CN109568578B - 天然生物质量子点和生物质量子点-铜纳米复合物的制备方法及其应用 - Google Patents

天然生物质量子点和生物质量子点-铜纳米复合物的制备方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及到天然生物质量子点和生物质量子点‑铜纳米复合物的制备方法及其应用。生物质量子点的制备方法包括步骤：S1：将菠菜叶研磨至糊状；S2：加入乙醇与丙酮混合液混匀后过滤；S3：在三口烧瓶中，加入油酸及聚氧乙烯二胺和磁力搅拌子，密封后抽出空气，通入氩气，搅拌升温至170‑190℃，溶液呈橙黄色时停止加热；S4：溶液冷至室温后加入叶绿素粗提取液，在氩气保护和磁力搅拌下，升温至170‑190℃且保持170‑190min；S5：自然冷却至室温后加入浓HCl至强酸性；S6：静至分层，收集下层液；S7：用饱和NaOH溶液调节溶液pH值至中性，滤去较大颗粒，透析得到生物质量子点溶液。生物质量子点溶液具有荧光强度高、光稳定和生物相容性好的特点。

Description

天然生物质量子点和生物质量子点-铜纳米复合物的制备方 法及其应用
技术领域
本发明涉及生物体细胞检测技术领域，尤其涉及到细胞病变的检测和光动力学治疗药剂技术，具体为天然生物质量子点和生物质量子点-铜纳米复合物的制备方法及其应用。
背景技术
光动力学疗法(photodynamic therapy,PDT)是治疗人体局部病变特别是恶性肿瘤的一种新的激光医学技术,它利用光敏剂在人体内的选择聚集性特点,当其在受到特定波长的光照射时,发生一系列光化学反应后，产生活性氧(ROS)从而杀伤肿瘤或其他病理组织,达到治疗的目的。然而，肿瘤治疗过程中，由光敏剂产生的ROS，首先要面对癌症细胞中过表达的还原性生物巯基化合物的抵抗，这使得PDT效果明显降低。虽然通过增加光敏剂用量和加大激光器的功率可以产生更多的ROS，有利于提高治疗效果，但是使用过量的光敏剂和高的激光功率可能引起更多副作用。因此，构建的光敏剂，需要结合降低细胞内的还原性生物巯基化合物，协同提高ROS的产生，实现增强PDT治疗效果。
细胞内的生物巯基化合物(biothiols)主要包括谷胱甘肽(GSH)、半胱氨酸(Cys)、高半胱氨酸(Hcy)等小分子，其中谷胱甘肽是细胞内含量最高的巯基化合物。还原性的巯基化合物不仅维持着生命体系的还原氧化动态平衡，且体内生物巯基化合物的含量异常与许多疾病密切相关，当生物巯基化合物(biothiols)过量时，可以导致癌症，加快老化，心脏问题等疾病。因此，制备出一种具有快速、灵敏、选择性地检测生物体系中的巯基化合物的药剂显得尤其重要。
碳量子点(CQDs)具有荧光强度高、光稳定性好、耐光漂白、毒性低和生物相容性好等优点，使其在生物成像、生物传感和药物转运等方面具有很好的应用前景。因此，近年来采用天然生物质如西瓜皮和荔枝壳等为原料绿色环保制备荧光CQDs的方法相继出现。叶绿素是绿色植物进行光合作用的色素，广泛存在于自然界，天然叶绿素有十多种，均是以镁原子为中心离子的卟啉环络合物，很早人们就开始叶绿素在医学方面的应用研究。然而，大多数叶绿素分子是疏水性的，其生物应用受到限制。
发明内容
本发明旨在解决现有技术中存在的不能同时进行体内生物巯基化合物的成像和肿瘤高效光动力学治疗的技术问题，提供一种具有荧光强度高、光稳定和生物相容性好的富含叶绿素的近红外天然生物质量子点的制备方法和生物质量子点-铜纳米复合物的制备方法及其应用。进一步将制备的生物质量子点-铜纳米复合物(CBQD-Cu)作为一种光敏试剂用于肿瘤的高效光动力学治疗。
本发明第一方面提供的一种天然生物质量子点的制备方法，包括如下步骤：
S1：称取适量的新鲜干净的菠菜叶，将菠菜叶研磨至糊状；
S2：然后按每20g菠菜叶加入90-110mL体积比为1:1的乙醇与丙酮混合液，混匀并浸泡4-6min后，使用滤纸过滤，滤液即为叶绿素提取液；
S3：在三口烧瓶中加入25-35mL油酸，0.073g分子量为2000的聚氧乙烯二胺和磁力搅拌子，装上回流管密封好，然后抽出内部的空气，通入氩气，放置在数显智能控温磁力搅拌器上，搅拌并以0.8-1.2℃/min速度升温至170-190℃，待溶液颜色呈橙黄色时停止加热；
S4：待步骤S3制取的溶液冷却至室温后，加入8mL步骤S2制取的叶绿素粗提取液，在氩气保护和磁力搅拌下，再次以0.8-1.2℃/min速度升温至170-190℃且在此温度下保持170-190min后停止加热；
S5：待步骤S4中的生成物自然冷却至室温后，加入1.8-2.2mL浓HCl调节生成物溶液至强酸性，在28-32℃下搅拌至少10h；
S6：将步骤S5的产物溶液进行静置至分层，收集下层溶液；
S7：用饱和NaOH溶液调节步骤S6获得是产物溶液的pH值至中性，再用滤膜抽滤，去除粒径较大的颗粒，最后用透析袋在超纯水的环境下透析12-24h，得到富含叶绿素的生物质量子点溶液。
进一步的，所述步骤S2中采用使用中速滤纸过滤。
进一步的，所述步骤S3中采用圆底烧瓶。
进一步的，所述步骤S7中采用0.15-0.25μm的有机系滤膜抽滤。
进一步的，所述步骤S7中采用的透析袋满足MWCO:1000Da。
进一步的，具体步骤中，S2：然后按每20g菠菜叶加入100ml体积比为1:1的乙醇与丙酮混合液，混匀并浸泡5min后，使用中速滤纸过滤；
S3：在圆底烧瓶中加入30mL油酸，0.073g分子量为2000的聚氧乙烯二胺和磁力搅拌子，装上回流管密封好，然后抽出仪器内部的空气，通入氩气，放置在数显智能控温磁力搅拌器上，搅拌并以1℃/min速度升温至180℃，待溶液颜色呈橙黄色时停止加热；
S4：待步骤S3制取的溶液冷却至室温后，加入8mL步骤S2制取的叶绿素粗提取液，在氩气保护和磁力搅拌下，再次以1℃/min速度升温至180℃且在此温度下保持180min后停止加热；
S5：待步骤4的生成物自然冷却至室温后，加入2mL浓HCl调节生成物溶液至强酸性，在30℃下搅拌12h；
S6：将步骤S5的产物溶液置于分液漏斗中静置至分层，收集下层溶液；
S7：用饱和NaOH溶液调节步骤S6获得是产物溶液的pH值至中性，再用0.22μm的有机系滤膜抽滤，去除粒径较大的颗粒，最后用规格为MWCO:1000Da的透析袋在超纯水的环境下透析12-24h，得到富含叶绿素的生物质量子点溶液。
进一步的，天然生物质量子点的制备方法还包括以下步骤
S8：将步骤S7获得的溶液放入冻干机中，冻干48h,得到棕色固体。
本发明第二方面还提供一种物质量子点-铜纳米复合物的制备方法，包括以下步骤：
S9：称取以上所述的天然生物质量子点的制备方法中步骤S7制取的富含叶绿素的生物质量子点溶液，溶于水中并超声配制成浓度为0.18-0.22mg/mL的溶液；
S10：在烧杯中加入上述配制好的富含叶绿素的天然生物质量子点溶液，在搅拌下加入与富含叶绿素的近红外天然生物质量子点溶液等体积量且浓度为0.14-0.18mol/L的CuSO4溶液，使富含叶绿素的近红外天然生物质量子点溶液的荧光猝灭；
S11：然后超声振荡至少50s时间，形成均匀的生物质量子点-铜纳米复合物。
进一步的，生物质量子点-铜纳米复合物(CBQD-Cu)的制备方法的步骤中，具体为
S9：称取以上所述的天然生物质量子点的制备方法中步骤S7制取的富含叶绿素的生物质量子点溶液，溶于水中并超声配制成浓度为0.2mg/mL的溶液；
S10：在烧杯中加入上述配制好的富含叶绿素的天然生物质量子点溶液，在搅拌下加入与富含叶绿素的天然生物质量子点溶液等体积量且浓度为0.16mol/L的CuSO4溶液，使富含叶绿素的天然生物质量子点溶液的荧光猝灭；
S11：然后超声振荡至少60s时间，形成均匀的生物质量子点-铜纳米复合物。
本发明第三方面还提供一种天然生物质量子点的应用，用于检测细胞内的生物巯基化合物(biothiols)浓度，其中包括以下步骤：
S12：向离心管中加入30μL浓度为0.2mg/mL的富含叶绿素的天然生物质量子点溶液和30μL不同浓度的CuSO4溶液，然后使用pH＝7.4、浓度为0.01mol/L的磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffered solution，PBS)稀释至200μL，充分振荡5min后测定其荧光光谱，激发波长为405nm；
S13：生物巯基化合物(biothiols)和CBQD-Cu相互作用：在30μL浓度为0.3mg/mL的生物质量子点-铜纳米复合物(CBQD-Cu)溶液中加入30μL不同浓度的生物巯基化合物(biothiols)溶液，然后使用pH＝7.4、浓度为0.01mol/L的PBS稀释至200μL后，充分振荡5min后测定其荧光光谱，激发波长为405nm。
一种天然生物质量子点的应用，用于细胞中的巯基化合物(biothiols)成像检测，其中包括以下步骤：
S14：将Hela或7702细胞接种于35mm激光共聚焦成像分析的皿中，并于培养箱中培养至细胞密度约为80％时，将新鲜配置的50μL浓度为0.3mg/mL的生物质量子点-铜纳米复合物(CBQD-Cu)溶液加入细胞培养的皿中与细胞孵育6h，用PBS洗涤细胞4至5次，除去未进入细胞的生物质量子点-铜纳米复合物(CBQD-Cu)后进行细胞成像；
S15：在对照组中加入50μL浓度为1mol/L的N-Ethylmaleimide(NEM)，放置在温度为37℃、含5％CO2的培养箱中孵育30min，然后再加入50μL浓度为0.3mg/mL生物质量子点-铜纳米复合物(CBQD-Cu)孵育6h后进行成像分析，其中所有细胞样品在成像分析之前，均用PBS洗涤4-5次除去未进入细胞的富含叶绿素的近红外天然生物质量子点(CBQDs)，共聚焦荧光成像时使用405nm激光作为激发光。
通过本方法制备的富含叶绿素的天然生物质量子点(CBQDs)不仅具有近红外发光的特征，而且具有荧光强度高、光稳定性和生物相容性好等特点；当与铜离子结合成生物质量子点-铜纳米复合物(CBQD-Cu)后，它的荧光猝灭，在生物巯基化合物(biothiols)存在下，荧光又能恢复。据此，CBQD-Cu可作为一种近红外发光的荧光探针，应用于体内biothiols成像。同时，CBQD-Cu探针表面铜离子与biothiols结合导致癌细胞内游离biothiols的含量降低，可提高光动力治疗效果。此外，由于探针表面叶绿素分子与铜离子的结合，导致叶绿素分子的能级差降低，在660nm激光照射下，产生更多的活性氧，能增强肿瘤的光动力学治疗。据此，CBQD-Cu可作为一种高效光动力学治疗试剂。本发明的好处和应用效果将在以下实施例中进一步阐述。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1为本发明的富含叶绿素的近红外天然生物质量子点的制备方法和生物质量子点-铜纳米复合物的制备过程流程示意图；
图2为本发明方案中CBQDs的透射电镜(TEM)图；
图3为CBQDs的粒径分布图；
图4为本发明CBQDs和CBQD-Cu的X射线光电子能谱(XPS)图；
图5为本发明CBQDs；
图6为CBQD-Cu的质谱图；
图7为CBQDs的紫外–可见吸收光谱及荧光激发和发射光谱图；
图8为CBQDs在不同浓度Cu(II)存在下的荧光光谱图；
图9为CBQDs、CBQD-Cu、CBQD-Cu+GSH(100μmol/L)、CBQD-Cu+Hcy(100μmol/L)和CBQD-Cu+Cys(100μmol/L)体系的荧光光谱图；
图10为用CBQD-Cu检测谷胱甘肽(GSH)的荧光光谱图；
图11为用CBQD-Cu检测GSH的响应曲线及线性关系图(GSH浓度为0、5、10、20、30、40、60、80、90和110μmol/L)
图12为用CBQD-Cu检测半胱氨酸(Cys)(Cys浓度为0、5、10、20、30、40和50μmol/L)的荧光光谱及线性关系图(内插图)；
图13为用CBQD-Cu检测高半胱氨酸(Hcy)(Hcy浓度为0、0.5、2、5、10、20、30、40、60和70μmol/L)的荧光光谱图及线性关系(内插图)；
图14为CBQD-Cu探针对不同物质(100μmol/L)的荧光响应值，对应关系为：1-Blank、2-ATP、3-Ala、4-Leu、5-His、6-Phe、7-Lys、8-Arg、9-Val、10-Gly、11-Ser、12-Glucose、13-Glu、14-Tys、15-Cys、16-Hcy、17-GSH；
图15细胞的激光共聚焦荧光成像图，图中A1、A2、A3表示用N-甲基马来酰亚胺(15mmol/L)预处理后的Hale细胞与CBQD-Cu孵育，B1、B2、B3表示7702细胞与CBQD-Cu孵育，C1、C2、C3表示Hale细胞与CBQD-Cu孵育；D1、D2、D3表示用GSH(100μmol/L)预处理后的Hale细胞与CBQD-Cu孵育，其中全部激发波长为405nm；发射波长为677nm；
图16小鼠活体肿瘤组织内biothiols的成像图，其中A表示在裸鼠正常组织和肿瘤组织分别注射50μL CBQD-Cu(0.3mg/mL)后的明场成像图；B表示在裸鼠正常组织和肿瘤组织分别注射50μL CBQD-Cu(0.3mg/mL)后的荧光成像图；C表示明场和荧光成像叠加图；E表示裸鼠肿瘤部位注射50μL CBQD-Cu(0.3mg/mL)后的成像图；F表示注射50μL的CBQD-Cu(0.3mg/mL)和20μL GSH(1mmol/L)后的成像图；G表示在F的基础上再注射40μL GSH(1mmol/L)后的成像图，以上成像图采用激光器：660nm,功率0.4W/cm2的条件获取；
图17为CBQDs和CBQD-Cu在660nm激光照射后产生O2 ·-(A)、·OH(B)和1O2(C)的EPR光谱图；
图18为Hale细胞用钙黄绿素和碘化丙锭染色后，不同条件下细胞的荧光成像图，其中D图像的条件为PBS+激光，E图像的条件为CBQDs+激光，F图像、G图像的条件为CBQD-Cu+激光，以上图像的激光器波长：660nm；功率：1.0W/cm2；照射时间：8min；
图19为治疗前和治疗12天之后肿瘤小鼠的照片图，由四组构成，包括没有任何治疗作为control(对照)组、CBQDs组、CBQDs+激光组和CBQD-Cu+激光组；
图20为图18中肿瘤小鼠治疗12天后取出的肿瘤组织照片图；
图21为图18中肿瘤小鼠的肿瘤体积随治疗时间(天)的变化图；
图22为图18中肿瘤小鼠治疗12天后，肿瘤进行H&E组织染色图像图，其中采用激光器波长为660nm,功率为0.4W/cm2；
图23为叶绿素CBQDs和CBQD-Cu的前线分子轨道分布图，其中左侧部分图为TD-DFT计算CBQDs的S1和T1之间的能级差(△EST)，右侧部分图为TD-DFT计算CBQD-Cu的S1和T1之间的能级差(△EST)；
图24为CBQDs在不同pH溶液中的荧光强度图；
图25为MTT法考察CBQD-Cu对Hela细胞的存活率图。
具体实施方式
为了能够更清楚地理解本发明的上述目的、特征和优点，下面结合附图和具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述。需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是，本发明还可以采用其他不同于在此描述的方式来实施，因此，本发明的保护范围并不受下面公开的具体实施例的限制。
下面对本发明实施例作进一步的描述。
一种富含叶绿素的近红外天然生物质量子点的制备方法，大致过程如图1所示，具体包括如下步骤：
S1：称取20g的新鲜干净的菠菜叶，将菠菜叶研磨至糊状；
S2：然后按加入90-110mL体积比为1:1的乙醇与丙酮混合液，混匀并浸泡4-6min后，使用滤纸过滤，滤液即为叶绿素提取液；此处的混合液体积可以是90mL、95mL、100mL、105mL、110mL,本实施例优选为100mL，混匀后浸泡5min。
S3：在圆底烧瓶中加入25-35mL油酸，0.073g分子量为2000的聚氧乙烯二胺和磁力搅拌子，装上回流管密封好，然后抽出内部的空气，通入氩气，放置在数显智能控温磁力搅拌器上，搅拌并以0.8-1.2℃/min速度升温至170-190℃，待溶液颜色呈橙黄色时停止加热；
S4：待步骤S3制取的溶液冷却至室温后，加入8mL步骤S2制取的叶绿素粗提取液，在氩气保护和磁力搅拌下，再次以0.8-1.2℃/min速度升温至170-190℃且在此温度下保持170-190min后停止加热；
S5：待步骤S4中的生成物自然冷却至室温后，加入1.8-2.2mL浓HCl调节生成物溶液至强酸性，在28-32℃下搅拌至少10h；
S6：将步骤S5的产物溶液进行静置至分层，收集下层溶液；
S7：用饱和NaOH溶液调节步骤S6获得是产物溶液的pH值至中性，再用滤膜抽滤，去除粒径较大的颗粒，最后用透析袋在超纯水的环境下透析12-24h，得到富含叶绿素的生物质量子点溶液。
通过以上方法获得的富含叶绿素的生物质量子点(CBQDs)不仅具有近红外发光的特征，而且具有荧光强度高、光稳定性和生物相容性好等特点。
进一步的，所述步骤S2中采用使用中速滤纸过滤。
进一步的，所述步骤S3中采用圆底烧瓶。
进一步的，所述步骤S7中采用0.15-0.25μm的有机系滤膜抽滤。
进一步的，所述步骤S7中采用的透析袋满足MWCO:1000Da。
进一步的，具体步骤中，S2：然后按每20g菠菜叶加入100mL体积比为1:1的乙醇与丙酮混合液，混匀并浸泡5min后，使用中速滤纸过滤；
S3：在圆底烧瓶中加入30mL油酸，0.073g分子量为2000的聚氧乙烯二胺和磁力搅拌子，装上回流管密封好，然后抽出仪器内部的空气，通入氩气，放置在数显智能控温磁力搅拌器上，搅拌并以1℃/min速度升温至180℃，待溶液颜色呈橙黄色时停止加热；
S4：待步骤S3制取的溶液冷却至室温后，加入8mL步骤S2制取的叶绿素粗提取液，在氩气保护和磁力搅拌下，再次以1℃/min速度升温至180℃且在此温度下保持180min后停止加热；
S5：待步骤4的生成物自然冷却至室温后，加入2mL浓HCl调节生成物溶液至强酸性，在30℃下搅拌12h；
S6：将步骤S5的产物溶液置于分液漏斗中静置至分层，收集下层溶液；
S7：用饱和NaOH溶液调节步骤S6获得是产物溶液的pH值至中性，再用0.22μm的有机系滤膜抽滤，去除粒径较大的颗粒，最后用规格为MWCO:1000Da的透析袋在超纯水的环境下透析12-24h，得到富含叶绿素的生物质量子点溶液。
进一步的，富含叶绿素的近红外天然生物质量子点的制备方法还包括以下步骤
S8：将步骤S7获得的溶液放入冻干机中，冻干48h,得到棕色固体。
通过本方法制取的CBQDs的TEM图(如图2所示)和CBQDs的粒径分布图(如图3所示)可以知道，CBQDs的粒径范围在3-5nm之间，其中4nm粒径比重最大，大体呈现正态分布。
本发明第二方面还提供一种物质量子点-铜纳米复合物的制备方法，包括以下步骤：
S9：称取以上任一所述的富含叶绿素的近红外天然生物质量子点的制备方法中步骤S7制取的富含叶绿素的生物质量子点溶液，溶于水中并超声配制成浓度为0.18-0.22mg/mL的溶液；
S10：在烧杯中加入上述配制好的富含叶绿素的近红外天然生物质量子点溶液，在搅拌下加入与富含叶绿素的近红外天然生物质量子点溶液等体积量且浓度为0.14-0.18mol/L的CuSO4溶液，使富含叶绿素的近红外天然生物质量子点溶液的荧光猝灭；
S11：然后超声振荡至少50s时间，形成均匀的生物质量子点-铜纳米复合物。
通过以上方法获得的生物质量子点-铜纳米复合物(CBQD-Cu)，生物质量子点的荧光猝灭，在biothiols存在下，荧光又能恢复。据此，CBQD-Cu可作为一种近红外发光的荧光探针，用于体内biothiols成像。同时，CBQD-Cu探针表面铜离子与biothiols结合导致癌细胞内游离biothiols的含量降低，可提高光动力治疗效果。此外，由于探针表面叶绿素分子与铜离子的结合，导致叶绿素分子的能级差降低，在660nm激光照射下，产生更多的活性氧，能增强肿瘤的光动力学治疗。因此，制备的CBQD-Cu纳米复合物可作为一种新型的诊断-治疗一体化纳米探针，应用于细胞和肿瘤组织中biothiols的成像及双重增效光动力学治疗。
进一步的，生物质量子点-铜纳米复合物(CBQD-Cu)的制备方法的步骤中，具体为：
S9：称取以上任一所述的富含叶绿素的近红外天然生物质量子点的制备方法中步骤S7制取的富含叶绿素的生物质量子点溶液，溶于水中并超声配制成浓度为0.2mg/mL的溶液；
S10：在烧杯中加入上述配制好的富含叶绿素的近红外天然生物质量子点溶液，在搅拌下加入与富含叶绿素的近红外天然生物质量子点溶液等体积量且浓度为0.16mol/L的CuSO4溶液，使富含叶绿素的近红外天然生物质量子点溶液的荧光猝灭；
S11：然后超声振荡至少60s时间，形成均匀的生物质量子点-铜纳米复合物。
本发明第三方面还提供一种富含叶绿素的近红外天然生物质量子点的应用，用于检测细胞内的生物巯基化合物浓度，其中包括以下步骤：
S12：向离心管中加入30μL浓度为0.2mg/mL的富含叶绿素的近红外天然生物质量子点溶液和30μL不同浓度的CuSO4溶液，然后使用pH＝7.4、浓度为0.01mol/L的磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffered solution,PBS)稀释至200μL，充分振荡5min后测定其荧光光谱，激发波长为405nm；
S13：生物巯基化合物和CBQD-Cu相互作用：在30μL浓度为0.3mg/mL的生物质量子点-铜纳米复合物(CBQD-Cu)溶液中加入30μL不同浓度的生物巯基化合物溶液，然后使用pH＝7.4、浓度为0.01mol/L的PBS稀释至200μL后，充分振荡5min后测定其荧光光谱，激发波长为405nm。
一种富含叶绿素的近红外天然生物质量子点的应用，用于细胞中的巯基化合物成像检测，其中包括以下步骤：
S14：将Hela或7702细胞接种于35mm激光共聚焦成像分析的皿中，并于培养箱中培养至细胞密度约为80％时，将新鲜配置的50μL浓度为0.3mg/mL的生物质量子点-铜纳米复合物(CBQD-Cu)溶液加入细胞培养的皿中与细胞孵育6h，用PBS洗涤细胞4至5次，除去未进入细胞的生物质量子点-铜纳米复合物(CBQD-Cu)后进行细胞成像；
S15：在对照组中加入50μL浓度为1mol/L的N-Ethylmaleimide(NEM)，放置在温度为37℃、含5％CO2的培养箱中孵育30min，然后再加入50μL浓度为0.3mg/mL生物质量子点-铜纳米复合物(CBQD-Cu)孵育6h后进行成像分析，其中所有细胞样品在成像分析之前，均用PBS洗涤4-5次除去未进入细胞的含叶绿素的近红外天然生物质量子点(CBQDs)，共聚焦荧光成像时使用405nm激光作为激发光。
本发明的有益效果通过以下检测和验证可以进一步表现出来：参照图4至图22。
为了考察制备的菠菜提取物(Spinach extraction)，表面富含叶绿素的生物质量子点(CBQDs)和生物质量子点-铜纳米复合物(CBQD-Cu)中各元素的构成，实验对三种物质进行了X射线光电子能谱(XPS)表征。如图4所示，三种物质都含有C1s、N1s和O1s的特征峰，它们分别在284.6、399.5和531.5eV处,值得注意的是，我们发现菠菜提取物在1304.6处出现Mg1s的特征峰；CBQD-Cu在935.5处存在Cu2p的特征峰。菠菜提取物的Mg1s特征峰出现说明它主要含有镁卟啉化合物(叶绿素)。对比菠菜提取物，CBQDs和CBQD-Cu没有出现Mg1s特征峰。这是由于CBQDs的制备过程中，进行了加热和强酸处理，在此过程中卟啉环中的镁被H取代了，转变成了去镁叶绿素。而在制备CBQD-Cu过程中，加入铜离子，它与去镁叶绿素中的卟啉环配位形成稳定性和亲水性更好的叶绿素铜纳米复合物。
为了进一步确定CBQD-Cu中Cu的价态，实验采用高分辨XPS进行表征，结果如图4所示。由图可见，CBQD-Cu具有两个明显的峰，分别出现在932.5和952.5eV，它们分别对应于Cu+的Cu(2P3/2)和Cu(2P1/2)特征峰，而在934.5eV处出现的弱峰归属于Cu2+的特征峰。这个结果说明CBQD-Cu中Cu由Cu+和Cu2+组成，且Cu+占大部分，从这个结果判断CBQDs具有一定的还原性，加进去的Cu2+大部分被CBQDs还原成Cu+。为了进一步确定制备CBQDs和CBQD-Cu是纳米结构，而不是单纯的小分子，实验通过质谱分析进行了表征，结果如图5和图6所示，显示CBQDs的分子量呈现正态分布，其平均分子量在970左右，而去镁叶绿素的分子量应在869左右，这说明实验制备的是富含叶绿素的BQDs，而不是单纯的叶绿素小分子；而在CBQD-Cu的质谱图中，其分子量也呈现正态分布，其平均分子量在1030左右，比CBQDs的分子量略有增加，这个结果进一步证实制备的纳米材料是CBQD-Cu纳米复合物。利用透射电镜(TEM)对CBQDs的形貌、分散情况及粒径进行了表征。从图2可以看到该CBQDs具有良好的分散性，直径分布在3.0～5.0nm之间，平均粒径为4nm。内插图是CBQDs高分辨透射电镜图(HRTEM)，从插图中可以清晰地看到CBQDs的晶格条纹，通过Digital Micrograph软件分析得到晶格常数为0.22nm，对应于石墨烯的(100)晶面，说明合成的CBQDs其石墨化和结晶程度比较高。CBQDs的紫外可见吸收光谱和荧光光谱图如图7所示，从紫外可见吸收光谱图中可看到CBQDs在272nm处有一个吸收峰，该吸收是由C＝C的π-π*跃迁及C＝O的n-π*跃迁引起的；除此之外，在660nm左右有一个叶绿素的特征吸收峰。CBQDs的荧光发射光谱图显示，在激发波长405nm的激发下，在490nm出现了一个弱的碳量子点的发射峰以及在677nm处出现了一个强的叶绿素发射峰，表明制备的BQDs为表面富含叶绿素的碳基量子点。另外，从CBQDs的激发光谱图可见，CBQDs在405nm和625nm处具有两个激发峰，可以在多个波长下激发；当在625nm激发时，也可得到近红外荧光，这为活体成像应用提供了可行。在CBQDs中加入不同浓度的铜离子所得到荧光光谱如图8所示，当加入铜离子后，CBQDs的荧光被显著猝灭。这是因为铜离子可以与叶绿素卟啉环结合，形成了稳定的叶绿素铜配合物，当光激发时，电子从CBQDs的基态跃迁到激发态，然后转移到铜离子上，导致荧光猝灭。
荧光探针的构建和biothiols的检测。为了研究CBQD-Cu作为荧光探针检测biothiols的可行性，通过实验考察不同条件下CBQDs和CBQD-Cu的荧光光谱，结果如图9所示，CBQDs溶液在405nm的激光激发下发出了很强的红色荧光，当加入铜离子时，CBQDs的荧光被显著猝灭；当有biothiols存在的情况下，铜离子与biothiols中的巯基结合形成了稳定的Cu-S键，使铜离子脱离CBQDs表面，CBQDs的荧光得以恢复。为了达到高效灵敏地检测生物巯基化合物，通过优化生物巯基化合物检测的条件，包括Cu(II)的浓度及反应溶液的酸度，实验考察不同浓度的Cu(II)对CBQDs溶液荧光猝灭的效果，结果如图7所示，当Cu(II)浓度从0增加到60μmol/L时，CBQDs溶液的荧光强度逐渐下降，Cu(II)浓度从50μmol/L增加到60μmol/L时，CBQDs溶液的荧光下降趋势明显减弱，考虑到低的背景信号以及宽的检测范围，以50μmol/L作为Cu(II)的最佳浓度。实验还测定了CBQDs在不同pH溶液中的荧光强度，结果如附图24所示，表明溶液酸度对CBQDs的荧光强度影响较小。
在优化的实验条件下，分别考察了使用CBQD-Cu探针检测GSH、Hcy和Cys的线性范围及检测限。结果如图10-13所示，随着biothiols浓度的增加，CBQD-Cu在677nm处的荧光强度逐渐增强；图11-13中插图表明了biothiols存在下CBQD-Cu的荧光强度I和CBQD-Cu的荧光强度I0的比值I/I0与biothiols浓度的关系；I/I0值与GSH的浓度在5-80μmol/L范围内呈现良好的线性关系，线性方程为I/I0＝0.02846C+0.90778，相关系数为0.9920其中C为GSH的浓度，单位为μM，检测限为1.6μmol/L；I/I0值与Cys的浓度在5-50μmol/L范围内呈现良好的线性关系，线性方程为I/I0＝0.00941C+0.97157,相关系数为0.9870，检测限为2.5μmol/L；I/I0值与Hcy的浓度在0.5-70μmol/L范围内呈现良好的线性关系，线性方程为I/I0＝0.01706C+0.96967,相关系数为0.9920，检测限为0.25μmol/L。图14表示了多种氨基酸和三磷酸腺苷(ATP)及biothiols对CBQD-Cu的荧光响应情况，从图中可见ATP、Ala、Leu、His、Phe、Lys、Arg、Val、Gly、Ser、Glucose和Glu对CBQD-Cu的荧光没有响应，而Cys、Hcy和GSH等biothiols对CBQD-Cu的荧光明显响应，表明CBQDs-Cu荧光探针对检测biothiols具有高的选择性。
细胞毒性实验和细胞中biothiols成像。为了评估CBQD-Cu在生物体内的应用潜力，实验采用MTT法考察了CBQD-Cu对Hela细胞的毒性，结果如附图25；CBQD-Cu的浓度在50-500μg/mL范围内，细胞的存活率从97％降到89％，证明CBQD-Cu的细胞毒性低，并且具有良好的生物相容性，可以安全地应用于活细胞成像。
使用CBQD-Cu纳米探针对7702和Hela细胞内的biothiols进行了激光共聚焦荧光成像分析，结果如图15所示，CBQD-Cu与细胞孵育后，在405nm激光的激发下,细胞发出明显的红光如图14中的B1、B2、B3,C1、C2、C3；当预先用N-Methylmaleimide处理细胞，然后再与CBQD-Cu孵育，由于细胞内的biothiols预先与N-Methylmaleimide结合，不能再与CBQD-Cu结合，所以，在405nm激光的激发下细胞的荧光十分微弱，如图14中A1、A2、A3；另一方面，通过比较图14中的B1、B2、B3和C1、C2、C3，可以看出，7702细胞B1、B2、B3的荧光强度较弱，Hela细胞如图C1、C2、C3的荧光强度较强。这一结果表明，本工作发展的CBQD-Cu探针可用于正常细胞和癌细胞的识别，实现癌症的诊断。当预先用GSH(100μmol/L)处理Hale细胞后，再与CBQD-Cu孵育，可以看到细胞的红色荧光大大增强，如附图14中D1、D2、D3，说明CBQD-Cu可作为一种新颖的纳米探针，用于细胞内biothiols含量的荧光成像定量检测。
小鼠活体内biothiols的成像。使用CBQD-Cu纳米探针对小鼠体内的biothiols进行了活体成像分析，分别皮下注射相同体积的CBQD-Cu到裸鼠的肿瘤部位和非肿瘤部位，然后在麻醉情况下，进行了活体荧光成像，结果如图16中的A-C图像所示，通过对比观察可以看出，肿瘤部位的荧光强度远高于非肿瘤部位、如图15中的C图像，说明小鼠肿瘤组织中biothiols的含量要远高于正常组织，表明使用发展的CBQD-Cu探针，可用于小鼠正常组织和肿瘤组织的识别，实现肿瘤的诊断。为了进一步确定肿瘤部位的高荧光增强是来自CBQD-Cu与biothiols作用的结果，通过在小鼠肿瘤部位注射CBQD-Cu进行活体成像后，再在肿瘤部位注射不同量的GSH进行成像，结果如图附图16中的E-G图像所示，对照几张图中肿瘤部位荧光的变化，可以发现随着注射GSH量的增加，肿瘤部位的荧光强度增强，证明肿瘤部位的荧光增强是来自CBQD-Cu与biothiols作用的结果，这些实验结果也同时表明，肿瘤组织的荧光强度与GSH的浓度具有相关性，可应用于成像指导下的光动力学治疗。
CBQDs和CBQD-Cu近红外光照下活性氧的产生和细胞活性。为了考察CBQDs和CBQD-Cu在光照下产生活性氧的情况，实验通过电子自旋共振(ESR)光谱方法检测了活性氧的产生，其中活性氧包括1O2，O2 ·-和·OH，结果如图17所示，从CBQDs和CBQD-Cu样品的ESR信号，可以清楚地观察到O2 ·-和·OH呈现出四重特征峰，图17中A部图像和B部图像；和1O2呈现出三重特征峰，如图17C部图像；这说明CBQDs和CBQD-Cu在近红外光照下，均能产生活性氧。进一步对比发现，CBQD-Cu的ESR信号强度均高于CBQDs，表明CBQD-Cu在光照下能产生更多的O2 ·-，·OH和1O2。这些研究结果证明CBQDs和CBQD-Cu均可作为新型的光敏剂用于肿瘤的光动力学治疗，并且CBQD-Cu能大大提高肿瘤的光动力学治疗效果。
研究了CBQDs和CBQD-Cu在近红外光照后的细胞毒性，结果如图18中图像D-G所示，在控制组(PBS+激光)，如图18中D图像所示，没有发现细胞死亡；在CBQDs+激光组，如图18中E图像所示，发现少量的细胞出现死亡；而在CBQD-Cu+激光组，如图18中F、G图像所示，所有的细胞均已死亡。这些研究结果进一步证明CBQDs和CBQD-Cu均可用于肿瘤的光动力学治疗，并且CBQD-Cu的治疗效果要远大于CBQDs。
小鼠肿瘤的光动力学治疗。通过实验进一步评估了CBQD-Cu治疗实体肿瘤的效果，结果如图19所示，当裸鼠体内肿瘤体积达到约200mm3时，将患肿瘤的裸鼠分为四组：(i)没有注射CBQD-Cu和激光治疗的对照组control组，(ii)注射了CBQD-Cu但没有激光照射的治疗组CBQD-Cu组，(iii)注射CBQDs并用激光照射的治疗组CBQDs+laser组，(iv)注射CBQD-Cu和激光照射的治疗组CBQD-Cu+laser组；图19显示了四个组治疗前和12天治疗后小鼠的照片。图20为四个组经过12天治疗后肿瘤体积的大小照片，从图中可见，对照组在12d生长后肿瘤体积非常大；注射了CBQD-Cu但没有激光照射的治疗组，肿瘤生长在一定程度上受到抑制，体积小于对照组；注射了CBQDs并用激光照射的治疗组，肿瘤体积进一步减小；而注射了CBQD-Cu并经过12天激光治疗的小鼠，其体内肿瘤组织已完全消失，具有非常理想的治疗效果。从图21也可以看出，随着治疗时间(天)的延长，对照组和注射了CBQD-Cu但没有激光照射的治疗组的小鼠，其体内肿瘤的体积逐渐增大，而注射了CBQDs并用激光照射治疗组的小鼠，其体内肿瘤的体积仅缓慢增大，表明CBQDs能抑制肿瘤的快速生长，具有一定的治疗效果。令人惊喜的是随着治疗时间(天)的延长，注射CBQD-Cu和激光照射治疗组的小鼠，其体内肿瘤组织的体积逐渐减小，治疗12天后，体内肿瘤组织的体积趋于零。上面的研究结果表明，使用菠菜基的CBQDs与Cu离子结合形成的CBQD-Cu纳米药，一方面由于表面叶绿素分子与铜离子的结合，导致叶绿素分子的能级差降低，在660nm激光照射下，能产生更多的活性氧，实现增强的肿瘤光动力学治疗；另一方面CBQD-Cu表面铜离子与生物硫醇结合使癌细胞内游离生物硫醇的含量降低，从而进一步提高光动力治疗效果，实现双重增强的高效光动力治疗实体肿瘤。对肿瘤组织用苏木精和伊红(H&E)染色检查，发现对照组和注射CBQD-Cu组小鼠的肿瘤组织没有被破坏的迹象，然而，如图22所示，对于注射CBQDs并用激光照射的治疗组及注射CBQD-Cu并用激光照射的治疗组，可以明显的观察到肿瘤组织细胞被破坏和清除。这些实验结果与活体抗肿瘤治疗的实验结果是一致的。
为了探究CBQD-Cu在近红外光照下高效产生活性氧(1O2，O2 ·-和·OH)的原因，我们使用Time-dependent density functional theory(TD-DFT)对叶绿素和叶绿素-铜复合物的最低单重激发态(S1)与最低三重激发态(T1)之间的能级差(△EST)进行计算，证明了近红外光照下CBQD-Cu高效产生活性氧的机理。计算原理如图23所示，计算结果见表1，从表中可见，叶绿素(CBQDs)△EST＝0.9174eV，叶绿素-铜复合物(CBQD-Cu)的△EST＝0.0172eV，对比发现叶绿素-铜复合物的△EST远低于叶绿素。说明富含叶绿素的CBQDs与铜离子结合，形成的CBQD-Cu具有更低的△EST，从而增加了激发电子的系间窜越速率(从S1到T1)。而单线态氧的产生是电子从最低三重激发态(T1)返回到基态(S0)，促使O2转变成1O2的过程，因此，CBQD-Cu能提高单线态氧的产生量。富含叶绿素的CBQDs与铜离子结合形成CBQD-Cu后，CBQDs的荧光发生猝灭，这说明CBQDs的电子可以转移给铜离子，形成的CBQD-Cu纳米复合物中铜的化合价大部分是处于+2和0价之间的+1价，因此在近红外光照射时，很容易发生电子转移，产生更多的O2 ·-和·OH。
表1..叶绿素和叶绿素-铜复合物的单重激发态和三重态能级
Figure GDA0002928004590000151
生物巯基化合物的检测。Cu(II)对CBQDs的猝灭实验：向600μL的离心管中加入30μL CBQDs(0.2mg/mL)溶液和30μL不同浓度的CuSO4溶液，然后使用PBS(pH＝7.4,0.01M)稀释至200μL后，充分振荡5min后测定其荧光光谱，激发波长为405nm.生物巯基化合物和CBQD-Cu相互作用实验：在30μL CBQD-Cu(0.3mg/mL)溶液中加入30μL不同浓度的生物巯基化合物溶液，然后使用PBS(pH＝7.4,0.01mol/L)稀释至200μL后，充分振荡5min后测定其荧光光谱，激发波长为405nm。
细胞毒性实验。为了评估CBQDs和CBQD-Cu对Hela细胞的毒性，首先在96孔板中接种细胞，放到细胞培养箱中(37℃、5％CO2)培养，当细胞的相对密度生长至约80％时，分别加入CBQDs和CBQD-Cu溶液，使其终浓度分别为0、50、100、200、300、500μg/mL，然后在相同条件下孵育24h。孵育完成后，向每个孔中加入20μL MTT(5mg/mL in PBS)孵育4h。然后，弃去培养基，再分别向每个孔中加入100μL二甲基亚砜，并置于振荡器上低速振荡10min，使MTT与细胞内的琥珀酸脱氢酶形成的结晶物充分溶解。在酶标仪上测定各孔溶液在波长为490nm处的吸光度值，并评估CBQDs和CBQD-Cu对细胞的毒性。
成像检测细胞中的巯基化合物。将Hela或7702细胞接种于35mm激光共聚焦成像分析专用皿中，并于培养箱中培养至细胞密度约为80％时，将一定量新鲜配置的50μL CBQD-Cu(0.3mg/mL)溶液加入细胞培养皿中与细胞孵育6h，用一定量的PBS洗涤细胞4至5次，除去未进入细胞的CBQD-Cu后进行细胞成像。在对照组中加入50μL的N-Ethylmaleimide(NEM)(1mmol/L),一种硫醇的清除试剂，放置到37℃，含5％CO2的培养箱中孵育30min，然后再加入50μL CBQD-Cu(0.3mg/mL)孵育6h。为了确认CBQD-Cu与细胞内生物巯基化合物的成像情况，往细胞样品中加入50μL GSH(100μmol/L)在相同的条件下孵育30min，然后加入50μLCBQD-Cu(0.3mg/mL)孵育6h，再进行成像分析。所有细胞样品在成像分析之前，均用PBS洗涤4-5次除去未进入细胞的CBQDs。共聚焦荧光成像时使用405nm激光作为激发光。
活体肿瘤光动力学治疗。为了评估肿瘤的生长速度，先将带有肿瘤的裸鼠分成四组，每组五只；然后对每组的裸鼠进行治疗：(i)没有注射CBQD-Cu和进行激光治疗的对照组，(ii)注射了CBQD-Cu但没有激光照射的治疗组，(iii)注射CBQDs并用激光照射的治疗组，和(iv)注射CBQD-Cu和激光照射的治疗组。激光：使用功率0.4W/cm2的660nm激光器。肿瘤的体积大小通过使用以下公式计算：V＝L×W2/2，式中L为肿瘤的较长直径；W为肿瘤的较短直径，相对肿瘤体积评估采用：V/V0，其中V和V0分别为治疗后的体积和最初的体积。
需要说明的是，以上的实验中采用的实验仪器有介绍如下：CBQDs的形貌使用Tecnai G2 F20 S-TWIN场发射透射电子显微镜(Transmission electron microscope,Philips)进行表征；CBQDs和CBQD-Cu表面元素及其化学价态使用ESCALAB 250Xi型X射线光电子能谱仪(XPS,Thermo Electron,USA)进行表征；CBQDs和CBQD-Cu分子量使用离子阱质谱仪(MS，Bruker，Germany)进行表征；紫外-可见吸收光谱(UV-Vis)通过Cary 60紫外可见分光光度计(Agilent Technologies,USA)进行测定；荧光光谱使用Cary eclipse型荧光发光光度计(Agilent Technologies,USA)进行测定；细胞成像实验使用Zeiss LSM710激光共聚焦扫描显微镜进行。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征及本发明的优点，本行业的技术人员应该了解，以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的创造性精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种天然生物质量子点的制备方法，包括如下步骤：
S1：称取适量的新鲜干净的菠菜叶，将菠菜叶研磨至糊状；
S2：然后按每20g菠菜叶加入90-110mL体积比为1:1的乙醇与丙酮混合液，混匀并浸泡4-6min后，使用滤纸过滤，滤液即为叶绿素提取液；
S3：在三口烧瓶中加入25-35mL油酸，0.073g分子量为2000的聚氧乙烯二胺和磁力搅拌子，装上回流管密封好，然后抽出内部的空气，通入氩气，放置在数显智能控温磁力搅拌器上，搅拌并以0.8-1.2℃/min速度升温至170-190℃，待溶液颜色呈橙黄色时停止加热；
S4：待步骤S3制取的溶液冷却至室温后，加入8mL步骤S2制取的叶绿素粗提取液，在氩气保护和磁力搅拌下，再次以0.8-1.2℃/min速度升温至170-190℃且在此温度下保持170-190min后停止加热；
S5：待步骤S4中的生成物自然冷却至室温后，加入1.8-2.2mL浓HCl调节生成物溶液至强酸性，在28-32℃下搅拌至少10h；
S6：将步骤S5的产物溶液进行静置至分层，收集下层溶液；
S7：用饱和NaOH溶液调节步骤S6获得是产物溶液的pH值至中性，再用滤膜抽滤，去除粒径较大的颗粒，最后用透析袋在超纯水的环境下透析12-24h，得到富含叶绿素的生物质量子点溶液。
2.如权利要求1所述的天然生物质量子点的制备方法，其特征在于所述步骤S2中采用使用中速滤纸过滤。
3.如权利要求1所述的天然生物质量子点的制备方法，其特征在于所述步骤S3中采用圆底烧瓶。
4.如权利要求1所述的天然生物质量子点的制备方法，其特征在于所述步骤S7中采用0.15-0.25μm的有机系滤膜抽滤。
5.如权利要求1所述的天然生物质量子点的制备方法，其特征在于
S2：然后按每20g菠菜叶加入100mL体积比为1:1的乙醇与丙酮混合液，混匀并浸泡5min后，使用中速滤纸过滤；
S3：在圆底烧瓶中加入30mL油酸，0.073g分子量为2000的聚氧乙烯二胺和磁力搅拌子，装上回流管密封好，然后抽出仪器内部的空气，通入氩气，放置在数显智能控温磁力搅拌器上，搅拌并以1℃/min速度升温至180℃，待溶液颜色呈橙黄色时停止加热；
S4：待步骤S3制取的溶液冷却至室温后，加入8mL步骤S2制取的叶绿素粗提取液，在氩气保护和磁力搅拌下，再次以1℃/min速度升温至180℃且在此温度下保持180min后停止加热；
S5：待步骤4的生成物自然冷却至室温后，加入2mL浓HCl调节生成物溶液至强酸性，在30℃下搅拌12h；
S6：将步骤S5的产物溶液置于分液漏斗中静置至分层，收集下层溶液；
S7：用饱和NaOH溶液调节步骤S6获得是产物溶液的pH值至中性，再用0.22μm的有机系滤膜抽滤，去除粒径较大的颗粒，最后用规格为MWCO:1000Da的透析袋在超纯水的环境下透析12-24h，得到富含叶绿素的生物质量子点溶液。
6.如权利要求1-5任一所述的天然生物质量子点的制备方法，其特征在于还包括以下步骤
S8：将步骤S7获得的溶液放入冻干机中，冻干48h,得到棕色固体。
7.生物质量子点-铜纳米复合物(CBQD-Cu)的制备方法，其特征在于还包括以下步骤：
S9：称取权利要求1-5任一所述的天然生物质量子点的制备方法中步骤S7制取的富含叶绿素的生物质量子点溶液，溶于水中并超声配制成浓度为0.18-0.22mg/mL的溶液；
S10：在烧杯中加入上述配制好的富含叶绿素的近红外天然生物质量子点溶液，在搅拌下加入与富含叶绿素的近红外天然生物质量子点溶液等体积量且浓度为0.14-0.18mol/L的CuSO4溶液，使富含叶绿素的天然生物质量子点溶液的荧光猝灭；
S11：然后超声振荡至少50s时间，形成均匀的生物质量子点-铜纳米复合物。
8.如权利要求7所述的生物质量子点-铜纳米复合物的制备方法，其特征在于
S9：称取权利要求1-5任一所述的天然生物质量子点的制备方法中步骤S7制取的富含叶绿素的生物质量子点溶液，溶于水中并超声配制成浓度为0.2mg/mL的溶液；
S10：在烧杯中加入上述配制好的富含叶绿素的天然生物质量子点溶液，在搅拌下加入与富含叶绿素的天然生物质量子点溶液等体积量且浓度为0.16mol/L的CuSO4溶液，使富含叶绿素的天然生物质量子点溶液的荧光猝灭；
S11：然后超声振荡至少60s时间，形成均匀的生物质量子点-铜纳米复合物。
9.一种天然生物质量子点的应用，用于检测细胞内的生物巯基化合物浓度，其特征在于包括以下步骤：
S12：向离心管中加入30μL浓度为0.2mg/mL的富含叶绿素的天然生物质量子点溶液和30μL不同浓度的CuSO4溶液，然后使用pH＝7.4、浓度为0.01mol/L的磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffered solution，PBS)稀释至200μL，充分振荡5min后测定其荧光光谱，激发波长为405nm；
S13：生物巯基化合物和CBQD-Cu相互作用：在30μL浓度为0.3mg/mL的生物质量子点-铜纳米复合物(CBQD-Cu)溶液中加入30μL不同浓度的生物巯基化合物溶液，然后使用pH＝7.4、浓度为0.01mol/L的PBS稀释至200μL后，充分振荡5min后测定其荧光光谱，激发波长为405nm，其中所述生物质量子点-铜纳米复合物依据权利要求7或8所述的制备方法制得。
10.一种天然生物质量子点的应用，用于细胞中的巯基化合物成像检测，其特征在于包括以下步骤：
S14：将Hela或7702细胞接种于35mm激光共聚焦成像分析的皿中，并于培养箱中培养至细胞密度约为80％时，将新鲜配置的50μL浓度为0.3mg/mL的生物质量子点-铜纳米复合物(CBQD-Cu)溶液加入细胞培养的皿中与细胞孵育6h，用PBS洗涤细胞4至5次，除去未进入细胞的生物质量子点-铜纳米复合物(CBQD-Cu)后进行细胞成像，其中所述生物质量子点-铜纳米复合物依据权利要求7或8所述的制备方法制得；
S15：在对照组中加入50μL浓度为1mol/L的N-Ethylmaleimide(NEM)，放置在温度为37℃、含5％CO2的培养箱中孵育30min，然后再加入50μL浓度为0.3mg/mL生物质量子点-铜纳米复合物(CBQD-Cu)孵育6h后进行成像分析，其中所有细胞样品在成像分析之前，均用PBS洗涤4-5次，除去未进入细胞的含叶绿素的近红外天然生物质量子点(CBQDs)，共聚焦荧光成像时使用405nm激光作为激发光。
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