CN110876805A - 一种巨噬细胞膜仿生三硒化二铋纳米粒的制备方法及应用 - Google Patents
一种巨噬细胞膜仿生三硒化二铋纳米粒的制备方法及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及巨噬细胞膜仿生三硒化二铋纳米粒的制备方法及应用,可有效解决巨噬细胞膜仿生三硒化二铋纳米粒的制备,及在制备基于细胞膜包裹的仿生抗肿瘤药物和光热治疗药物中的应用问题。解决的技术方案是,中空三硒化二铋纳米粒表面物理负载抗肿瘤药物槲皮素,与细胞经低渗裂解液和裂解处理、匀浆得到的细胞膜囊泡共挤压,即得细胞膜仿生三硒化二铋纳米粒的药物组合物,粒径为120‑150nm,本发明制备工艺简单可行,粒径分部均匀,增强癌细胞对光热的敏感性,增强光热治疗的抗肿瘤效果,同时具有针对转移病灶的靶向能力和CT成像等多种功能,提高药物的抗肿瘤疗效。
Description
技术领域
本发明涉及医药,特别是一种巨噬细胞膜仿生三硒化二铋纳米粒的制备方法及应用。
背景技术
光热疗法(Photothermal therapy, PTT)作为一种有效的癌症治疗方案,由于其在癌症治疗中的热疗作用,以及它在提高其他治疗方案如化疗和光动力疗法的治疗效率方面的关键作用,已经变得相当有吸引力。特别是成像引导的PTT,在一个纳米系统中可以同时监测和杀死肿瘤,由于其方便性、选择性、远程控制和高效率,引起了科学界的广泛研究关注。近年来,基于铋的纳米粒不仅可作为x射线计算机断层成像造影剂,还可作为增敏剂增强PTT治疗癌症。中空介孔三硒化二铋纳米粒(Bi2Se3 NPs)具有生物相容性好、化学稳定性高、光热转换能力强,比表面积大和多重成像等优点。
尽管PTT具有诸多优点,但在PTT的过程中由于热休克蛋白(hot shock proteins,HSPs)的上调,经PTT处理的肿瘤细胞可以迅速获得耐热性,提高肿瘤细胞的存活率和抗应激能力。槲皮素(quercetin, QE)是一个经典的蛋白激酶B (Akt)抑制剂,可通过下调p-Akt/MMP-9信号通路防止肿瘤的入侵和转移,同时促进凋亡蛋白Cas-3的表达增加肿瘤细胞的凋亡。不仅如此,槲皮素还可以有效减少HSP70的表达,显著提高PTT 的抗肿瘤疗效。
目前,绝大多数的微纳米运输载体不具有主动生物靶向能力,虽然可以通过肿瘤区域增强的渗透和滞留效应到达肿瘤,但这些运输载体也会在正常细胞附近聚集,杀死癌细胞的同时也杀死了正常细胞,具有一定的毒副作用。表面化学修饰虽然能够提高微纳米运输载体的生物靶向能力,但是修饰后的微纳米载体依然无法避免机体免疫清除。较低的肿瘤靶向能力、抗免疫清除能力、血液循环能力等严重限制了微纳米载体在生物医学领域的应用。近年来,细胞膜仿生纳米粒的研究为抗肿瘤药物的递送提供了新思路。细胞膜包裹纳米粒是将细胞膜包覆在纳米颗粒表面所制备而成的一种新型药物递送载体和仿生纳米材料。其表面的细胞膜完整地从细胞分离而来,从而在纳米颗粒的基本特性上进一步结合和发挥了细胞膜的复杂生物功能。巨噬细胞膜仿生的纳米粒在制备抗肿瘤递药系统方面可具有优秀的免疫逃避属性, 长循环能力和主动靶向特性,尤其是针对转移病灶等多种功能。因此,发明一种细胞膜仿生三硒化二铋纳米粒的药物递送系统应用在癌症治疗中具有重大意义和价值,但至今未见有公开报导。
发明内容
针对上述情况,为克服现有技术之缺陷,本发明之目的就是提供一种巨噬细胞膜仿生三硒化二铋纳米粒的制备方法及应用,可有效解决巨噬细胞膜仿生三硒化二铋纳米粒的制备,及在制备基于细胞膜包裹的仿生抗肿瘤药物和光热治疗药物中的应用问题。
本发明解决的技术方案是,一种巨噬细胞膜仿生三硒化二铋纳米粒的制备方法,利用天然来源的巨噬细胞膜包被的纳米粒,包载难溶性药物,通过巨噬细胞膜表面的内源性生物大分子在体内对肿瘤区域释放的趋化因子、信号分子的主动识别作用,招募至肿瘤区域,从而增加药物在肿瘤组织的蓄积,发挥抗肿瘤疗效;通过肿瘤组织的慢性炎症病理特征释放的趋化因子与巨噬细胞膜表面的生物大分子相互作用,招募巨噬细胞膜包被的纳米粒向肿瘤组织主动募集,增加载药制剂在肿瘤的蓄积,同时增强肿瘤细胞对光热治疗的敏感性,提高治疗效果。据此本发明解决的技术方案是,中空三硒化二铋纳米粒表面物理负载抗肿瘤药物槲皮素,最后与细胞经低渗裂解液和裂解处理、匀浆得到的细胞膜囊泡共挤压,即得细胞膜仿生三硒化二铋纳米粒的药物组合物,粒径为120-150nm,具体包括以下步骤:
1)、三氧化二铋纳米粒(Bi2O3 NPs)的合成:将五水硝酸铋0.32-0.4g溶于1mol/L的硝酸溶液9-11mL中,搅拌下加入氢氧化纳0.08-0.12g、聚乙烯吡咯烷酮1-1.4g、乙二醇48-52mL搅拌混合均匀,转移至高温反应,以每分钟5℃的速度升温至150℃,恒温维持3h,然后冷却至室温,每次用500mL去离子水洗涤5次,干燥,得三氧化二铋纳米粒(Bi2O3 NPs);
2)、中空介孔三硒化二铋纳米粒(Bi2Se3 NPs,简写为BS NPs)的合成:将亚硒酸钠0.18-0.22g和D-(+)-葡萄糖0.5-0.7g溶解于去离子水48-52mL中,搅拌下加入步骤1)得到的三氧化二铋纳米粒(Bi2O3 NPs)水溶液,转移至高温反应,以每分钟5℃的速度升温至150℃,恒温维持12h,然后冷却至室温,每次用500mL去离子水洗涤5次,收集沉淀,将沉淀用8000-14000Da的透析袋于2L的去离子水中进行透析,透析后每次用500mL无水乙醇洗涤5次,12000r/min离心10min,收集沉淀,沉淀50℃真空干燥12h,得中空介孔三硒化二铋纳米粒(Bi2Se3 NPs);
3)、制备载药纳米粒(BS-QE NPs):将浓度1-6mg/mL的药物乙醇溶液1.8-2.2mL加入到浓度2mg/ mL的BS水溶液0.9-1.1mL中,100W超声30min,室温下搅拌24h,12000r/min离心5min,收集沉淀,沉淀用去离子水1.8-2.2mL清洗,12000r/min离心5min,收集沉淀,得负载药物的纳米粒,将纳米粒分散于1mL去离水中,4℃保存;
所述的药物为槲皮素(QE)或荧光探针IR780;
4) 提取巨噬细胞膜:将收集的RAW264.7巨噬细胞以2.5×107/mL的浓度重悬于4-8mL冰冷的Tris-镁缓冲液(TM缓冲液)中提取,所述的Tris-镁缓冲液是0.01M Tris和0.001MMgCl2加水混匀,调pH7.4;用超声仪100W超声3-5次,每次5s,以破坏细胞;破坏后的细胞匀浆与1M的蔗糖混匀,使蔗糖浓度为0.25M,4℃下2000r/min离心10min,收集上清液,上清液再次在4℃下3000r/min离心30min,收集提取的细胞膜,用含0.25M蔗糖的TM缓冲液洗涤,4℃下3000r/min离心30min,得到1-2mL含有1×108个巨噬细胞膜的溶液;
5) 制备细胞膜包裹的载药纳米粒:将浓度0.5mg/mL负载药物的纳米粒 18-22μl与1×108个巨噬细胞膜混合,通过纳米脂质体挤出仪的400nm的聚碳酸酯膜挤出,得到巨噬细胞膜包裹的载药纳米粒。
所述方法制备的巨噬细胞膜仿生三硒化二铋纳米粒在制备基于细胞膜包裹的仿生抗肿瘤药物中的应用。
所述方法制备的巨噬细胞膜仿生三硒化二铋纳米粒在制备基于光热治疗药物中的应用。
本发明采用巨噬细胞膜包被纳米粒形成伪装,通过其表面生物大分子对肿瘤细胞的识别和对肿瘤区域信号分子的响应功能,使其能够主动招募至肿瘤组织,增加滞留和蓄积,该制备工艺简单可行,粒径分部均匀;采用巨噬细胞膜包被的三硒化二铋纳米颗粒,粒径为120-150nm,注射机体后血液循环保持稳定,通过巨噬细胞膜的主动招募快速蓄积于肿瘤,增强癌细胞对光热的敏感性,增强光热治疗的抗肿瘤效果,同时具有针对转移病灶的靶向能力和CT成像等多种功能,提高药物的抗肿瘤疗效,开拓了治疗抗肿瘤和光热治疗药物的新途径,有显著的经济和社会效益。
附图说明
图1为本发明单纯的BS,BS载药QE(BS-QE),BS载药QE并包裹上巨噬细胞膜(M@BS-QE)纳米粒的粒径和电位分布图。
图2为本发明装载槲皮素的巨噬细胞膜包被的纳米粒的体外光热转换行为图。
图3为巨噬细胞膜仿生三硒化二铋纳米粒的促进细胞凋亡实验图。
图4为巨噬细胞膜仿生三硒化二铋荧光纳米粒的肿瘤蓄积图。
图5为巨噬细胞膜仿生三硒化二铋纳米粒的抗肿瘤结果图。
图6为巨噬细胞膜仿生三硒化二铋纳米粒的CT成像结果图。
具体实施方式
以下结合具体情况对本发明的具体实施方式作详细说明。
本发明在具体实施中可由以下具体方式实现。
实施例1
本发明一种巨噬细胞膜仿生三硒化二铋纳米粒的制备方法,包括以下步骤:
1)、三氧化二铋纳米粒(Bi2O3 NPs)的合成:将五水硝酸铋0.36g溶于1mol/L的硝酸溶液10mL中,,搅拌下加入氢氧化纳0.1g、聚乙烯吡咯烷酮1.2g、乙二醇50mL搅拌混合均匀,转移至高温反应,以每分钟5℃的速度升温至150℃,恒温维持3h,然后冷却至室温,每次用500mL去离子水洗涤5次,干燥,得三氧化二铋纳米粒(Bi2O3 NPs);
2)、中空介孔三硒化二铋纳米粒(Bi2Se3 NPs,简写为BS NPs)的合成:将亚硒酸钠0.2g和D-(+)-葡萄糖0.6g溶解于去离子水50mL中,搅拌下加入步骤1)得到的三氧化二铋纳米粒(Bi2O3 NPs)水溶液,转移至高温反应,以每分钟5℃的速度升温至150℃,恒温维持12h,然后冷却至室温,每次用500mL去离子水洗涤5次,收集沉淀,将沉淀用8000-14000Da的透析袋于2L的去离子水中进行透析,透析后每次用500mL无水乙醇洗涤5次,12000r/min离心10min,收集沉淀,沉淀50℃真空干燥12h,得中空介孔三硒化二铋纳米粒(Bi2Se3 NPs);
3)、制备载药纳米粒(BS-QE NPs):将浓度6mg/mL的槲皮素(QE)乙醇溶液2mL加入到浓度2mg/ mL的BS水溶液1mL中,100W超声30min,室温下搅拌24h,12000r/min离心5min,收集沉淀,沉淀用去离子水2mL清洗,12000r/min离心5min,收集沉淀,得负载药物QE的纳米粒BS-QE NPs,将纳米粒分散于1mL去离水中,4℃保存;
4) 提取巨噬细胞膜:将收集的RAW264.7巨噬细胞以2.5×107/mL重悬于4mL冰冷的Tris-镁缓冲液(TM缓冲液)中提取,所述的Tris-镁缓冲液是0.01M Tris和0.001M MgCl2加水混匀,调pH7.4;用超声仪100W超声4次,每次5s,以破坏细胞;破坏后的细胞匀浆与1M的蔗糖混匀,使蔗糖浓度为0.25M,4℃下2000r/min离心10min,收集上清液,上清液再次在4℃下3000r/min离心30min,收集提取的细胞膜,用含0.25M蔗糖的TM缓冲液洗涤,4℃下3000r/min离心30min,得到1mL含有1×108个巨噬细胞膜的溶液;
5) 制备细胞膜包裹的载药纳米粒:将浓度0.5mg/mL的BS-QE NPs 200μl与1×108个巨噬细胞膜混合,通过纳米脂质体挤出仪的400nm的聚碳酸酯膜挤出,得到巨噬细胞膜包裹的载药纳米粒(M@BS-QE NPs)。
实施例2
本发明一种巨噬细胞膜仿生三硒化二铋荧光纳米粒的制备方法,包括以下步骤:
1)、三氧化二铋纳米粒(Bi2O3 NPs)的合成:将五水硝酸铋0.36g溶于1mol/L的硝酸溶液10mL中,,搅拌下加入氢氧化纳0.1g、聚乙烯吡咯烷酮1.2g、乙二醇50mL搅拌混合均匀,转移至高温反应,以每分钟5℃的速度升温至150℃,恒温维持3h,然后冷却至室温,每次用500mL去离子水洗涤5次,干燥,得三氧化二铋纳米粒(Bi2O3 NPs);
2)、中空介孔三硒化二铋纳米粒(Bi2Se3 NPs,简写为BS NPs)的合成:将亚硒酸钠0.2g和D-(+)-葡萄糖0.6g溶解于去离子水50mL中,搅拌下加入步骤1)得到的三氧化二铋纳米粒(Bi2O3 NPs)水溶液,转移至高温反应,以每分钟5℃的速度升温至150℃,恒温维持12h,然后冷却至室温,每次用500mL去离子水洗涤5次,收集沉淀,将沉淀用8000-14000Da的透析袋于2L的去离子水中进行透析,透析后每次用500mL无水乙醇洗涤5次,12000r/min离心10min,收集沉淀,沉淀50℃真空干燥12h,得中空介孔三硒化二铋纳米粒(Bi2Se3 NPs);
3)、制备载荧光纳米粒(BS-IR780 NPs):将浓度1mg/ml的荧光探针IR780乙醇溶液2ml加入到浓度2mg/ mL的BS水溶液1mL中,100W超声30min,室温下搅拌24h,12000r/min离心5min,收集沉淀,沉淀用去离子水2mL清洗,12000r/min离心5min,收集沉淀,得负载药物IR780的纳米粒BS-IR780 NPs,将纳米粒分散于1mL去离水中,4℃保存;
4)、提取巨噬细胞膜:将收集的RAW264.7巨噬细胞以2.5×107/mL重悬于4mL冰冷的Tris-镁缓冲液(TM缓冲液)中提取,用超声仪100W超声4次,每次5s,以破坏细胞;破坏后的细胞匀浆与1M的蔗糖混匀,使蔗糖浓度为0.25M,4℃下2000r/min离心10min,收集上清液,上清液再次在4℃下3000r/min离心30min,收集提取的细胞膜,用含0.25M蔗糖的TM缓冲液洗涤,4℃下3000r/min离心30min,得到1mL含有1×108个巨噬细胞膜的溶液;
5)、制备细胞膜包裹的载荧光纳米粒:将浓度0.1mg/mL的BS-IR780 NPs 200μl与1×108个巨噬细胞膜混合,通过纳米脂质体挤出仪的400nm的聚碳酸酯膜挤出,得到巨噬细胞膜包裹的载药纳米粒(M@BS-IR780 NPs)。
上述方法制备的巨噬细胞膜仿生三硒化二铋纳米粒在制备基于细胞膜包裹的仿生抗肿瘤药物中的应用及在制备基于光热治疗药物中的应用,本发明中以中空三硒化二铋纳米粒子作为内核并包载抗肿瘤药物,将RAW264.7巨噬细胞膜作为外壳包覆于纳米粒表面,制成巨噬细胞膜包覆的仿生纳米粒子递药系统。本发明制备方法稳定简单,原材料来源广泛,生产费用低。经体内外实验表明,制得的巨噬细胞膜仿生三硒化二铋纳米粒在制备抗肿瘤递药系统方面可增强癌细胞对光热的敏感性,增强光热治疗的抗肿瘤效果,同时具有优秀的免疫逃避属性,针对转移病灶的靶向能力和CT成像等多种功能,为临床乳腺癌治疗提供新药物,并经实验取得了非常好的有益技术效果,有关试验资料如下:
一、巨噬细胞膜仿生三硒化二铋纳米粒的粒径和电位的测定试验
取适量单纯的BS,BS载药QE(BS-QE),BS载药QE并包裹上巨噬细胞膜(M@BS-QE)纳米粒分散于超纯水中,用Nano-ZS90型激光纳米粒度分析仪测得其粒径分别为:145.6±3.5nm;146.2±4.1nm;155.3±4.7nm;电位分别为-27.8±1.0mV;-29.4±1.9mV;-17.5±1.3mV(图一)。
二、巨噬细胞膜仿生三硒化二铋纳米粒的光热转化研究试验
取2mL的BS浓度为100μg/mL的BS,BS-QE,M@BS-QE纳米粒溶液,用808近红外激光照射仪(NIR,吉林,长春药物研究所)照射,记录溶液随照射时间产生温度的温度变化;并记录溶液的升温-降温变化,即记录照射至不再升温后,记录降温变化,待降至室温后再次使用808红外激光照射仪照射并记录随照射时间产生温度的温度变化,共记录4个循环的升温-降温变化(图2),A图显示了BS,BS-QE,M@BS-QE后都可以吸收近红外光(NIR)转化为热能,使温度从室温22℃上升至50℃; B图显示了BS,BS-QE,M@BS-QE纳米粒都具有良好的光热稳定性,能循环的将光能转化为热能。
三、巨噬细胞膜仿生三硒化二铋纳米粒的促进细胞凋亡实验
4T1鼠源乳腺癌细胞贴壁生长24h后加药,依次为空白组、 QE、BS-QE、M@BS-QE (QE:80μg/mL),并分激光组(2W,2min)和非激光组。在37℃,5%CO2的培养箱中继续孵育24h后利用Annexin V-FITC/PI凋亡试剂盒检测巨噬细胞膜仿生三硒化二铋纳米粒的促进细胞凋亡的程度。空白组、QE、BS-QE、M@BS-QE、BS-QE+NIR、M@BS-QE+NIR的细胞凋亡率分别为4.2%、18.9%,18.5%、20.3%、33.2%、43.3%。结果表明,QE、BS-QE和M@BS-QE在实验剂量下对细胞的损伤程度基本一致;近红外光的照射导致更强的细胞毒性,应是QE的加入使PTT疗效增强的结果(见图3)。
购买BALB/c小鼠(雌性,5~6周龄),右上肢皮下接种4T1鼠源乳腺癌细胞,取肿瘤体积≥100mm3的小鼠,分别将200μL,0.1mg/mL的IR780,BS-IR780和M@BS-IR780溶液静脉注射于小鼠体内,在第36h剥离小鼠的肿瘤组织分析纳米粒在肿瘤部位的荧光强度。实验结果为IR780,BS-IR780和M@BS-IR780组的肿瘤蓄积荧光强度分别为2249、4841、11335。结果表明巨噬细胞膜包裹后能显著提高纳米粒在肿瘤处的积累,这应该是巨噬细胞膜赋予了纳米粒免疫逃避和肿瘤靶向的功能(见图4)。
四、巨噬细胞膜仿生三硒化二铋纳米粒的药效学研究实验
购买BALB/c小鼠(雌性,5~6周龄),右上肢皮下接种4T1鼠源乳腺癌细胞,取肿瘤体积≥100mm3的小鼠,分为:PBS组、BS、BS+NIR、QE、BS-QE、BS-QE+NIR、M@BS-QE、M@BS-QE+NIR(BS:1.83mg/mL,QE:2.25 mg/mL),每只小鼠尾静脉给药200μL,6h后808照射肿瘤部位(2W,2min)。每两天给药一次,共7次。使用数显游标卡尺测量瘤的长径(A)与短径(B),按公式V=A×B2/2计算肿瘤体积。
结果显示:BS、BS+NIR、QE、BS-QE、BS-QE+NIR,M@BS-QE,M@BS-QE+NIR的抑瘤率分别为:1.23%、56.7%、31.8%、34.2%、68.6%、41.7%、82.3%。说明该巨噬细胞膜仿生给药系统联合光热敏感可显著增强抗肿瘤效果(见图5)。
五、巨噬细胞膜仿生三硒化二铋纳米粒的CT成像研究实验
购买BALB/c小鼠(雌性,5~6周龄),右上肢皮下接种4T1鼠源乳腺癌细胞,取肿瘤体积≥100mm3的小鼠,分别注射临床用CT成像剂碘海醇和M@BS-QE纳米粒,比较两组小鼠注射前(Pre)和注射后(Post)肿瘤处的CT信号值。结果显示:小鼠注射M@BS-QE纳米粒后,在肿瘤处的CT信号值为295HU,远高于碘海醇的CT信号值183HU。说明了巨噬细胞膜仿生三硒化二铋纳米粒具有良好的CT成像能力,可作为肿瘤治疗过程中的监测手段(见图6)。
总之,本发明制备方法简单、方便、高效,易于规模化生产,开拓了制备抗肿瘤药物的新途径,是抗肿瘤药物上的一大创新,经济和社会效益显著。
Claims (6)
1.一种巨噬细胞膜仿生三硒化二铋纳米粒的制备方法,其特征在于,以中空三硒化二铋纳米粒子作为内核并包载抗肿瘤药物,将RAW264.7巨噬细胞膜作为外壳包覆于纳米粒表面,制成巨噬细胞膜包覆的仿生纳米粒子递药系统,具体包括以下步骤:
1)、三氧化二铋纳米粒(Bi2O3 NPs)的合成:将五水硝酸铋0.32-0.4g溶于1mol/L的硝酸溶液9-11mL中,搅拌下加入氢氧化纳0.08-0.12g、聚乙烯吡咯烷酮1-1.4g、乙二醇48-52mL搅拌混合均匀,转移至高温反应,以每分钟5℃的速度升温至150℃,恒温维持3h,然后冷却至室温,每次用500mL去离子水洗涤5次,干燥,得三氧化二铋纳米粒(Bi2O3 NPs);
2)、中空介孔三硒化二铋纳米粒(Bi2Se3 NPs,简写为BS NPs)的合成:将亚硒酸钠0.18-0.22g和D-(+)-葡萄糖0.5-0.7g溶解于去离子水48-52mL中,搅拌下加入步骤1)得到的三氧化二铋纳米粒(Bi2O3 NPs)水溶液,转移至高温反应,以每分钟5℃的速度升温至150℃,恒温维持12h,然后冷却至室温,每次用500mL去离子水洗涤5次,收集沉淀,将沉淀用8000-14000Da的透析袋于2L的去离子水中进行透析,透析后每次用500mL无水乙醇洗涤5次,12000r/min离心10min,收集沉淀,沉淀50℃真空干燥12h,得中空介孔三硒化二铋纳米粒(Bi2Se3 NPs);
3)、制备载药纳米粒(BS-QE NPs):将浓度1-6mg/mL的药物乙醇溶液1.8-2.2mL加入到浓度2mg/ mL的BS水溶液0.9-1.1mL中,100W超声30min,室温下搅拌24h,12000r/min离心5min,收集沉淀,沉淀用去离子水1.8-2.2mL清洗,12000r/min离心5min,收集沉淀,得负载药物的纳米粒,将纳米粒分散于1mL去离水中,4℃保存;
所述的药物为槲皮素(QE)或荧光探针IR780;
4) 提取巨噬细胞膜:将收集的RAW264.7巨噬细胞以2.5×107每毫升的浓度重悬于4-8mL冰冷的Tris-镁缓冲液(TM缓冲液)中提取,所述的Tris-镁缓冲液是0.01M Tris和0.001M MgCl2加水混匀,调pH7.4;用超声仪100W超声3-5次,每次5s,以破坏细胞;破坏后的细胞匀浆与1M的蔗糖混匀,使蔗糖浓度为0.25M,4℃下2000r/min离心10min,收集上清液,上清液再次在4℃下3000r/min离心30min,收集提取的细胞膜,用含0.25M蔗糖的TM缓冲液洗涤,4℃下3000r/min离心30min,得到1-2mL含有1×108个巨噬细胞膜的溶液;
5) 制备细胞膜包裹的载药纳米粒:将浓度0.5mg/mL负载药物的纳米粒 18-22μl与1×108个巨噬细胞膜混合,通过纳米脂质体挤出仪的400nm的聚碳酸酯膜挤出,得到巨噬细胞膜包裹的载药纳米粒。
2.根据权利要求1所述的巨噬细胞膜仿生三硒化二铋纳米粒的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
1)、三氧化二铋纳米粒(Bi2O3 NPs)的合成:将五水硝酸铋0.36g溶于1mol/L的硝酸溶液10mL中,,搅拌下加入氢氧化纳0.1g、聚乙烯吡咯烷酮1.2g、乙二醇50mL搅拌混合均匀,转移至高温反应,以每分钟5℃的速度升温至150℃,恒温维持3h,然后冷却至室温,每次用500mL去离子水洗涤5次,干燥,得三氧化二铋纳米粒(Bi2O3 NPs);
2)、中空介孔三硒化二铋纳米粒(Bi2Se3 NPs,简写为BS NPs)的合成:将亚硒酸钠0.2g和D-(+)-葡萄糖0.6g溶解于去离子水50mL中,搅拌下加入步骤1)得到的三氧化二铋纳米粒(Bi2O3 NPs)水溶液,转移至高温反应,以每分钟5℃的速度升温至150℃,恒温维持12h,然后冷却至室温,每次用500mL去离子水洗涤5次,收集沉淀,将沉淀用8000-14000Da的透析袋于2L的去离子水中进行透析,透析后每次用500mL无水乙醇洗涤5次,12000r/min离心10min,收集沉淀,沉淀50℃真空干燥12h,得中空介孔三硒化二铋纳米粒(Bi2Se3 NPs);
3)、制备载药纳米粒(BS-QE NPs):将浓度6mg/mL的槲皮素(QE)乙醇溶液2mL加入到浓度2mg/ mL的BS水溶液1mL中,100W超声30min,室温下搅拌24h,12000r/min离心5min,收集沉淀,沉淀用去离子水2mL清洗,12000r/min离心5min,收集沉淀,得负载药物QE的纳米粒BS-QE NPs,将纳米粒分散于1mL去离水中,4℃保存;
4) 提取巨噬细胞膜:将收集的RAW264.7巨噬细胞以2.5×107每毫升的浓度重悬于1mL冰冷的Tris-镁缓冲液(TM缓冲液)中提取,所述的Tris-镁缓冲液是0.01M Tris和0.001MMgCl2加水混匀,调pH7.4;用超声仪100W超声4次,每次5s,以破坏细胞;破坏后的细胞匀浆与1M的蔗糖混匀,使蔗糖浓度为0.25M,4℃下2000r/min离心10min,收集上清液,上清液再次在4℃下3000r/min离心30min,收集提取的细胞膜,用含0.25M蔗糖的TM缓冲液洗涤,4℃下3000r/min离心30min,得到1mL含有1×108个巨噬细胞膜的溶液;
5) 制备细胞膜包裹的载药纳米粒:将浓度0.5mg/mL的BS-QE NPs 200μl与1×108个巨噬细胞膜混合,通过纳米脂质体挤出仪的400nm的聚碳酸酯膜挤出,得到巨噬细胞膜包裹的载药纳米粒(M@BS-QE NPs)。
3.根据权利要求1所述的巨噬细胞膜仿生三硒化二铋纳米粒的制备方法,其特征在于,所述步骤3)制备载药纳米粒(BS-IR780 NPs):将浓度1mg/ml的荧光探针IR780乙醇溶液2ml加入到浓度2mg/ mL的BS水溶液1mL中,100W超声30min,室温下搅拌24h,12000r/min离心5min,收集沉淀,沉淀用去离子水2mL清洗,12000r/min离心5min,收集沉淀,得负载药物IR780的纳米粒BS-IR780 NPs,将纳米粒分散于1mL去离水中,4℃保存;
步骤5)制备细胞膜包裹的载药纳米粒:将浓度0.1mg/mL的BS-IR780 NPs 200μl与1×108个巨噬细胞膜混合,通过纳米脂质体挤出仪的400nm的聚碳酸酯膜挤出,得到巨噬细胞膜包裹的载药纳米粒(M@BS-IR780 NPs)。
4.权利要求1-3所述的巨噬细胞膜仿生三硒化二铋纳米粒的制备方法,其特征在于,巨噬细胞膜仿生三硒化二铋纳米粒的粒径为120-150nm。
5.权利要求1-4所述方法制备的巨噬细胞膜仿生三硒化二铋纳米粒在制备基于细胞膜包裹的仿生抗肿瘤药物中的应用。
6.权利要求1-4所述方法制备的巨噬细胞膜仿生三硒化二铋纳米粒在制备基于光热治疗药物中的应用。
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