CN112755925A - 一种神经组织来源外泌体的提取方法 - Google Patents

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Abstract

本发明构建了一种Ag‑Fe3O4免疫磁性微球，Ag‑Fe3O4磁性微球表面修饰有多聚右旋赖氨酸，通过酰胺键连接S100β和/或MBP抗体。本发明所述Ag‑Fe3O4免疫磁性微球能够特异性捕获外周神经组织来源的外泌体。利用该微球提取神经组织来源外泌体，单位体积神经组织中提取外泌体的得率高，神经特异性强，未来可为临床治疗外周神经损伤提供新方法。

Description

一种神经组织来源外泌体的提取方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种Ag-Fe3O4免疫磁性微球，以及使用该微球提取神经组织来源外泌体(exosome)的方法。
背景技术
外泌体(Exosome)是细胞核内体膜通过出芽方式，主动分泌出细胞直径为 30-150nm的膜性纳米囊泡，表面为磷脂双分子结构。通常由于来源于不同类型细胞的分泌释放，外泌体可以携带各种蛋白，mRNA以及miRNA等细胞特异性成份。通过传递信号分子参与调节多种信号通路，且可通过胞吞胞饮等作用直接与细胞融合。近年的研究发现，在正常生理环境，外泌体中的内含物会因为不同的组织细胞来源，呈现组织细胞特异性；在机体病理状态，外泌体的内含物会随细胞外环境的变化而发生改变。因此，外泌体的检测和应用在临床工作中得到越来越多的重视。例如，在临床分子诊断中，外泌体可作为生物标志分子。另外，通过基因修饰等分子生物学研究手段，外泌体还可作为药物载体，实现体内药物输送的靶向治疗。外泌体具有对靶细胞或组织的特异趋向性，容易通过生物屏障，同时又具有良好的生物相容性与低免疫原性等优势，因此，在临床药物输送和靶向治疗中具有广阔的应用前景。
施万细胞在外周神经再生中起到重要作用，是神经组织工程中最重要也是最常使用的种子细胞之一。S100β蛋白由神经外胚层细胞表达分泌，是一种可溶性的酸性钙结合蛋白，属肌钙蛋白C家族，是S100家族中在神经系统内最具活性的成员，主要定位于中枢神经系统的星形胶质细胞和少突神经胶质细胞以及周围神经系统的施万细胞。S100β作为神经系统的特异性蛋白，参与构成与维持由磷脂构成的细胞膜表面，影响微管、微丝的解聚，参与调节蛋白激酶C和钙调蛋白的磷酸化以及RNA的合成，具有营养神经作用，能促进神经的生长和损伤的修复。
髓鞘是神经胶质细胞包裹神经轴突形成的髓磷脂膜，主要生理功能是确保钠离子的顺利通过，神经元电信号在郞飞氏结处实现跳跃式传导，增加轴突信号传导速率和能量效率，以及防止郎飞氏结之间神经冲动扩散的绝缘作用。髓鞘碱性蛋白(Myelin BasicProtein，MBP)占髓鞘蛋白质总量的30％，位于髓鞘浆膜面，是髓鞘特有的一种碱性膜蛋白，含有多种碱性氨基酸。主要由中枢神经系统的少突胶质细胞和外周神经系统的施万细胞合成与分泌，对神经细胞分化，髓鞘形成，以及维持神经系统稳定性具有至关重要的作用。
目前，获得外泌体的主要研究手段是从培养特定细胞的培养液中提取该种细胞分泌的外泌体和从体液收集外泌体。然而体外培养的环境与机体体内的环境并不相同，这些细胞分泌的外泌体并不能准确模拟机体体内的环境来源的外泌体。而从体液收集得到的外泌体，通常混杂有多种组织器官外泌体的集合。这些来源于不同组织细胞的外泌体具有的组织细胞特异性。保证外泌体的组织细胞特异性，对于进一步研究该特定组织器官疾病的发生发展具有重要意义。
现有常用外泌体分离提取方法主要有超高速离心，密度梯度离心法，膜过滤，以及色谱排阻等方法，但大多存在回收率低，费时费力费用昂贵，外泌体容易破裂，产生大量蛋白质及脂质污染等问题。
发明内容
本发明构建了一种连接有S100β和/或MBP抗体的修饰有多聚右旋赖氨酸的 Ag-Fe3O4磁性微球，能够特异性捕获外周神经组织来源的外泌体。利用该微球提取神经组织来源外泌体，单位体积神经组织中提取外泌体的得率高，神经特异性强，未来可为临床治疗外周神经损伤提供新方法。
本发明具体技术方案如下：
一种Ag-Fe3O4免疫磁性微球，其特征在于Ag-Fe3O4磁性微球表面修饰有多聚右旋赖氨酸，通过酰胺键连接S100β和/或MBP抗体。
本发明所述免疫Ag-Fe3O4磁性微球可采用如下方法制备而成：
(1)将Fe2+和Fe3+金属盐溶解在三乙醇胺水溶液中，加热(优选75℃)，惰性气体保护下，加入Ag+(例如硝酸银)水溶液，在磁场强度作用下，搅拌、分散，洗涤Ag-Fe3O4微球至中性(优选剧烈搅拌至溶液由黄色逐渐成为浅灰色，停止搅拌后超声分散，纯水洗涤Ag-Fe3O4微球至中性)；
(2)将步骤(1)得到的Ag-Fe3O4微球加入聚醚酰亚胺(PEI,Mw1/4分子量25kDa) 和碱性氨基酸多聚右旋赖氨酸Poly-D-Lysine，反应得到多聚右旋赖氨酸修饰的 Ag-Fe3O4微球；
(3)将步骤(2)得到的微球与S100β抗体和/或MBP抗体混合，加入交联剂EDC和/或NHS促进多聚赖氨酸与抗体之间通过酰胺键偶联，制备得到Ag-Fe3O4免疫磁性微球；(优选EDC：NHS摩尔比为2:1)。
步骤(1)中Fe2+和Fe3+金属盐为可溶性盐，如FeCl3和FeCl2。优选的，步骤(1)中Ag+：Fe3+：Fe2+质量比为1.0:2.5:1.0。
优选的，步骤(1)中三乙醇胺的浓度为1mol/L。
本发明研究结果显示Ag+/Fe3+/Fe2+质量比控制为1.0:2.5:1.0，三乙醇胺的浓度为1mol/L，形成的Ag-Fe3O4磁性微球具有最佳吸附外泌体的特异性。
优选的，步骤(2)Ag-Fe3O4微球：多聚右旋赖氨酸的质量比为3:2-16，优选为3:8。
Ag-Fe3O4磁性微球表面通过碱性氨基酸多聚右旋赖氨酸Poly-D-Lysine进行修饰，结果表明Ag-Fe3O4微球：多聚右旋赖氨酸的质量比为3:8时，修饰制备的微球吸附外泌体效率最佳。
优选的，所述步骤(3)中步骤(2)得到的微球与S100β和MBP抗体质量比为10:1:1。
本发明另一目的在于提供本发明所述Ag-Fe3O4免疫磁性微球在神经组织来源外泌体提取中的应用。
本发明另一目的在于提供一种神经组织来源外泌体的提取方法，将外周神经组织使用含酶类的消化液消化后，使用本发明所述Ag-Fe3O4免疫磁性微球进行提取。
优选的，所述消化液含有DNA酶I、木瓜蛋白酶、透明质酸酶、胶原蛋白酶 I、胶原蛋白酶II、胶原蛋白酶IV。进一步优选的，所述消化液含有0.05mg/mL DNA酶I、0.2mg/ml木瓜蛋白酶、0.1mg/ml透明质酸酶、1mg/ml胶原蛋白酶I、 1mg/ml胶原蛋白酶II、1mg/ml胶原蛋白酶IV。
具体步骤包括：
将外周神经组织用显微剪剪成1-2mm3大小的碎块，加入适量消化液 (D-Hank’s液中各种酶类的最佳浓度：0.05mg/mL DNA酶I、0.2mg/ml木瓜蛋白酶、0.1mg/ml透明质酸酶、1mg/ml胶原蛋白酶I、1mg/ml胶原蛋白酶II、1mg/ml 胶原蛋白酶IV)，37℃孵育3小时。经大量的D-Hank’s液稀释，离心去除残余酶类。10mL0.01MPBS重悬，0.22μm滤器过滤后，加入500μg多聚右旋赖氨酸Poly-D-Lysine修饰的结合了S100β，MBP抗体的Ag-Fe3O4磁性微球，提取外周神经组织来源的外泌体。
本发明优点：
本发明用多聚右旋赖氨酸Poly-D-Lysine修饰的Ag-Fe3O4微球连接S100β， MBP抗体，提取外周神经组织中的外泌体，与传统的超速离心法提取的相比，具有在单位体积外周神经组织中获得外泌体得率高，以及神经特异性高的双重特点，适用于提取外周神经组织中的外泌体。
附图说明
图1为不同类型和质量比多聚赖氨酸修饰Ag-Fe3O4微球对外泌体的吸附率。图2为不同比例的多聚赖氨酸修饰Ag-Fe3O4微球与抗体吸附外泌体特异性蛋白 (图2A为外泌体特异性蛋白CD63和HSP70的Western检测代表图；图2B和2C 分别为外泌体特异性蛋白CD63和HSP70的Western柱形统计图)。
图3为扫描电镜观察Ag-Fe3O4免疫磁性微球与微球直径统计分析(图3A为扫描电镜观察磁性微球的代表图；图3B为微球直径统计图)。
图4为透射电镜观察外泌体与NTA粒径分布统计图(图4A为透射电镜观察外泌体的代表图；图4B为外泌体粒径分布统计图)。
图5为NTA检测Ag-Fe3O4免疫微球与传统的超速离心法提取外泌体的效果。
具体实施方式
以下通过实施例说明本发明的具体步骤，但不受实施例限制。
在本发明中使用的术语，除非另有说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
下面结合具体实施例并参照数据进一步详细描述本发明，应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
在以下实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。
实施例1：微乳法与银离子制备Ag-Fe3O4磁性微球。
分别称取3g FeCl3·6H2O和1.2g FeCl2·4H2O，分别溶解在250mL不同浓度的三乙醇胺C6H15O3N溶液(0.16、0.40、1.00、2.50mol/L)的烧杯中。室温超声充分溶解得到均质的橙黄色溶液。然后，在75℃水浴，高纯氮保护下，将硝酸银水溶液加入到上述Fe2+和Fe3+溶液中，将Ag+/Fe3+/Fe2+质量比控制为1.0:2.5:1.0。在磁场强度(E＝200mT)作用下，剧烈搅拌90min，溶液逐渐成为浅灰色。pH＝10-11 的条件下，磁性微球具有形貌规整性和粒径单分散性。停止搅拌后超声分散 30min，微球用ddH2O洗至pH显中性，60℃真空干燥，制备Ag-Fe3O4微球。
考察不同浓度碱盐C6H15O3N制备得到的Ag-Fe3O4微球对核酸和外泌体的吸附率(表1)。
分别应用市售的小牛胸腺DNA(CT-DNA)和健康人血清外泌体作为DNA和外泌体吸附率检测的标准品。将小牛胸腺DNA粉末(Solarbio公司，Cat.No. D8020)溶解于0.01MPBS，制成1mg/ml的小牛胸腺DNA溶液。室温轻柔搅拌 1h，使Ag-Fe3O4微球与溶液中的DNA充分混合。通过紫外分光光度计检测吸附前和吸附后溶液中OD260处的净吸收值来计算溶液中DNA的浓度，计算出不同浓度碱盐C6H15O3N形成微球的DNA吸附率。将健康人血清粉末化外泌体(润基生物Rengenbio公司，Cat.No.EXOLyoS-2)，溶解于0.01M PBS，制成1012/ml 的外泌体悬液。通过纳米粒子跟踪分析吸附前和吸附后溶液中外泌体颗粒数，计算出不同浓度碱盐C6H15O3N形成微球的外泌体吸附率。结果如表1所示。结果表明1mol/L的碱盐C6H15O3N制得的微球对外泌体的吸附率最高，达到 86.42±5.84％，同时对核酸DNA的吸附率相对较低(*P<0.05VS.0.16M C6H15O3N 组；##P<0.01VS.0.16M C6H15O3N组)，因此，1mol/L的碱盐C6H15O3N制得的 Ag-Fe3O4微球微球具有最佳吸附外泌体的特异性。
表1不同浓度碱盐C6H15O3N制得的Ag-Fe3O4微球对DNA和外泌体吸附率的影响
C<sub>6</sub>H<sub>15</sub>O<sub>3</sub>N(M) Absorption rate of DNAs(％) Absorption rate of exosomes(％)
0.16 18.12±2.52 26.75±2.51
0.40 64.57±3.47<sup>*</sup> 61.92±4.03
1.00 25.37±3.85 86.42±5.84<sup>##</sup>
2.50 19.65±2.12 35.46±6.22
实施例2：多聚右旋赖氨酸修饰磁性微球的制备
将实施例1中1mol/L的碱盐C6H15O3N制得的Ag-Fe3O4微球，加入聚醚酰亚胺(PEI,Mw1/4分子量25kDa)，分别与碱性氨基酸多聚右旋赖氨酸 Poly-D-Lysine和多聚左旋赖氨酸Poly-L-Lysine反应修饰，其中，Ag-Fe3O4微球：PEI：多聚赖氨酸的质量比分别为3:1:2、3:1:4、3:1:8、3:1:16.。以柠檬酸钠修饰微球作为对照组(根据参考文献Stem cell-mediateddelivery of nanogels loaded with ultrasmall iron oxide nanoparticles forenhanced tumor MR imaging,Nanoscale. 2019Mar 14；11(11):4904-4910)。未修饰的Ag-Fe3O4微球组设为空白Control组。
图1为不同类型和质量比多聚赖氨酸修饰的微球对外泌体吸附率的影响，结果表明，多聚右旋赖氨酸Poly-D-Lysine相对于多聚左旋赖氨酸Poly-L-Lysine修饰Ag-Fe3O4微球，能显著提高Ag-Fe3O4微球对外泌体的吸附效果，并且， Ag-Fe3O4微球：多聚赖氨酸的质量比为3:8时制得的多聚右旋赖氨酸 Poly-D-Lysine修饰的Ag-Fe3O微球吸附外泌体效率最佳(*P<0.05，**P<0.01VS. Control)。
实施例3：特异性免疫磁性微球的制备
将市售的S100β抗体(Proteintech公司，cat.No.15146-1-AP)50μg和MBP 抗体(R&D公司，cat.No.MAB42282)50μg与实施例2最优条件制得的多聚右旋赖氨酸修饰的Ag-Fe3O4微球1mg，500μg，250μg混合，加入1.0M EDC和0.5M NHS混合溶液，促进多聚赖氨酸与抗体之间羧基/氨基的共价偶联，制备Ag-Fe3O4免疫磁性微球。
将健康人血清粉末化外泌体(润基生物Rengenbio公司，Cat. No.EXOLyoS-2)，溶解于0.01M PBS，制成1mg/mL的外泌体悬液。将多聚右旋赖氨酸修饰Ag-Fe3O4微球与抗体不同质量比制备所得的微球1mg，分别加入外泌体悬液，用于吸附溶液中的外泌体，通过Western blot检测免疫磁性微球吸附外泌体特异性标记的蛋白表达量，测定微球/抗体不同质量比制备所得的免疫磁性微球外泌体吸附效率。
通过外部磁场收集吸附了外泌体的免疫磁性微球，加入蛋白裂解液及蛋白酶抑制剂提取总蛋白，Western blot检测外泌体特异性标记CD63和HSP70的蛋白表达量。提取总蛋白溶于2×SDS上样缓冲液，煮沸5min，取上清10g行10％ SDS-PAGE。电泳结束后将样品转移至PVDF膜(40mA，2h)。转膜结束后，室温下用25ml TBS/T漂洗5min后，将PVDF膜放入含有5％脱脂奶粉的TBS/T 中，4℃包被过夜。TBS/T漂洗5min×3次，加入一抗monoclonal antibodymouse anti-CD63(1:1000dilution，Abcam公司ab108950)，monoclonal antibody rabbitanti-HSP70(1:1000dilution,Abcam公司ab181606)4℃过夜。TBS/T漂洗5min×3 次，加入二抗HRP-conjugated goat anti-mouse IgG(1:2000dilution)， HRP-conjugated goatanti-rabbit IgG(1:2000dilution)室温2h。TBS/T漂洗5min×3 次，将膜置于ECL显色液(A、B液各300μl，临用前混匀)中，室温2min。压片、曝光、显影。实验中设不加一抗的空白对照组，除以0.01M PBS代替一抗，其余步骤同上。实验重复三次。以GAPDH(1：4000)作为内参。图像以GS800 Calibrated Densitometer扫描仪进行灰度扫描，PDQuest7.2.0软件分析结果。
图2为多聚右旋赖氨酸修饰的Ag-Fe3O4微球与抗体不同比例下制备的免疫磁性微球吸附外泌体特异性蛋白CD63和HSP70的Western代表图(图2A)和柱形统计图(图2B)。结果表明，外泌体特异性蛋白CD63在多聚右旋赖氨酸修饰的Ag-Fe3O4微球与抗体比例为10:1和5:1时都有统计学差异(*P<0.05， **P<0.01VS.Control)，其中，以比例为10:1时为最佳。外泌体特异性蛋白HSP70 在多聚右旋赖氨酸修饰的Ag-Fe3O4微球与抗体比例为20:1和10:1时都有统计学差异(*P<0.05，**P<0.01VS.Control)，其中，以比例为10:1时为最佳。因此，以多聚右旋赖氨酸修饰的Ag-Fe3O4微球与S100β抗体和MBP抗体质量比为 10:1:1为最佳比例，制备特异性免疫磁性微球。
扫描电镜观察最优条件下制备的免疫磁性微球，并统计微球直径范围和分布情况。使用冷场发射型扫描电镜(JEM-T300,JEOL Inc.,日本)，二次电子检测器，图像分辨率在1kV。图3为扫描电镜观察磁性纳米微球与微球直径统计分析，结果发现，扫描电镜下该免疫磁性微球形状接近球形，表面光滑完整，分散性好，尺寸基本均匀(图3A)，粒径范围主要分布在4.5～5.5μm，平均直径5μm(图3B)。
实施例4：外周神经组织外泌体的提取
取外周神经组织10g置于冰上，解剖镜下仔细去除包裹的结缔组织和神经外膜后，置于冰上盛有D-Hank’s液的培养皿中，显微剪尽量剪碎成约1mm3的组织块，加入20mL组织消化液(各种酶类的终浓度分别为0.05mg/mL DNA酶I、 0.2mg/ml木瓜蛋白酶、0.1mg/ml透明质酸酶、1mg/ml胶原蛋白酶I、1mg/ml胶原蛋白酶II、1mg/ml胶原蛋白酶IV加入D-Hank’s液中组成)37℃孵育3小时后，用大量的D-Hank’s液稀释，并离心去除残余的酶类。用10mL0.01MPBS重悬， 0.22μm滤器过滤后，加入1mg实施例3以多聚右旋赖氨酸修饰的Ag-Fe3O4微球与S100β抗体和MBP抗体质量比为10:1:1为最佳比例制备的免疫磁性微球，涡旋振荡充分混匀后，4℃旋转混匀过夜>16h。以外置磁场进行固液分离，弃去上清，得到多聚右旋赖氨酸修饰的Ag-Fe3O4-S100β/MBP抗体-外泌体复合物。 0.01MPBS重悬，外置磁场固液分离，去除细胞碎片等杂质后，用pH＝3浓度为 0.2mol/L的甘氨酸溶液充分溶解沉淀在管底的微球复合物，以解离抗体与外泌体之间的相互连接，然后用pH＝10浓度为0.1mol/L的Tris溶液进行中和，调整至合适的pH。以外置磁场进行固液分离，弃去沉淀的微球，保留上清液，提取的外周神经组织来源外泌体即在上清液中。4℃，1500g×30min后加100μL 0.01MPBS重悬，即得神经组织来源的外泌体溶液。
纳米粒子跟踪分析技术(NTA)检测，ZataView 8.04.02软件分析外泌体颗粒浓度和粒径分布。图4为透射电镜观察外泌体的大小和形态结果。图4A Ag-Fe3O4免疫微球提取的外泌体透射电镜结果，大小在30-150nm之间，囊膜状的超微结构清晰可见，符合外泌体的形态特征，图4B粒径统计分析得出平均粒径为120nm。
参照文献A protocol for exosome isolation and characterization:evaluation of ultracentrifugation,density-gradient separation,andimmunoaffinity capture methods， Methods Mol Biol.2015；1295:179-209.公开的方法，采用传统超速离心法提取的外泌体与本发明所述提取方法进行比较。纳米颗粒追踪分析仪(NTA)检测外泌体颗粒浓度情况。将制得的外泌体悬液用0.01M PBS稀释1000倍，仪器用直径为 100nm的聚苯乙烯颗粒校准，超纯水清洗样本池。室温下，外泌体悬液样本上机，ZataView 8.04.02软件检测外泌体颗粒浓度，SPSS 11.5统计分析结果。图5NTA 检测不同提取方法获得外泌体浓度的柱形统计图。比较本发明所述Ag-Fe3O4免疫磁性微球与Control组即传统超速离心法提取的外泌体浓度，结果显示有显著性差异(**p<0.01VS.Control)，表明通过Ag-Fe3O4免疫磁性微球方法提取的外泌体，具有在单位体积外周神经组织中获得外泌体得率高的特点。
实施例5：考察不同提取方法获得的外泌体对胚胎干细胞向类神经细胞特异性分化的作用
饲养层细胞即胎鼠成纤维细胞的(PMEF)制备：取胚胎期13.5d小鼠，置于冰冷的D-Hank’s液中，将躯干部尽量剪碎成1mm3的碎块，0.25％胰酶37℃消化10min，血清终止消化后，用PMEF生长培养基(高糖DMEM，0.1mmol/Lβ-ME 和10％胎牛血清)，以5×105/mL密度终于培养板中。将传至第三代的PMEF，加入10mg/L的丝裂霉素C，作用2h，充分洗涤后可用作饲养层使用。
将ES-D3胚胎干细胞，用高糖DMEM，0.1mmol/Lβ-ME，1％非必需氨基酸， 106U/LLIF和10％FBS按一定密度接种于饲养层细胞上，一般2-3天传代一次。当细胞接近80％融合时，用胰酶消化成单细胞悬液，ES用分化培养液I(含高糖 DMEM，非必需氨基酸，10％胎牛血清，不合LIF)，重新接种于无饲养层6孔培养板中，逐渐更换为无血清PMEF生长培养基，并且在培养基中添加不同浓度和不同提取方法获得的外泌体(实施例4本发明方法和传统超速离心法提取得到的外泌体)，继续培养3天后免疫细胞化学染色，观察胚胎干细胞分化为Tuj1 阳性的类神经细胞百分比情况。
4％多聚甲醛室温下固定15min，0.01M PBS洗涤10min×3次。用含10％羊血清、0.3％Triton X-100的0.01M PBS液封闭60min。荧光免疫细胞化学分析：滴加一抗(rabbitanti-Tuj1 polyclonal antibody，1:350)，4℃放置过夜，0.01M PBS 洗涤10min×3次。滴加二抗(FITC donkey anti-rabbit IgG，1:1000)，以 Hoechst33342(5μg/ml)标记细胞核，室温、避光放置1h，0.01M PBS洗涤10min×3 次。实验中设不加一抗的空白对照组。在激光共聚焦显微镜下(FITC激发波长： 488nm，观察波长：500-535nm；Hoechst33342亚离子Ar激发波长：353-364nm，观察波长：460-480nm)，观察免疫荧光细胞化学检测结果，ImageJ软件统计Tuj1 阳性细胞百分比和突起总长度。
表2免疫荧光细胞化学染色统计结果显示，与阴性对照组，即只应用神经元培养基97％Neurobasal+2％B27+1％GluMAX中的Tuj1阳性细胞率与突起总长度相比，Ag-Fe3O4免疫磁性微球提取的外泌体浓度107/mL的Tuj1阳性细胞百分比为0.38±0.11，突起总长度为15.34±1.64μm(*p<0.05VS.Control；#p<0.05VS.超速离心法外泌体浓度108/mL)，Ag-Fe3O4免疫磁性微球提取的外泌体浓度108/mL 的Tuj1阳性细胞百分比为0.88±0.09，突起总长度为31.89±2.09μm(**p<0.01VS. Control；##p<0.01VS.超速离心法外泌体浓度108/mL)，均有显著性差异，其中以Ag-Fe3O4磁性微球提取的外泌体浓度108/mL为最佳。表明随着加入不同浓度梯度的外泌体，与干细胞分化为类神经细胞的百分比呈正相关，提示本发明采用的Ag-Fe3O4免疫磁性微球提取的外泌体对胚胎干细胞具有向类神经细胞特异性分化的作用，并且这种特异性比单纯通过超速离心法获得外泌体的神经特异性高。
表2不同浓度Ag-Fe3O4免疫磁性微球提取外泌体对干细胞向类神经细胞分化的影响
实验分组 Tuj1阳性细胞百分比(％) 突起总长度(μm)
Control 0.09±0.03 1.50±0.12
本发明方法提取外泌体浓度10<sup>5</sup>/mL 0.12±0.02 2.65±0.74
本发明方法提取外泌体浓度10<sup>6</sup>/mL 0.22±0.05 4.32±1.24
本发明方法提取外泌体浓度10<sup>7</sup>/mL 0.38±0.11<sup>*</sup> 15.34±1.64<sup>*,#</sup>
本发明方法提取外泌体浓度10<sup>8</sup>/mL 0.88±0.09<sup>**,##</sup> 31.89±2.09<sup>**,##</sup>
超速离心法外泌体浓度10<sup>8</sup>/mL 0.22±0.10 2.53±1.08

Claims (10)

1.一种Ag-Fe3O4免疫磁性微球，其特征在于Ag-Fe3O4磁性微球表面修饰有多聚右旋赖氨酸，通过酰胺键连接S100β和/或MBP抗体。
2.根据权利要求1所述的微球，其特征在于，所述Ag-Fe3O4免疫磁性微球采用如下方法制备而成：
(1)将Fe2+和Fe3+金属盐溶解在三乙醇胺水溶液中，加热，惰性气体保护下，加入Ag+水溶液在磁场强度作用下搅拌、分散，洗涤得到的Ag-Fe3O4微球至中性；
(2)将步骤(1)得到的Ag-Fe3O4微球加入聚醚酰亚胺和多聚右旋赖氨酸Poly-D-Lysine反应得到多聚右旋赖氨酸修饰的Ag-Fe3O4微球；
(3)将步骤(2)得到的微球与S100β抗体和/或MBP抗体混合，加入交联剂EDC和/或NHS促进多聚赖氨酸与抗体之间通过酰胺键偶联，制备得到Ag-Fe3O4免疫磁性微球。
3.根据权利要求2所述的微球，其特征在于步骤(1)所述Ag+：Fe3+：Fe2+质量比为1.0:2.5:1.0。
4.根据权利要求2所述的微球，其特征在于步骤(1)所述三乙醇胺的浓度为1mol/L。
5.根据权利要求2所述的微球，其特征在于步骤(2)Ag-Fe3O4微球：多聚右旋赖氨酸的质量比为3:2-16。
6.根据权利要求1-5所述的微球，其特征在于所述步骤(3)中步骤(2)得到的微球与S100β和/或MBP抗体质量比为10:1:1。
7.根据权利要求1-6任一项所述的微球在提取神经组织来源外泌体中的应用。
8.一种神经组织来源外泌体的提取方法，其特征在于将外周神经组织使用含酶类的消化液消化后，使用权利要求1-6任一项所述的微球进行提取。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述消化液含有DNA酶I、木瓜蛋白酶、透明质酸酶、胶原蛋白酶I、胶原蛋白酶II、胶原蛋白酶IV。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述消化液含有0.05mg/mL DNA酶I、0.2mg/ml木瓜蛋白酶、0.1mg/ml透明质酸酶、1mg/ml胶原蛋白酶I、1mg/ml胶原蛋白酶II、1mg/ml胶原蛋白酶IV。
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