CN113274499B

CN113274499B - 一种仿生型铋纳米花及其制备方法和应用

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Publication number: CN113274499B
Application number: CN202110711375.9A
Authority: CN
Inventors: 沈雁; 王璐; 闻静
Original assignee: China Pharmaceutical University
Current assignee: China Pharmaceutical University
Priority date: 2021-06-25
Filing date: 2021-06-25
Publication date: 2022-06-24
Anticipated expiration: 2041-06-25
Also published as: CN113274499A

Abstract

本发明公开了一种仿生型铋纳米花及其制备方法和应用，属于医药技术领域。所述仿生型铋纳米花包括细胞膜和铋纳米花，细胞膜作为外壳包覆在铋纳米花表面。本发明仿生铋纳米花不仅具有良好的生物安全性，生理环境可降解性，而且具有良好的NIR II光热转化效率，放疗增敏和CT/PAI双模式成像的特征，是集光热协同放疗于一体的新型诊疗一体化载体。

Description

一种仿生型铋纳米花及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种仿生型铋纳米花及其制备方法和在制备诊疗载体应用。

背景技术

光热疗法（Photothermal therapy, PTT）是通过人为方法提高人体组织温度来治疗肿瘤的一种方法，凭借其高效、微创和高选择性等优势在临床前和临床研究中都被深入研究，激光能量被组织吸收转换成热量，造成不可逆的组织损伤。热疗虽然不能取代手术、放疗或化疗作为一种独立的治疗方案，但它对化疗、放疗和手术等治疗手段具有明显的增效和补充作用。

放射疗法（Interventional radiology, IR）是一种使用高剂量的辐射杀死癌细胞并抑制肿瘤生长的治疗方法，放射增敏剂可以通过产生自由基来增强对肿瘤细胞的杀伤作用，以达到增效减毒的目的。X射线吸收系数（μ）与原子序数（Z）是呈正比的关系，高原子序数金属纳米材料可以有效吸收X射线能量并与肿瘤相互作用生成二次电子，这些二次电子不仅会直接损伤DNA，而且还会与水反应以促进活性氧的产生，进一步增加肿瘤对辐射的敏感性，这是一种物理敏化机制。

铋（Bi）被称为“绿色金属”，是一种可降解无毒安全且资源丰富的金属材料，铋及其衍生物的生物医药应用可以追溯到18世纪后期，目前，枸橼酸铋钾、胶体果胶铋等铋化合物药物制剂仍广泛用于治疗胃肠道疾病。近年来，铋基纳米材料因其在NIR区域具有强吸收，并具有高光热转换效率，已被开发为良好的PTT载体和PAI造影剂；同时，铋元素的原子序数很高（Z = 83），使其有可能作为CT成像造影剂。此外，铋纳米粒在生理条件下易被氧化并被溶解为铋离子从人体排出，具有良好的可降解性和生物安全性。因此，可开发铋纳米材料应用于多模式成像诊断、药物递送、光热治疗、放疗增敏及联合疗法等研究领域。

仿生纳米系统（Biomimetic nanoscale systems）中，细胞膜仿生修饰可以将细胞膜融合于纳米粒表面，“复制”源细胞的生物学功能，可实现免疫逃逸、有效递送和长循环作用。传统纳米技术可对其进行一些外源性的化学配位修饰，进入体内易被免疫系统识别并清除，而细胞膜仿生修饰可“复制”源细胞的生物功能，从而实现免疫逃逸、有效递送和长循环作用，因此可通过仿生细胞膜修饰，进一步优化诊疗一体化的治疗效果。

医学影像技术（Medical imaging technology）在疾病治疗过程中扮演者重要角色，如疾病的早期诊断，手术过程中的实时成像以及治疗后的效果跟踪等，这些技术都可以大大提高疾病的治愈率，但由于每种成像方式自身的局限性，单一的成像模式不能完全提供病灶的形态和功能信息。所以发展多模态成像技术可以充分发挥各个成像模式的长处，大大提高诊断的精度。其中CT（X-ray computed tomography imaging, CT）是目前诊疗中最重要和最常用的影像学检查手段，可检出直径约2 mm的小结节，但它最大的缺点是软组织对比度较低，需要使用造影剂以获得分辨率较高的CT图像，临床上常用的造影剂主要是小分子碘造影剂，但碘造影剂具有肾毒性，造影时间短等缺点。因此开发高X射线吸收系数，安全性高的造影剂已成为研究的热点。PAI（Photoacoustic imaging, PAI）的成像原理是脉冲激光的发射光被生物组织吸收并转化为热量，瞬态热弹性膨胀效应产生超声波，从而被检测器捕捉到超声波信号形成图像。PAI弥补了光学成像和超声成像的非深度穿透和非全身成像的缺点，灵敏度高，以约100 μm的分辨率提供PAI图像，可对从细胞器到器官多个维度的生物样品进行成像，与CT成像须借助X射线成像相比，其安全性更好。综上所述，CT和PAI各有优劣，功能互补，如果将这两种成像结合起来，将具有较高的医学诊断应用价值。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种仿生型铋纳米花，该制剂能够联合热疗和放疗作用，提高治疗效果。

本发明的目的之二在于提供一种仿生型铋纳米花的制备方法。

本发明的目的之三在于提供一种仿生型铋纳米花在多模式精准诊疗肿瘤、感染和心血管疾病中的应用。

为了实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：

一种仿生型铋纳米花，包括细胞膜和铋纳米花，所述细胞膜作为外壳包覆在铋纳米花表面。

进一步地，所述细胞膜选自红细胞膜、血小板膜、巨噬细胞膜、干细胞膜、癌细胞膜或外泌体膜。

进一步地，所述铋纳米花通过以下步骤制备得到：

步骤1，取PVP，溶于乙二醇，备用；取五水合硝酸铋，加入1 mol/L HNO₃溶液，溶解后加入NaOH，然后加入配制好的PVP溶液，转移至反应釜中进行反应，反应液离心收集沉淀，洗涤后得到氧化铋纳米粒，分散在水中备用；

步骤2，取硼氢化钠，溶于水中，加入步骤1的氧化铋纳米粒溶液，进行反应，反应液经离心收集沉淀，洗涤后冻干，得到铋纳米花。

进一步地，步骤1中，PVP和五水合硝酸铋的质量比为3-10：1，反应条件为100-180°C反应3-12 h。

进一步地，步骤2中，硼氢化钠的用量为五水合硝酸铋质量的1/2-1/100，反应条件为20-30°C反应0.5-2 h。

上述仿生型铋纳米花的制备方法，包括以下步骤：

步骤1，取冻干细胞膜，加入PBS冰浴超声分散后，加入DSPE-PEG₂₀₀₀，然后依次通过400 nm、200 nm的碳酸脂膜各5次得到细胞膜囊泡；

步骤2，加入浓度为1 mg/mL铋纳米花溶液，再依次通过400 nm、200 nm的碳酸脂膜各5次得到仿生铋纳米花。

进一步地，步骤1中DSPE-PEG₂₀₀₀和细胞膜蛋白的质量比为2-16：1。

进一步地，步骤2中铋纳米花和细胞膜蛋白的质量比为1-8：1。

上述仿生型铋纳米花在制备CT/PAI双模式成像和热放疗一体的诊疗产品中的应用。

基于仿生设计的思路，本发明通过简单的两步法制备了在第二近红外窗口中具有高光热转化效率的可生物降解的铋纳米花，并采用内源性材料细胞膜进行修饰以提高其稳定性，降低其免疫原性从而逃避巨噬细胞的吞噬，提膜挤出工艺可以完整保留铋纳米花的物理性质及细胞膜的生物特性，构建了一种集成CT/PAI双模式成像和热放疗协同治疗为一体的细胞膜修饰的仿生型铋纳米花诊疗载体。

本发明的优点在于近红外一区和二区激光的照射下，细胞膜修饰的铋纳米花均能高效地将光能转化为热能，其光热转化效率分别为20.90%和34.64%，呈现出良好的光热效应并且红细胞膜的修饰不会对铋纳米花本身的光热性能产生负面影响。经过 NIR照射和IR辐照后，均可以显著地生成ROS，表现出了良好的放疗增敏效应，热放疗联合疗法具有较强的协同作用，同时细胞膜的修饰不仅增强了肿瘤细胞的摄取作用，而且增强了对巨噬细胞的免疫逃逸作用。

有益效果：本发明仿生铋纳米花不仅具有良好的生物安全性，生理环境可降解性，而且具有良好的NIR II光热转化效率，放疗增敏和CT/PAI双模式成像的特征，是集光热协同放疗于一体的新型诊疗一体化载体。

附图说明

图1为本发明中铋纳米花BNF（A）和红细胞膜修饰的铋纳米花RBCM-BNF（B）的透射电镜图（标尺100 nm）；

图2为本发明中铋纳米花BNF和红细胞膜修饰的铋纳米花RBCM-BNF的紫外全波长扫描图；

图3为几种铋纳米材料光热转化的升温曲线（铋纳米球SBNP、菱形铋纳米粒RBNP、中空铋纳米粒HBNP和铋纳米花BNF）；

图4为本发明中铋纳米花BNF红细胞膜修饰的铋纳米花RBCM-BNF的粒径分布图（A）和红细胞膜修饰的铋纳米花RBCM-BNF的电位图（B）；

图5为本发明中铋纳米花BNF和红细胞膜修饰的铋纳米花RBCM-BNF的光热升温曲线；

图6为本发明中铋纳米花BNF和红细胞膜修饰的铋纳米花RBCM-BNF经近红外光照射后小鼠肺癌细胞LLC存活率；

图7为本发明中铋纳米花BNF和红细胞膜修饰的铋纳米花RBCM-BNF经X射线照射后小鼠肺癌细胞LLC存活率；

图8本发明中铋纳米花BNF和红细胞膜修饰的铋纳米花RBCM-BNF经热放疗联合治疗后小鼠肺癌细胞LLC存活率；

图9本发明中铋纳米花BNF和红细胞膜修饰的铋纳米花RBCM-BNF在小鼠肺癌细胞LLC中的摄取；

图10本发明中铋纳米花BNF和红细胞膜修饰的铋纳米花RBCM-BNF在小鼠巨噬细胞RAW264.7中的摄取；

图11为本发明中红细胞膜修饰的铋纳米花RBCM-BNF的体外CT成像；

图12为本发明中红细胞膜修饰的铋纳米花RBCM-BNF的体外PAI成像。

具体实施方式

下面为本发明的实施例，但下述实施例并不限制本发明的权利范围。

实施例1

铋纳米花（BNF）的合成与表征

（1）称取PVP （厂家：阿拉丁，型号K29，平均分子量：58000）2 g，量取乙二醇50 mL，超声溶解待用。称取五水合硝酸铋300 mg，加入1 mol/L HNO₃溶液 10 mL，充分溶解，加入NaOH 10 mg，超声溶解，再加入配制好的PVP溶液，充分混合后，转移到反应釜中，150°C反应4 h。自然冷却至室温后，离心（10000 rpm, 40 min）收集沉淀，洗涤三次得到乳白色氧化铋纳米粒，重新分散在纯化水50 mL中待用；

（2）称取硼氢化钠15 mg，量取预冷的纯化水10 mL，溶解后立刻加入氧化铋纳米粒溶液，观察到溶液颜色逐渐从乳白色变成黑色。室温反应1 h，离心（10000 rpm, 40 min），用纯化水洗涤3次以去除过量的反应试剂，冻干备用。

使用透射电镜和紫外全波长扫描仪对产物进行检测，结果如图1（A）和图2。BNF呈大小为110-130 nm表面粗糙的花瓣状，在400-1100 nm的波长范围内均没有明显的最大吸收波长。

实施例2

几种铋纳米材料光热转化能力的比较

按照相关文献方法制备得到铋纳米球（SBNP）、菱形铋纳米粒（RBNP）和中空铋纳米粒（HBNP），以及本发明合成的铋纳米花（BNF），通过离心浓缩，调整使其铋含量相同。

分别从上述溶液中取1mL于石英皿，808 nm和1064 nm激光以3w/cm²照射10min，红外测温枪每隔1min检测一次温度，并以PBS作为对照，结果如图3。经功率为3 W/cm²的激光连续照射10 min后，双波长下BNF的升温能力均显著高于SBNP、RBNP和HBNP，BNF是这四种纳米粒中升温最快的纳米材料。

实施例3

制备红细胞膜修饰的铋纳米花（RBCM-BNF）

红细胞膜蛋白质量 4 mg

DSPE-PEG₂₀₀₀ 32 mg

铋纳米花粒 16 mg

通过如下方法制备得到：取适量冻干细胞膜，采用BCA试剂盒测定膜蛋白的含量，加入适量PBS冰浴超声30 s使充分分散后，加入处方量的DSPE-PEG₂₀₀₀再依次通过400 nm、200 nm的碳酸脂膜各5次得到细胞膜囊泡。加入处方量的铋纳米花溶液，再依次通过400nm、200 nm的碳酸脂膜各5次得到红细胞膜修饰的铋纳米花。

使用透射电镜和紫外全波长扫描仪对产物进行检测，结果如图1（B）和图2。BNF为花状表面粗糙的球形结构，RBCM-BNF可见表面有一圈浅色薄膜，证明红细胞膜已包被在铋纳米花表面，从BNF和RBCM-BNF的TEM图中可看出，BNF和RBCM-BNF的粒径约在110-130 nm左右，与粒径测定结果相比偏小，推测是因为粒径仪测定的是水合粒径会大于实际粒径。1000-1100 nm范围内，BNF的局部最大紫外吸收波长为1048 nm，RBCM-BNF的局部最大紫外吸收波长为1066 nm，红细胞膜包被的铋纳米花的局部最大紫外吸收波长相比于铋纳米花也发生了轻微的红移，这是由于红细胞膜的修饰使得铋纳米周围的折射率发生改变，从而使得紫外可见光光谱发生红移。

通过马尔文激光粒度电位仪测定红细胞膜修饰的铋纳米花的粒径分布和电位，如图4所示，所制备的RBCM-BNF的水合粒径为190.7±5.5 nm，粒径稍大于BNF，与TEM结果相似；PDI为0.241±0.045，说明制备得到的RBCM-BNF较为均一，zeta电位为-20.6±1.5 mV，与红细胞膜的电位相吻合。

实施例4

制备中性粒细胞膜修饰的铋纳米花

中性粒细胞膜蛋白质量 4 mg

DSPE-PEG₂₀₀₀ 32 mg

铋纳米花粒 16 mg

通过如下方法制备得到：取适量冻干细胞膜，采用BCA试剂盒测定膜蛋白的含量，加入适量PBS冰浴超声30 s使充分分散后，加入处方量的DSPE-PEG₂₀₀₀再依次通过400 nm、200 nm的碳酸脂膜各5次得到细胞膜囊泡。加入处方量的铋纳米花溶液，再依次通过400nm、200 nm的碳酸脂膜各5次得到中性粒细胞膜修饰的铋纳米花。

实施例5

制备外泌体膜修饰的铋纳米花

外泌体膜蛋白质量 4 mg

DSPE-PEG₂₀₀₀ 32 mg

铋纳米花粒 16 mg

其通过如下方法制备得到：取适量冻干细胞膜，采用BCA试剂盒测定膜蛋白的含量，加入适量PBS冰浴超声30 s使充分分散后，加入处方量的DSPE-PEG₂₀₀₀再依次通过400nm、200 nm的碳酸脂膜各5次得到细胞膜囊泡。加入处方量的铋纳米花溶液，再依次通过400nm、200 nm的碳酸脂膜各5次得到外泌体膜修饰的铋纳米花。

实施例6

铋纳米花与红细胞膜修饰的铋纳米花的光热转化能力比较

取实施例1制得的铋纳米花与实施例3制得的红细胞膜修饰的铋纳米花，调整浓度使其铋含量相同；分别从上述溶液中取1mL于石英皿，808 nm和1064 nm激光以3 W/cm²照射10min，红外测温枪每隔1 min检测一次温度，并以PBS作为对照。

结果如图5所示。在功率为3 W/cm²的激光照射10 min后，BNF和RBCM-BNF在808 nm和1064 nm波长下均能迅速吸收光能转化为热量。将最终温度与初始温度相比，BNF组ΔT_{808 nm} 为36.1 °C，ΔT_{1064 nm} 为36.7 °C，RBCM-BNF组ΔT_{808 nm} 为36.8 °C， ΔT_{1064 nm} 为36.5 °C，而PBS组ΔT_{808 nm} 为13.7 °C，ΔT_{1064 nm} 为2.2 °C。结果显示BNF和RBCM-BNF与阴性对照PBS相比，升温幅度显著，此外BNF和RBCM-BNF的升温能力未有明显不同，证明了红细胞膜的修饰不会影响BNF本身的光热性能。

实施例7

铋纳米花与红细胞膜修饰的铋纳米花体外抗肿瘤活性评价

（1）单一热疗作用

使用DMEM培养基（5%胎牛血清，100U/mL青霉素/链霉素）配置系列浓度（5, 10,25, 50, 100, 200, 300 ppm）的铋纳米花BNF、红细胞膜修饰的铋纳米花RBCM-BNF溶液备用。

取96孔板，收集对数生长期LLC细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入200 μL使每孔细胞数为2000-10000个左右，培养24 h待细胞贴壁后，弃去旧培养基，每孔加入200 μL上述系列浓度制剂溶液，及其相应的NIR光热组BNF@NIR、RBCM-BNF@NIR，同时设置阴性对照组及空白组，每组设置6个复孔。加入后，普通制剂组BNF、RBCM-BNF继续与细胞共孵育24 h，而激光照射组和与细胞共孵育4 h后，用1064 nm波长的NIR，设置照射功率3 W/cm²，每个加药孔照射5 min后，再放回培养箱中继续培养20 h，然后利用MTT法测定各孔的吸光度，计算细胞存活率，实验结果如图6所示。研究了不同浓度下NIR热疗组BNF@NIR、RBCM-BNF@NIR对LLC细胞的毒性作用，并与普通制剂组BNF、RBCM-BNF比较，以铋浓度为横坐标，细胞存活率为纵坐标作图，平均抑制率呈浓度依赖性，同样的，因为红细胞膜的滋养作用，RBCM-BNF组的平均细胞存活率较BNF组高。低浓度（5-50 μg/mL）时由于制剂中铋浓度较低使得热疗治疗效果不明显，细胞存活率在80%以上。高浓度（50-300 μg/mL）时热疗组对细胞的毒性作用越来越明显。铋浓度为300 μg/mL时，热疗组BNF@ NIR的平均细胞存活率为60.11%；低于普通制剂组的83.16%（**p<0.01），热疗组RBCM-BNF@ NIR的平均细胞存活率为75.69%，低于热疗组的124.85%（***p<0.001）。在3 W/cm²，5 min的热疗条件下，热疗组BNF@NIR对肿瘤细胞有一定的的增殖抑制效果，热疗组RBCM-BNF@NIR的毒性作用较小，不能有效杀伤肿瘤细胞，说明单一热疗对肿瘤细胞的治疗作用有限，需要联合其他治疗手段以增强对肿瘤的杀伤作用。

（2）单一放疗作用

取96孔板，收集对数生长期LLC细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入200μL使每孔细胞数为2000-10000个左右，培养24h待细胞贴壁后，弃去旧培养基，每孔加入200 μL上述系列浓度BNF、RBCM-BNF溶液，及其相应的IR放疗组BNF@IR、RBCM-BNF@IR同时设置阴性对照组及空白组，每组设置6个复孔。加入后，继续与细胞共孵育24 h，而放疗组与细胞共孵育4 h后，用PBS冲洗三次，每孔加200 μL PBS，采用20 gy（戈瑞）放疗剂量辐照，辐照完成以后，再换上200 μL新鲜的DMEM培养基（5%胎牛血清，100 U/mL青霉素/链霉素）继续培养20 h。然后利用MTT法测定各孔的吸光度，实验结果如图7所示。比较了不同浓度下IR放疗组BNF@IR、RBCM-BNF@IR对LLC细胞的毒性作用，并与普通制剂组BNF、RBCM-BNF比较，以铋浓度为横坐标，细胞存活率为纵坐标作图，平均抑制率呈浓度依赖性，同样的，因为红细胞膜的滋养作用，RBCM-BNF组的平均细胞存活率较BNF组高。低浓度（5-25 μg/mL）时由于制剂铋浓度较低使得放疗治疗效果不明显，细胞存活率在88%以上。高浓度（25-300 μg/mL）时放疗对细胞的毒性作用越来越明显。铋浓度为300 μg/mL时，放疗组BNF@IR的平均细胞存活率为放疗组的55.34%；低于普通制剂组的83.16%（***p<0.001），放疗组RBCM-BNF@ IR的平均细胞存活率为53.60%，低于普通制剂组的124.85%（****p<0.0001）。在20 gy的放疗条件下，放疗组对肿瘤细胞有明显的增殖抑制效果，但是对肿瘤细胞的抑制率未达到50%，不能有效杀伤肿瘤细胞，说明单纯放疗对肿瘤细胞的治疗作用有限，需要结合其他治疗手段以增强对肿瘤的杀伤作用。

（3）热疗联合放疗作用

取96孔板，收集对数生长期LLC细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入200 μL使每孔细胞数为2000-10000个左右，培养24 h待细胞贴壁后，弃去旧培养基，每孔加入200 μL上述系列浓度BNF、RBCM-BNF溶液，及其相应的NIR光热组BNF@NIR、RBCM-BNF@NIR，IR放疗组BNF@IR、RBCM-BNF@IR，协同治疗组BNF@NIR&IR、RBCM-BNF@NIR&IR，并设置阴性对照组及空白组，每组设置6个复孔。

加入后，普通制剂组BNF、RBCM-BNF继续与细胞共孵育24 h，而光热组和协同治疗组与细胞共孵育4 h后，用1064 nm波长的NIR，设置照射功率3 W/cm²，每个加药孔照射5min后，再放回培养箱中继续培养20 h。放疗组和协同治疗组与细胞共孵育6 h后，用PBS冲洗三次，每孔加200 μL PBS，采用20 gy剂量辐照，辐照完成以后，再换上200 μL新鲜的DMEM培养基（5%胎牛血清，100 U/mL青霉素/链霉素）继续培养18 h，然后利用MTT法测定各孔的吸光度，实验结果如图8所示。本实验比较了不同浓度下热疗联合放疗组（协同治疗组）BNF@NIR&IR、RBCM-BNF@NIR&IR对LLC细胞的毒性作用，并与普通制剂组BNF、RBCM-BNF，NIR光热组BNF@NIR、RBCM-BNF@NIR和IR放疗组BNF@IR、RBCM-BNF@IR比较，以铋浓度为横坐标，细胞存活率为纵坐标作图，平均抑制率呈浓度依赖性，同样的，因为红细胞膜的滋养作用，RBCM-BNF组的平均细胞存活率较BNF组高。低浓度（5-25 μg/mL）时由于制剂铋浓度较低使得光热及放疗治疗效果不明显，细胞存活率在70%以上。高浓度（25-300 μg/mL）时协同治疗组对细胞的毒性作用与两组单独治疗组相比差距越来越大。铋浓度为300 μg/mL时，协同治疗组BNF@NIR&IR的平均细胞存活率为33.56%，低于热疗组的60.11%（**p<0.01）及放疗组的55.34%（**p<0.01）；协同治疗组RBCM-BNF@NIR&IR的平均细胞存活率为40.46%，低于热疗组的75.69%（****p<0.0001）及放疗组的53.60%（*p<0.05）。相较于单一疗法，热疗与放疗的协同作用增强了对肿瘤细胞的杀伤效果。

实施例8

铋纳米花与红细胞膜修饰的铋纳米花肿瘤细胞摄取实验

取12孔板，收集对数生长期LLC细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入1.5 mL使每孔细胞数为1×10⁵个左右。培养24 h待细胞贴壁后，弃去旧培养基，每孔加入铋纳米花BNF、红细胞膜修饰的铋纳米花RBCM-BNF溶液各1.5 mL，分别在给药后2, 4, 6 h后弃去药液，用预冷的PBS清洗3次，每孔加入150 μL RIPA（含1mM PMSF），冰上操作，用枪吹打使细胞充分裂解后，收集裂解液，离心（1000 rpm, 5min），取上清液用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白含量，沉淀微波消解仪消解后，采用ICP-MS测定铋含量，计算单位蛋白中铋的含量并比较。实验结果如图9所示。本实验利用ICP-MS测定铋的含量，BCA试剂盒定量细胞中蛋白的含量，通过mBi/mProtein的比值来考察在LLC中的摄取，随着BNF和RBCM-BNF与LLC细胞孵育的时间增加，肿瘤细胞摄取的铋也增加，具有时间依赖性。并且在每个时间点，RBCM-BNF组的被摄取量均显著高于BNF组，可能是由于红细胞膜修饰的RBCM-BNF可以通过膜融合的方式与LLC细胞结合而进入细胞，进而增加小鼠肺癌细胞对于铋纳米花的摄取。

实施例9

铋纳米花与红细胞膜修饰的铋纳米花巨噬细胞逃逸实验

取12孔板，收集对数生长期Raw264.7细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入1.5 mL使每孔细胞数为1×10⁵个左右。培养24 h待细胞贴壁后，弃去旧培养基，每孔加入铋纳米花BNF、红细胞膜修饰的铋纳米花RBCM-BNF溶液各1.5 mL，分别在给药后2 h、4 h、6 h后，吸取培养基，离心（1000 rpm, 5min），用预冷的PBS清洗3次，每孔加入150 μL RIPA（含1 mMPMSF），冰上操作，用枪吹打使细胞充分裂解后，收集裂解液，离心（1000 rpm, 5 min），取上清液用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白含量，沉淀微波消解仪消解后，采用ICP-MS测定铋含量，计算单位蛋白中铋的含量并比较。实验结果如图10所示。本实验利用ICP-MS测定铋的含量，BCA试剂盒定量细胞中蛋白的含量，通过mBi/mProtein的比值来考察在RAW264.7中的摄取，随着BNF与RAW264.7细胞孵育的时间增加，随着与细胞孵育的时间增加，细胞摄取的铋也增加，具有时间依赖性；而RBCM-BNF组随着孵育时间增加，被摄取量并未显著增加；同时，在每个时间点，RBCM-BNF组的被摄取量均显著低于BNF组。

实施例10

红细胞膜修饰的铋纳米花的体外CT成像

取红细胞膜修饰的铋纳米花RBCM-BNF溶液适量，稀释得到铋浓度为0.008 M、0.013 M、0.021 M、0.031 M、0.042 M、0.064 M并将其装入到200 μL的微量离心管中。以相同摩尔浓度梯度的碘海醇溶液作为对比进行CT扫描，测量各溶液的CT信号值并作图。扫描参数：X射线管电压为60 kV，电流为133 μA，单次曝光时间为50 ms。实验结果如图11所示。由于铋元素具有较强的X射线衰减能力，且与碘元素相比，铋元素的原子序数更大，其衰变能力更强。为了对此进行验证，将系列浓度的RBCM-BNF进行CT扫描，并以相同摩尔浓度的市售造影剂碘海醇作为对照。以CT信号强度对铋浓度建立线性关系，RBCM-BNF和碘海醇的CT强度值均与浓度之间存在良好的线性关系，RBCM-BNF组拟合的线性方程为y = 17855x -29.473，R²= 0.9623，碘海醇组拟合的线性方程为y = 29230x - 20.924，R² = 0.9484，可见RBCM-BNF的CT成像能力较弱于碘海醇。

实施例11

红细胞膜修饰的铋纳米花的体外PAI成像

取红细胞膜修饰的铋纳米花RBCM-BNF适量稀释配置成0.008 M、0.013 M、0.021M、0.031 M、0.042 M的溶液，吸取100 μL于5 cm长的四氟毛细管中，将各组毛细管平行埋入预先离心（3000 rpm, 5 min）后除气泡的超声耦合剂中，确保耦合剂中无气泡，采用 VevoLAZR小动物光声成像系统检测其光声信号。实验结果如图12所示。光声信号是通过脉冲激光照射载体引起热膨胀而产生的，由于RBCM-BNF具有良好的光热转化效应，因此考察了RBCM-BNF的光声性能。在体外采用光声成像系统检测了不同浓度下的光声图像，以光声信号强度对铋浓度建立线性关系，结果显示，其PAI响应值与浓度之间存在良好的线性关系，拟合的线性方程为y = 400.31x + 2.113，R² = 0.9527。表明RBCM-BNF有作为PAI造影剂的潜力。

Claims

1.一种仿生型铋纳米花，其特征在于：包括细胞膜和铋纳米花，所述细胞膜作为外壳包覆在铋纳米花表面；

所述细胞膜为红细胞膜；

所述铋纳米花通过以下步骤制备得到：

步骤2，取硼氢化钠，溶于水中，加入步骤1的氧化铋纳米粒溶液，进行反应，反应液经离心收集沉淀，洗涤后冻干，得到铋纳米花；

步骤1中PVP和五水合硝酸铋的质量比为3-10：1，反应条件为100-180℃反应3-12 h；

步骤2中硼氢化钠的用量为五水合硝酸铋质量的1/2-1/100，反应条件为20-30℃反应0.5-2 h。

2.权利要求1所述的仿生型铋纳米花的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

步骤1，取冻干细胞膜，加入PBS冰浴超声分散后，加入DSPE-PEG₂₀₀₀，然后依次通过400nm、200 nm的碳酸脂膜各5次得到细胞膜囊泡；

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤1中DSPE-PEG₂₀₀₀和细胞膜蛋白的质量比为2-16：1。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤2中铋纳米花和细胞膜蛋白的质量比为1-8：1。

5.权利要求1所述的仿生型铋纳米花在制备CT/PAI双模式成像和热放疗一体的诊疗产品中的应用。