CN109576210A - 一种快速分离外泌体的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种快速分离外泌体的方法，以超滤的方法对血清进行预处理，以聚乙二醇为间隔合成超顺磁纳米颗粒与配体的复合物，利用配体与外泌体表面的受体的特异性结合，形成基于外泌体的超顺磁性纳米离子团簇，在磁场作用下实现对外泌体的分离。本发明方法可以快速有效的清除血液中的游离配体，增加外泌体表面瞄定的超顺磁纳米颗粒的数目，从而快速的分离血液中的外泌体。

Description

一种快速分离外泌体的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，更具体地说涉及一种优化的基于超顺磁纳米颗粒簇快速分离血液中外泌体的方法。
背景技术
外泌体是指由哺乳动物细胞分泌到细胞外微环境的一类直径为40～100nm的膜结构囊泡，其可以从多种细胞培养基及动物体液中分离得到。由于其独特的生物来源，丰富的表面膜蛋白和脂质双分子层结构，外泌体已经在药物投递载体领域得到了越来越多的关注{van Dommelen,Susan M.,et al."Microvesicles and exosomes:opportunities forcell-derived membrane vesicles in drug delivery."Journal of ControlledRelease 161.2(2012)；Vader,Pieter,et al."Extracellular vesicles for drugdelivery."Advanced drug delivery reviews 106(2016)}。目前已经利用外泌体投递各种治疗性分子，例如化疗药物，蛋白质，基因等等。虽然这种基于外泌体的药物投递系统已取得了显著的进展，但仍面临很多挑战。首先，目前外泌体的主要来源为细胞培养基，其中的外泌体数量非常有限，并且通常含有致癌或免疫原性成分。其次，外泌体的分离和提纯较困难，一些传统的分离方法，如超速离心，蔗糖密度梯度法等既费时又费力。另外，作为药物投递载体，外泌体必须被赋予肿瘤靶向能力，因为其表面缺乏靶向因子，血液循环半衰期较短{Imai,Takafumi,et al."Macrophage-dependent clearance of systemicallyadministered B16BL6-derived exosomes from the blood circulation in mice."Journal of extracellular vesicles 4.1(2015)}。
健康动物的体液如血液是优选的外泌体来源，因为其具有较高的生物安全性且其中的外泌体数量较多。然而由于血液的成分较复杂，传统的分离方法得不到较纯的外泌体。为了解决这个问题，我们课题组以前开发了一种新的基于超顺磁纳米颗粒簇(SMNCs)分离血液中外泌体的方法。通过这种免疫磁性分离方法，我们同时解决了外泌体的来源、分离和靶向的问题{Qi,Hongzhao,et al."Blood exosomes endowed with magnetic andtargeting properties for cancer therapy."ACS nano 10.3(2016)}。为了更高效的获取血液中的外泌体，需要提高基于外泌体的超顺磁性纳米粒子团簇(SMNC-EXOs)的形成效率。首先，以前使用透析的方法以清除血清中的游离配体，虽有助于获得高纯度的SMNC-EXOs，但该过程耗时较长，形成效率较低。因此需要选择适当的方法来缩短血清的预处理时间。另外，配体与超顺磁纳米颗粒(SPMNs)的直接连接使其之间存在一定的空间位阻效应，从而限制了瞄定在外泌体上的SPMNs的数量，进而减弱了SMNC-EXOs的磁相应强度。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种快速分离外泌体的方法，即一种优化的基于超顺磁性纳米粒子团簇分离血清中外泌体的方法。具体而言，本发明使用超滤的方法快速有效的清除血清中的游离配体，从而缩短了体液的预处理时间；采用聚乙二醇(PEG)作为SPMNs与配体之间的间隔物，从而降低其之间的空间效应，提高了外泌体磁分离效率。
本发明的技术目的通过下述技术方案予以实现：
一种快速分离外泌体的方法，按照下述步骤进行：将超顺磁纳米颗粒-聚乙二醇-配体复合物(即SPMN-PEG-配体复合物)置于待分离样品中进行孵育，将孵育完成后用的溶液进行磁分离并用缓冲溶液洗涤，即可得到基于外泌体的超顺磁性纳米粒子团簇，其中超顺磁纳米颗粒-聚乙二醇-配体复合物选择聚乙二醇化的超顺磁纳米颗粒与激活的硫醇基配体反应制备，氨基官能化的超顺磁性Fe3O4纳米颗粒与活性酯聚乙二醇马来酰亚胺进行反应，以实现超顺磁纳米颗粒的聚乙二醇化；配体与2-亚氨基四氢噻吩反应得到激活的硫醇基配体；待分离样品经过超滤处理，超滤管的截留分子量为(数均)3kDa-300kDa。
而且，待分离样品为含有外泌体的体液，如从血液样本中得到的血清、唾液、尿液、精液或者母乳。
而且，对待分离样品进行超滤处理时，在3-5℃离心20-40min，离心速度为100×g-100000×g。
而且，超顺磁纳米颗粒-聚乙二醇-配体复合物与待分离样品在30-40℃下孵育0.5-2h。
而且，将孵育完成后用的溶液进行磁分离，时间为10-5000min，优选30—100min，使用磷酸缓冲溶液进行洗涤。
在制备超顺磁纳米颗粒-聚乙二醇-配体复合物时，参考课题组已有技术Qi,Hongzhao,et al."Blood exosomes endowed with magnetic and targeting propertiesfor cancer therapy."ACS nano 10.3(2016)进行，将氨基官能化的超顺磁性Fe3O4纳米颗粒溶液与活性酯聚乙二醇马来酰亚胺(NHS-PEG-MAL)在硼酸盐缓冲液中混合将混合物在室温(20-25℃)下孵育1-3h，以实现超顺磁纳米颗粒的聚乙二醇化；将配体与2-亚氨基四氢噻吩在硼酸盐缓冲液中混合，在室温(20-25℃)下孵育1-3h，以得到激活的硫醇基配体，使用含EDTA的硼酸盐缓冲液透析3-5h；最后将聚乙二醇化超顺磁纳米颗粒和活化的配体均匀分散在硼酸盐缓冲液中并在室温(20-25℃)下孵育1-3h后，得到SPMN-PEG-配体复合物，或者在分离得到聚乙二醇化超顺磁纳米颗粒和活化的配体后，直接将两者重新均匀分散在水溶液或者硼酸盐缓冲液中，得到两者的溶液后进行混合孵育反应。
配体采用CD63抗体、CD9抗体、CD81抗体、CD82抗体、ALIX抗体、Tsg101抗体或者转铁蛋白中的一种。
在超顺磁纳米颗粒的聚乙二醇化中，活性酯聚乙二醇马来酰亚胺的数均分子量为1000-100000，磁分离时间为10-5000min；优选活性酯聚乙二醇马来酰亚胺的数均分子量为4000-10000，磁分离时间为60-200min。
配体与2-亚氨基四氢噻吩以摩尔比为(1-10000)：(1-10000)，优选(10-1000)：(10-1000)，更加优选(10—100)：(600—1000)，直接根据配体和2-亚氨基四氢噻吩的质量和分子质量计算两者的摩尔数。
氨基官能化的超顺磁性Fe3O4纳米颗粒与活性酯聚乙二醇马来酰亚胺的摩尔比为(1-10000)：(1-10000)，优选(10-1000)：(10-1000)，更加优选(10—100)：(500—1000)，根据活性酯聚乙二醇马来酰亚胺的质量和分子质量计算其摩尔数，根据氨基官能化的超顺磁性Fe3O4纳米颗粒的浓度和体积，计算氨基官能化的超顺磁性Fe3O4纳米颗粒的个数，再除以NA。
与现有技术相比，本发明将超顺磁性纳米颗粒和配体之间构建PEG柔性结构单元，减少位阻效应，可快速有效的从血清中分离外泌体，大大缩短了外泌体制备的时间；通过本发明的方法制备得到的外泌体纯度较高，由于分离得到的外泌体携带有超顺磁性纳米颗粒(即SMNC-EXOs)，能够作为靶向治疗的药物载体，即依照本发明方法分离得到的外泌体在制备靶向治疗药物载体中的应用，超顺磁纳米颗粒-聚乙二醇-配体复合物在分离外泌体、制备基于外泌体的超顺磁性纳米粒子团簇和在制备靶向治疗药物载体中的应用；同时采用超滤离心方式大大降低残余配体对分离外泌体的干扰，即超滤离心在分离外泌体中的应用。
附图说明
图1为利用本发明技术方案分离血清得到的SMNC-EXOs的粒径分布表征图。
图2为利用本发明技术方案分离血清得到的SMNC-EXOs的透射电子显微镜照片。
图3为本发明中制备SPMN-PEG-配体复合物的原理示意图。
图4为经不同时间的超滤或透析后，测量血清中游离(残余)配体浓度的对比测试曲线图。
图5为SPMN-配体和SPMN-PEG-配体对超滤血清的外泌体的分离速度对比测试曲线图。
具体实施方式
下面通过具体的实施例对本发明的技术方案作进一步的说明。
实施例中使用的主要仪器及试剂：氨基官能化超顺磁性Fe3O4纳米颗粒(南京纳米生物科技有限公司)；CD63抗体、CD9抗体、CD81抗体、CD82抗体、ALIX抗体、Tsg101抗体和转铁蛋白(Sigma-Aldrich公司)；超滤管(Merck Millipore)；TG16-WS台式高速离心机(湖南湘仪实验室仪器有限公司)；动态光散射粒度仪(美国布鲁克海文有限公司)。
实施例1
1.采用超滤的方法对血清进行预处理
将1mL的血清加入超滤管(截留分子量为3kDa)中，在4℃离心30min。离心速度为1000×g。
2.SPMN-PEG-配体的合成
将氨基官能化的超顺磁性Fe3O4纳米颗粒溶液(40μL，2.5mg/mL)与NHS-PEG1000-MAL以摩尔比1:100的比例在硼酸盐缓冲液(pH8.0)中混合，将混合物在室温下孵育2h，然后将PEG化的SPMN进行磁分离。将CD63配体溶液(100μL，0.1mg/mL)与2-亚氨基四氢噻吩以摩尔比为1:200的比例在硼酸盐缓冲液(pH8.0)中混合，在室温下孵育2h后，将激活的CD63配体溶液用含EDTA的PBS缓冲液透析4h。将聚乙二醇化SPMNs溶液和活化的CD63配体溶液混合并在室温下孵育2h，然后进行磁分离，PBS洗涤并重悬，得到产物SPMN-PEG1000-CD63。
3.利用SPMN-PEG1000-CD63分离超滤血清中的外泌体并进行表征
将超滤后血清与SPMN-PEG1000-CD63溶液混合，并使用涡旋振荡器均匀混合，将混合物在37℃下孵育1h；在10min的磁分离后获得产物SMNC-EXOs，并用PBS洗涤3次，得到SMNC-EXOs。
实施例2
1.采用超滤的方法对血清进行预处理
将1mL的血清加入超滤管(截留分子量为5kDa)中，在4℃离心30min。离心速度为10000×g。
2.SPMN-PEG-配体的合成
将氨基官能化的超顺磁性Fe3O4纳米颗粒溶液(40μL，2.5mg/mL)与NHS-PEG10000-MAL以摩尔比100:1的比例在硼酸盐缓冲液(pH8.0)中混合。将混合物在室温下孵育2h，然后将PEG化的SPMN进行磁分离。将CD9配体溶液(100μL，0.1mg/mL)与2-亚氨基四氢噻吩以摩尔比为500:1的比例在硼酸盐缓冲液(pH8.0)中混合，在室温下孵育2h后，将激活的CD9配体溶液用含EDTA的PBS缓冲液透析4h。将聚乙二醇化SPMNs溶液和活化的CD9配体溶液混合并在室温下孵育2h，然后进行磁分离，PBS洗涤并重悬，得到产物SPMN-PEG10000-CD9。
3.利用SPMN-PEG10000-CD9分离超滤血清中的外泌体并进行表征
将超滤后血清与SPMN-PEG10000-CD9溶液混合，并使用涡旋振荡器均匀混合，将混合物在37℃下孵育1h；在1440min的磁分离后获得产物SMNC-EXOs，并用PBS洗涤3次，得到SMNC-EXOs。
实施例3
1.采用超滤的方法对血清进行预处理
将1mL的血清加入超滤管(截留分子量为10kDa)中，在4℃离心30min。离心速度为4000×g。
2.SPMN-PEG-配体的合成
将氨基官能化的超顺磁性Fe3O4纳米颗粒溶液(40μL，2.5mg/mL)与NHS-PEG5000-MAL以摩尔比1:10的比例在硼酸盐缓冲液(pH8.0)中混合。将混合物在室温下孵育2h，然后将PEG化的SPMN进行磁分离。将转铁蛋白(Tfs)配体溶液(100μL，0.1mg/mL)与2-亚氨基四氢噻吩以摩尔比为1:10的比例在硼酸盐缓冲液(pH8.0)中混合，在室温下孵育2h后，将激活的转铁蛋白配体溶液用含EDTA的PBS缓冲液透析4h。将聚乙二醇化SPMNs溶液和活化的转铁蛋白配体溶液混合并在室温下孵育2h，然后进行磁分离，PBS洗涤并重悬，得到产物SPMN-PEG5000-Tfs。
3.利用SPMN-PEG5000-Tfs分离超滤血清中的外泌体并进行表征
将超滤后血清与SPMN-PEG5000-Tfs溶液混合，并使用涡旋振荡器均匀混合，将混合物在37℃下孵育1h；在40min的磁分离后获得产物SMNC-EXOs，并用PBS洗涤3次，得到SMNC-EXOs。
实施例4
1.采用超滤的方法对血清进行预处理
将1mL的血清加入超滤管(截留分子量为10kDa)中，在3℃离心50min。离心速度为100×g。
2.SPMN-PEG-配体的合成
将氨基官能化的超顺磁性Fe3O4纳米颗粒溶液(40μL，2.5mg/mL)与NHS-PEG10000-MAL以摩尔比1:10000的比例在硼酸盐缓冲液(pH8.0)中混合。将混合物在室温下孵育2h，然后将PEG化的SPMN进行磁分离。将CD81配体溶液(100μL，0.1mg/mL)与2-亚氨基四氢噻吩以摩尔比为1:10000的比例在硼酸盐缓冲液(pH8.0)中混合，在室温下孵育1h后，将激活的CD81配体溶液用含EDTA的PBS缓冲液透析3h。将聚乙二醇化SPMNs溶液和活化的CD81配体溶液混合并在室温下孵育1h，然后进行磁分离，PBS洗涤并重悬，得到产物SPMN-PEG10000-CD81。
3.利用SPMN-PEG10000-CD81分离超滤血清中的外泌体并进行表征
将超滤后血清与SPMN-PEG10000-CD81溶液混合，并使用涡旋振荡器均匀混合，将混合物在35℃下孵育2h；在10min的磁分离后获得产物SMNC-EXOs，并用PBS洗涤4次，得到SMNC-EXOs。
实施例5
1.采用超滤的方法对血清进行预处理
将1mL的血清加入超滤管(截留分子量为300kDa)中，在5℃离心20min。离心速度为100×g。
2.SPMN-PEG-配体的合成
将氨基官能化的超顺磁性Fe3O4纳米颗粒溶液(40μL，2.5mg/mL)与NHS-PEG8000-MAL以摩尔比1:1的比例在硼酸盐缓冲液(pH8.0)中混合。将混合物在室温下孵育3h，然后将PEG化的SPMN进行磁分离。将CD82配体溶液(100μL，0.1mg/mL)与2-亚氨基四氢噻吩以摩尔比为1:1的比例在硼酸盐缓冲液(pH8.0)中混合，在室温下孵育3h后，将激活的CD82配体溶液用含EDTA的PBS缓冲液透析5h。将聚乙二醇化SPMNs溶液和活化的CD82配体溶液混合并在室温下孵育3h，然后进行磁分离，PBS洗涤并重悬，得到产物SPMN-PEG8000-CD82。
3.利用SPMN-PEG8000-CD82分离超滤血清中的外泌体并进行表征
将超滤后血清与SPMN-PEG8000-CD82溶液混合，并使用涡旋振荡器均匀混合，将混合物在40℃下孵育0.5h；在5000min的磁分离后获得产物SMNC-EXOs，并用PBS洗涤2次，得到SMNC-EXOs。
实施例6
1.采用超滤的方法对血清进行预处理
将1mL的血清加入超滤管(截留分子量为3kDa)中，在4℃离心35min。离心速度为50000×g。
2.SPMN-PEG-配体的合成
将氨基官能化的超顺磁性Fe3O4纳米颗粒溶液(40μL，2.5mg/mL)与NHS-PEG9000-MAL以摩尔比1:1000的比例在硼酸盐缓冲液(pH8.0)中混合，将混合物在室温下孵育2h，然后将PEG化的SPMN进行磁分离，将ALIX配体溶液(100μL，0.1mg/mL)与2-亚氨基四氢噻吩以摩尔比为1:2000的比例在硼酸盐缓冲液(pH8.0)中混合，在室温下孵育2h后，将激活的ALIX配体溶液用含EDTA的PBS缓冲液透析4h。将聚乙二醇化SPMNs溶液和活化的ALIX配体溶液混合并在室温下孵育2h，然后进行磁分离，PBS洗涤并重悬，得到产物SPMN-PEG9000-ALIX。
3.利用SPMN-PEG9000-ALIX分离超滤血清中的外泌体并进行表征
将超滤后血清与SPMN-PEG9000-ALIX溶液混合，并使用涡旋振荡器均匀混合，将混合物在38℃下孵育1.5h；在500min的磁分离后获得产物SMNC-EXOs，并用PBS洗涤5次，得到SMNC-EXOs。
实施例7
1.采用超滤的方法对血清进行预处理
将1mL的血清加入超滤管(截留分子量为300kDa)中，在5℃离心20min。离心速度为100×g。
2.SPMN-PEG-配体的合成
将氨基官能化的超顺磁性Fe3O4纳米颗粒溶液(40μL，2.5mg/mL)与NHS-PEG80000-MAL以摩尔比500:1的比例在硼酸盐缓冲液(pH8.0)中混合。将混合物在室温下孵育3h，然后将PEG化的SPMN进行磁分离。将Tsg101配体溶液(100μL，0.1mg/mL)与2-亚氨基四氢噻吩以摩尔比为1000:1的比例在硼酸盐缓冲液(pH8.0)中混合，在室温下孵育3h后，将激活的Tsg101配体溶液用含EDTA的PBS缓冲液透析5h。将聚乙二醇化SPMNs溶液和活化的Tsg101配体溶液混合并在室温下孵育3h，然后进行磁分离，PBS洗涤并重悬，得到产物SPMN-PEG80000-Tsg101。
3.利用SPMN-PEG80000-Tsg101分离超滤血清中的外泌体并进行表征
将超滤后血清与SPMN-PEG80000-Tsg101溶液混合，并使用涡旋振荡器均匀混合，将混合物在38℃下孵育1.5h；在2500min的磁分离后获得产物SMNC-EXOs，并用PBS洗涤2次，得到SMNC-EXOs。
使用动态光散射粒度仪对实施例的产物进行尺寸的表征。结果如图1所示，所制备的外泌体的流体动力学直径表现一直，均为50-150nm，粒径较均一，纯度较高，无大尺寸囊泡和小分子杂蛋白的污染，且该尺寸符合SMNC-EXOs的理论尺寸。使用透射电子显微镜对所得产物进行尺寸的表征。结果如图2所示，所制备的SMNC-EXOs的形态是黑点包围的圆形囊泡，超顺磁性纳米颗粒以辐射状分布在外泌体周围。这种辐射状分布增加了瞄定在外泌体上的超顺磁性纳米颗粒的数目，由原来的6-8增加到了12-16，这赋予了SMNC-EXOs更高的磁响应性。由图3可知，与现有技术相比，本发明将超顺磁性纳米颗粒和配体之间构建PEG柔性结构单元，减少位阻效应，并可根据PEG单元的聚合度调整超顺磁性纳米颗粒和配体之间的位阻效应，调控超顺磁性纳米颗粒在外泌体周围的分布情况，即PEG单元在调控超顺磁性纳米颗粒在外泌体周围的分布情况中的应用。
为表征本发明中超滤离心和SPMN-PEG-配体的效率，进行如下测试：(1)经不同时间的超滤或透析后，测量血清中游离配体的浓度，即血清中残余配体的浓度，未与SPMN-PEG进行功能化的配体，其会在分离外泌体时，对SPMN-PEG-配体产生干扰，残余量越少越好；超滤离心后，通过BCA测定试剂盒测定滞留物中配体蛋白的浓度；透析后，滞留物中配体蛋白的浓度也通过BCA测定试剂盒进行测定。结果图4所示，超滤30分钟后，血清中游离配体的浓度降至～0.08mg/mL，远远低于透析30分钟的浓度。为了达到相同的浓度，透析需要的时间远远大于超滤，表明超滤可以显着加速血清中游离配体的消除，这可缩短外泌体的分离时间；(2)将SPMN-配体(课题组之前现有技术)和SPMN-PEG-配体(本发明制备)分别与超滤血清混合，孵育相同时间。孵育后，将混合物置于磁场中不同时间段。然后丢弃上清液，用PBS将磁性分离的样品洗涤三次。最后，将样品分别重悬在PBS中，并通过BCA测定试剂盒测定所得溶液的蛋白质浓度。比较了SPMN-配体和SPMN-PEG-配体对超滤血清的外泌体的分离速度，蛋白质浓度用于表示外泌体的数量。结果如图5所示，40分钟后SPMN-PEG-配体分离的外泌体蛋白质浓度达到3000μg/mL。然而，为了达到类似的效果，SPMN-配体需要100分钟，表明SPMN-PEG-配体对外泌体的磁分离效率要高得多。
根据本发明内容进行工艺参数的调整，均可制备本发明的SPMN-PEG-配体，且表现出与实施例基本一致的性能。以上对本发明做了示例性的描述，应该说明的是，在不脱离本发明的核心的情况下，任何简单的变形、修改或者其他本领域技术人员能够不花费创造性劳动的等同替换均落入本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种快速分离外泌体的方法，其特征在于，按照下述步骤进行：将超顺磁纳米颗粒-聚乙二醇-配体复合物、置于待分离样品中进行孵育，将孵育完成后用的溶液进行磁分离并用缓冲溶液洗涤，即可得到基于外泌体的超顺磁性纳米粒子团簇，其中超顺磁纳米颗粒-聚乙二醇-配体复合物选择聚乙二醇化的超顺磁纳米颗粒与激活的硫醇基配体反应制备，氨基官能化的超顺磁性Fe3O4纳米颗粒与活性酯聚乙二醇马来酰亚胺进行反应，以实现超顺磁纳米颗粒的聚乙二醇化；配体与2-亚氨基四氢噻吩反应得到激活的硫醇基配体；待分离样品经过超滤处理。
2.根据权利要求1所述的一种快速分离外泌体的方法，其特征在于，对待分离样品进行超滤处理时，超滤管的截留分子量为3kDa-300kDa，在3-5℃离心20-40min，离心速度为100×g-100000×g；配体采用CD63抗体、CD9抗体、CD81抗体、CD82抗体、ALIX抗体、Tsg101抗体或者转铁蛋白中的一种。
3.根据权利要求1所述的一种快速分离外泌体的方法，其特征在于，待分离样品为含有外泌体的体液，如从血液样本中得到的血清、唾液、尿液、精液或者母乳。
4.根据权利要求1所述的一种快速分离外泌体的方法，其特征在于，超顺磁纳米颗粒-聚乙二醇-配体复合物与待分离样品在30-40℃下孵育0.5-2h，将孵育完成后用的溶液进行磁分离，时间为10-5000min，优选30—100min，使用磷酸缓冲溶液进行洗涤。
5.根据权利要求1所述的一种快速分离外泌体的方法，其特征在于，在超顺磁纳米颗粒的聚乙二醇化中，将氨基官能化的超顺磁性Fe3O4纳米颗粒溶液与活性酯聚乙二醇马来酰亚胺在硼酸盐缓冲液中混合将混合物在室温(20-25℃)下孵育1-3h，氨基官能化的超顺磁性Fe3O4纳米颗粒与活性酯聚乙二醇马来酰亚胺的摩尔比为(1-10000)：(1-10000)，优选(10-1000)：(10-1000)，更加优选(10—100)：(500—1000)，活性酯聚乙二醇马来酰亚胺的数均分子量为1000-100000，磁分离时间为10-5000min；优选活性酯聚乙二醇马来酰亚胺的数均分子量为4000-10000，磁分离时间为60-200min。
6.根据权利要求1所述的一种快速分离外泌体的方法，其特征在于，将配体与2-亚氨基四氢噻吩在硼酸盐缓冲液中混合，在室温(20-25℃)下孵育1-3h，以得到激活的硫醇基配体，使用含EDTA的硼酸盐缓冲液透析3-5h，配体与2-亚氨基四氢噻吩以摩尔比为(1-10000)：(1-10000)，优选(10-1000)：(10-1000)，更加优选(10—100)：(600—1000)。
7.依照权利要求1—6之一所述的方法分离得到的外泌体在制备靶向治疗药物载体中的应用。
8.超顺磁纳米颗粒-聚乙二醇-配体复合物在分离外泌体、制备基于外泌体的超顺磁性纳米粒子团簇、在制备靶向治疗药物载体中的应用。
9.超滤离心在分离外泌体中的应用。
10.PEG单元在调控超顺磁性纳米颗粒在外泌体周围的分布情况中的应用。
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Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110231207A (zh) * 2019-05-23 2019-09-13 上海交通大学 一种分离外泌体的方法
CN110283776A (zh) * 2019-06-26 2019-09-27 上海交通大学医学院附属第九人民医院 一种胞外囊泡的分离方法
CN110904039A (zh) * 2018-09-17 2020-03-24 天津大学 pH响应性精确无损分离血液外泌体的方法
CN111358957A (zh) * 2020-03-06 2020-07-03 西安组织工程与再生医学研究所 磁性纳米颗粒
CN111518742A (zh) * 2020-05-07 2020-08-11 西安交通大学 一种纳米尺度单外泌体分离方法
CN112755925A (zh) * 2020-12-25 2021-05-07 南通大学 一种神经组织来源外泌体的提取方法
CN114533696A (zh) * 2022-01-28 2022-05-27 天津医科大学总医院 一种脑靶向递送sicPLA2和二甲双胍用工程化外泌体的制备方法和应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102091027A (zh) * 2011-01-14 2011-06-15 华南理工大学 一种载抗肿瘤小分子干扰rna磁性纳米探针的制备方法
EP2388589A1 (en) * 2010-05-21 2011-11-23 Imec Plasma membrane isolation
US20150233800A1 (en) * 2012-10-11 2015-08-20 Vin-De-Bona Trading Company Pte Ltd Method of painting microvesicles
CN106124282A (zh) * 2016-07-26 2016-11-16 广州海力特生物科技有限公司 一种叠层离心过滤分离提取外泌体的方法
CN106289926A (zh) * 2016-07-26 2017-01-04 华东理工大学 一种使用免疫磁珠分离血清中外泌体的方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2388589A1 (en) * 2010-05-21 2011-11-23 Imec Plasma membrane isolation
CN102091027A (zh) * 2011-01-14 2011-06-15 华南理工大学 一种载抗肿瘤小分子干扰rna磁性纳米探针的制备方法
US20150233800A1 (en) * 2012-10-11 2015-08-20 Vin-De-Bona Trading Company Pte Ltd Method of painting microvesicles
CN106124282A (zh) * 2016-07-26 2016-11-16 广州海力特生物科技有限公司 一种叠层离心过滤分离提取外泌体的方法
CN106289926A (zh) * 2016-07-26 2017-01-04 华东理工大学 一种使用免疫磁珠分离血清中外泌体的方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HONGZHAO QI: "Blood Exosomes Endowed with Magnetic and Targeting Properties for Cancer Therapy", 《ACS NANO》 *
亓洪昭: "磁性外泌体作为载体靶向肿瘤治疗的研究", 《2015年全国高分子学术论文报告会》 *
莫尊理: "《神奇的人体修复材料》", 30 April 2012, 甘肃科学技术出版社 *

Cited By (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110904039A (zh) * 2018-09-17 2020-03-24 天津大学 pH响应性精确无损分离血液外泌体的方法
CN110231207B (zh) * 2019-05-23 2021-10-08 上海迈景纳米科技有限公司 一种分离外泌体的方法
CN110231207A (zh) * 2019-05-23 2019-09-13 上海交通大学 一种分离外泌体的方法
CN110283776A (zh) * 2019-06-26 2019-09-27 上海交通大学医学院附属第九人民医院 一种胞外囊泡的分离方法
CN111358957A (zh) * 2020-03-06 2020-07-03 西安组织工程与再生医学研究所 磁性纳米颗粒
CN111358957B (zh) * 2020-03-06 2024-03-26 西安组织工程与再生医学研究所 磁性纳米颗粒
CN111518742A (zh) * 2020-05-07 2020-08-11 西安交通大学 一种纳米尺度单外泌体分离方法
CN111518742B (zh) * 2020-05-07 2022-02-11 西安交通大学 一种纳米尺度单外泌体分离方法
CN112755925A (zh) * 2020-12-25 2021-05-07 南通大学 一种神经组织来源外泌体的提取方法
WO2022134246A1 (zh) * 2020-12-25 2022-06-30 南通大学 一种神经组织来源外泌体的提取方法
US11731098B2 (en) 2020-12-25 2023-08-22 Nantong University Method for extracting nerve tissue-derived exosomes
JP7424712B2 (ja) 2020-12-25 2024-01-30 南通大学 神経組織由来エクソソームの抽出方法
CN114533696A (zh) * 2022-01-28 2022-05-27 天津医科大学总医院 一种脑靶向递送sicPLA2和二甲双胍用工程化外泌体的制备方法和应用

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