的质粒，载体为pSuper(购买)；Kras干扰基因由公司合成，经过酶切后插入到上述载体中，插入序列为：5’-GATCCCCGTTGGAGCTGTTGGCGTAGTTAAGAGACTACGCCAACAGCT CCAACTTTTTGGAAA-3’双链DNA，构建的质粒DNA被命名为pSuper-Style1；
具体过程如下：100ng pSuper-Style 1质粒DNA分别与不同体积rGADA材料(3μL,6μL,9μL,12μL,15μL)混合，室温放置15分钟，然后进行琼脂糖凝胶电泳实验(1％琼脂糖)。如图2所示，图2为本发明实施例1制备的rGADA的琼脂糖凝胶电泳图，由图2可知：rGADA用量为9μL时即可将DNA结合，说明材料具有DNA装载能力。
本申请还进行了材料的生物相容性试验，利用CCK-8实验测试了rGADA材料对细胞活性的影响。首先，将癌细胞以10000个细胞/孔的密度分配到96孔板中，在细胞培养箱中经过过夜培养后，次日换上新鲜的细胞培养基。在培养基中依次加入终浓度为25μg/mL,50μg/mL,75μg/mL和100μg/mL rGADA载体材料，对照组加入相同体积的去离子水(材料浓度为0μg/mL)，每个浓度做5个复孔。将细胞放回细胞培养箱中继续培养48小时，再加入10μL CCK-8溶液(购自日本同仁化学研究所DOJINDO)，2小时后测细胞溶液在450纳米波长的吸收(酶标仪，Tecan Infinite 200Pro，瑞士)。通过去除背景，以及与对照组的相对吸光值的计算得出细胞的相对活性。细胞相对活性计算公式：细胞相对活力*(％Control)＝[A(加材料)-A(空白)]/[A(对照)-A(空白)]×100，测试结果如图3。图3为本发明实施例1制备的rGADA材料的细胞相容性测试结果。材料与细胞共孵育48小时后，当材料浓度为100μg/mL时，细胞的相对活性大于90％。材料的细胞毒性实验结果表明rGADA具有很好的细胞相容性，可作为癌症治疗的载体材料。
为了研究上述rGADA在活体中的靶向能力，申请人将接种于96孔板中的癌细胞分为2组，一组用正常的培养基，另一组含饱和的叶酸的培养基。然后将rGADA与FITC荧光素标记的DNA的复合物加至以上两组中，继续培养4小时后，用激光扫描共聚焦显微镜(LeicaTCS sp2，德国)对其成像(激发光波长为488nm)。与此同时，将细胞消化下来，用流式细胞仪进行分析(BD Biosciences，美国)。如图4所示，图4为本发明实施例1制备的rGADA的靶向能力测试图，其中，A为正常培养条件下的荧光图，B为含有饱和叶酸的荧光图，C为流式分析图，D为基因递送效率统计比较结果。由图4可知：正常培养基的条件下相比于加入饱和的叶酸的培养基，DNA的递送能力明显提高，说明该材料具有较好的靶向能力。
为了研究该纳米材料的光热能力与光稳定性，将1mL不同浓度的rGADA溶液置于无色透明比色皿中，用不同功率的激光(808nm)对其进行辐射，温度采集通过热电偶，每30秒读取一个温度。为了测试光稳定性，用激光辐射1mLrGADA溶液10分钟，然后降至室温，再进行10min照射并降温20min，如此反复测试6次。图5为本发明实施例1制备的rGADA纳米材料的光热能力与光稳定性测试图，其中，A表示rGADA纳米材料溶液的温度变化与激光功率密度有关。当50μg/mL溶液被不同功率的激光照射时，随激光功率的升高溶液的温度逐渐增大。图5中B所示温度的升高与rGADA浓度之间的关系也有关，当激光功率密度为0.33W/cm2，温度随着rGADA浓度的增加而逐渐增大。图5中C所示浓度为50μg/mL的rGADA溶液在连续六个周期的激光照射时，升高温度随时间的变化重复性很好，这说明材料的光热稳定性较好。
本申请还进行了细胞存活率实验，细胞存活率通过CCK-8法进行测试。首先，将癌细胞细胞以10000个/孔的密度接种于96孔板中，培养24小时后，不同条件的材料加入到孔中，继续培养48小时后，进行CCK-8测试。通过酶标仪(Tecan Infinite 200Pro，瑞士)获取450nm处的吸收强度并记录。如图6所示，图6为处理48h后癌细胞的存活率，其中，Blank为对照(对照为空白细胞，不做任何处理的)，rGADA为材料组(材料浓度为50μg/mL)；rGADA+laser为50μg/mL材料加上0.33W/cm2功率密度激光(808nm)照射；rGADApSuper为50μg/mL材料+空质粒pSuper+0.33W/cm2功率密度激光(808nm)照射；rGADA pSuper-Style 1为50μg/mL材料+Kras干扰质粒；rGADA pSuper-Style 1+laser为50μg/mL材料+Kras干扰质粒+0.33W/cm2功率密度激光(808nm)照射。由图6可知，对于材料本身或者材料加空白基因组，细胞活性较高，对于材料加激光或者材料加基因，细胞活性显著降低，而材料加Kras干扰质粒pSuper-Style 1并且光照后，细胞活性低于20％。
由以上实施例可知，本发明提供了一种脂质体-石墨烯-金复合纳米材料，包括脂质体和包覆在所述脂质体内的还原石墨烯-金纳米材料；所述脂质体由正电磷脂、中性磷脂和叶酸修饰的二油酰基磷脂酰乙醇胺按照摩尔比为5～7:3～5:0.25溶解在氯仿中，干燥，水化，超声得到；所述正电磷脂选自二甲基二(十八烷基)溴化铵、(2,3-二油酰基-丙基)-三甲胺、双十二烷基二甲基溴化铵或1,2-二油醇-3-二甲基氨基-丙烷；所述中性磷脂选自二油酰基磷脂酰乙醇胺、二油酰基卵磷脂、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱或胆固醇；所述脂质体、还原石墨烯和金纳米材料的质量比为30～50:1:1～3。本发明采用上述脂质体包覆还原石墨烯-金纳米材料，使得复合纳米材料既有光热治疗能力，也有基因递送能力，两者协同治疗，大大提高其治疗效果，实现光热及基因协同治疗目的。该复合纳米材料生物相容性好，尺寸小，光热稳定性较好。实验结果表明：复合材料的水合粒径约为50nm。在0.05W/cm2的功率密度下即可达到良好的治疗效果，并且在0.33W/cm2的功率密度下循环光热转换6次后，材料的光热转换能力基本也没有受到影响。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (2)

1.一种脂质体-石墨烯-金纳米材料的制备方法，包括以下步骤：
a）将氧化石墨烯溶液和氯金酸在4-羟乙基哌嗪乙磺酸溶液中混合，搅拌，得到氧化石墨烯-金纳米材料；氧化石墨烯和氯金酸的质量比为1:1~3；氧化石墨烯溶液、氯金酸和4-羟乙基哌嗪乙磺酸溶液混合后搅拌的速率为200~800 rpm，搅拌的时间为55~65 min；
将叶酸采用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺激活后与二油酰磷脂酰乙醇胺避光反应，再加入氯仿水溶液，震荡，离心，水洗，得到叶酸修饰的二油酰基磷脂酰乙醇胺；所述避光反应的时间为4~5 h；
将二甲基二（十八烷基）溴化铵、二油酰基磷脂酰乙醇胺和叶酸修饰的二油酰基磷脂酰乙醇胺按照质量比为5~7:3~5:0.25溶解在氯仿中，震荡均匀后，氮气吹干，过夜干燥，水化，超声直至得到澄清透明的正电磷脂-中性磷脂-叶酸修饰的二油酰基磷脂酰乙醇胺溶液；
所述叶酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和二油酰磷脂酰乙醇胺的质量比为0.0088: 0.0192~0.0384:0.0035~0.0045；
b）向澄清透明的正电磷脂-中性磷脂-叶酸修饰的二油酰基磷脂酰乙醇胺溶液中加入氧化石墨烯-金纳米材料，在还原剂存在下搅拌，离心，弃上清，水洗，得到脂质体-石墨烯-金复合纳米材料；所述还原剂为抗坏血酸溶液;
所述步骤b)中在还原剂存在下搅拌的温度为32~37 ℃，时间为23~25 h；
所述脂质体-石墨烯-金复合纳米材料包括脂质体和包覆在所述脂质体内的还原石墨烯-金纳米材料；所述还原石墨烯-金纳米材料中金纳米材料选自具有近红外吸收性质的金纳米材料；所述近红外吸收性质的金纳米材料为金纳米星；
所述脂质体、还原石墨烯和金纳米材料的质量比为30~50:1:1~3。
2.一种权利要求1所述制备方法制备的脂质体-石墨烯-金复合纳米材料在制备用于胰腺癌的基因-光热治疗复合材料中的应用。
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