CN110746963B - 近红外发光的生物质量子点和细胞内mRNA比率荧光成像的纳米探针及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供源于薄荷叶的近红外发光的生物质量子点和用于细胞内mRNA比率荧光成像的纳米探针及其制备方法和应用，细胞内mRNA比率荧光成像的纳米探针制备方法包括从薄荷叶中制备叶绿素提取液，再制备近红外发光的生物质量子点(ML‑BQDs)，最后制备得到功能化的ML‑BQDs‑Dylight680探针溶液。本发明的细胞内mRNA比率荧光成像的纳米探针是基于荧光共振能量转移(FRET)的细胞内mRNA比率荧光成像，抗生物组织背景干扰的能力强，mRNA成像的准确度更高。

Description

近红外发光的生物质量子点和细胞内mRNA比率荧光成像的纳 米探针及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及化学和生物医学技术领域，尤其是涉及生物体细胞生物信息检测材料，具体为近红外发光的生物质量子点和对mRNA特异性响应的NIR比率荧光探针及其制备方法和应用。
背景技术
生物质量子点(BQDs)是一类新型荧光纳米材料，制备原料来源于天然生物质，制备方法简单，成本低廉，生物相容性好且无毒。细胞内信使RNA(mRNA)是由DNA的一条链作为模板转录而来,它将遗传信息从DNA传递到核糖体，在其中作为蛋白质合成模板并决定基因表达蛋白产物肽链的氨基酸序列。因此，mRNA的表达水平为医学诊断及疾病治疗提供了重要的信息，针对活细胞中特定mRNA分子的成像在生物学、生物医学、药物设计，临床诊断和癌症治疗等方面均具有重要意义。目前，互补单链核苷酸与靶标mRNA在指定位置结合常被用于细胞及活体内mRNA的单通道成像。然而这类基于细胞内mRNA的单通道成像方法，存在生物组织背景干扰，探针体内分布的非均匀性和仪器稳定性波动等因素，影响mRNA成像的准确度。
发明内容
本发明的目的在于为了克服现有技术不足而提供一种便于可以应用于不同细胞中生存素mRNA的比率荧光成像的细胞内mRNA比率荧光成像的纳米探针，以及用于制备细胞内mRNA比率荧光成像纳米探针的近红外发光的生物质量子点，和他们的制备方法及应用。细胞内mRNA比率荧光成像的纳米探针基于荧光共振能量转移(FRET)的细胞内mRNA比率荧光成像，抗生物组织背景干扰的能力强，mRNA成像的准确度更高。
本发明第一方面提供了一种近红外发光的生物质量子点的制备方法，制备方法包括如下过程，其中材料份是按份搭配：
S11：称取10g薄荷叶，洗净晾干后，放入研磨器中加入18-22mL无水乙醇，完全研碎，随后加入18-22mL丙酮，搅拌均匀后静置，用定性滤纸过滤得到叶绿素提取液；
S12：将0.025-0.032g NH2-PEG-NH2和18-22mL油酸放入圆底三口烧瓶中，装上空气回流管，充入氩气保护，加热升温至溶液变为橙黄色后停止加热；
S13：冷却至室温后加入6-8mL叶绿素提取液，升温至170-190℃，搅拌回流160-200min，再次冷却至室温后加入4-6mL浓度为10-15mol/L的HCl，在恒温28-32℃下搅拌超过8小时；
S14：将产物转移至分液漏斗中，加入1.0-1.5mL超纯水，混合均匀后静置分层，取下层溶液，加入固体氢氧化钠，调节溶液pH至中性，待温度降至室温后，用0.2-0.24μm滤膜过滤，滤液转移至MWCO:2kDa的透析袋中，用超纯水透析20小时以上从而获得ML-BQDs溶液，即近红外发光的生物质量子点。
进一步的，在步骤S11中，搅拌均匀后静置的时间为20min以上；
在步骤S12中，加热升温至溶液变为橙黄色后停止加热具体为加热升温至240-260℃或加热27-33min使得溶液变为橙黄色后停止加热。
本发明第二方面提供近红外发光的生物质量子点，其是按照上述的近红外发光的生物质量子点的制备方法制得。
本发明第三方面提供一种细胞内mRNA比率荧光成像的纳米探针的制备方法，该方法包括如下步骤，其中材料份是按份搭配：
S21：取透析后的ML-BQDs溶液5mL加入0.008-0.012g NHS和0.08-0.12g EDC，搅拌20min以上；
S22：取1.3-1.7mL活化后的溶液加入95-105μL浓度为90-110μmol/L氨基修饰的DNA单链，在36-38℃恒温且摇动下进行共价偶联反应；
S23：随后加入95-105μL浓度为90-110μmol/L修饰了Dylight680的单链生存素mRNA适配体，继续在36-38℃恒温摇床上杂交反应50-70min。
S24：冷却至室温后，将杂交反应后的溶液转移至10kD超滤管中，在9500-10500r/min下离心12min以上，移去滤出的溶液，加入1×PBS溶液，然后重复离心步骤三次，回收超滤管中未滤出的溶液，得到功能化ML-BQDs-Dylight680溶液，即为细胞内mRNA比率荧光成像的纳米探针溶液。
本发明第四方面提供细胞内mRNA比率荧光成像的纳米探针，该细胞内mRNA比率荧光成像的纳米探针是根据上述的细胞内mRNA比率荧光成像的纳米探针制备方法制成。
本发明第五方面还提供细胞内mRNA比率荧光成像的纳米探针的应用，用于细胞中mRNA的比率荧光检测。
进一步的，细胞内mRNA比率荧光成像的纳米探针用于不同细胞中生存素mRNA的比率荧光成像来区别不同类型的细胞。
细胞内mRNA比率荧光成像的纳米探针由近红外染料Dylight680标记的mRNA适配体与共价偶联在ML-BQDs表面的DNA单链杂交结合而成(ML-BQDs-Dylight680)。由于Dylight680的吸收光谱与ML-BQDs的荧光发射光谱相互重叠，在ML-BQDs-Dylight680中，ML-BQDs作为荧光供体，Dylight680作为荧光受体，两者结合后它们之间可发生FRET，导致ML-BQDs的荧光强度降低，而Dylight680的荧光强度升高。在mRNA存在的情况下，mRNA竞争置换连接在ML-BQDs表面Dylight680标记的mRNA适配体，导致Dylight680远离ML-BQDs表面，FRET效应消失。且随mRNA浓度的增加，Dylight680的荧光强度逐渐降低，而ML-BQDs的荧光强度逐渐升高，从而实现了mRNA的比率荧光检测。以肿瘤细胞中过表达的生存素mRNA为靶标模型，本发明制备的纳米探针可应用于不同细胞中生存素mRNA的比率荧光成像，其成像结果可用于区分不同类型的细胞，并可望在生物医学研究中发挥重要作用。
本发明将通过实施例并结合附图加以说明。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1为本发明中ML-BQDs-Dylight680纳米探针的制备及比率荧光检测生存素mRNA的原理图；
图2为本发明中ML-BQDs的透射电镜及高分辨透射电镜照片；
图3为本发明中ML-BQDs-Dylight680纳米探针的XRD图；
图4为本发明中ML-BQDs的XPS图；
图5为本发明中ML-BQDs及ML-BQDs-Dylight680纳米探针的红外光谱图，曲线A为ML-BQDs的红外光谱图；曲线B为ML-BQDs-Dylight680红外光谱图；
图6为本发明中Dylight680的紫外可见光谱(a曲线)及ML-BQDs的荧光激发(b曲线)和发射光谱(c曲线)图；
图7为本发明中Dylight680紫外-可见光谱及其荧光激发-发射光谱图，图中a曲线为紫外-可见吸收光谱，b色曲线和c曲线分别为荧光激发和发射光谱；
图8为本发明中ML-BQDs-Dylight680纳米探针的紫外-可见吸收光谱及荧光激发和发射光谱图，图中a曲线为紫外-可见吸收光谱，b曲线和c曲线分别为荧光激发和发射光谱；
图9为本发明中DNA-Dylight680用量的优化图，其中a-f:0-100μmol/L；
图10为本发明中ML-BQDs-Dylight680在不同浓度生存素mRNA(60-470nmol/L)存在下的荧光光谱图；
图11为本发明中荧光强度比值(I670/I720)的对数值与生存素mRNA浓度的线性关系，其中的插图为生存素mRNA低浓度(0-60nmol/L)时与荧光强度比值(I670/I720)对数值的线性关系图；
图12为本发明中不同ML-BQDs-Dylight680纳米探针浓度下Hela细胞的存活率图；
图13为本发明中Hela细胞、MCF-7细胞和MCF-7细胞的比率荧光成像图；
图14为本发明中Hela细胞及Hela细胞中加入生存素mRNA抑制剂后的比率荧光成像图。
具体实施方式
为了能够更清楚地理解本发明的上述目的、特征和优点，下面结合附图和具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述。需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请的实施例子及实施例中的特征可以相互组合。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是，本发明还可以采用其他不同于在此描述的方式来实施，因此，本发明的保护范围并不受下面公开的具体实施例的限制。
下面参照图1-14对本发明实施例的近红外发光的生物质量子点和细胞内mRNA比率荧光成像的纳米探针的特点做进一步的描述。
本发明第一方面提供的一个具体实施例，提供一种近红外发光的生物质量子点(ML-BQDs)的制备方法，其特征在于包括如下过程，其中材料份是按份搭配：
S11：称取10g薄荷叶，洗净晾干后，放入研磨器中加入18-22mL无水乙醇，完全研碎，随后加入18-22mL丙酮，搅拌均匀后静置，用定性滤纸过滤得到叶绿素提取液；
S12：将0.025-0.032g NH2-PEG-NH2和18-22mL油酸放入圆底三口烧瓶中，装上空气回流管，充入氩气保护，加热升温至溶液变为橙黄色后停止加热；
S13：冷却至室温后加入6-8mL叶绿素提取液，升温至170-190℃，搅拌回流160-200min，再次冷却至室温后加入4-6mL浓度为10-15mol/L的HCl，在恒温28-32℃下搅拌超过8小时；
S14：将产物转移至分液漏斗中，加入1.0-1.5mL超纯水，混合均匀后静置分层，取下层溶液，加入固体氢氧化钠，调节溶液pH至中性，待温度降至室温后，用0.2-0.24μm滤膜过滤，滤液转移至MWCO:2kDa的透析袋中，用超纯水透析20小时以上从而获得ML-BQDs溶液，即近红外发光的生物质量子点。
通过以上制备方法制得的ML-BQDs溶液即是近红外发光的生物质量子点。
本发明第二方面提供的一个具体实施例，提供一种细胞内mRNA比率荧光成像的纳米探针的制备方法，其特征在于该方法包括如下步骤，其中材料份是按份搭配：
S21：取透析后的ML-BQDs溶液5mL加入0.008-0.012g NHS和0.08-0.12g EDC，搅拌20min以上；
S22：取1.3-1.7mL活化后的溶液加入95-105μL浓度为90-110μmol/L氨基修饰的DNA单链，在36-38℃恒温且摇动下进行共价偶联反应；
S23：随后加入95-105μL浓度为90-110μmol/L修饰了Dylight680的单链生存素mRNA适配体，继续在36-38℃恒温摇床上杂交反应50-70min。
S24：冷却至室温后，将杂交反应后的溶液转移至10kD超滤管中，在9500-10500r/min下离心12min以上，移去滤出的溶液，加入1×PBS溶液，然后重复离心步骤三次，回收超滤管中未滤出的溶液，得到功能化ML-BQDs-Dylight680溶液，即为细胞内mRNA比率荧光成像的纳米探针溶液。
根据上述步骤S21-24制备得到的功能化ML-BQDs-Dylight680溶液即是细胞内mRNA比率荧光成像的纳米探针。
需要说明的是，以上制备方法中说的材料份是按份搭配是指1份近红外发光的生物质量子点的量或是1份细胞内mRNA比率荧光成像的纳米探针的量，如需要制备更多份量时则可以将步骤中的材料份量按比例调整。
下面通过实验来验证制备近红外发光的生物质量子点和细胞内mRNA比率荧光成像的纳米探针，以及他们的一些特征和属性，以及用途。
准备的实验试剂和材料有：1,3-二苯基异苯并呋喃购于上海源叶生物有限公司；聚氧乙烯二胺(NH2-PEG-NH2,MW＝2000)，油酸，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)均购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；YM155(Sepantronium bromide)购于MCE(MedChemExpress)中国有限责任公司；实验使用的DNA链均购于宝生物工程(大连)有限公司.DNA链的序列如表1所示；胎牛血清(Fetal BovineSerum)，DMEM basic(1×)，RPMI Medium 1640basic(1×)，0.25％Tryosin-EDTA(1×)均购于赛默飞世尔(苏州)仪器有限公司；不含抗菌剂的乳腺上皮基底介质乳腺上皮细胞购于美国Lonza公司；青链霉素混合液(100×)，1×PBS，5×TBE均购于索莱宝(北京)科技有限公司；PAGE胶促凝剂，丙烯酰胺/甲叉双丙烯酰胺30％溶液，过硫酸铵均购于生工生物工程(上海)股份有限公司；Calcein-AM/PI活细胞/死细胞双染试剂盒购置于上海翊圣生物科技有限公司；实验所用细胞株：Hela细胞(人宫颈癌细胞)，MCF-7细胞(人乳腺癌细胞)，MCF-10A细胞(人乳腺上皮细胞)购于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库/中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心；实验用水为18.2MΩ·cm超纯水。
准备的实验仪器包括：细胞培养瓶(Cell Culture Flask)T25(Eppendorf，USA)用于细胞培养；97孔和6孔组织培养板(Jet Biofil，广州)用于MTT实验；Cytation 5细胞成像多模式检测仪(BioTek，USA)用于细胞染色实验；X射线粉末衍射仪(XRD)(Rigaku，Japan)；Cary-60型紫外-可见分光光度计(Agilent Technologies，USA)；Cary Eclipse荧光光谱仪(Agilent Technologies，USA)；傅立叶转换红外光谱仪(Perkin-Elmer Instruments，USA)用于BQDs表面基团的表征；爱丁堡FLS980型时间分辨荧光光谱仪(Edinburgh，England)；透射电子显微镜(Transmission electro microsope，TEM，Philips，Netherlands)；X射线光电子能谱仪(XPS，USA)；EL×800型酶标仪(Bio Tekinstruments，USA)；Zeiss LSM710激光扫描共聚焦显微镜系统(CLSM，Zeiss，Germany)；SZCL-3B数显智能控温磁力搅拌器(巩义市予华仪器有限责任公司)。
一份细胞内mRNA比率荧光成像的纳米探针具体制备过程步骤如下，其中的质量和容量或体积根据需要可以同比例变化：
S11：称取10g薄荷叶，洗净晾干后，放入研磨器中加入20mL无水乙醇，完全研碎，随后加入10mL丙酮，搅拌均匀后静置30min，用定性滤纸过滤得到叶绿素提取液；
S12：将0.03g NH2-PEG-NH2和20mL油酸加入250mL圆底三口烧瓶中，装上空气回流管，充入氩气，加热升温至250℃(约30min)后停止加热，此时溶液变为橙黄色；
S13：冷却至室温后加入7mL叶绿素提取液，升温至180℃，搅拌回流3小时。再次冷却至室温后加入5mL 12mol/L HCl，在恒温30℃下搅拌过夜，即搅拌超过8小时，例如10小时、12小时等；
S14：将产物转移至分液漏斗中，加入适量水，混合均匀后静置分层；取下层溶液，加入固体氢氧化钠，调节溶液pH至中性，待温度降至室温后，用0.22μm滤膜过滤，滤液转移至MWCO:2kDa的透析袋中，用超纯水透析24小时；获得的溶液为ML-BQDs溶液，即近红外发光的生物质量子点。
S21：取透析后的溶液(ML-BQDs)5mL加入0.01g NHS和0.1g EDC，搅拌30min；
S22：取1.5mL活化后的溶液加入100μL 100μmol/L氨基修饰的DNA单链(DNA-NH2)，在37℃恒温且摇动下进行共价偶联反应；
S23：随后加入100μL浓度为100μmol/L修饰了Dylight680的单链生存素mRNA适配体(DNA-Dylight680)，继续在37℃恒温摇床上杂交反应1小时；
S24：冷却至室温后，将上述溶液转移至10kD超滤管中，在10000r/min下离心15min，移去滤出的溶液，加入1×PBS溶液，然后重复离心步骤三次，回收超滤管中未滤出的溶液，得到功能化ML-BQDs-Dylight680溶液，即为细胞内mRNA比率荧光成像的纳米探针。
如图1所示，通过上述例子中方法制备的一种在近红外发光的生物质量子点，也就是首先将一定量薄荷叶的乙醇-丙酮提取液与油酸及聚氧乙烯二胺混合，搅拌反应得到近红外荧光的生物质量子点ML-BQDs。然后将5’端修饰氨基的氨基DNA链(DNA-NH2)与生物质量子点表面的羧基共价偶联，再加入3’端修饰Dylight680染料的生存素mRNA适配体(DNA-Dylight680)链，两者杂交结合得到ML-BQDs-Dylight680纳米探针。由于Dylight680的吸收光谱与ML-BQDs荧光发射光谱相互重叠，它们之间可以发生FRET，导致ML-BQDs的荧光强度降低，而Dylight680的荧光强度升高。在mRNA存在的情况下，mRNA竞争置换连接在ML-BQDs表面Dylight680标记的mRNA适配体，导致Dylight680远离ML-BQDs表面，FRET效应消失，且随mRNA浓度的增加，Dylight680的荧光强度逐渐降低，而ML-BQDs的荧光强度逐渐升高，从而实现了mRNA的比率荧光检测。
下面通过实验对ML-BQDs及ML-BQDs-Dylight680纳米探针的表征。
采用透射电镜(TEM)分别对ML-BQDs的形貌、分散程度和粒径进行了表征，结果如图2所示，从图2中(a)透射电镜图可见，ML-BQDs的粒径在3-5nm之间，并具有良好的分散性，2中(b)图为ML-BQDs的高分辨透射电镜(HRTEM)图，通过Gatan Digital Micrograph软件分析其晶格条纹得知晶格常数为0.23μm，这个尺寸对应石墨烯(100)晶格面，说明ML-BQDs的石墨化程度较高。采用X射线粉末衍射(XRD)分析，考察了ML-BQDs-Dylight680纳米探针的石墨化晶型，结果如图3所示。从XRD图中可以看出在2θ＝23.43°处有一宽的衍射峰，对应的无定型碳结构晶型为(002)。
采用XPS对ML-BQDs的元素组成及表面成键情况进行了表征，结果如图4所示，从XPS图中可见，ML-BQDs的主要元素构成为C、N、O。利用傅里叶红外吸收光谱分析，考察了ML-BQDs和ML-BQDs-Dylight680纳米探针及功能化M-BQDs纳米探针的表面基团，结果如图5示，从图中可以看出，ML-BQDs和ML-BQDs-Dylight680纳米探针的表面基团相似，在1100cm-1有一个吸收峰，该峰归属于C-O-C/C-O键；1380cm-1处属于C-N/O＝C-O/N-H键；2850-2920cm-1峰对应于C-H/N-H键的伸缩振动；3450cm-1处的宽峰对应于O-H/N-H键。与ML-BQDs不同,ML-BQDs-Dylight680纳米探针在1625cm-1出现吸收峰，这个峰为Dylight680的特征吸收峰，说明Dylight680已成功修饰在ML-BQDs的表面；同时1100cm-1处的吸收峰明显增强说明DNA链成功修饰在了ML-BQDs表面。
下面通实验数据考察ML-BQDs及ML-BQDs-Dylight680纳米探针的光学性质。
测量了Dylight680的吸收光谱及ML-BQDs的荧光激发和发射光谱，结果如图6所示。从图6中可以看到，ML-BQDs的最佳激发波长为405nm(曲线a)，用此波长激发得到的最大荧光发射峰在675nm处(曲线c)。Dylight680的吸收光谱在279nm和680nm呈现了两个吸收峰，且680nm的吸收峰与ML-BQDs的荧光发射峰(670nm)基本上重叠，这表明两者靠近时可以发生FRET。
为了考察Dylight680和ML-BQDs-Dylight680纳米探针的光学性质。首先测量了Dylight680的紫外-可见吸收光谱及荧光激发-发射光谱，结果如图7所示，从图7中可以看到，Dylight680的吸收光谱在279nm和680nm呈现了两个吸收峰，它的荧光激发和发射光谱峰分别位于692nm和712nm。然后测量了ML-BQDs-Dylight680纳米探针的紫外-可见吸收光谱及荧光激发-发射光谱，结果如图8所示，从图8中可以看到，ML-BQDs-Dylight680纳米探针在279nm及680nm处也有明显的吸收峰，这两个峰均来自Dylight680的特征吸收，但是峰强度大大降低。这个结果表明Dylight680已成功负载在ML-BQDs表面，ML-BQDs-Dylight680纳米探针的最佳激发在405nm(图8中a曲线)，在此波长激发下得到两个荧光发射峰，分别位于670nm(ML-BQDs的最大荧光发射)和720nm(Dylight680的荧光发射)。
为了构建双发射的比率荧光纳米探针，并证明Dylight680与ML-BQDs之间是否发生了FRET，我们优化了DNA-Dylight680的用量。在修饰了氨基DNA的ML-BQDs溶液中，加入不同浓度的DNA-Dylight680溶液，基于两者中的单链DNA相互杂交，使Dylight680分子连接在ML-BQDs表面，它们之间发生FRET，ML-BQDs的能量转移到Dylight680分子，导致ML-BQDs的荧光减弱而Dylight680增强，且随着Dylight680-DNA浓度的不断增加(0-100μmol/L)，ML-BQDs的荧光强度逐渐降低，Dylight680的荧光强度逐渐增大。当选择适当的浓度比时，即可得到双发射的近红外比率型荧光纳米探针，图9所示。
下面通过实验数据结果探讨对纳米探针比率荧光检测生存素mRNA
在纳米探针溶液中加入不同浓度的生存素mRNA，反应后得到如图10所示的系列荧光光谱。从图中可见，随着生存素mRNA浓度的不断增加，670nm波长处的荧光强度逐渐升高，而720nm波长处的荧光强度逐渐降低。两波长处荧光强度比值的对数值与生存素mRNA的浓度在0-470nmol/L范围内呈现出良好的线性关系(图11)。线性回归方程为：log(F670/F720)＝0.00175CmRNA-0.0856，R2＝0.9949。图中插图为生存素mRNA浓度在0-60nmol/L范围内的线性关系：log(F670/F720)＝0.00174CmRNA-0.0796，线性相关系数为R2＝0.9896，检测限为5.5nmol/L)(S/N＝3)。
下面通过实验考察纳米探针的细胞毒性。
为了研究开发的纳米探针能否应用于细胞中生存素mRNA的成像，我们首先考察了ML-BQDs-Dylight680的细胞毒性。选用人宫颈癌细胞(Hela)进行测定，将细胞转移至96孔板中培育，在孔中分别加入不同浓度的ML-BQDs-Dylight680纳米探针，并孵育20h后加入标准浓度的MTT溶液，检测Hela细胞的存活率，结果如图12所示。ML-BQDs-Dylight680纳米探针在0-200μg/mL浓度范围内细胞存活率超过80％，表明所制备的纳米探针具有良好的生物相容性。
下面通过实验数据说明细胞中生存素mRNA的比率荧光成像。
分别培养Hela、MCF-7、MCF-10A细胞，并转移接种至35mm共聚焦成像皿中，继续培育至细胞密度接近60％时，加入ML-BQDs-Dylight680纳米探针，并继续孵育12h。然后在激光共聚焦显微成像系统上进行细胞成像，得到结果如图13所示，从图中可见，人宫颈癌细胞(Hela)中，720nm通道(700-800nm)的荧光强度最强，670nm通道(640-680nm)的荧光强度最弱。与人宫颈癌细胞(Hela)相比较，在人乳腺癌细胞(MCF-7)中720nm通道的荧光强度增加，而670nm通道的荧光强度降低；在人乳腺上皮细胞(MCF-10A)中720nm通道与670nm通道的荧光强度均较弱且几乎相同；比率成像结果表明：细胞内生存素mRNA的含量，Hela细胞大于MCF-7细胞，MCF-7细胞大于MCF-10A细胞。这些成像分析结果与生存素mRNA在三种细胞中的含量完全相匹配。因此，上述方法制备的比率荧光纳米探针，可以通过比率荧光成像区分不同类型的细胞。
为了证明ML-BQDs-Dylight680纳米探针功对生存素mRNA成像记过的可靠性，将Hela细胞分为两组孵育，一组中加入终浓度为2.5nmol/L的生存素mRNA抑制剂(YM-155)，另一组中加入等量的1×PBS。然后在激光共聚焦显微成像系统上进行细胞成像，得到结果如图14所示。从图中可见，在加入YM-155的Hela细胞中，720nm通道的荧光强度增加，而670nm通道的荧光强度降低。结果表明，在加入YM-155的Hela细胞中，生存素mRNA已被完全抑制。
以上实施例，通过薄荷叶为原料，制备了一种近红外发光的生物质量子点(ML-BQDs)，并开发了一种基于荧光共振能量转移(FRET)的细胞内mRNA比率荧光成像的纳米探针(ML-BQDs-Dylight680)。该纳米探针具有细胞毒性小，生物相容性好，特异性高，抗光漂白能力强等特点，并能克服测量仪器本身稳定性变化，探针在细胞和体内分布不均匀和生物组织背景等因素引起的测量误差。该纳米探针对生存素mRNA具有高的灵敏度，检测限为5.5nmol/L。已应用于活细胞中内源性生存素mRNA的比率荧光成像。因此，它可以作为一种理想的NIR比率荧光探针用于可视化、原位检测活细胞中内源性生存素mRNA，通过比率荧光成像区分不同类型的细胞。并有望在生存素mRNA的生物医学研究和肿瘤的临床诊断中发挥关键作用。
表1本工作中使用的DNA序列
Figure GDA0002782982290000121
以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的创造性精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.细胞内mRNA比率荧光成像的纳米探针的制备方法，其特征在于该方法包括如下步骤，其中材料份是按份搭配：
S11：称取10g薄荷叶，洗净晾干后，放入研磨器中加入18-22mL无水乙醇，完全研碎，随后加入18-22mL丙酮，搅拌均匀后静置，用定性滤纸过滤得到叶绿素提取液；
S12：将0.025-0.032g NH2-PEG-NH2和18-22mL油酸放入圆底三口烧瓶中，装上空气回流管，充入氩气保护，加热升温至溶液变为橙黄色后停止加热；
S13：冷却至室温后加入6-8mL叶绿素提取液，升温至170-190℃，搅拌回流160-200min，再次冷却至室温后加入4-6mL浓度为10-15mol/L的HCl，在恒温28-32℃下搅拌超过8小时；
S14：将产物转移至分液漏斗中，加入1.0-1.5mL超纯水，混合均匀后静置分层，取下层溶液，加入固体氢氧化钠，调节溶液pH至中性，待温度降至室温后，用0.2-0.24μm滤膜过滤，滤液转移至MWCO:2kDa的透析袋中，用超纯水透析20小时以上从而获得ML-BQDs溶液；
S21：取步骤S14中透析后的ML-BQDs溶液5mL加入0.008-0.012g NHS和0.08-0.12gEDC，搅拌20min以上；
S22：取1.3-1.7mL活化后的溶液加入95-105μL浓度为90-110μmol/L氨基修饰的DNA单链，在36-38℃恒温且摇动下进行共价偶联反应；
S23：随后加入95-105μL浓度为90-110μmol/L修饰了Dylight680的单链生存素mRNA适配体，继续在36-38℃恒温摇床上杂交反应50-70min；
S24：冷却至室温后，将杂交反应后的溶液转移至10kD超滤管中，在9500-10500r/min下离心12min以上，移去滤出的溶液，加入1×PBS溶液，然后重复离心步骤三次，回收超滤管中未滤出的溶液，得到功能化ML-BQDs-Dylight680溶液，即为细胞内mRNA比率荧光成像的纳米探针溶液。
2.细胞内mRNA比率荧光成像的纳米探针，其特征在于所述的细胞内mRNA比率荧光成像的纳米探针是根据权利要求1所述的制备方法制成。
3.根据权利要求2所述的细胞内mRNA比率荧光成像的纳米探针的应用，其特征在于用于细胞中mRNA的比率荧光检测。
4.根据权利要求3所述的细胞内mRNA比率荧光成像的纳米探针的应用，其特征在于用于不同细胞中生存素mRNA的比率荧光成像来区别不同类型的细胞。
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