CN110368501B - 一种rgd肽修饰的硼载药体系及其制备和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种RGD肽修饰的硼载药体系及其制备和应用，RGD肽修饰的硼复合材料作为药物载体负载药物。本发明实验条件易控制且操作简单；得到的载药复合物具有良好的生物相容性，能够长效缓释，且具有pH和近红外光(NIR)双重敏感药物释放性质，在较低pH值和近红外光照射环境下释放率高，适合肿瘤组织的微环境，可用于联合低温光热治疗和化疗协同作用，具有在制备肿瘤靶向、成像及协同治疗药物方面的应用前景。

Description

一种RGD肽修饰的硼载药体系及其制备和应用
技术领域
本发明属于载药体系及其制备和应用领域，特别涉及一种RGD肽修饰的硼载药体系及其制备和应用。
背景技术
恶性肿瘤严重威胁人类健康和生命，肿瘤治疗已经成为当前医学研究领域所面临的一个重大挑战。目前，肿瘤的治疗手段主要以手术切除、放射性治疗以及化学药物治疗为主，同时利用基因、生物治疗等方法作为辅助治疗。阿霉素是一种广谱高效的抗肿瘤药物，它主要通过嵌入DNA来抑制核酸的合成，从而达到对肿瘤细胞的杀伤作用。但是，大多数抗肿瘤药物都表现出高剂量引起的细胞毒性以及特异性和靶向性力不足引起的副作用。其中，最不利的一点是，静脉注射DOX不仅对病变部位细胞有杀伤能力，而且对正常组织的毒性是不能避免的，因此，选择合适的药物载体，对于这种抗肿瘤药物的临床应用尤为关键。具体来说，与传统药物相比，纳米药物传递系统能够表现出被动/主动的肿瘤位点靶向性和持续且智能的药物释放特点，同时可以实现多种治疗方法协同抗癌的效果。
众所周知，光热疗法(PTT)是目前新兴的一种新型癌症治疗方法，它通过光热剂在近红外光诱导下将光年转化为热能，从而实现肿瘤消融。与传统癌症治疗方法相比，光热治疗具有微创的显著优势和更好的功效。同时，PTT也与其他方法一起应用以进行协同抗癌治疗，特别是化学疗法和光热疗法的协同治疗。据研究报告显示协同化学光热疗法的肿瘤治疗效果，优于任何单一治疗方式。然而，由于经过热处理的细胞容易获得对热应激的耐受性，所以需要相对高的温度(>50℃)来实现所需的治疗效果。但这种高温会对肿瘤附近的正常器官造成损害并限制激光的穿透深度。因此，基于纳米材料的低温光热治疗预计将成为新一代癌症治疗方法。热休克蛋白(Hsp)是一种被证明可激活肿瘤防御机制的因子，在热耐药中起着关键作用。所以，利用热休克蛋白抑制剂17-AAG负载在硼纳米载体上，可实现低温光热/化疗的协同抗癌作用。
值得注意的是，肿瘤位置的微环境比正常组织的温度稍微高些(1～2℃高于正常组织)，偏酸性pH值(略低于正常组织)和伴随着高酶浓度的过度细胞增殖，这些都会减弱细胞毒性药物的治疗效果。而根据这些特点可以合成一些温度、酶或pH响应性的药物传递载体，通常被称为“智能纳米载体”，因为它们能够在肿瘤位置经历快速、突然和可逆的结构/属性改变，以应对周围环境的微小变化。针对上述问题，吴建荣等报道了用于抑制Hsp90的基于HMONs的纳米复合物，在低温条件下可以有效地抑制癌细胞。遗憾的是，该纳米复合物药物负载量相对较低且所利用的光热转换机缺乏药物负载能力。
作为乳腺癌治疗的多功能药物载体，对纳米颗粒的肿瘤主动靶向性做进一步的改进是必要的。肿瘤生长、发展和转移的整个过程都离不开血管的生长，整合素αvβ3在肿瘤新生血管的细胞膜表面具有高表达，成为肿瘤新生血管的标志分子之一。据我们所知，采用低温光热治疗与化疗协同治疗策略构建基于B NSs的纳米复合物的研究尚未报道。因此，开发基于B NSs肽的纳米载药平台对于乳腺癌治疗的进一步生物医学应用有着很大的促进作用。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种RGD肽修饰的硼载药体系及其制备和应用，克服现有技术存在的生物系统异质性、生物相容性差、药物装载能力弱等局限。针对上述问题，利用聚乙二醇和RGD肽先后修饰的方法，构建了基于B纳米片的药物载体，提高了材料的稳定性及靶向性能，实现了阿霉素(DOX)与热休克蛋白抑制剂(17AAG)的有效装载。该纳米载体具有强烈的近红外光吸收、优异的光热转换性能、pH和近红外光双重敏感的药物释放性质，可以用于联合低温光热治疗和化疗协同作用，实现热化疗更为显著的肿瘤抑制效果，同时具有良好的生物安全性。
本发明一种RGD肽修饰的硼复合材料，所述复合材料为RGD肽与聚乙二醇修饰硼纳米片复合获得。其中RGD肽为cRGD。
本发明的一种RGD肽修饰的硼复合材料的制备方法，包括：
(1)将H2N-PEG-NH2分散在硼纳米片溶液中，超声，搅拌，离心，洗涤，得到聚乙二醇修饰的硼纳米片B-PEG；
(2)RGD肽cRGD溶液中加入EDC和NHS，超声，然后加入聚乙二醇修饰的硼纳米片B-PEG溶液中，室温搅拌反应12-24h，透析，即得RGD肽修饰的硼复合材料B-PEG-cRGD。
所述步骤(1)中H2N-PEG-NH2的分子量大小为2000；H2N-PEG-NH2与硼纳米片的质量比为5：1-10：1。
所述步骤(1)中硼纳米片由下列方法制备：
将硼粉分散在溶剂中，超声，分级离心得到沉淀物，再洗涤后在650℃下加热2h，超声，离心，得到硼纳米片；其中溶剂为体积比为1:1的NMP(N-甲基-2-吡咯烷酮)和无水乙醇。
所述硼粉分散在溶剂后的浓度为5mg/mL。
所述分级离心为先以3,000rpm离心5-10min去掉沉淀，再将上清液以12,000rpm离心10-20min；加热的温度上升速率为5℃/min。
所述再洗涤后在650℃下加热2h，超声，离心具体为：沉淀物用乙醇洗涤后除去乙醇，将收集的硼片置于坩埚中并在650℃下加热2h，并在水中进行探针超声处理，将所得混合物以12,000rpm离心30min。
所述步骤(2)中RGD肽、EDC、NHS摩尔比为1：1：1；RGD肽与B-PEG的质量比为1：4～8。
所述步骤(2)中RGD肽cRGD溶液与B-PEG溶液的溶剂均为PBS缓冲液(pH＝6.5，0.2M)。本发明的一种所述RGD肽修饰的硼复合材料的载药体系。
所述RGD肽修饰的硼复合材料负载药物阿霉素DOX和/或热休克蛋白抑制剂17-AAG。
本发明的一种所述RGD肽修饰的硼复合材料的载药体系的制备方法，包括：
将阿霉素DOX溶液滴加入搅拌的B-PEG-cRGD溶液中，搅拌反应12-24h，透析、冷冻干燥，得到DOX@B-PEG-cRGD；
然后将热休克蛋白抑制剂17-AAG溶液加入DOX@B-PEG-cRGD水溶液中，搅拌反应12-24h，透析、冷冻干燥，即得；其中B-PEG-cRGD纳米复合物与阿霉素DOX的质量比为1：0.25～1：3；DOX@B-PEG-cRGD纳米复合物与热休克蛋白抑制剂17-AAG的质量比为1：0.1～1:1。
所述B-PEG-cRGD溶液的溶剂为PBS缓冲液(pH＝7.0)；药物阿霉素DOX溶液与药物热休克蛋白抑制剂17-AAG溶液的溶剂为二甲基亚砜(DMSO)。
所述透析时间为2天，冷冻干燥时间为2～4天。
所述热休克蛋白抑制剂17-AAG即为热休克蛋白90(Hsp90)抑制剂烯丙胺基-17-去甲氧基格尔德霉素(17-AAG)。
所述热休克蛋白抑制剂17-AAG溶液的浓度为0.05-1mg/mL。
本发明所述的一种RGD肽修饰的硼复合材料的载药体系在制备基于pH和近红外光双响应型肿瘤靶向药物中的应用，如制备乳腺癌靶向药物。
所述RGD肽修饰的硼复合材料的载药体系在成像及协同治疗方面有良好的应用前景。
有益效果
(1)本发明制备的纳米颗粒DOX-17AAG@B-PEG-cRGD的大小平均180nm，和现有纳米颗粒相比本发明制备的纳米颗粒大小更为合适，能最大程度的通过EPR效应将药物递送到肿瘤部位；
(2)本发明制备的乳腺癌靶向的硼纳米载药复合材料药物装载量高(相关数据在后面的数据中体现)，能够长效缓释，且具有pH和近红外光双响应输送，在较低pH和近红外光照射环境下释放率高，适合肿瘤组织的微环境，具有应用其做后续相关实验分析的潜力；
(3)本发明制备的乳腺癌靶向的硼纳米载药复合物中的cRGD可以实现其对乳腺癌癌细胞的主动靶向作用，cRGD可靶向细胞表面高表达的整合素(主要是αvβ3)，提高对癌细胞的抑制作用。
(4)本发明的硼纳米载药复合材料在较低功率(0.5W/cm2)的激光照射下产生高热，且能在较低温度下(43℃)对癌细胞有较大的杀伤作用，具有应用于肿瘤靶向及协同治疗的前景；
(5)本发明方法简单，反应条件温和，易于操作，具有产业化实施的前景。
附图说明
图1为本发明实施例1中DOX-17AAG@B-PEG-cRGD纳米复合物的TEM图。
图2为本发明实施例1中纳米复合物载药前、后的紫外吸收光谱。
图3为本发明实施例1中硼载药体系建立各部分产物的Zeta电势变化。
图4为本发明实施例1中DOX-17AAG@B-PEG-cRGD纳米复合物的流体动力学直径分布图。
图5为本发明实施例2中DOX-17AAG@B-PEG-cRGD纳米复合物的药物释放图；其中A为DOX载药释放率，B为17AAG载药释放率。
图6为本发明实施例3中MDA-MB-231细胞与B-PEG-cRGD+NIR、游离DOX、DOX-17AAG@B-PEG、DOX@B-PEG-cRGD+NIR、DOX-17AAG@B-PEG-cRGD+NIR(0.5W/cm2，30min)共同孵育后的相对细胞存活率。
图7为本发明实施例4中DOX-17AAG@B-PEG、DOX-17AAG@B-PEG-cRGD纳米颗粒的对HUVEC及MBA-MD-231细胞的激光共聚焦显微镜结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
(1)硼纳米片的制备方法为：将0.5g硼粉(购自上海阿拉丁化学试剂有限公司)分散在100mL混合的NMP(N-甲基-2-吡咯烷酮)和乙醇(1：1，v/v)中,冰浴探针超声处理5h后以3,000rpm离心10min以弃去大块B。将上清液以12,000rpm离心20min，用乙醇洗涤三次后通过真空旋转蒸发除去乙醇。将收集的B片置于坩埚中并在650℃下加热2h。反应结束后收集产物并在水中进行探针超声处理。最后，将所得混合物以12,000rpm离心30min，收集沉淀物。
(2)将10mg的H2N-PEG-NH2(MW：2000Da，购自上海亚亦生物科技有限公司)分散在10mL的B NSs(B浓度为200μg/mL)水溶液中。在超声30min并磁力搅拌12h后，将所得混合物以2500rpm(4℃)离心30min以除去未负载的H2N-PEG-NH2分子，并使用同样的方法洗涤3次。将得到的B-PEG NSs样品重悬于超纯水中供进一步使用，并储存在4℃下。
将B-PEG(60mg，0.03mmol)溶解于1mL PBS缓冲液(pH＝6.5，0.2M)中。将cRGD(9.3mg，0.015mmol，购自国药集团化学试剂有限公司)溶于1mL PBS缓冲液(pH＝6.5，0.2M)中，然后向cRGD溶液中加入3.8mg EDC和2.3mg NHS并超声10min。随后将其缓慢加入B-PEG/PBS溶液中，并在室温下缓慢搅拌24h。反应产物用去离子水透析纯化、冷冻干燥，收集得到B-PEG-cRGD。
(3)将10mg的B-PEG-cRGD分散在PBS(pH＝7.0)缓冲液中，将预先溶解在DMSO中的5mg的DOX(购自阿拉丁生化科技股份有限公司)快速加入到B-PEG-cRGD分散体中。磁力搅拌24h后，使用纤维素膜(MW：3500Da)对混合溶液进行透析纯化，收集产物(命名为DOX@B-PEG-cRGD)。将预先溶解在DMSO中的5mg的17AAG(购自大连美仑生物科技有限公司)与DOX@B-PEG-cRGD(0.5mg/mL)混合并搅拌过夜以形成DOX-17AAG@B-PEG-cRGD。通过透析除去过量的未负载的17AAG，离心，冷冻干燥，得到DOX-17AAG@B-PEG-cRGD纳米复合物。
所述步骤(3)中17AAG与DOX@B-PEG-cRGD的质量比为1:2。通过UV与HPLC分别对DOX与17AAG进行载药能力的评估，结果显示载药率DOX为41.68％，17AAG为38.67％。
所制得的硼纳米片的TEM图如图1所示，可以看出存在层数较少甚至单层的硼纳米片，表明硼纳米片的成功制备。然而单纯的硼纳米片容易聚集，纳米直径比图4所示的DOX-17AAG@B-PEG-cRGD纳米复合物要大。
纳米复合物载药前、后的紫外吸收光谱如图2所示，表明药物阿霉素DOX与热休克蛋白抑制剂17-AAG成功负载到载体B-PEG-cRGD上，也表明了硼载药体系DOX-17AAG@B-PEG-cRGD的成功制备。
硼载药体系建立各部分产物的Zeta电势变化如图3所示，表明硼载药体系DOX-17AAG@B-PEG-cRGD的成功制备。
的流体动力学平均直径约180nm(如图4所示)，相对稳定，可以很好的发挥肿瘤靶向治疗的EPR效应，适合体内静脉注射。
实施例2
(1)硼纳米片的制备方法为：将硼粉0.5g分散在100mL混合的NMP(N-甲基-2-吡咯烷酮)和乙醇(1：1，v/v)中,冰浴探针超声处理5h后以3,000rpm离心10min以弃去大块B。将上清液以12,000rpm离心20min，用乙醇洗涤三次后通过真空旋转蒸发除去乙醇。将收集的B片置于坩埚中并在650℃下加热2h。反应结束后收集产物并在水中进行探针超声处理。最后，将所得混合物以12,000rpm离心30min，收集沉淀物。
(2)将10mg的H2N-PEG-NH2分散在10mL的B NSs/H2O(B浓度为200μg/mL)溶液中。在超声30min并磁力搅拌12h后，将所得混合物以2500rpm(4℃)离心30min以除去未负载的H2N-PEG-NH2分子，并使用同样的方法洗涤3次。将得到的B-PEG NSs样品重悬于超纯水中供进一步使用，并储存在4℃下。
将B-PEG(60mg，0.03mmol)溶解于1mL PBS缓冲液(pH＝6.5，0.2M)中。将cRGD(9.3mg，0.015mmol)溶于1mL PBS缓冲液(pH＝6.5，0.2M)中，然后向cRGD溶液中加入3.8mgEDC和2.3mg NHS并超声10min。随后将其缓慢加入B-PEG/PBS溶液中，并在室温下缓慢搅拌24h。反应产物用去离子水透析纯化、冷冻干燥，收集得到B-PEG-cRGD。
(3)将10mg的B-PEG-cRGD分散在PBS(pH＝7.0)缓冲液中，将预先溶解在DMSO中的5mg的DOX快速加入到B-PEG-cRGD分散体中。磁力搅拌24h后，使用纤维素膜(MW：3500Da)对混合溶液进行透析纯化，收集产物(命名为DOX@B-PEG-cRGD)。将预先溶解在DMSO中的5mg的17AAG与DOX@B-PEG-cRGD(0.5mg/mL)混合并搅拌过夜以形成DOX-17AAG@B-PEG-cRGD。通过透析除去过量的未负载的17AAG，离心，冷冻干燥，得到DOX-17AAG@B-PEG-cRGD纳米复合物。
所述步骤(3)中17AAG与DOX@B-PEG-cRGD的质量比为1:2。通过UV与HPLC分别对DOX与17AAG进行载药能力的评估，结果显示载药率DOX为41.68％，17AAG为38.67％。
(4)取冷冻干燥后的载药纳米颗粒5mg于1mL PBS缓冲液中，使其充分溶解后，分别取50μL置于两个微量透析管中，将其悬浮于离心管内，离心管中加入pH 7.4和pH 5.0的磷酸盐缓冲液20mL，将其分别置于37℃水浴振荡器中，振荡频率为100次/min，定时取样1mL。取出的样品在高速离心机中离心，转速为10000r/min，30分钟。HPLC法测定上清液中阿霉素DOX与热休克蛋白抑制剂17-AAG的含量。整理数据后计算药物释放情况。
分别设置不同的pH(pH5.0和pH7.4)和有无近红外光照射的环境条件，研究体外环境变化对霉素DOX与热休克蛋白抑制剂17-AAG释放的影响。如图5所示，在不同条件下，在无近红外光照射条件下pH7.4时药物释放缓慢，DOX最大释放率为18.4％，17-AAG最大释放率为18.6％，在pH5.0时药物释放速度稍微加快，DOX最大释放率为41.8％，17-AAG最大释放率为41.9％；在有近红外光照射条件下(功率为0.5W/cm2)，当PH为7.4时DOX最大释放率为50.3％，17-AAG最大释放率为，而在pH5.0释放速率迅速加快，72小时内DOX累积释放最大达到66.5％,17-AAG累积释放最大达到73.1％。肿瘤环境的pH比正常组织低，且温度也比正常组织的温度高约0.5℃，所通过以上的药物释放数据证明DOX-17AAG@B-PEG-cRGD载药体系能很好的响应肿瘤微环境。
实施例3
在96孔板中种入MDA-MB-231细胞，每孔的细胞个数大约为10000个，每孔补足200μL的DMEM全培养基，在37℃和5％CO2恒温培养箱中培养24h。之后去掉旧的培养基，用PBS缓冲液清洗后每孔加入20μL不同浓度的B-PEG-cRGD、游离DOX、DOX-17AAG@B-PEG、DOX@B-PEG-cRGD、DOX-17AAG@B-PEG-cRGD溶液，并补足180μL新鲜培养基，继续放入恒温培养箱培养24h。其中B-PEG-cRGD+NIR、DOX@B-PEG-cRGD+NIR、DOX-17AAG@B-PEG-cRGD+NIR组在功率为0.5W/cm2的808nm激光照射30min后，继续放入恒温培养箱培养(共24h)。加入20μL的5mg/mL的MTT溶液，在培养箱中孵育4h，去除孔内培养液，并添加200μL DMSO，置摇床上避光低速振荡15-20min，使用酶联免疫检测仪检测490nm处各孔的紫外吸收值。各组药物的细胞MTT实验结果如图6所示，我们可以看到B-PEG-cRGD+NIR与游离DOX组对MDA-MB-231细胞都有一定的杀伤效果；DOX@B-PEG-cRGD+NIR组对癌细胞的杀伤效果优异于B-PEG-cRGD+NIR与游离DOX组，说明了协同化疗与光热治疗的良好的作用。由于癌细胞在治疗过程中产生耐热性，DOX@B-PEG-cRGD+NIR组对癌细胞的杀伤能力弱于DOX-17AAG@B-PEG-cRGD+NIR组，且在实验药物浓度范围内，药物浓度越大效果越明显。
实施例4
在24孔细胞培养板中放入18mm细胞爬片，分别种入HUVEC和MBA-MD-231细胞，每孔细胞密度大约为1.0×104个，并补足每孔2mL的培养液，在5％CO2，37℃的条件下于培养箱中培养24h。弃去旧培养基，分别加入200μL含有DOX-17AAG@B-PEG、DOX-17AAG@B-PEG-cRGD载药纳米颗粒的PBS溶液，并补足1.5mL的新鲜培养基，共同孵育3h。弃去含材料的培养液，并用PBS清洗两次，加入1mL 2.5％的戊二醛固定15min。吸去戊二醛，并用PBS冲洗，加入1mlDAPI避光染色15min。吸去DAPI，并用PBS冲洗，将盖玻片取出，滴一滴荧光封闭剂，置于载玻片上，进行激光共聚焦显微镜检测。
cRGD修饰和没有修饰的DOX-17AAG@B-PEG载药纳米颗粒孵育后的细胞荧光显微镜图像结果显示如图7所示，两种纳米颗粒在对照组HUVEC细胞的细胞核中均未见明显的荧光，但在细胞核周围出现荧光。另一方面，cRGD没有修饰的DOX-17AAG@B-PEG载药纳米颗粒在MDA-MB-231细胞的细胞核中表现出微弱的红色荧光强度，而cRGD修饰的DOX-17AAG@B-PEG-cRGD载药纳米颗粒在MDA-MB-231细胞的细胞核中表现出强烈的荧光强度。说明RGD肽cRGD的修饰使载药纳米颗粒识别表面受体以至于更加容易进入乳腺癌细胞而发挥优异的肿瘤杀伤作用。

Claims (7)

1.一种RGD肽修饰的硼复合材料的载药体系的制备方法，包括：
将配置好的阿霉素DOX溶液滴加入搅拌的B-PEG-cRGD溶液中，搅拌反应12-24h，透析、冷冻干燥，得到DOX@B-PEG-cRGD；其中B-PEG-cRGD为RGD肽与聚乙二醇修饰硼纳米片复合获得；
然后将热休克蛋白抑制剂17-AAG溶液加入DOX@B-PEG-cRGD水溶液中，搅拌反应12-24h，透析、冷冻干燥，即得；其中B-PEG-cRGD纳米复合物与阿霉素DOX的质量比为1：0.25~1：2；DOX@B-PEG-cRGD纳米复合物与热休克蛋白抑制剂17-AAG的质量比为1：0.1~1:1。
2.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述B-PEG-cRGD由下列方法制备，包括：
（1）将H2N-PEG-NH2分散在硼纳米片溶液中，超声，搅拌，离心，洗涤，得到聚乙二醇修饰的硼纳米片B-PEG；
（2）在RGD肽溶液中加入EDC和NHS，超声，然后将上述溶液加入B-PEG溶液中，室温搅拌反应12-24h，透析，即得RGD肽修饰的硼复合材料B-PEG-cRGD。
3.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中H2N-PEG-NH2的分子量大小为2000；H2N-PEG-NH2与硼纳米片的质量比5：1-10：1。
4.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中硼纳米片由下列方法制备：将硼粉分散在溶剂中，超声，分级离心得到沉淀物，再洗涤后在650 ℃下加热2 h，超声，离心，得到硼纳米片。
5.根据权利要求4所述制备方法，其特征在于，所述分级离心为先以3,000 rpm离心5-10 min去掉沉淀，再将上清液以12,000 rpm离心10-20 min；加热的温度上升速率为5 ℃/min。
6.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中RGD肽、EDC、NHS摩尔比为1：1：1；RGD肽与B-PEG的质量比为1：4~8。
7.一种权利要求1所述方法制备的RGD肽修饰的硼复合材料的载药体系在制备基于pH和近红外光双响应型肿瘤靶向药物中的应用。
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