CN103616361A - 一种荧光葡萄糖纳米生物传感器及其制备方法 - Google Patents

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本发明公开了一种荧光葡萄糖纳米生物传感器，该传感器的有效成分是功能化的荧光纳米颗粒。本发明是将酶催化法与荧光氧气纳米传感器进行结合而制备了荧光纳米葡萄糖传感器，基于葡萄糖氧化酶在催化葡萄糖过程中对氧气的消耗，而间接实现对葡萄糖的荧光检测。本发明葡萄糖纳米生物传感器具有响应时间快、灵敏度高和稳定性好的优点，对葡萄糖的检测下限可达到0.5mmol/L。该传感器由于具有纳米级的尺寸和良好的生物相容性，可以用于生物体内微小环境（如活细胞内）以及人体体液（如血浆）葡萄糖浓度的检测。

Description

一种荧光葡萄糖纳米生物传感器及其制备方法
技术领域
本发明属于生化分析和定量研究的技术领域，具体涉及一种荧光葡萄糖纳米生物传感器及其制备方法。
背景技术
葡萄糖浓度的测定在临床分析、生物技术、农业、食品工业等方面都有广泛的应用。其中，在临床分析中，它对于糖尿病的诊断、后续治疗以及检测细胞代谢有十分重要的意义。糖尿病是一种很常见的疾病，病人胰岛素缺乏导致血糖代谢紊乱。因此，血液中的葡萄糖浓度变化比正常机体中更强烈。一系列用于检测葡萄糖的技术相继发展起来。
葡萄糖的检测方法主要有分光光度法、旋光度法、气相色谱法、比色法等。其中，分光光度法需要加入显色剂；旋光度法由于葡萄糖结构的复杂性，仅适宜作为一种辅助的检测方法；气相色谱法需要经过硅醚化处理，操作比较复杂。并且，这些检测方法大都应用于宏观尺度的葡萄糖浓度检测，对局域微环境的葡萄糖浓度难以实时、灵敏检测。
基于葡萄糖氧化酶的生物传感器对葡萄糖的检测具有线性检测范围宽、特异性好、灵敏度高、响应速度快等优点，且成本较低，有很好的应用前景。葡萄糖氧化酶在氧化葡萄糖的过程中消耗氧气，因此对氧化过程中溶氧量的检测则可以间接反应出葡萄糖的浓度水平。对于溶氧量的检测，荧光氧气纳米传感器具有尺寸小、非侵入性和灵敏度高等优点。而将葡萄糖氧化酶分子偶联到氧气纳米传感器的表面，构建葡萄糖氧化酶荧光纳米传感器，从而对微量样品中的葡萄糖进行快速精确的荧光检测还未见报道。
发明内容
本发明要解决的第一个技术问题是提供一种荧光葡萄糖纳米生物传感器，所述传感器能够实现在微小的环境内部（如活细胞内）或是少量样品中的葡萄糖浓度的检测。
本发明要解决的第二个技术问题是提供一种荧光葡萄糖纳米生物传感器的制备方法，该方法制备步骤简单，容易操作，适于大规模生产。
为解决第一个技术问题，本发明采用下述技术方案：
一种荧光葡萄糖纳米生物传感器，所述荧光葡萄糖纳米生物传感器包括核壳结构的荧光氧气纳米粒子和偶联于荧光氧气纳米粒子表面的葡萄糖氧化酶功能基团；所述荧光氧气纳米粒子的核层是由十二烷基三甲氧基硅烷与聚苯乙烯杂化并掺杂荧光氧气探针分子铂(Ⅱ)MESO-四(五氟苯)卟吩和荧光参比分子香豆素6形成，所述荧光氧气纳米粒子的壳层为多聚赖氨酸，包覆于核层外面。
优选地，所述核壳结构的荧光氧气纳米粒子粒径为240-260nm。
优选地，所述荧光氧气纳米粒子表面偶联葡萄糖氧化酶功能基团后的粒径为270-290nm。
为解决第二个技术问题，本发明采用下述技术方案：
一种荧光葡萄糖纳米生物传感器的制备方法，包括以下制备步骤：
1)将质量比为1-3:1-3:44-48:50的铂(Ⅱ)MESO-四(五氟苯)卟吩、香豆素6、聚苯乙烯和十二烷基三甲氧基硅烷溶解于四氢呋喃中，溶液中的总浓度为0.1-0.3％；
2)配制浓度为0.02-0.04mg/ml的多聚赖氨酸的去离子水溶液，并用氨水调整多聚赖氨酸的去离子水溶液pH值为8-9；
3)取300-500μL步骤1)所述四氢呋喃溶液，在超声震荡条件下注入到步骤2)所述多聚赖氨酸的去离子水溶液中，得到悬浮液，经超声震荡1-3小时后，随后在去离子水中透析12-48小时，即得到核壳结构的荧光氧气纳米粒子；
4)在步骤3)所述核壳结构的荧光氧气纳米粒子中，首先加入与多聚赖氨酸等物质的量的戊二醛，在20-25°C的条件下震荡3-5分钟，然后加入浓度为1000-2000ppm的葡萄糖氧化酶水溶液，加入的葡萄糖氧化酶的质量是荧光氧气纳米粒子质量的10-20倍，在20-25°C的条件下震荡1-2小时，实现葡萄糖氧化酶与纳米颗粒的偶联，即得到荧光葡萄糖纳米生物传感器。
本发明的有益效果：
本发明葡萄糖纳米生物传感器具有响应时间快、灵敏度高和稳定性好的优点，荧光氧气纳米粒子中的PLL壳层使得传感器拥有很好的生物相容性和低毒性；对葡萄糖的检测下限可达到0.5m mol/L。该传感器由于具有纳米级的尺寸和良好的生物相容性，可以用于生物体内微小环境（如活细胞内）以及人体体液（如血浆）葡萄糖浓度的检测。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。
图1是本发明实施例1的表面偶联葡萄糖氧化酶功能基团后的荧光氧气纳米粒子结构示意图。
图2是本发明实施例1核壳结构的荧光氧气纳米粒子的SEM图。
图3是本发明实施例1戊二醛将葡萄糖氧化酶偶联到荧光氧气纳米粒子表面的原理图。
图4是本发明实施例1表面偶联葡萄糖氧化酶功能基团后的荧光氧气纳米粒子的SEM图。
图5是本发明实施例1表面偶联葡萄糖氧化酶功能基团后的荧光氧气纳米粒子在加入不同葡萄糖浓度后的荧光光谱图（λEx=405nm）。葡萄糖浓度的单位是mmol/L。
图6是本发明实施例1荧光葡萄糖纳米生物传感器对葡萄糖浓度的标定曲线图（R和R0分别代表无、有葡萄糖时红绿荧光荧光强度的比值）。
图7是本发明实施例1的PtTFPP荧光氧气猝灭原理图。
具体实施方式
为更好地理解本发明，下面将通过具体的实施例进一步说明本发明的方案，本发明的保护范围应包括权利要求的全部内容，但不限于此。
实施例1
一种荧光式葡萄糖纳米生物传感器，该生物传感器由功能化荧光纳米颗粒组成，结构如图1所示。首先利用再沉淀法制备了表面包覆多聚赖氨酸（PLL）壳层的比率荧光氧气纳米传感器：内部为十二烷基三甲氧基硅烷（DTS）与聚苯乙烯（PS）杂化形成的核，其中掺杂了两种荧光染料分子（氧气探针分子铂(Ⅱ)MESO-四(五氟苯)卟吩（PtTFPP）和荧光参比分子香豆素6（C6））；外部为PLL壳层。氧气纳米传感器的形貌和粒径如图2所示，粒径集中分布在258.2nm左右。然后基于伯胺与戊二醛之间的席夫碱反应，将葡萄糖氧化酶偶联于氧气纳米传感器的表面，使其具备对葡萄糖的氧化催化功能，具体的偶联反应原理如图3所示。所制备的功能纳米纳米颗粒的形貌如图4所示，粒径集中分布在284.6nm左右，比之前粒径明显增加。
随后，对所制备的葡萄糖荧光纳米传感器的葡萄糖传感性能进行检测。在含有纳米传感器的溶液中，分别加入浓度为0、0.5、1、2、3、5、8、10mmol/L的葡萄糖溶液。在反应10分钟后，测量其荧光光谱（激发波长为405nm），结果如图5所示。计算不同葡萄糖浓度对应的红、绿荧光荧光强度的比值与葡萄糖浓度作图，得到标定曲线如图6所示。由图中可以看出，当葡萄糖浓度小于0.5mmol/L时，荧光强度的比值基本保持不变；在0.5-3mmol/L范围内，荧光强度比值与葡萄糖浓度呈线性关系；当大于3mmol/L时，荧光强度比值又达到饱和。上述数据表明，所制备的葡萄糖传感器的检测范围为0.5-3mmol/L。
本发明的检测原理：
在氧气存在的条件下，葡萄糖可以被葡萄糖氧化酶催化氧化，具体反应如下：
Figure BDA0000429926840000041
铂(Ⅱ)MESO-四(五氟苯)卟吩（PtTFPP）是一种对氧气敏感的过渡金属配合物，在受到外界化学能或光能的激发后，电子会从基态S0跃迁到高能激发态，再经无辐射弛豫作用回到能级寿命较长的三线态MLCT激发态，之后电子从该激发态返回到基态并产生发光现象。MLCT激发态对氧高度敏感，在氧气存在的作用下发生无辐射跃迁返回基态，能量传递给氧气，使氧气由三线态变为单线态。PtTFPP荧光的氧气猝灭原理如图7所示。
实施例2
将PtTFPP，C6，PS和DTS按照2:2:46:50的质量比溶解于四氢呋喃中，并且使它们在溶液中的总浓度为0.2％。然后，使用微量调节注射器取500μL溶液，在超声震荡条件下迅速注入到pH值为9（用氨水调整pH值）的PLL浓度为0.02mg/ml的去离子水中，由此产生的悬浮液经超声震荡2小时后，随后在去离子水中透析24小时，即得到PLL包覆的核壳结构纳米颗粒，它对氧气敏感，荧光强度随氧气浓度的增加而减弱。这就是荧光纳米氧气传感器。
在上述制备的荧光纳米氧气传感器，即包覆PLL的纳米颗粒中，首先加入PLL物质的量的相同的戊二醛，在25°C的条件下震荡5分钟，使之混合均匀；然后加入葡萄糖氧化酶（GOx）的水溶液，加入的葡萄糖氧化酶的质量是溶液中纳米颗粒质量的20倍，在25°C的条件下震荡2小时，实现葡萄糖氧化酶与纳米颗粒的偶联，即得到荧光纳米葡萄糖传感器。
在葡萄糖传感器溶液中加入1m mol/L的葡萄糖，再加入矿物油进行密封。然后利用荧光光谱仪，用波长为405nm的光激发，检测加入葡萄糖后，探针PtTFPP荧光强度随时间的变化，发现随着时间的推迟，荧光强度先增强后基本保持不变，在加入10分钟后荧光强度的变化率达到最大。
在葡萄糖传感器中加入不同浓度（0-10mmol/L）的葡萄糖溶液，用波长为405nm的光激发，测得在加入葡萄糖10min后荧光光谱，由此计算在不同葡萄糖浓度下的红绿荧光荧光强度的比值R，即可得到荧光纳米传感器对葡萄糖的响应曲线。分析结果发现，红绿荧光荧光强度的比值与葡萄糖浓度的关系呈反曲线关系。当葡萄糖在低浓度范围时（<0.5mmol/L），比值随葡萄糖浓度的增加变化不大；当葡萄糖浓度在0.5-3mmol/L范围内时，比值随葡萄糖浓度的增加迅速增大；当葡萄糖浓度在高浓度范围时（>3mmol/L），比值基本稳定。
荧光纳米葡萄糖传感器的使用方法
在待测溶液中按照固定的体积比加入纳米葡萄糖传感器溶液，再加入矿物油密封。反应10分钟后测量在405nm波长激发下的荧光发射光谱，计算其红、绿荧光荧光强度的比值。根据标定曲线，即可得到该溶液中的葡萄糖浓度。
实施例3
1)将质量比为1:2:47:50的铂(Ⅱ)MESO-四(五氟苯)卟吩、香豆素6、聚苯乙烯和十二烷基三甲氧基硅烷溶解于四氢呋喃中，溶液中的总浓度为0.1％；
2)配制浓度为0.02mg/ml的多聚赖氨酸的去离子水溶液，并用氨水调整多聚赖氨酸的去离子水溶液pH值为8；
3)取300μL步骤1)所述四氢呋喃溶液，在超声震荡条件下注入到步骤2)所述多聚赖氨酸的去离子水溶液中，得到悬浮液，经超声震荡1小时后，随后在去离子水中透析12小时，即得到核壳结构的荧光氧气纳米粒子，所得粒子粒径为240nm左右；
4)在步骤3)所述核壳结构的荧光氧气纳米粒子中，首先加入与多聚赖氨酸等物质的量的戊二醛，在20°C的条件下震荡3分钟，然后加入浓度为1000ppm的葡萄糖氧化酶水溶液，加入的葡萄糖氧化酶的质量是荧光氧气纳米粒子质量的10倍，在20°C的条件下震荡1小时，实现葡萄糖氧化酶与纳米颗粒的偶联，表面偶联葡萄糖氧化酶功能基团后的粒径为270nm左右，即为荧光葡萄糖纳米生物传感器。本实施例的荧光葡萄糖纳米生物传感器对葡萄糖的检测下限为0.5m mol/L。
实施例4
1)将质量比为2:1:47:50的铂(Ⅱ)MESO-四(五氟苯)卟吩、香豆素6、聚苯乙烯和十二烷基三甲氧基硅烷溶解于四氢呋喃中，溶液中的总浓度为0.3％；
2)配制浓度为0.04mg/ml的多聚赖氨酸的去离子水溶液，并用氨水调整多聚赖氨酸的去离子水溶液pH值为9；
3)取500μL步骤1)所述四氢呋喃溶液，在超声震荡条件下注入到步骤2)所述多聚赖氨酸的去离子水溶液中，得到悬浮液，经超声震荡3小时后，随后在去离子水中透析48小时，即得到核壳结构的荧光氧气纳米粒子，所得粒子粒径为260nm左右；
4)在步骤3)所述核壳结构的荧光氧气纳米粒子中，首先加入与多聚赖氨酸等物质的量的戊二醛，在25°C的条件下震荡5分钟，然后加入浓度为2000ppm的葡萄糖氧化酶水溶液，加入的葡萄糖氧化酶的质量是荧光氧气纳米粒子质量的20倍，在25°C的条件下震荡2小时，实现葡萄糖氧化酶与纳米颗粒的偶联，表面偶联葡萄糖氧化酶功能基团后的粒径为285nm左右，即为荧光葡萄糖纳米生物传感器。
实施例5
1)将质量比为1:3:46:50的铂(Ⅱ)MESO-四(五氟苯)卟吩、香豆素6、聚苯乙烯和十二烷基三甲氧基硅烷溶解于四氢呋喃中，溶液中的总浓度为0.2％；
2)配制浓度为0.03mg/ml的多聚赖氨酸的去离子水溶液，并用氨水调整多聚赖氨酸的去离子水溶液pH值为8；
3)取400μL步骤1)所述四氢呋喃溶液，在超声震荡条件下注入到步骤2)所述多聚赖氨酸的去离子水溶液中，得到悬浮液，经超声震荡2小时后，随后在去离子水中透析24小时，即得到核壳结构的荧光氧气纳米粒子，所得粒子粒径为250nm左右；
4)在步骤3)所述核壳结构的荧光氧气纳米粒子中，首先加入与多聚赖氨酸等物质的量的戊二醛，在23°C的条件下震荡4分钟，然后加入浓度为1500ppm的葡萄糖氧化酶水溶液，加入的葡萄糖氧化酶的质量是荧光氧气纳米粒子质量的15倍，在23°C的条件下震荡1.5小时，实现葡萄糖氧化酶与纳米颗粒的偶联，表面偶联葡萄糖氧化酶功能基团后的粒径为280nm左右，即为荧光葡萄糖纳米生物传感器。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

Claims (5)

1.一种荧光葡萄糖纳米生物传感器，其特征在于，所述荧光葡萄糖纳米生物传感器包括核壳结构的荧光氧气纳米粒子和偶联于荧光氧气纳米粒子表面的葡萄糖氧化酶功能基团；所述荧光氧气纳米粒子的核层是由十二烷基三甲氧基硅烷与聚苯乙烯杂化并掺杂荧光氧气探针分子铂(Ⅱ)MESO-四(五氟苯)卟吩和荧光参比分子香豆素6形成，所述荧光氧气纳米粒子的壳层为多聚赖氨酸，包覆于核层外面。
2.根据权利要求1所述的荧光葡萄糖纳米生物传感器，其特征在于：所述核壳结构的荧光氧气纳米粒子粒径为240-260nm。
3.根据权利要求1所述的荧光葡萄糖纳米生物传感器，其特征在于：所述荧光氧气纳米粒子表面偶联葡萄糖氧化酶功能基团后的粒径为270-290nm。
4.如权利要求1-3所述的荧光葡萄糖纳米生物传感器的制备方法，其特征在于，包括以下制备步骤：
1)将质量比为1-3:1-3:44-48:50的铂(Ⅱ)MESO-四(五氟苯)卟吩、香豆素6、聚苯乙烯和十二烷基三甲氧基硅烷溶解于四氢呋喃中，溶液中的总浓度为0.1-0.3％；
2)配制浓度为0.02-0.04mg/ml的多聚赖氨酸的去离子水溶液，并用氨水调整多聚赖氨酸的去离子水溶液pH值为8-9；
3)取300-500μL步骤1)所述四氢呋喃溶液，在超声震荡条件下注入到步骤2)所述多聚赖氨酸的去离子水溶液中，得到悬浮液，经超声震荡1-3小时后，随后在去离子水中透析12-48小时，即得到核壳结构的荧光氧气纳米粒子；
4)在步骤3)所述核壳结构的荧光氧气纳米粒子中，首先加入与多聚赖氨酸等物质的量的戊二醛，在20-25°C的条件下震荡3-5分钟，然后加入浓度为1000-2000ppm的葡萄糖氧化酶水溶液，加入的葡萄糖氧化酶的质量是荧光氧气纳米粒子质量的10-20倍，在20-25°C的条件下震荡1-2小时，实现葡萄糖氧化酶与纳米颗粒的偶联，即得到荧光葡萄糖纳米生物传感器。
5.如权利要求1-3所述的荧光葡萄糖纳米生物传感器的应用，其特征在于，在待测溶液中加入荧光葡萄糖纳米生物传感器溶液，再加入矿物油密封，反应10分钟后测量在405nm波长激发下的荧光发射光谱，计算其红、绿荧光荧光强度的比值，根据标定曲线，即可得到该溶液中的葡萄糖浓度。
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