CN111912822B - 基于酶-无定形金属有机骨架复合物的活细胞胞内葡萄糖浓度的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于新型酶‑无定形金属有机骨架复合物的活细胞胞内葡萄糖浓度的检测方法。本发明方法利用新型酶‑定形金属有机骨架复合物以及荧光探针进行活细胞检测，不仅能有效检测活细胞胞内葡萄糖浓度，并且能保持检测后细胞的状态良好。通过本方法可以同时在单细胞和细胞群体两个尺度上有效检测活细胞内的葡萄糖浓度，能够有效区分癌细胞和非癌细胞，在研究细胞的葡萄糖代谢，以及癌症的诊断治疗上具有重要意义。与现有胞内葡萄糖检测方法相比，本发明方法具有操作方便，设备简单，重复性良好，对细胞的损伤较小等多种优势。
Description
技术领域
本发明涉及一种活细胞胞内葡萄糖浓度的检测方法，具体涉及一种基于新型酶-无定形金属有机骨架复合物的活细胞胞内葡萄糖浓度的检测方法。
背景技术
细胞作为生物形态和机构的基本单元，检测胞内葡萄糖浓度对了解细胞的生长、代谢，乃至于疾病的诊断与治疗，都具有重要的意义。不同的组织细胞具有差异性，不同种类细胞的胞内葡萄糖浓度不尽相同，甚至同种细胞间也会有一定差异。理论和实验证据均表明恶性肿瘤细胞的胞内葡萄糖浓度则会显著增加。传统检测细胞内葡萄糖浓度的手段大多需要将细胞破碎后，采用相应的仪器如高效液相色谱等进行检测。因此传统检测手段不仅不能实现活细胞检测，检测结果也基于大量细胞的统计平均，在疾病比如癌症的检测中，往往会遮盖住癌症早期少量癌细胞产生的异常信号，造成漏诊，误诊。因此传统检测手段具有低灵敏度，区分度，且对细胞具有巨大的破坏性。而可以检测单细胞胞内葡萄糖浓度的活细胞检测则为解决上述难题提供了有效的手段。
美国专利(US8173863B2)公开了一种基于荧光共振能量转移的胞内葡萄糖浓度检测方法。该方法公开了一种可以由细胞表达的葡萄糖荧光指示物，比如 FLIPglu600μΔ11，包括葡萄糖结合蛋白，与之共价结合的供体荧光蛋白以及受体荧光蛋白。当葡萄糖与葡萄糖结合蛋白接触后，将使供体荧光蛋白与受体荧光蛋白间的荧光共振能量转移强度发生变化，从而可以作为葡萄糖浓度的指示物。
除上述提到的专利以外，也有文献提出利用葡萄糖氧化酶催化葡萄糖氧化形成葡萄糖酸引起溶液pH变化，从而引起胞质内电导率的变化，通过扫描离子电导显微镜检测胞质内阻抗的变化即可以测量胞内葡萄糖的浓度。以此为原理，Pourmand等人将葡萄糖氧化酶固定在纳米检测探头上，设计了检测单细胞内葡萄糖的“葡萄糖纳米传感器”(NaderPourmand et al.,Nano Lett.,2016,16,1194-1200)。
然而，专利文件US20090083196所公开的方法中，需要将相应蛋白的基因通过基因工程手段导入细胞，因而需要进行较为复杂的操作，此外，该方法受到类型的影响较大，有部分细胞无法表达葡萄糖指示物，这也限制了该方法的进一步应用。Pourmand 等人所提出的纳米探针检测方法需要制备较为复杂的纳米探针，检测中所必须的扫描离子电导显微镜也造成该实验复杂程度上升。此外该方法检测过程中对细胞的穿刺也会对细胞造成一定的损伤。因而提出一种简单可靠，对细胞的破坏性较小，并且能同时在细胞群体和单细胞尺度上检测细胞内葡萄糖浓度的方法颇具挑战和意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种活细胞内葡萄糖浓度的检测方法，本发明方法基于一种新型酶-无定形金属有机骨架复合物，可以同时从细胞群体以及单细胞尺度检测活细胞胞内葡萄糖浓度。
本发明所提供的细胞胞内葡萄糖浓度的检测方法，包括如下步骤：
(1)向至少四种(优选四种至六种)离体的细胞中分别加入下述1)或2)，然后在活细胞成像系统上测定激发波长和发射波长分别为488nm和525nm处的荧光强度随时间的变化，所述荧光强度的最大值的差值F1即为测定的细胞的荧光强度；
1)体积相同的2’,7’-二氯二氢荧光素-乙酰乙酸酯的溶液和酶-无定形金属有机骨架复合物的浊液；
2)体积相同的磷酸缓冲液或磷酸盐缓冲液和酶-无定形金属有机骨架复合物的浊液；
所述荧光强度的最大值的差值F1指的是加入1)后的体系与加入2)后的体系所测定的荧光强度的最大值的差值；
所述2’,7’-二氯二氢荧光素-乙酰乙酸酯的溶液和所述酶-无定形金属有机骨架复合物的浊液均由所述磷酸缓冲液或磷酸盐缓冲液配制；
(2)将至少四种(优选四种至六种)离体的所述细胞分别经胰蛋白酶消化后进行计数，然后进行细胞破碎，取上清液并设置浓度梯度；取葡萄糖标准溶液，并设置浓度梯度；分别向所述上清液和所述葡萄糖标准溶液中依次加入含有葡萄糖氧化酶的溶液、含有辣根过氧化物酶和含有ABTS (2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid))的溶液，反应结束后测定 415nm处的吸光度变化，得到含有每种细胞的所述上清液和所述葡萄糖标准溶液的吸光度-样品体积曲线，经线性拟合得两条直线，由所述直线的斜率即得到所述细胞内的葡萄糖浓度，由至少四种所述细胞的荧光强度和所述细胞内的葡萄糖浓度关系，得到荧光强度和细胞内葡萄糖浓度之间的标准曲线；
(3)按照步骤(1)的方法测定待测细胞群或单细胞的荧光强度，根据步骤(2) 得到的所述标准曲线，即得到所述细胞群或所述单细胞内的葡萄糖浓度；
所述含有葡萄糖氧化酶的溶液、所述含有辣根过氧化物酶的溶液、所述含有ABTS溶液均由所述磷酸缓冲液或所述磷酸盐缓冲液配制；
所述酶-无定形金属有机骨架复合物由包括如下步骤的方法制备：
将葡萄糖氧化酶、锌离子和2-甲基-1H-咪唑在溶剂中进行反应即得。
上述的检测方法中，所述酶-无定形金属有机骨架复合物呈平均粒径为100～200nm 的颗粒状；
于pH为中性(优选6.9～7.0)的条件下，所述酶-无定形金属有机骨架复合物的表面电荷为18～25mV；
所述酶-无定形金属有机骨架复合物可在pH＝7.4的磷酸缓冲液中可均匀分散并维持一段时间不发生团聚；
所述酶-无定形金属有机骨架复合物具有明显的介孔，介孔孔径为2～50nm，优选2～10nm；且具有较低的细胞毒性。
上述的检测方法中，制备所述酶-无定形金属有机骨架复合物的方法具体如下：
将可溶性锌盐的溶液加入至所述2-甲基-1H-咪唑的溶液中，产生沉淀后(5～30秒内)加入所述葡萄糖氧化酶的溶液，经搅拌后离心分离即可；
所述可溶性锌盐的溶液中所述锌离子的浓度为15～25mM，所述2-甲基-1H-咪唑的溶液的浓度为70～90mM，所述葡萄糖氧化酶的溶液的质量-体积浓度为0.5～1mg/mL；
所述锌离子来自于所述可溶性锌盐；
所述可溶性锌盐的溶液、所述2-甲基-1H-咪唑的溶液与所述葡萄糖氧化酶的溶液均由所述溶剂配制；
所述溶剂可为水。
上述的检测方法中，所述磷酸缓冲液或所述磷酸盐缓冲液的pH为7.2～7.5，浓度为5～20mM；
所述活细胞成像系统可为激光共聚焦成像系统或高内涵活细胞成像系统等；
所述细胞包括(如MCF-7)，肝癌细胞(如HepG2)，人胃癌细胞(MGC803)，小鼠乳腺癌细胞(如4T1)，间充质干细胞(MSC)等，但不限于此。
上述的检测方法中，步骤(1)，所述2’,7’-二氯二氢荧光素-乙酰乙酸酯的浓度为1～10μM。
上述的检测方法中，步骤(1)中，所述酶-无定形金属有机骨架复合物的浊液的质量-体积浓度为10～20μg/mL，即经所述磷酸缓冲液或所述磷酸盐缓冲液稀释后的浓度。
上述的检测方法中，步骤(1)中，所述方法还包括对所述酶-无定形金属有机骨架复合物的浊液进行超声分散的步骤，采可用水浴超声或手持超声，超声时间为5～10s。
上述的检测方法中，步骤(2)中，采用磷酸盐缓冲液或磷酸缓冲液洗涤经所述胰蛋白酶消化后的细胞；采用所述磷酸盐缓冲液或所述磷酸缓冲液重悬后进行细胞计数。
上述的检测方法中，步骤(2)中，所述葡萄糖标准溶液的浓度为0～100μM，但不为零；
可配制至少五种浓度梯度，优选5～8种。
上述的检测方法中，步骤(2)中，所述含有葡萄糖氧化酶的溶液中葡萄糖浓度为0.1～1mg/mL，所述含有辣根过氧化物酶的溶液中辣根过氧化物酶浓度为 0.1～1mg/mL，所述含有ABTS的溶液中ABTS浓度为1～5mg/mL。
上述的检测方法中，步骤(2)中，两条直线斜率的比值即为所述上清液和葡萄糖标准液中葡萄糖浓度的比值，并由此计算出所述上清液中的葡萄糖浓度。
本发明具有以下优点：
本发明中酶-金属有机骨架复合物的细胞毒性小，且检测无需对细胞进行基因改造或者对细胞造成伤害，可以在保持细胞活力的同时，进行胞内葡萄糖浓度的检测。
本发明采用的酶-金属有机骨架复合物易于大量制备，检测操作简单，试剂、检测仪器易得，检测成本明显降低。
本发明可以从宏观角度研究细胞群体的胞内葡萄糖浓度水平，也可以从单细胞的角度对单个细胞进行研究，在不同尺度上均能有效检测细胞内葡萄糖浓度。
本发明可以研究多种细胞的胞内葡萄糖浓度，对细胞具有一定的普适性，对于贴壁生长的细胞尤其适用。
本发明可以利用不同细胞胞内葡萄糖浓度的较大差异实现对不同细胞的区分，在癌症筛查、诊断以及治疗上具有非常重要的意义。
附图说明
图1为本发明实施例1制备的葡萄糖氧化酶-无定形金属有机骨架复合物的扫描电镜SEM图。
图2为本发明实施例2中MCF-7细胞实验组荧光强度随时间变化的曲线。
图3为本发明实施例2得到的人乳腺癌细胞MCF-7细胞群、人胃癌细胞群 MGC803、小鼠乳腺癌细胞群4T1、间充质干细胞群MSC的细胞群的荧光强度随时间的变化。
图4为本发明实施例3得到的荧光强度-葡萄糖浓度的标准曲线。
图5为本发明实施例4得到的单个胃癌细胞荧光强度随时间的变化。
图6为本发明实施例5得到的胃癌细胞与肝细胞的荧光强度分别随时间变化的图像
图7为本发明实施例1制备的葡萄糖氧化酶-无定形金属有机骨架复合物的X射线衍射图。
图8为本发明实施例1制备的葡萄糖氧化酶-无定形金属有机骨架复合物金的傅里叶红外谱图。
图9是本发明实施例1所制备的复合物和ZIF-8晶体的氮气吸附曲线图。
图10是本发明实施例1所制备的复合物和ZIF-8晶体的孔径分布图。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、酶-无定形金属有机骨架复合物的制备
将1mL、浓度为20mM的醋酸锌溶液加入到1mL、浓度为80mM的2-甲基-1H咪唑溶液(溶剂为水)中，持续搅拌，产生沉淀大约30s左右加入80μL、0.5mg/mL的 GOx(葡萄糖氧化酶)水溶液，继续搅拌30分钟，离心后，用去离子水洗涤3次，冻干得到葡萄糖氧化酶-无定形金属有机骨架复合物干粉，所得质量约为1.5～2mg。
本实施例制备的葡萄糖氧化酶-无定形金属有机骨架复合物的扫描电镜SEM图如图1所示，由图1可知，所得复合物的主体形状为球形，颗粒粒径在100～200nm之间。
本实施例制备的葡萄糖氧化酶-无定形金属有机骨架复合物的X射线衍射图如图7所示，由图7可知，复合物没有晶体的衍射峰，是无定形材料。
本实施例制备的葡萄糖氧化酶-无定形金属有机骨架复合物金的傅里叶红外分析如图8所示，由图8可知，复合物指纹区红外峰与金属有机骨架化合物(ZIF-8)一致，在1659cm-1处有蛋白质的酰胺峰。
本实施例制备的复合物的氮气吸附曲线如图9所示，由图9可知，该复合物的吸附氮气体积显著低于金属有机骨架化合物(ZIF-8)。
本实施例制备的复合物的孔径分布分析如图10所示，由图10可知，该复合物呈现微孔和介孔复合结构，其中微孔低于2nm，含量较低，介孔比例较高，介孔处于2～10nm 之间，而金属有机骨架化合物(ZIF-8)仅含微孔结构。
实施例2、用制备的酶-无定形金属有机骨架复合物测量人乳腺癌细胞MCF-7细胞群、人胃癌细胞群MGC803、小鼠乳腺癌细胞群4T1、间充质干细胞群MSC的胞内葡萄糖浓度
向制得的葡萄糖氧化酶-无定形金属有机骨架复合物中加入pH7.4，浓度为10mM的磷酸缓冲液并重悬至浓度为1.5～2mg/mL的浊液。为了使葡萄糖氧化酶-无定形金属有机骨架复合物充分分散，使用水浴超声10s左右。将1μL、10mM的2’,7’-二氯二氢荧光素-乙酰乙酸酯-DMSO溶液加入到1mL、pH7.4、浓度为10mM的磷酸盐缓冲液中。
取5μL重悬后的葡萄糖氧化酶-无定形金属有机骨架复合物浊液，加入45μL的pH7.4，浓度为10mM的磷酸缓冲液，再加入50μL的2’,7’-二氯二氢荧光素-乙酰乙酸酯稀释液，混合均匀后加入分别种有人乳腺癌细胞MCF-7细胞群、人胃癌细胞群 MGC803、小鼠乳腺癌细胞群4T1间充质干细胞群MSC的96孔孔板中，实验中设置 2个平行的实验组。
另取5μL重悬后的葡萄糖氧化酶-无定形金属有机骨架复合物浊液，加入45μL的pH7.4、浓度为10mM的磷酸缓冲液，再加入50μL、pH7.4、浓度为6.7mM的磷酸盐缓冲液，混合均匀后加入种有MCF-7的96孔孔板中作为空白对照。实验中设置了2 个平行的对照组。
将该96孔孔板置于PerkinElmer Operetta CLS高内涵成像分析系统下，放大倍数选用63倍，激发、发射波长选用488nm、525nm，激光功率、曝光时间设置均为10％，拍摄间隔为4min左右，拍摄总时间选为2小时进行激光共聚焦成像。拍摄完成后，计算各个细胞荧光强度随时间的变化。
如图2所示为所拍摄的MCF-7细胞实验组荧光强度随时间的变化曲线。该图可以看出，在葡萄糖氧化酶的作用下，细胞内DCF的荧光强度先增强，并迅速达到最高点。该最大值反映了细胞内的葡萄糖浓度。
如图3所示为通过统计计算得到的人乳腺癌细胞MCF-7细胞群、人胃癌细胞群MGC803、小鼠乳腺癌细胞群4T1、间充质干细胞群MSC的细胞群的荧光强度(实验组的荧光强度与对照组的荧光强度的差值)随时间的变化，可以看出，不同细胞的变化趋势具有明显差异，且最高点的荧光强度也有所不同，这反映了不同细胞胞内葡萄糖浓度的差异。此外，癌细胞的胞内葡萄糖浓度也显著高于正常细胞的胞内葡萄糖浓度。
实施例3、绘制荧光强度-葡萄糖浓度标准曲线
分别取人乳腺癌细胞株MCF-7、小鼠乳腺癌细胞株4T1、胃癌细胞MGC803和人正常肝细胞L-02。
以人乳腺癌细胞MCF-7为例，向培养有人乳腺癌细胞群的培养皿中加入胰蛋白酶消化3分钟后，加入培养液中和反应。取细胞悬液离心(1000rpm)，并用磷酸盐缓冲液洗涤，重复3次。随后加入500μL磷酸盐缓冲液，将细胞重悬后，采用Millipore Sceptor 手持细胞计数仪计数。计数完成后，利用手持超声细胞破碎仪，在冰水浴中，将细胞超声破碎5分钟。将细胞破碎液离心后，取上清液。向96孔孔板中分别加入20、40、 60、80、100μL的上清液，并补充磷酸盐缓冲液至总体积为100μL。再向96孔孔板中分别加入20、40、60、80、100μL的10μM的葡萄糖溶液，并补充磷酸盐缓冲液至总体积为100μL。
向各个孔内加入含有葡萄糖氧化酶(1mg/mL)、辣根过氧化物酶(1mg/mL)以及ABTS(2mg/mL)的磷酸盐缓冲液100μL，反应5分钟后，在酶标仪下测量415nm处的吸光度。分别绘制细胞上清液以及葡萄糖标准液的吸光度-样品体积曲线，并进行线性拟合。两直线斜率的比值即为上清液和葡萄糖标准液中葡萄糖浓度的比值，并由此计算出上清液中的葡萄糖浓度。在光学显微镜下观察到悬浮MCF-7细胞直径约为 15μm，由此可以计算出MCF-7细胞内的葡萄糖浓度。
按照上述步骤得到小鼠乳腺癌细胞株4T1、胃癌细胞MGC803和人正常肝细胞 L-02细胞内的葡萄糖浓度。
按照实施例2的方法得到小鼠乳腺癌细胞株4T1、胃癌细胞MGC803和人正常肝细胞L-02细胞的荧光强度。
至此即能得到人乳腺癌细胞株MCF-7、小鼠乳腺癌细胞株4T1、胃癌细胞 MGC803、人正常肝细胞L-02细胞的荧光强度和胞内葡萄糖浓度之间的标准曲线，所构成的标准曲线可以作为通过荧光强度判断细胞内葡萄糖浓度的依据，如图4所示。
实施例4、测量单个胃癌细胞MGC803的胞内葡萄糖浓度
向制得的葡萄糖氧化酶-无定形金属有机骨架复合物中加入pH7.4、浓度为10mM的磷酸缓冲液并重悬至浓度为1.5～2mg/mL的浊液。为了使葡萄糖氧化酶-无定形ZIF8 复合物充分分散，使用水浴超声10s左右。将1μL、10mM的2’,7’-二氯二氢荧光素- 乙酰乙酸酯-DMSO溶液加入到1mL、pH7.4、浓度为10mM的磷酸盐缓冲液中。
取5μL重悬后的葡萄糖氧化酶-无定形金属有机骨架复合物浊液，加入45μL的pH7.4，浓度为10mM的磷酸缓冲液，再加入50μL的2’,7’-二氯二氢荧光素-乙酰乙酸酯稀释液，混合均匀后加入种有胃癌细胞的96孔孔板中，实验中设置2个平行的实验组。
另取5μL重悬后的葡萄糖氧化酶-无定形金属有机骨架复合物浊液，加入45μL的pH7.4、浓度为10mM的磷酸缓冲液，再加入50μL、pH7.4、浓度为0.0067M的磷酸盐缓冲液，混合均匀后加入种有胃癌细胞的96孔孔板中作为空白对照。实验中设置了 2个平行的对照组。
将该96孔孔板置于PerkinElmer Operetta CLS高内涵成像分析系统下，放大倍数选用63倍，激发、发射波长选用488nm、525nm，激光功率、曝光时间设置均为10％，拍摄间隔为4min左右，拍摄总时间选为2小时进行激光共聚焦成像。拍摄完成后，计算各个细胞荧光强度随时间的变化。
如图5所示为统计计算得到的单个胃癌细胞荧光强度(实验组的荧光强度与对照组的荧光强度的差值)随时间的变化，利用实施例3所得到的标准曲线，实现了单个细胞分辨率下的活细胞胞内葡萄糖浓度检测。
实施例5：鉴别胃癌细胞MGC803和肝细胞
向制得的葡萄糖氧化酶-无定形金属有机骨架复合物中加入pH7.4、浓度为10mM的磷酸缓冲液并重悬至浓度为1.5～2mg/mL的浊液。为了使葡萄糖氧化酶-无定形ZIF8 复合物充分分散，使用水浴超声10s左右。将1μL、10mM的2’,7’-二氯二氢荧光素- 乙酰乙酸酯-DMSO溶液加入到1mL、pH7.4，浓度为10mM的磷酸盐缓冲液中。
取5μL重悬后的葡萄糖氧化酶-无定形ZIF8浊液，加入45μL的pH7.4、浓度为 10mM的磷酸缓冲液，再加入50μL的2’,7’-二氯二氢荧光素-乙酰乙酸酯稀释液，混合均匀后加入同时种有胃癌细胞和干细胞的96孔孔板中，实验中设置2个平行的实验组。
另取5μL重悬后的葡萄糖氧化酶-无定形ZIF8浊液，加入45μL的pH7.4，浓度为10mM的磷酸缓冲液，再加入50μL、pH7.4、浓度为0.0067M的磷酸盐缓冲液，混合均匀后加入同时种有胃癌细胞和肝细胞的96孔孔板中作为空白对照。实验中设置了2 个平行的对照组。
将该96孔孔板置于PerkinElmer Operetta CLS高内涵成像分析系统下，放大倍数选用63倍，激发、发射波长选用488nm、525nm，激光功率、曝光时间设置均为10％，拍摄间隔为4min左右，拍摄总时间选为2小时进行激光共聚焦成像。拍摄完成后，计算各个细胞荧光强度随时间的变化。
如图6所示为统计计算得到的胃癌细胞与肝细胞的荧光强度(实验组的荧光强度与对照组的荧光强度的差值)随时间的变化，看以看出胃癌细胞的荧光强度最大值要显著高于肝细胞，由此可以通过检测胞内葡萄糖浓度，来区分癌细胞和正常细胞。
Claims (4)
1.一种非治疗和/或诊断目的的细胞胞内葡萄糖浓度的检测方法，包括如下步骤：
（1）向至少四种离体的细胞中分别加入下述1）或2），然后在活细胞成像系统上测定激发波长和发射波长分别为488nm和525nm处的荧光强度随时间的变化，所述荧光强度的最大值的差值F1即为测定的细胞的荧光强度；
1）体积相同的2’,7’-二氯二氢荧光素-乙酰乙酸酯的溶液和酶-无定形金属有机骨架复合物的浊液；
所述2’,7’-二氯二氢荧光素-乙酰乙酸酯的浓度为1~10μM；
2）体积相同的磷酸缓冲液或磷酸盐缓冲液和酶-无定形金属有机骨架复合物的浊液；
所述酶-无定形金属有机骨架复合物的浊液中所述酶-无定形金属有机骨架复合物的质量-体积浓度为10~20μg/mL；
所述荧光强度的最大值的差值F1指的是加入1）后的体系与加入2）后的体系所测定的荧光强度的最大值的差值；
所述2’,7’-二氯二氢荧光素-乙酰乙酸酯的溶液和所述酶-无定形金属有机骨架复合物的浊液均由所述磷酸缓冲液或所述磷酸盐缓冲液配制；
所述酶-无定形金属有机骨架复合物呈平均粒径为100~200nm的颗粒状；
于pH为中性的条件下，所述酶-无定形金属有机骨架复合物的表面电荷为18~25mV；
所述酶-无定形金属有机骨架复合物由包括如下步骤的方法制备：
将葡萄糖氧化酶、锌离子和2-甲基-1H-咪唑在溶剂中进行反应即得；
制备所述酶-无定形金属有机骨架复合物的方法具体如下：
将可溶性锌盐的溶液加入至所述2-甲基-1H-咪唑的溶液中，产生沉淀后加入所述葡萄糖氧化酶的溶液，经搅拌后离心分离即可；
所述可溶性锌盐的溶液中所述锌离子的浓度为15~25mM，所述2-甲基-1H-咪唑的溶液中所述2-甲基-1H-咪唑的浓度为70~90mM，所述葡萄糖氧化酶的溶液中所述葡萄糖氧化酶的质量体积浓度为0.5~1mg/mL；
所述锌离子来自于所述可溶性锌盐；
所述可溶性锌盐的溶液、所述2-甲基-1H-咪唑的溶液与所述葡萄糖氧化酶的溶液均由所述溶剂配制；
所述活细胞成像系统为激光共聚焦高内涵活细胞成像系统；
（2）将至少四种离体的所述细胞分别经胰蛋白酶消化后进行计数，然后进行细胞破碎，取上清液并设置浓度梯度；取葡萄糖标准溶液，并设置浓度梯度；分别向所述上清液和所述葡萄糖标准溶液中加入含有葡萄糖氧化酶、辣根过氧化物酶和ABTS的溶液，反应结束后测定415nm处的吸光度变化，得到含有每种细胞的所述上清液和所述葡萄糖标准溶液的吸光度-样品体积曲线，经线性拟合得两条直线，由所述直线的斜率即得到所述细胞内的葡萄糖浓度，由至少四种所述细胞的荧光强度和所述细胞内的葡萄糖浓度关系，得到荧光强度和细胞内葡萄糖浓度之间的标准曲线；
所述葡萄糖标准溶液的浓度为0~100μM，但不为零；
（3）按照步骤（1）的方法测定待测细胞群或单细胞的荧光强度，根据步骤（2）得到的所述标准曲线，即得到所述细胞群或所述单细胞内的葡萄糖浓度。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述磷酸缓冲液或所述磷酸盐缓冲液的pH为7.2~7.5，浓度为5~20mM。
3.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于：步骤（1）中，为了使所述酶-无定形金属有机骨架复合物充分分散，所述方法还包括对所述酶-无定形金属有机骨架复合物的浊液进行超声分散的步骤。
4.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于：步骤（2）中，采用所述磷酸盐缓冲液或所述磷酸缓冲液洗涤经所述胰蛋白酶消化后的细胞；
采用所述磷酸盐缓冲液或所述磷酸缓冲液重悬后进行细胞计数。
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2019
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