CN114699526B - 一种藻蓝蛋白矿化纳米粒及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种藻蓝蛋白矿化纳米粒及其制备方法和应用,所述制备方法包括:在搅拌条件下,向藻蓝蛋白溶液中滴加锰盐溶液进行反应,得到藻蓝蛋白‑锰离子络合物混悬液;调节藻蓝蛋白‑锰离子络合物混悬液的pH值至6~11,再搅拌反应一段时间,得到藻蓝蛋白矿化物混悬液;在搅拌条件下,向藻蓝蛋白矿化物混悬液中添加盐酸多巴胺进行反应,再经离心、水洗,既得所述藻蓝蛋白矿化纳米粒;本发明制备得到的瘤藻蓝蛋白矿化纳米粒,其尺寸可控,生物相容性好,可在激光刺激下发挥较强的光热‑光动力效应杀伤肿瘤,而且骨架中的二氧化锰可与肿瘤内过表达的过氧化氢反应产生氧气和锰离子,提高藻蓝蛋白的光动力抗肿瘤效果。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学材料技术领域,具体涉及一种藻蓝蛋白矿化纳米粒及其制备方法和应用。
背景技术
藻蓝蛋白(Phycocyanin,Pc)是一种从螺旋藻中分离出的深蓝色粉末,是螺旋藻细胞中重要的光合作用天然色素卟啉类色素蛋白,具有很好的水溶性。目前已被批准作为天然食用色素和营养食品使用于人们生活活动中,具有良好的安全性。
研究表明,藻蓝蛋白还可作为天然光敏剂通过光动力治疗策略杀伤肿瘤,在适宜波长的光激发下可以产生单线态氧及其它的氧自由基来杀伤肿瘤细胞内生物大分子,从而诱导肿瘤组织坏死。然而,藻蓝蛋白在体内复杂的生理环境下容易被蛋白酶降解或破坏,存在肿瘤富集能力差及免疫原性高等问题,导致其临床应用受到明显限制。此外,肿瘤严重乏氧的微环境极大地减弱了成功到达肿瘤区域的藻蓝蛋白的光动力杀伤效应,导致不佳的抗肿瘤效果。因此,如何高效地共输送藻蓝蛋白和氧气是目前肿瘤光动力治疗亟需解决的关键科学问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种藻蓝蛋白矿化纳米粒及其制备方法和应用,本发明藻蓝蛋白矿化纳米粒具有优异的生物相容性,并能够在激光刺激下发挥较强的光热-光动力效应杀伤肿瘤,具有优异的抗肿瘤效果。
为了实现本发明的上述目的,特采用以下技术方案:
本发明第一方面提供了一种藻蓝蛋白矿化纳米粒的制备方法,所述制备方法包括如下步骤:
(a)在搅拌条件下,向藻蓝蛋白溶液中滴加锰盐溶液进行反应,得到藻蓝蛋白-锰离子络合物混悬液;
(b)调节藻蓝蛋白-锰离子络合物混悬液的pH值至6~11,再搅拌反应一段时间,得到藻蓝蛋白矿化物混悬液;
(c)在搅拌条件下,向藻蓝蛋白矿化物混悬液中添加盐酸多巴胺进行反应,再经离心、水洗,既得所述藻蓝蛋白矿化纳米粒。
优选地,所述步骤(a)中,搅拌速率500~1200rpm;反应温度为4~40℃,时间为20~40min。
优选地,所述步骤(a)中,藻蓝蛋白溶液与锰盐溶液的体积比为(15~25)∶1,其中,藻蓝蛋白溶液浓度为0.1~50mg/mL,锰盐溶液浓度为0.5~50mg/mL;
所述锰盐溶液为二氯化锰溶液、三氯化锰溶液或四氯化锰溶液。
优选地,所述步骤(b)中,搅拌反应条件如下:搅拌速率为100~1500rpm,反应时间为0.5~4h。
优选地,所述步骤(c)中,盐酸多巴胺的添加量与藻蓝蛋白的质量比为3∶(15000~25000)。
优选地,所述步骤(c)中,搅拌转速为800~1200rpm;反应时间为0.5~4h;反应温度为10~30℃。
优选地,所述步骤(c)中,离心转速为5000~30000rpm,离心时间为3~12min。
本发明第二方面提供一种上述制备方法制备得到的藻蓝蛋白矿化纳米粒。
本发明第三方面提供一种上述制备方法制备得到的藻蓝蛋白矿化纳米粒在制备治疗肿瘤药物或诊断试剂中的应用。
本发明第四方面提供一种用于治疗肿瘤的药物,所述药物包括上述制备方法制备得到的藻蓝蛋白矿化纳米粒。
与现有技术相比,本发明的有益效果至少包括:
本发明制备方法制备得到了一种抗肿瘤藻蓝蛋白矿化纳米粒,其尺寸可控,生物相容性好,可在激光刺激下发挥较强的光热-光动力效应杀伤肿瘤,而且骨架中的二氧化锰可与肿瘤内过表达的过氧化氢反应产生氧气和锰离子,提高藻蓝蛋白的光动力抗肿瘤效果;同时降解产物锰离子具有核磁共振成像的能力,可以对肿瘤进行诊断。此外,位于本发明藻蓝蛋白矿化纳米粒的纳米骨架中的聚多巴胺具有光热效应,经与藻蓝蛋白共同作用,进一步增强抗肿瘤效率,拓展了其新生物医学应用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案,下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。在所有附图中,类似的元件或部分一般由类似的附图标记标识。附图中,各元件或部分并不一定按照实际的比例绘制。
图1为本发明实施例中MnPc@PDA纳米复合物的电镜扫描图。
图2为本发明实施例中MnPc@PDA纳米复合物的粒径分布图。
图3为本发明实施例中MnPc@PDA纳米复合物的Zeta电位分布。
图4为本发明实施例中MnPc@PDA纳米复合物的X射线光电子图谱。
图5为本发明实施例中MnPc@PDA纳米复合物在过氧化氢存在下的ROS产生能力。
图6为本发明实施例中MnPc@PDA纳米复合物的紫外-可见光光谱图。
图7为本发明实施例中MnPc@PDA纳米复合物的光热性能研究结果。
图8为本发明实施例中MnPc@PDA纳米复合物的细胞毒性试验结果统计图。
图9为本发明实施例中MnPc@PDA纳米复合物在激光处理下的细胞毒性试验结果统计图。
图10为本发明实施例中MnPc@PDA纳米复合物的细胞ROS产生能力测试图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明技术方案的实施例进行详细的描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案,因此只作为示例,而不能以此来限制本发明的保护范围。
需要注意的是,除非另有说明,本申请使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域技术人员所理解的通常意义。
实施例1
本实施例为一种藻蓝蛋白矿化纳米粒的制备方法,该制备方法包括如下步骤:
(a)于50mL单口圆底烧瓶中加入25mL去离子水再加入300mg藻蓝蛋白,在室温条件下温和搅拌5min;在1200rpm转速搅拌条件下,逐滴加入1mL浓度为20mg/mL的二氯化锰水溶液,继续搅拌反应40min,得到藻蓝蛋白-锰离子络合物混悬液;
(b)在200rpm搅拌条件下,采用1M氢氧化钠水溶液或1M盐酸溶液调节藻蓝蛋白-锰离子络合物混悬液的pH值至8;然后增加搅拌转速至1200rpm,继续搅拌反应4h,得到藻蓝蛋白矿化物混悬液;
(c)在室温、1200rpm搅拌条件下,向藻蓝蛋白矿化物混悬液中添加38μg盐酸多巴胺进行反应3h,再使用低温高速离心机以30000rpm经离心3min、水洗3次,既得上述藻蓝蛋白矿化纳米粒。
实施例2
本实施例为一种藻蓝蛋白矿化纳米粒的制备方法,该制备方法包括如下步骤:
(a)于50mL单口圆底烧瓶中加入15mL去离子水再加入75mg藻蓝蛋白,在室温条件下温和搅拌5min;在1000rpm转速搅拌条件下,逐滴加入1mL浓度为10mg/mL的二氯化锰水溶液,继续搅拌反应20min,得到藻蓝蛋白-锰离子络合物混悬液;
(b)在100rpm搅拌条件下,采用1M氢氧化钠水溶液或1M盐酸溶液调节藻蓝蛋白-锰离子络合物混悬液的pH值至7;然后增加搅拌转速至1000rpm,继续搅拌反应1h,得到藻蓝蛋白矿化物混悬液;
(c)在室温、1000rpm搅拌条件下,向藻蓝蛋白矿化物混悬液中添加15μg盐酸多巴胺进行反应1h,再使用低温高速离心机以10000rpm经离心12min、水洗3次,既得上述藻蓝蛋白矿化纳米粒。
实施例3
本实施例为一种藻蓝蛋白矿化纳米粒的制备方法,该制备方法包括如下步骤:
(a)于50mL单口圆底烧瓶中加入20mL去离子水再加入200mg藻蓝蛋白,在室温条件下温和搅拌5min;在1000rpm转速搅拌条件下,逐滴加入1mL浓度为12.6mg/mL的二氯化锰水溶液,继续搅拌反应30min,得到藻蓝蛋白-锰离子络合物混悬液;
(b)在100rpm搅拌条件下,采用1M氢氧化钠水溶液或1M盐酸溶液调节藻蓝蛋白-锰离子络合物混悬液的pH值至10;然后增加搅拌转速至1000rpm,继续搅拌反应2h,得到藻蓝蛋白矿化物混悬液;
(c)在室温、1000rpm搅拌条件下,向藻蓝蛋白矿化物混悬液中添加30μg盐酸多巴胺进行反应2h,再使用低温高速离心机以18000rpm经离心5min、水洗2次,既得上述藻蓝蛋白矿化纳米粒(记为MnPc@PDA)。
实验例
获得实施例3制备方法制得的藻蓝蛋白矿化纳米粒(记为MnPc@PDA);
1、对MnPc@PDA纳米复合物进行电镜扫描观察其形态大小,观察结果如图1所示;
从图1可看出,MnPc@PDA纳米复合物粒径分布均一,尺寸在50-70nm之间。
对MnPc@PDA纳米复合物进行粒径分布分析,结果如图2所示,图中A为不同粒径范围内的个数占比;B为不同粒径强度大小分布结果;
由图2可知,MnPc@PDA纳米复合物的流体动力学粒径(Number)为170nm左右;流体动力学粒径(Intensity)为250nm左右。
对MnPc@PDA纳米复合物进行Zeta电位分析,分析结果如图3所示;
由图3可知,MnPc@PDA纳米复合物的Zeta电位为-20mV左右。
对MnPc@PDA纳米复合物进行X射线光电子图谱(XPS)分析,分析结果如图4所示;图4A:总谱;图4B:Mn元素单谱图;
从图4A可看出,MnPc@PDA纳米复合物存在Mn、C、N、O元素,表明本发明的MnPc@PDA纳米复合物制备成功。从图4B可看出,MnPc@PDA纳米复合物的Mn元素主要以四价Mn离子存在。
2、对MnPc@PDA纳米复合物的物化性能进行分析:
对MnPc@PDA纳米复合物的ROS产生能力进行测试,具体地,ROS产生能力测试方法为:将MnPc@PDA纳米复合物(200μg/mL)分散在磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中,然后加入1mM 1,3-二苯基异苯并呋喃指示剂,最后加入H2O2(10mM),用紫外可见光光谱仪测量660nm激光照射溶液不同时间点的紫外吸收,结果如图5所示。
由图5可知,MnPc@PDA纳米复合物具有较强的ROS产生能力。
3、对不同浓度MnPc@PDA纳米复合物的光学吸收强度进行检测,结果如图6所示,图中,A:不同浓度的MnPc@PDA纳米复合物的紫外-可见光光谱图;B:MnPc@PDA纳米复合物在660nm处浓度与吸光度的线性关系;C:MnPc@PDA纳米复合物在808nm处浓度与吸光度的线性关系;
由图6中A可知,MnPc@PDA纳米复合物在紫外-可见光-近红外区均具有很强的光学吸收,且具有浓度依赖性。由B可知,MnPc@PDA纳米复合物在660nm波长处具有浓度依赖的光学吸收。由C可知,MnPc@PDA纳米复合物在808nm波长处具有浓度依赖的光学吸收。
4、在不同功率808nm激光条件下,对不同浓度MnPc@PDA纳米复合物的光热性能和光热稳定性进行评估:评估结果如图7所示,A、B为不同浓度和不同功率下激发温度变化,C为光热稳定性评估;
由图7中A可知,MnPc@PDA纳米复合物在808nm激光(1W/cm2)激发下具有较高的温度升高,呈现出浓度依赖性。由图7中B可知,MnPc@PDA纳米复合物(200μg/mL)在不同功率808nm激光激发下具有较高的温度升高,呈现出激光功率依赖性。由图7中C可知,MnPc@PDA纳米复合物经过五个循环的808nm激光照射后,仍表现出很强的光稳定性,未出现光热性能变弱的现象。
综上,MnPc@PDA纳米复合物具备光热治疗烧灼肿瘤的所需温度。
5、对MnPc@PDA纳米复合物的细胞毒性进行分析:
测试方法为:将人乳腺癌细胞MCF-7细胞以每孔8×103个细胞的密度接种于96孔板并培养12小时;用PBS洗涤一次后,将细胞与梯度浓度(0、3.13、6.25、12.5、25、50、100、200μg/mL)的MnPc@PDA纳米复合物孵育24小时或48小时;用PBS洗涤后,使用Cell CountingKit-8(CCK-8)孵育2小时,在450nm波长处测量吸光度,进行标准细胞活力测定以确定相对细胞活力,测定结果如图8所示,图中,A为共培养24小时的相对细胞活力;B为共培养48小时的相对细胞活力;
将人乳腺癌细胞MCF-7细胞以每孔8×103个细胞的密度接种于96孔板并培养12小时;用PBS洗涤一次后,将细胞与梯度浓度(0、3.13、6.25、12.5、25、50、100、200μg/mL)的MnPc@PDA纳米复合物共孵育4小时,然后进行808nm或660nm激光照射5分钟;继续培养20小时,用PBS洗涤后,使用Cell Counting Kit-8(CCK-8)孵育2小时,在450nm波长处测量吸光度,进行标准细胞活力测定以确定相对细胞活力,测定结果如图9所示,图中A为808nm激光处理后的相对细胞活力;B为660nm激光处理后的相对细胞活力;
将MCF-7细胞以5×104/皿的密度接种在共聚焦培养皿上,然后在细胞培养箱中过夜培养使其贴壁。第二天,弃去旧培养基并用PBS洗涤两次,然后加入预分散在DMEM培养基的MnPc@PDA纳米复合物或单纯DMEM培养液,再继续孵育12h;接着移弃旧培养基并用PBS洗两次,加入含DCFH-DA的DMEM培养液继续孵育30min后,使用660nm激照射需激光处理组的细胞,接着使用共聚焦显微镜观察所有组的ROS产生情况,观察结果如图10所示;
由图8可知,在无激光光照条件下,不同浓度MnPc@PDA纳米复合物对肿瘤细胞几乎没有毒性。
由图9可知,在808nm或660nm激光光照条件下,MnPc@PDA纳米复合物对肿瘤细胞的毒性均呈现出浓度依赖性。
由图10可知,在660nm激光照射下,MnPc@PDA纳米复合物处理的细胞内ROS产率明显提高。
最后应说明的是:以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案,而非对其限制;尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明,本领域的普通技术人员应当理解:其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换;而这些修改或者替换,并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围,其均应涵盖在本发明的权利要求和说明书的范围当中。
Claims (9)
1.一种藻蓝蛋白矿化纳米粒的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
(a)在搅拌条件下,向藻蓝蛋白溶液中滴加锰盐溶液进行反应,得到藻蓝蛋白-锰离子络合物混悬液;
(b)调节藻蓝蛋白-锰离子络合物混悬液的pH值至6~11,再搅拌反应一段时间,得到藻蓝蛋白矿化物混悬液;
(c)在搅拌条件下,向藻蓝蛋白矿化物混悬液中添加盐酸多巴胺进行反应,再经离心、水洗,既得所述藻蓝蛋白矿化纳米粒;
所述步骤(a)中,藻蓝蛋白溶液与锰盐溶液的体积比为(15~25)∶1,其中,藻蓝蛋白溶液浓度为0.1~50mg/mL,锰盐溶液浓度为0.5~50mg/mL;
所述锰盐溶液为二氯化锰溶液、三氯化锰溶液或四氯化锰溶液。
2.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述步骤(a)中,搅拌速率500~1200rpm;反应温度为4~40℃,时间为20~40min。
3.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述步骤(b)中,搅拌反应条件如下:搅拌速率为100~1500rpm,反应时间为0.5~4h。
4.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述步骤(c)中,盐酸多巴胺的添加量与藻蓝蛋白的质量比为3∶(15000~25000)。
5.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述步骤(c)中,搅拌转速为800~1200rpm;反应时间为0.5~4h;反应温度为10~30℃。
6.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述步骤(c)中,离心转速为5000~30000rpm,离心时间为3~12min。
7.权利要求1~6任一所述的制备方法制备得到的藻蓝蛋白矿化纳米粒。
8.权利要求1~6任一所述的制备方法制备得到的藻蓝蛋白矿化纳米粒在制备治疗肿瘤药物或诊断试剂中的应用。
9.一种用于治疗肿瘤的药物,其特征在于,包括权利要求1~6任一所述的制备方法制备得到的藻蓝蛋白矿化纳米粒。
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