CN103207166B - 用于快速检测atp的荧光共振体系的制备方法 - Google Patents

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Abstract

用于快速检测ATP的荧光共振体系的制备方法，包括以下步骤：步骤一：准备一种Cy3荧光标记的ATP-aptamer适配体；步骤二：将QDs与ATP-aptamer适配体互补链进行偶联反应，得到QDs分子探针；步骤三：将步骤2得到的QDs分子探针与Cy3荧光标记的ATP适配体反应，得到ATP适配体与互补链相互作用后的用于检测ATP的荧光共振体系。本发明利用了ATP与其配体链(aptamer)特异性结合的特点，结合能量共振转移技术，实现了对ATP的快速检测，并且实现了对线粒体内ATP浓度变化的实时监控，为ATP的体外及体内检测监控提供了一种新的方法。

Description

用于快速检测ATP的荧光共振体系的制备方法
技术领域
本发明涉及生物技术和快速诊断检测领域，特别涉及用于快速检测ATP的荧光共振体系的制备方法，适用于低浓度ATP的快速检测以及细胞生物学线粒体功能等方面的应用。
技术背景
三磷酸腺苷(ATP)存在于从微生物到高等动植物细胞所有的生物体中。ATP在细胞体内主要作用是提供能量，参与体内脂肪、蛋白质、糖和核酸的代谢，是机体能量的重要来源，在维持生物体的正常机能上有着无可替代的作用。ATP作为最重要的能量分子在细胞的各种生理、病理过程中起着重要作用，可作为细胞活性的一个重要标志物。ATP也常作为微生物污染的一个指标，通过检测ATP含量，可以检测食品、水、啤酒、药品、化妆品等样品中的微生物含量，从而反应出其受污染的程度。线粒体是细胞内氧化磷酸化和合成ATP的主要场所，通过监测活细胞线粒体内ATP含量的改变，可以评价多种药物、生物制剂或生物活性物质引起的细胞杀伤、细胞抑制和细胞增殖作用。
传统的ATP检测方法有生物发光法、高效液相色谱法和同位素示踪法等。其中高效液相色谱法操作复杂且检测时间较长；同位素示踪法虽检测灵敏度较高，但污染较大限制其应用。采用生物发光方法是目前较为流行的方法之一，该方法基于萤火虫荧光素酶（Firefly Luciferase）催化荧光素氧化，消耗ATP，发出光子的高效发光反应，具有发光效率极高、发光量与ATP含量呈很好的线性关系的特点，而ATP含量是萤光素氧化反应中的限制因素，光的强度与样品中所含的ATP量成正比，需利用高灵敏度的仪器测定光的强度进行定量分析。而目前众多的ATP检测方法多适用于体外ATP检测，对活细胞线粒体内ATP的检测涉及较少。
发明内容
为了克服上述现有技术的不足、提高ATP检测的灵敏度以及实现对细胞内ATP的适时监控，本发明的目的在于提供用于快速检测ATP的荧光共振体系的制备方法，利用ATP与其配体链（aptamer)的特异性结合原理，利用荧光能量共振转移技术，通过检测QDs与配对荧光染料的荧光强度比值变化，实现对ATP的快速检测。
为实现上述目的，本发明通过以下的技术方案实现，
用于快速检测ATP的荧光共振体系的制备方法，包括以下步骤：
步骤一：准备一种Cy3荧光标记的ATP-aptamer适配体，ATP-aptamer适配体为3’-Cy3修饰的DNA适配体，其序列信息为：5’-ACCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGGT-Cy3-3’；
步骤二：将QDs与ATP-aptamer适配体互补链进行偶联反应，得到QDs-分子探针，QDs为羧基表面水溶性量子点（COOH-QDs），浓度为1uM；ATP适配体互补链为5’-NH2-(CH2)12修饰的DNA，其序列信息为：5’-NH2-(CH2)12-ACCTTCCTCCGCAATACTCCCCCAGGT-3’（ProbeDNA，DNAp）；
步骤三：将步骤2得到的QDs-分子探针与Cy3荧光标记的ATP适配体反应，得到ATP适配体与互补链相互作用后的用于检测ATP的荧光共振体系。
本发明采用能量共振转移原理，以带有荧光染料Cy3标记的ATP适配体与量子点标记的ATP适配体互补链，通过杂交反应形成双链，构建能量共振转移体系。利用ATP与ATP适配体特异性识别结合的原理，以量子点为能量供体，Cy3为能量受体进行能量共振转移，检测荧光信号强度比值改变。在无ATP存在的条件下，与QDs偶联的ATP适配体互补链与Cy3标记的ATP适配体形成双链进行能量转移，QDs荧光下降，Cy3荧光增强；当有ATP存在时，ATP与ATP适配体特异性识别，双链解体，能量共振转移体系降低或消失，QDs荧光增强，Cy3荧光降低，从而实现对ATP的快速检测。
本发明利用了ATP与其配体链(aptamer)特异性结合的特点，结合能量共振转移技术，实现了对ATP的快速检测，为ATP的体外检测监控提供了一种新的方法
本发明设计了一种快速、高灵敏度检测ATP的体系。以QDs标记的DNA-aptamer为分子探针，利用荧光能量共振转移原理，通过检测QDs与配对荧光染料的荧光强度比值变化，从而实现对ATP进行定量检测，可以提高ATP检测灵敏度、缩短检测时间，降低成本。
附图说明
图1为偶联反应原理示意图。
图2为荧光共振体系反应原理示意图。
图3为QDs发射谱和Cy3激发谱示意图。
图4为偶联杂交后终产物QDs-DNAp-Cy3进行荧光光谱扫描得到的谱图。
图5为荧光共振体系可用于检测ATP原理示意图。
图6是对于不同浓度的ATP系统的检测结果示意图。
图7是根据图6的光谱数据，计算的体系在检测不同浓度的atp时候的响应结果。
图8是在适当浓度范围内的标准曲线，以显示整个系统的线性范围。
具体实施方式
下面结合附体对本发明的结构原理和工作原理做详细叙述。
用于快速检测ATP的荧光共振体系的制备方法，包括以下步骤：
步骤一：准备一种Cy3荧光标记的ATP-aptamer适配体；ATP-aptamer适配体为3’-Cy3修饰的DNA适配体，浓度为0.2uM-1uM，其序列信息为：5’-ACCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGGT-Cy3-3’；
步骤二：将QDs与ATP-aptamer适配体互补链进行偶联反应，得到QDs分子探针，QDs为羧基表面水溶性量子点（COOH-QDs），浓度为1uM；ATP适配体互补链为5’-NH2-(CH2)12修饰的DNA，浓度为10-500uM，其序列信息为：5’-NH2-(CH2)12-ACCTTCCTCCGCAATACTCCCCCAGGT-3’（ProbeDNA，DNAp）。
步骤三：将步骤2得到的QDs分子探针与Cy3荧光标记的ATP适配体反应，得到ATP适配体与互补链相互作用后的用于检测ATP的荧光共振体系。
本发明中，偶联反应按如下方法制备，原理示意详见图1：将COOH-QDs加入到反应器中，300rpm，5min，震荡混匀；加入计算好用量的EDC溶液和sulfo-NHS（10mg/mL，10mM硼酸盐缓冲液，pH7.4）活化30min；加入计算好用量的DNAp，继续震荡混合均匀，300rpm，室温反应2h（若室温较低，可将搅拌式加热器的温度调至25℃）。反应结束，用0.22μm针头式滤器将样品过滤，或者12000rpm离心3min除团聚；用超滤管将样品浓缩纯化5次，每次浓缩比不小于10，终产物（QDs-DNAp）复溶于适当的目标偶联物缓冲液中。
反应用量：
QDs发射谱和Cy3激发谱详见图3，偶联杂交后终产物QDs-DNAp-Cy3进行荧光光谱扫描，380nm激发，得到如图4的谱图。
本发明中，步骤三的荧光共振体系按如下方法制备，原理示意详见图2：在QDs-DNAp溶液中加入适量ATP适体链，37℃，杂交30min，构建fret体系，用超滤管将样品浓缩纯化5次，每次浓缩比不小于10，终产物（QDs-DNAp-Cy3体系）复溶于适当的目标偶联物缓冲液中。
本发明中，步骤三得到的荧光共振体系可用于检测ATP，ATP的检测按如下方法进行，原理示意图见图5：在QDs-DNAp-Cy3体系中加入不同浓度的ATP，45℃，30min，冷却至室温，用超滤管将样品浓缩纯化5次，每次浓缩比不小于10，终产物测量荧光强度变化。
ATP及其类似物的检测方法如下：在QDs-DNAp-Cy3体系中加入相同浓度的ATP，CTP，UTP，GTP，45℃，30min，冷却至室温，用超滤管将样品浓缩纯化5次，每次浓缩比不小于10，终产物测量荧光强度变化。
实施例一
将32.5uL PB缓冲液（10mM，pH7.4）加入到反应器中，加入6.3uLCOOH-QDs300rpm，5min，震荡混匀；加入2.9uL EDC溶液（10mg/mL，10mM PB缓冲液，pH7.4）和3.3uL sulfo-NHS溶液（10mg/mL，10mM PB缓冲液，pH7.4）活化30min；加入5uL100uM DNAp，继续震荡混合均匀，300rpm，25℃，2h，各反应物摩尔浓度比为：QDs:DNA:EDC:sulfo-NHS=1:10:3000:3000；加入2uL100uM ATP适配体，37℃，杂交30min；反应样品加入200uL PB缓冲液（10mM，pH7.4），超滤管浓缩纯化5次，终产物复溶于50uL PB缓冲液（10mM，pH7.4）中；FLS920荧光分光光度计检测荧光值；依次加入不同浓度的ATP（0-10uM）于终产物中，45℃，30min，冷却至室温，加入200uL PB缓冲液（10mM，pH7.4），超滤管浓缩纯化5次，终产物测量荧光强度变化。荧光信号随着ATP浓度的变化而变化，图中横坐标为ATP的浓度，纵坐标为荧光信号强度，ATP的浓度为：0.001uM，0.005uM，0.01uM，0.05uM，0.001uM，0.005uM，1uM，5uM，10uM，利用这一方法的所获得的ATP检测先为：1nM，能得到如下结果，参照图6：
加入不同浓度的ATP（0.1nM-10uM）后检测荧光强度变化得到如下趋势线：参照图7，R为加入ATP后，572nm处荧光强度与545nm处荧光强度的比值；R0为没有加入ATP时，参照图8，572nm处荧光强度与545nm处荧光强度的比值；*R=|R-R0|。
从上面的数据可以看出，基于量子点荧光共振能量转移技术检测ATP的体系的灵敏度非常高，当检测浓度低至0.1nM的时候仍然可以得到非常好的检测信噪比。

Claims (1)

1.用于快速检测ATP的荧光共振体系的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一：准备一种Cy3荧光标记的ATP-aptamer适配体，ATP-aptamer适配体为3’-Cy3修饰的DNA适配体，浓度为0.2uM-1uM，其序列信息为：5’-ACCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGGT-Cy3-3’；
步骤二：将QDs与ATP-aptamer适配体互补链进行偶联反应，得到QDs-分子探针，QDs为羧基表面水溶性量子点COOH-QDs，浓度为1uM；ATP-APTAMER适配体互补链为5’-NH2-(CH2)12修饰的DNA，浓度为10-500uM,其序列信息为：5’-NH2-(CH2)12-ACCTTCCTCCGCAATACTCCCCCAGGT-3’；
偶联反应方法制备如下：将COOH-QDs加入到反应器中，300rpm，5min，震荡混匀；加入计算好用量的EDC溶液和sulfo-NHS，10mg/mL，10mM硼酸盐缓冲液，pH7.4活化30min；加入计算好用量的DNAp，继续震荡混合均匀，300rpm，室温反应2h，当室温较低时，将搅拌式加热器的温度调至25℃，反应结束，用0.22μm针头式滤器将样品过滤，或者12000rpm离心3min除团聚；用超滤管将样品浓缩纯化5次，每次浓缩比不小于10，终产物QDs-DNAp复溶于适当的目标偶联物缓冲液中；
步骤三：将步骤二得到的QDs-分子探针与Cy3荧光标记的ATP-APTAMER适配体反应，得到ATP-APTAMER适配体与互补链相互作用后的用于检测ATP的荧光共振体系。
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