CN113546087B - 一种纤连蛋白包覆的单宁酸/铁配合物的载药纳米材料及其制备和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种纤连蛋白包覆的单宁酸/铁配合物的载药纳米材料及其制备方法和应用。该方法包括:将盐酸阿霉素加入三乙胺去质子化,将得到的疏水性阿霉素溶液与单宁酸溶液混合,加入铁盐反应,将得到的负载阿霉素的单宁酸/铁配合物的载药纳米材料与纤连蛋白溶液混合搅拌,挤压。该方法制备得到的载药纳米材料不仅可以实现T1MR成像,同时通过化疗以及铁死亡引起的免疫原性死亡还可以起到抗肿瘤免疫的效果,具有潜在的临床应用价值。
Description
技术领域
本发明属于纳米医学诊疗材料及其制备和应用领域,特别涉及一种纤连蛋白包覆的单宁酸/铁配合物的载药纳米材料及其制备方法和应用。
背景技术
传统的肿瘤治疗具有毒副作用大、选择性差、疗效欠佳等缺点,而精准诊断和高效治疗对提高肿瘤患者生存率至关重要。通过纳米材料靶向输送传统化疗药物和进行多种治疗方式联合治疗是增强治疗效果的有效途径。发展新型、易于制备的多功能化纳米载体材料同时负载一种或多种造影剂或治疗剂用于肿瘤的高效联合治疗及诊疗一体化依然存在着巨大的挑战。
铁死亡于2012年被发现是一种新型的细胞死亡方式,它区别于其它程序性死亡。铁死亡的发生与脂质活性氧的形成密不可分,细胞内活性氧在铁死亡中发挥着重要作用,各种抗氧化剂和活性氧清除剂可以抑制铁死亡发生。目前普遍认为,铁死亡最终是由脂质活性氧参与执行,大量的活性氧与脂膜上的多聚不饱和脂肪酸(PUFAs)发生反应,生成超额的脂质活性氧导致细胞膜损伤或细胞死亡。然而,抑制细胞膜胱氨酸/谷氨酸反向转运体(System Xc-)、谷胱甘肽过氧化物酶-4(GPX-4)以及还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADPH)氧化酶等也可促进脂质活性氧的产生进而诱导铁死亡的发生。铁死亡的影响因素有铁、脂质活性氧和GPX-4。到目前为止,含铁的纳米系统(例如铁纳米金属玻璃、氧化铁和金属-酚醛网络(或金属-多酚网络,MPNs)已被用作促铁死亡和ROS产生剂,用于治疗癌症。在这些系统中,由多酚与金属离子配位形成的基于MPN的材料具有多种吸引人的特性,包括低细胞毒性、高热稳定性和pH响应性。癌细胞中积累的H2O2随后可被多余的铁离子利用,通过Fenton反应生成ROS(例如·OH),这将最终导致细胞死亡(Shan L,et al.Biomaterials 2019,210,62-69)。
研究发现化疗药物阿霉素(DOX)是一种免疫原性诱导剂,可以引起肿瘤细胞的免疫原性细胞死亡(ICD),通过诱导肿瘤细胞自噬,释放3类信号:钙网蛋白暴露在细胞表面,刺激树突状细胞(DC)吞噬;三磷酸腺苷释放,招募DC进入肿瘤灶;高迁徙率族蛋白B1(HMGB-1)促进DC与垂死肿瘤细胞稳定结合,诱导机体产生特异性的T细胞抗肿瘤免疫(Couzin,etal.Science,2013,342,1432-1433)。肿瘤细胞的ICD是一种有多种信号分子和细胞因子参与的复杂过程,这些分子的细胞定位和表达水平的改变直接影响死亡肿瘤细胞与免疫细胞之间的相互作用。对肿瘤细胞ICD机制的深入研究可为肿瘤的免疫治疗提供新的依据和手段。
目前市面上已经存在诸多的商业化造影剂,然而这些造影剂的安全性和生物相容性系列问题依然在学术界存在着许多争议,因此开发出具有良好的MR成像性能,且更加安全的造影剂迫在眉睫。Gd3+作为顺磁性金属离子,由于其本身具有7个不成对的电子,因而自旋的磁矩较大,弛豫率也较高,是作为顺磁性造影剂的最佳选择。但是Gd3+对生物体产生的较强毒性依然不可忽视。因此,采用内源性金属Fe3+作为T1造影剂,可大大提高MR造影剂的生物安全性,同时通过Fe3+与带负电荷的单宁酸配位,可进一步延长其体内血液循环时间,从而增强肿瘤成像效果。
检索国内外文献和专利,尚未发现关于纤连蛋白包覆且具有MR成像性能的单宁酸/铁配合物的载药纳米材料的制备,以及在其空腔负载抗癌药物DOX并联合铁死亡用于肿瘤T1 MR成像和化疗/免疫联合治疗的相关报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种纤连蛋白包覆的单宁酸/铁配合物的载药纳米材料及其制备和应用,以填补现有技术的空白。
本发明提供一种纤连蛋白包覆的单宁酸/铁配合物的载药纳米材料,将疏水性阿霉素与单宁酸溶液混合,搅拌下加入铁盐反应,将得到的负载阿霉素的单宁酸/铁配合物的载药纳米材料与纤连蛋白溶液混合搅拌,通过挤压获得。
优选地,上述材料中,所述铁盐为FeCl3。
本发明还提供一种纤连蛋白包覆的单宁酸/铁配合物的载药纳米材料的制备方法,包括:
(1)将盐酸阿霉素溶解于溶剂中,加入三乙胺去质子化,得到疏水性阿霉素DOX溶液;
(2)将步骤(1)中DOX溶液与单宁酸TA溶液混合,搅拌下加入铁盐反应,离心,得到负载阿霉素的单宁酸/铁配合物的载药纳米材料DOX-TAF;
(3)将步骤(2)中DOX-TAF溶于超纯水中,加入纤连蛋白FN溶液,搅拌,挤压,离心,真空干燥,得到纤连蛋白包覆的单宁酸/铁配合物的载药纳米材料。
优选地,上述方法中,所述步骤(1)中盐酸阿霉素与三乙胺的摩尔比为1:1~3。
优选地,上述方法中,所述步骤(1)中溶剂为甲醇。
优选地,上述方法中,所述步骤(1)中去质子化时间为2~4h。
优选地,上述方法中,所述步骤(1)中加入三乙胺后需要超声混合,可以加速盐酸的去除。
优选地,上述方法中,所述步骤(2)中单宁酸TA溶液的溶剂为无水乙醇。
优选地,上述方法中,所述步骤(2)中TA、铁盐和DOX的质量比为5.14~7.12:0.45~1:2.5~3.5。
优选地,上述方法中,所述步骤(2)中反应为:室温搅拌12~24h,将甲醇和乙醇挥发除尽。
优选地,上述方法中,所述步骤(2)和(3)中离心的工艺参数为:离心转速为10000~13000rpm,温度为4~10℃,时间为20~30min。
优选地,上述方法中,所述步骤(3)中DOX-TAF和纤连蛋白FN的质量比为1:0.5~1。
优选地,上述方法中,所述步骤(3)中纤连蛋白FN溶液浓度为0.5~2.5mg/mL。
优选地,上述方法中,所述步骤(3)中搅拌温度为室温,搅拌时间为12~24h。
优选地,上述方法中,所述步骤(3)中挤压的方法为:使用挤膜器挤压,使蛋白充分包裹单宁酸/铁配合物的纳米载药材料。
本发明还提供一种纤连蛋白包覆的单宁酸/铁配合物的载药纳米材料在制备化疗/免疫联合治疗和MR成像一体化药物中的应用。
本发明通过一锅法合成疏水空腔内负载化疗药物阿霉素(DOX)的单宁酸铁(TAF)金属酚网络结构,得到单宁酸/铁配合物的载药复合物(DOX-TAF),并通过物理挤压和氢键作用在其表面包裹纤连蛋白(FN),得到纤连蛋白包覆的单宁酸/铁配合物的载药纳米材料(DOX-TAN@FN)。包裹含有RGD序列的纤连蛋白可以增加纳米平台的生物相容性,同时能够靶向整合素αvβ3过表达的肿瘤细胞,实现对肿瘤的精准靶向;单宁酸/铁配合物金属酚网络具有pH响应性,在肿瘤微环境酸性条件下,可以解离成游离的铁离子(Fe3+)和单宁酸单体,Fe3 +可以实施MR成像诊断,同时通过铁介导的芬顿(Fenton)反应,生成过量的脂质活性氧导致细胞膜损伤或细胞死亡,实施区别于其它程序性死亡的铁死亡治疗;DOX化疗能够引起肿瘤细胞的免疫原性死亡,同时细胞由于铁死亡产生的氧化应激反应也会引起免疫原性死亡,可达到铁死亡增强的免疫原性死亡的效果;利用PD-L1免疫检查点阻断法进一步增强对肿瘤的免疫治疗。由此用于肿瘤模型的T1 MR成像和靶向化疗/免疫联合治疗,实现对肿瘤模型的诊疗一体化。
本发明使用Zeta电势及动态光散射分析(DLS)、紫外可见光谱法(UV-vis)、电感耦合等离子体原子发射光谱法(ICP-OES)、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)等手段表征制备的DOX-TAN@FN的物理及化学性质。并通过核磁共振造影剂成像分析仪测定其T1成像性能,通过测定材料在不同pH溶液中的弛豫性能变化,评价其体外成像性能;通过材料在不同pH溶液中的药物释放量,测定其药物释放pH响应性能;然后利用CCK-8法评价DOX-TAN@FN的细胞毒性,利用流式细胞术检测细胞对材料的吞噬情况,利用活性氧检测试剂盒检测肿瘤细胞的活性氧产生能力,利用细胞凋亡试剂盒检测肿瘤细胞的凋亡效率。最后建立黑鼠皮下肿瘤模型进行MR成像以及抗肿瘤实验。具体测试结果如下:
1.Zeta电势及水动力学直径测试结果
取合成的TAF、DOX-TAF、DOX-TAF@FN各1mg,用超纯水稀释至50μg/mL,用于测定表面电势和水动力学直径。如表1所示,TAF的电势为-24.5mV,DOX-TAF的电势为-18.2mV,电势上升,粒径增加至190.1nm,证明了DOX的成功负载。通过物理挤压和氢键连接在DOX-TAF的表面包覆上纤连蛋白后,电势变为-25.5mV,水合粒径变为221.3nm,证明了DOX-TAF表面纤连蛋白的成功包覆。DOX-TAF@FN在水、PBS溶液和RPMI 1640培养基中的水动力学直径能够较长时间保持基本不变(图2),证明了材料DOX-TAF@FN具有良好的胶体稳定性。
2.紫外(UV-vis)测试:
本发明通过UV-vis测试对制备出的TAF、DOX-TAF、DOX-TAF@FN进行表征,如图3所示,曲线b和c中,在480nm处的吸收峰为DOX的特征峰,证明了DOX的成功负载。
3.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)测试:
利用BCA法测定FN溶液和DOX-TAF@FN中的蛋白含量,用生理盐水稀释材料及FN至浓度为1mg/mL的溶液。取5μL体积的相应蛋白Marker加入到第一条蛋白泳道,再取20μL的FN溶液、DOX-TAF@FN(200μg溶于1mL生理盐水)和DOX-TAF分别加入第二、第三、第四泳道,采用100A电流电泳,时间设置为50min。如图4所示,DOX-TAF组没有跑出蛋白条带,而DOX-TAF组与FN组跑出了相同的蛋白条带,证明了FN的成功包覆。
4.材料T1弛豫性能测试:
通过电感耦合等离子体发射光谱仪(ICP-OES)测试法测定DOX-TAF@FN中Fe元素的含量。为测定DOX-TAF@FN的pH响应性能和在酸性条件下的弛豫率,分别用不同pH(pH=5.5和7.4)的缓冲液将材料DOX-TAF@FN稀释成不同浓度梯度的溶液(Fe元素浓度分别为0.07、0.14、0.28、0.5、1.1mM),取2mL待测。利用核磁共振造影剂成像分析仪分别测定DOX-TAF@FN在不同pH条件下(pH=5.5、7.4)的T1弛豫时间,将弛豫时间的倒数与Fe浓度进行线性拟合作图,其斜率即为弛豫率r1(如图5)。在pH为5.5时,DOX-TAF@FN的r1为6.1mM-1s-1;在pH为7.4时,DOX-TAF@FN的r1为5.3mM-1s-1。综合上述结果进一步说明,以pH作为响应机制,DOX-TAF@FN具有良好的T1 MR成像性能,可作为MR T1造影剂使用。
5.体外药物释放测试:
利用磷酸氢二钠和磷酸二氢钠分别配制pH=7.4、pH=6.5、pH=5.5的缓冲溶液,将制备的DOX-TAF和DOX-TAF@FN分别用1mL上述两种不同pH的缓冲溶液溶解,配置为1mg/mL的溶液,再将其置于透析袋中,随后将透析袋置于含有9mL上述对应的pH缓冲溶液的50mL离心管中,置于37℃的恒温摇床中振荡。在不同的时间点(15min、30min、1h、2h、4h、8h、12h、24h和48h)吸取透析袋外液1mL加入不同的5mL离心管中,再向50mL离心管中补充相应pH的新鲜缓冲溶液,最后利用紫外测量5mL离心管中的溶液在480nm处的吸光值。缓释结束后,绘制DOX-TAF和DOX-TAF@FN在不同pH条件下的药物释放曲线,如图6中a所示,DOX-TAF在pH=5.5条件下的48小时药物释放率为34.85%,而在pH=7.4的条件下的48小时药物释放率为11.58%,说明DOX-TAF具有pH响应性能,且在酸性条件下更有利于药物的释放,而DOX-TAF@FN的药物释放率在相同条件下低于DOX-TAF,说明包覆蛋白后,材料的药物释放速率有所降低(图6中b)。
6.细胞毒性实验:
以B16细胞为细胞模型来评价单独DOX、DOX-TAF、DOX-TAF@FN的细胞毒性。将B16细胞按照1×104个细胞每孔的密度接种在3个96孔板的细胞培养板上,置于5%CO2、37℃培养箱中孵育12小时。然后将培养基换成含有一定浓度的单独DOX、TAF、DOX-TAF、DOX-TAF@FN(DOX的浓度均设置为0μg/mL、1.4μg/mL、2.8μg/mL、5.6μg/mL、11.2μg/mL和22.4μg/mL)的培养基与细胞在5%CO2、37℃培养箱共培养24h,随后加入含10%(v/v)CCK-8(10μL)的无血清RPMI 1640培养基(100μL/孔)溶液,在培养箱中继续培养2-4h。最后用多功能酶标仪于波长为450nm处测定每孔的吸光度,以PBS处理的细胞作为空白对照,细胞活力标记为100%。结果如图7所示,在实验浓度范围内,随着DOX浓度增加,各组材料的细胞毒性逐渐增强。由于FN具有靶向能力,能够增加细胞对材料的摄取,所以在相同DOX浓度下,DOX-TAF@FN比DOX-TAF表现出更强的细胞毒性。通过表2可知,DOX、DOX-TAF、DOX-TAF@FN与B16细胞共孵育24h后的DOX半数抑制浓度(IC50)分别为0.43μg/mL、12.85μg/mL、7.12μg/mL,证明在相同实验操作条件下,除单独DOX外,DOX-TAF@FN对B16细胞具有比DOX-TAF更强的杀伤力。
7.靶向能力测试:
以B16细胞为细胞模型来评价DOX-TAF@FN的靶向能力。分别将B16细胞按照15×104个细胞每孔的密度接种在12孔板的细胞培养板上,置于5%CO2、37℃培养箱中孵育12h。随后,将培养基换成具有一定浓度的DOX-TAF、DOX-TAF@BSA、DOX-TAF@FN([Fe]=20μg/mL)的培养基与细胞在5%CO2、37℃条件下共孵育,并在不同时间点(0、1、2、4、8和12h)收集孔板中的细胞,用1mL王水消化4h。最后,通过ICP-OES测定B16细胞中Fe元素的含量,以PBS处理的细胞作为空白对照(设定Fe元素含量为0pg/cell)。从图8中a可以看出,在同一Fe浓度的条件下,随着时间的推移,B16细胞对材料的吞噬量逐渐增高,其中B16细胞对DOX-TAF@FN吞噬量明显高于DOX-TAF、DOX-TAF@BSA,其中DOX-TAF@BSA为包覆牛血清白蛋白(BSA)的对照组。从图8中b可以看出,在相同时间点,随着Fe浓度的升高,B16细胞对材料的吞噬量逐渐增高,其中B16细胞对DOX-TAF@FN的吞噬量最高;说明FN能够靶向整合素αvβ3高表达的B16细胞,增加B16细胞对DOX-TAF@FN的吞噬。
8.细胞吞噬实验:
以B16细胞为细胞模型来评价细胞对DOX-TAF、DOX-TAF@BSA、DOX-TAF@FN的吞噬能力。将B16细胞按照2×105个细胞每孔的密度接种在6孔板的细胞培养板上,置于5%CO2、37℃培养箱中孵育12h。然后将培养基换成含有DOX-TAF、DOX-TAF@BSA、DOX-TAF@FN(DOX的浓度均设置为1.0μg/mL、2.0μg/mL和5.0μg/mL)的培养基与细胞在5%CO2、37℃条件下共培养6h。随后将各个孔板中的细胞胰酶消化、离心收集,用流式细胞仪检测细胞的荧光强度。由图9中a和b可以看出,各组细胞的荧光强度均随着DOX的浓度升高而增强。在相同浓度时,DOX-TAF@FN组的细胞荧光强度明显高于DOX-TAF和DOX-TAF@BSA组,说明FN独特的RGD序列能够靶向αvβ3整合素高表达的B16细胞,增强细胞对材料的吞噬,而牛血清白蛋白却没有此特性。
9.体外活性氧(ROS)的检测
为了检测B16细胞经处理后产生ROS的能力,将B16细胞按照2×105个细胞每孔的密度接种在6孔细胞培养板,置于5%CO2、37℃培养箱中孵育12h。然后将培养基换成含有PBS、DOX、TAF、DOX-TAF、DOX-TAF@FN(含Fe组中Fe浓度均为30μg/mL)的培养基与细胞在5%CO2、37℃条件下共培养6h。随后将培养液倒掉,将细胞用无菌的PBS洗三次,随后将各个孔板中的细胞胰酶消化、离心收集,加入ROS探针DCFH-DA染色,37℃孵育20-30min,用流式细胞仪检测细胞的荧光强度。从图10中可以看出,含铁的材料组均有相对较高的荧光强度,说明铁离子在过氧化氢(H2O2)高表达的B16细胞中与H2O2发生芬顿反应产生了较高水平的ROS,其中DOX-TAF@FN组的荧光强度最高,说明该组细胞吞噬铁的能力最高,从而使ROS达到最高水平,而加入螯合剂去铁胺(DFO)后,细胞内ROS水平明显下降,证明ROS主要通过铁离子介导的芬顿反应而产生。
10.体外免疫原性验证
将B16细胞按照2×105个细胞每孔的密度接种至Transwell孔板的上室中,置于5%CO2、37℃培养箱中孵育12h。然后将培养基换成含有PBS、DOX、TAF、DOX-TAF@BSA、DOX-TAF@FN(含DOX组DOX浓度均为5μg/mL)的培养基与细胞在5%CO2、37℃条件下共培养24h。将培养液倒掉,将细胞用无菌的PBS洗三次,再加入新鲜培养基。随后将上室细胞与以2×105个DC每孔的密度接种的下室细胞共孵育24h。然后将DC用胰酶消化,离心收集,加入无菌的PBS重悬细胞,再加入CD80、CD86抗体及对应的同型对照标记,并设置空白对照,在4℃条件下避光孵育20-30min。随后用无菌的PBS离心洗涤三次,除去过量未结合的抗体。将DC重悬于300μL的PBS中并转移到流式管中,通过流式细胞仪分别检测CD80、CD86的荧光强度。从图11中a和b中可以看出,DOX-TAF@FN组的CD80、CD86的荧光强度最高,即DC的熟化程度最高,说明其诱导免疫原性效果最佳。
为了进一步验证经材料处理的B16细胞免疫原性死亡的机制,将B16细胞按照2×105个细胞每孔的密度接种在6孔细胞培养板,置于5%CO2、37℃培养箱中孵育12h。然后将培养基换成含有PBS、DOX、TAF、DOX-TAF@BSA、DOX-TAF@FN(含DOX组DOX浓度均为5μg/mL)的培养基与细胞在5%CO2、37℃条件下共培养24h。随后将培养液倒掉,将细胞用无菌的PBS洗三次,随后将各个孔板中的细胞胰酶消化、离心收集,通过蛋白免疫印迹法(WB)分析B16细胞中CRT的表达情况,以及酶联免疫吸附剂测定法(ELISA)检测HMGB-1的表达量。通过图12中a和b均可以看出,铁死亡及化疗均能引起B16细胞的免疫原性死亡,导致CRT外翻高表达,同时HMGB-1表达也增加。其中,DOX-TAF@FN组的蛋白表达量最高,说明其导致的免疫原性死亡的程度最高。
11.组织分布
为研究纳米材料在生物体内各器官和组织的分布及代谢情况,将制备的两组纳米材料(DOX-TAF@BSA、DOX-TAF@FN)配置成Fe浓度为50μg/mL的PBS溶液。将2×106个B16细胞接种到黑鼠的大腿内侧,待肿瘤体积达到200mm3左右时,通过小鼠尾静脉注射各组材料(200μL)。经过不同时间点(1、2、8、12、24和48h)处死荷瘤鼠并解剖,以尾静脉注射PBS(200μL)的荷瘤鼠作为空白对照,取出心、肝、脾、肺、肾称重,剪成2×2mm的碎块,然后用王水消化3-5天。同时,在不同时间点(15min、30min、1h、1.5h、2h、4h、12h和24h)处死荷瘤鼠并解剖,以尾静脉注射PBS(200μL)的荷瘤鼠作为空白对照,取出肿瘤称重,剪成2×2mm的碎块,然后用王水消化3-5天。最后,通过ICP-OES测定各个样品中铁元素的含量,计算出各个器官和肿瘤中铁元素的含量(图13)。从图13中a-c中可以看出,在尾静脉注射完各组材料24小时之后,各器官(心、肝、脾、肺、肾)的铁元素含量恢复到了注射前,这些结果证明了制备的材料(DOX-TAF@BSA、DOX-TAF@FN)能够在小鼠体内正常代谢清除。从图13中c可以看出,在尾静脉注射完各组材料(DOX-TAF@BSA、DOX-TAF@FN)30min后,肿瘤部位的相对Fe含量明显增加,2h左右达到峰值,可能是肿瘤内高通透性和滞留效应引起的材料滞留;而4h后,相对Fe含量开始下降,可能是材料解离后经血液循环代谢输送至小鼠其他器官和组织。
12.MR成像
将材料DOX-TAF@BSA、DOX-TAF@FN配置成Fe浓度为50μg/mL的生理盐水溶液。将2×106个B16细胞接种到白鼠的大腿内侧,待肿瘤体积达到200mm3左右时,通过小鼠尾静脉注射各组材料(200μL)。由于材料在2h的时间点处在肿瘤部位的富集最高值,所以通过核磁共振成像仪扫描荷瘤鼠在注射材料前和注射后2h的肿瘤部位进行MR成像,评价其T1双模态MR造影效果(如图14)。注射2h后,DOX-TAF@BSA和DOX-TAF@FN两组的肿瘤部位变亮,但DOX-TAF@FN组比DOX-TAF@BSA组的肿瘤部位更亮,这是由于FN的靶向功能,使得其在肿瘤部位聚集和滞留效果更优,说明DOX-TAF@FN纳米材料在体内具有良好的MR成像性能。
13.肿瘤治疗结果
将2×106个B16细胞接种到白鼠的大腿内侧,待肿瘤体积达到200mm3左右时,将小鼠随机分为5组(每组5只),分组情况如下:对照组(PBS,100μL);DOX([DOX]=5mg/kg,100μL);TAF([Fe]=50μg/mL,100μL);DOX-TAF@BSA([DOX]=5mg/kg,100μL);DOX-TAF@FN([DOX]=5mg/kg,100μL);DOX-TAF@FN+anti-PD-L1([DOX]=5mg/kg,100μL;[PD-L1]=2mg/mL,100μL),通过尾静脉将各组材料注射至老鼠体内。开始治疗的当天记为第0天,每4天治疗一次,每隔2天记录老鼠体重和肿瘤尺寸。从图15中a可以看出,相对于PBS组,单独DOX、TAF、DOX-TAF@FN和DOX-TAF@FN+anti-PD-L1组均表现出一定程度的抗肿瘤效果。在相同条件下,相比于DOX-TAF@BSA组,DOX-TAF@FN组抗肿瘤效果更好,可能是由于DOX-TAF@FN具有靶向特异性,能够通过主动靶向更有效地到达肿瘤内部。同时,DOX-TAF@FN+anti-PD-L1组抗肿瘤效果优于DOX-TAF@FN组,这是由于PD-L1抗体有增强免疫治疗的效果。从图15中b可以看出,单独DOX处理组的黑鼠体重明显下降,其余各组老鼠的体重变化不明显,说明DOX可能会对老鼠的身体产生一定的毒副作用。
有益效果
(1)本发明简单,产物易于纯化,成本低廉。制备的纳米材料分布均匀,具有良好的水溶性、生物相容性和安全性。
(2)本发明制备得到的纤连蛋白包覆的单宁酸/铁配合物的载药纳米材料在体外表现出良好的pH响应性能。在肿瘤微环境(弱酸性,pH约为5.5)下,金属酚网络结构解离,分解成单宁酸单体和游离的铁离子,同时释放化疗药物,实现化疗和化学动力学联合治疗的效果。
(3)本发明制备得到的纳米材料通过尾静脉注射进入小鼠体内后,不仅可以实现T1 MR成像,同时通过化疗以及铁死亡引起的免疫原性死亡还可以起到抗肿瘤免疫的效果,具有潜在的临床应用价值。
附图说明
图1为本发明中纳米材料DOX-TAF@FN的合成和应用示意图;
图2为本发明制备的DOX-TAF@FN在水溶液中、PBS溶液中以及RPMI 1640培养基中的水动力学直径随时间变化的曲线图;
图3为本发明制备的TAF、DOX-TAF、DOX-TAF@FN的紫外吸收光谱图;
图4为本发明制备的DOX-TAF、DOX-TAF@FN的SDS-PAGE电泳图,FN为阳性对照组;
图5为本发明制备的DOX-TAF@FN在不同pH条件下的T1弛豫率;
图6为本发明制备的DOX-TAF(a)和DOX-TAF@FN(b)在不同pH条件下的药物释放曲线图;
图7为本发明中DOX、DOX-TAF和DOX-TAF@FN与B16细胞共孵育24h后的细胞活力图;
图8为本发明中DOX、DOX-TAF@BSA和DOX-TAF@FN与B16细胞孵育在(a)不同时间下和(b)不同铁浓度下的Fe元素含量分析图;
图9为本发明中DOX-TAF、DOX-TAF@BSA和DOX-TAF@FN与B16细胞共孵育6h后的流式细胞定量分析柱状图;
图10为本发明中DOX、TAF、DOX-TAF@BSA、DOX-TAF@FN和DOX-TAF@FN+DFO与B16细胞共孵育6h后的细胞内ROS水平分析图;
图11为本发明中DOX、TAF、DOX-TAF@BSA和DOX-TAF@FN与B16细胞以及DC共孵育后树突细胞的CD80、CD86的(a)流式细胞表达分析图和(b)定量分析柱状图;
图12为本发明中B16细胞经DOX、TAF、DOX-TAF@BSA和DOX-TAF@FN处理后(a)CRT蛋白表达WB结果分析图和(b)HMGB-1蛋白表达分析图;
图13为本发明中DOX-TAF@BSA(a)和DOX-TAF@FN(b)经尾静脉注射不同时间点后在小鼠体内各器官及肿瘤部位(c)的分布情况;
图14为本发明中DOX-TAF@BSA(a)和DOX-TAF@FN(b)经尾静脉注射前和注射后小鼠肿瘤的T1 MR成像图,(c)为相应肿瘤部位的MR信噪比变化图;
图15为本发明中小鼠经尾静脉注射PBS、DOX、TAF、DOX-TAF@BSA、DOX-TAF@FN和DOX-TAF@FN+PD-L1后,12天内肿瘤的体积变化(a)和小鼠体重变化(b)图。
具体实施方式
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解,在阅读了本发明讲授的内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
除非特殊说明,否则所有化学试剂都是可商购的,无需进一步纯化即可直接使用。阿霉素(DOX)购自北京华丰药业有限公司(中国北京)。TA与FeCl3购自百灵威科技有限公司(中国上海)。纤连蛋白(FN)购自上海纤连生物技术有限公司(中国上海)。牛血清白蛋白(BSA)购自上海麦克林生化科技有限公司(中国上海)。SDS样品缓冲液和SDS-聚丙烯酰胺凝胶购自Tanon Science&Technology Co.,Ltd.(中国上海)。Avanti挤出机购自AvantiPolar Lipids,Inc.(美国阿拉巴马州)。B16细胞(鼠类黑色素瘤细胞系)来自中国科学院生物化学与细胞生物学研究所。RPMI-1640培养基、胎牛血清、青霉素-链霉素双抗和胰蛋白酶购自杭州吉诺生物医学技术有限公司(中国杭州)。Cell Counting Kit-8(CCK-8)购自上海七海生物科技有限公司(中国上海)。GSH与GSSH检测试剂盒、ROS检测试剂盒购自上海碧云天生物公司(中国上海)。黑鼠购自上海斯莱克实验动物中心(中国上海)。所有实验中使用的电阻率高于18.2MΩ.cm的水均通过实验室水净化系统(Cascada I,PALL,中国北京)进行净化。
实施例1
(1)称取3.48mg盐酸阿霉素将其溶解于甲醇(1mL)中,加入三乙胺去质子化,其中盐酸阿霉素与三乙胺的摩尔比为1:1,经过充分反应4h以后,得到疏水性阿霉素(DOX);DOX的甲醇溶液与溶于无水乙醇的单宁酸(TA)(0.2mg/mL)混合搅拌,边搅拌边加入三氯化铁(FeCl3)水溶液(0.5mg/mL),以上混合溶液搅拌12h过夜,将甲醇和乙醇挥发除尽,以13000rpm转速4℃离心30min,得到负载阿霉素的单宁酸/铁配合物的载药纳米材料(DOX-TAF),其中TA/FeCl3/DOX的摩尔比例为1:1:2。
(2)负载阿霉素的单宁酸/铁配合物的载药纳米材料(DOX-TAF)(1mg)溶于超纯水(1.5mL)中,加入纤连蛋白溶液(0.1mg/mL,5mL超纯水)混合,磁力搅拌12h,利用Avanti微型挤出机将溶液挤出11次,离心(13000rpm,20-30min),弃上清,干燥12~24h,得到纤连蛋白包覆的单宁酸/铁配合物的载药纳米材料(DOX-TAF@FN)。
实施例2
取对比例1中合成的TAF以及实施例1中合成的DOX-TAF、DOX-TAF@FN各1mg,用超纯水将各组材料稀释至50μg/mL,用于测定表面电势和水动力学直径。如表1所示,TAF的电势为-24.5mV,DOX-TAF的电势为-18.2mV,电势上升,粒径增加至190.1nm,证明了DOX的成功负载。通过物理挤压在DOX-TAF的表面包覆牛血清白蛋白后,电势降为-29.2mV,水合粒径变为232.2nm;而以氢键连接包覆上纤连蛋白后,电势变为-25.5mV,水合粒径变为221.3nm,证明了DOX-TAF表面纤连蛋白的成功包覆。DOX-TAF@FN在水、PBS溶液和RPMI 1640培养基中的水动力学直径能够较长时间保持基本不变(图2),证明了材料DOX-TAF@FN具有良好的胶体稳定性。
表1
样品 | 表面电势(mV) | 水动力学直径(nm) | 多分散性指数(PDI) |
TAF | -24.5±1.00 | 136.7±2.517 | 0.236±0.061 |
DOX-TAF | -18.2±1.00 | 190.1±2.328 | 0.454±0.023 |
DOX-TAF@BSA | -29.2±1.26 | 232.2±3.114 | 0.396±0.048 |
DOX-TAF@FN | -25.5±0.55 | 221.3±2.943 | 0.408±0.034 |
实施例3
取实施例1中制备的TAF、DOX-TAF、DOX-TAF@FN进行紫外表征,如图3所示,曲线b和c中,在480nm处的吸收峰为DOX的特征峰,证明了DOX的成功负载。
实施例4
取实施例1中制备的DOX-TAF、DOX-TAF@FN进行SDS-PAGE表征,如图4所示,用BCA蛋白定量试剂盒对实施例1中DOX-TAF@FN的FN含量进行测定。取5μL体积的相应蛋白Marker加入到第一条蛋白泳道,再取20μL的FN溶液、DOX-TAF@FN(200μg溶于1mL生理盐水)和DOX-TAF分别加入第二、第三、第四泳道,采用100A电流电泳,时间设置为50min。如图4所示,DOX-TAF组没有跑出蛋白条带,而DOX-TAF组与FN组跑出了相同的蛋白条带,证明了FN的成功包覆。
实施例5
通过ICP-OES测定DOX-TAF@FN中Fe元素的含量。为了确定DOX-TAF@FN在肿瘤微环境中是否具有pH响应性能,分别用不同pH(pH=5.5和7.4)的缓冲液将材料DOX-TAF@FN稀释成不同浓度梯度的溶液(Fe元素浓度分别为0.07、0.14、0.28、0.5、1.1mM),取2mL待测。利用核磁共振造影剂成像分析仪分别测定DOX-TAF@FN在不同pH条件下(pH=5.5、7.4)的T1弛豫时间,将弛豫时间的倒数与Fe浓度进行线性拟合作图,其斜率即为弛豫率r1(如图5)。在pH为5.5时,DOX-TAF@FN的r1为6.1mM-1s-1;在pH为7.4时,DOX-TAF@FN的r1为5.3mM-1s-1。综合上述结果进一步说明,DOX-TAF@FN在弱酸性条件下具有良好的T1 MR成像性能,可作为MR T1造影剂使用。
实施例6
利用磷酸氢二钠和磷酸二氢钠分别配制pH=7.4、pH=6.5、pH=5.5的缓冲溶液,将制备的DOX-TAF和DOX-TAF@FN分别用1mL上述两种不同pH的缓冲溶液溶解,配置为1mg/mL的溶液,再将其置于透析袋中,随后将透析袋置于含有9mL上述对应的pH缓冲溶液中,置于37℃的恒温摇床中振荡。在不同的时间点(15min、30min、1h、2h、4h、8h、12h、24h和48h)吸取透析袋外液1mL,再补充1mL相应pH的新鲜缓冲溶液,最后利用紫外测量1mL透析袋外液在480nm处的吸光值。缓释结束后,绘制DOX-TAF和DOX-TAF@FN在不同pH条件下的药物释放曲线,如图6中a所示,DOX-TAF在pH=5.5条件下的48小时药物释放率为34.85%,而在pH=7.4的条件下的48小时药物释放率为11.58%,说明DOX-TAF具有良好的pH响应性能,在酸性条件下更有利于药物的释放,而DOX-TAF@FN的药物释放率在相同条件下低于DOX-TAF,说明包覆蛋白后,材料的药物释放速率有所降低(图6中b)。
实施例7
以B16细胞为细胞模型来评价自由DOX、DOX-TAF和DOX-TAF@FN的细胞毒性。将B16细胞按照每孔1×104个细胞的密度接种在3个96孔板的细胞培养板上,置于5%CO2、37℃条件下孵育12小时。然后将培养基换成含有单独DOX、DOX-TAF和DOX-TAF@FN(DOX的浓度均设置为0μg/mL、1.4μg/mL、2.8μg/mL、5.6μg/mL、11.2μg/mL和22.4μg/mL)的培养基与细胞在5%CO2、37℃条件下共培养24h。随后加入含10%(v/v)CCK-8(10μL)的无血清RPMI 1640培养基(100μL/孔)溶液,在培养箱中继续培养2-4h。最后用多功能酶标仪于波长为450nm处测定每孔的吸光度,以PBS处理的细胞作为空白对照,细胞活力标记为100%。结果如图7所示,在实验浓度范围内,随着DOX浓度增加,各组材料的细胞毒性逐渐增强。由于FN具有靶向能力,能够增加细胞对材料的摄取,所以在相同DOX浓度下,DOX-TAF@FN比DOX-TAF表现出更强的细胞毒性。通过表2可知,DOX、DOX-TAF、DOX-TAF@FN与B16细胞共孵育24h后的DOX半数抑制浓度(IC50)分别为0.43μg/mL、12.85μg/mL、7.12μg/mL,证明在相同实验操作条件下,除单独DOX外,DOX-TAF@FN对B16细胞具有比DOX-TAF更强的杀伤力。
表2
样品 | IC<sub>50</sub>(μg/mL) |
Free DOX | 0.43 |
DOX-TAF | 12.85 |
DOX-TAF@FN | 7.12 |
实施例8
以B16细胞为细胞模型来测定细胞对DOX-TAF、DOX-TAF@BSA、DOX-TAF@FN中铁元素的吞噬能力。分别将B16细胞按照15×104个细胞每孔的密度接种在12孔板的细胞培养板上,置于5%CO2、37℃培养箱中孵育12h。随后,将培养基换成具有一定浓度的DOX-TAF、DOX-TAF@BSA、DOX-TAF@FN([Fe]=20μg/mL)的培养基与细胞在5%CO2、37℃条件下共孵育,并在不同时间点(0、1、2、4、8和12h)收集孔板中的细胞,用1mL王水消化4h。最后,通过ICP-OES测定B16细胞中Fe元素的含量,以PBS处理的细胞作为空白对照。从图8中a可以看出,在同一Fe浓度的条件下,随着时间的推移,B16细胞对材料的吞噬量逐渐增高,其中B16细胞对DOX-TAF@FN吞噬量明显高于DOX-TAF、DOX-TAF@BSA,其中DOX-TAF@BSA为包覆牛血清白蛋白(BSA)的对照组。从图8中b可以看出,在相同时间点,随着Fe浓度的升高,B16细胞对材料的吞噬量逐渐增高,其中B16细胞对DOX-TAF@FN的吞噬量最高;说明FN能够靶向整合素αvβ3高表达的B16细胞,实现B16细胞对DOX-TAF@FN的特异性吞噬。
实施例9
以B16细胞为细胞模型进一步通过流式细胞仪测定细胞对DOX-TAF、DOX-TAF@BSA和DOX-TAF@FN的吞噬能力。将B16细胞按照2×105个细胞每孔的密度接种在6孔板的细胞培养板上,置于5%CO2、37℃培养箱中孵育12h。然后将培养基换成含有DOX-TAF、DOX-TAF@BSA、DOX-TAF@FN(DOX的浓度均设置为1.0μg/mL、2.0μg/mL和5.0μg/mL)的培养基与细胞在5%CO2、37℃条件下共培养6h。随后将各个孔板中的细胞胰酶消化、离心收集,用流式细胞仪检测细胞的荧光强度。由图9中a和b可以看出,各组细胞的荧光强度均随着DOX的浓度升高而增强。在相同浓度时,DOX-TAF@FN组的细胞荧光强度明显高于DOX-TAF和DOX-TAF@BSA组,说明FN独特的RGD序列能够靶向αvβ3整合素高表达的B16细胞,增强细胞对材料的吞噬,而牛血清白蛋白却没有此特性。
实施例10
为了检测B16细胞经处理后产生ROS的能力,将B16细胞按照2×105个细胞每孔的密度接种在6孔细胞培养板,置于5%CO2、37℃培养箱中孵育12h。然后将培养基换成含有PBS、DOX、TAF、DOX-TAF、DOX-TAF@FN(含Fe组中Fe浓度均为30μg/mL)的培养基与细胞在5%CO2、37℃条件下共培养6h。随后将培养液倒掉,将细胞用无菌的PBS洗三次,随后将各个孔板中的细胞胰酶消化、离心收集,加入ROS探针DCFH-DA染色,37℃避光孵育20-30min,用流式细胞仪检测细胞的荧光强度。从图10中可以看出,含铁的材料组均有相对较高的荧光强度,说明铁离子在过氧化氢(H2O2)高表达的B16细胞中与H2O2发生芬顿反应产生了较高水平的ROS,其中DOX-TAF@FN组的荧光强度最高,说明该组细胞吞噬铁的能力最高,从而使ROS达到最高水平,而加入螯合剂去铁胺(DFO)后,细胞内ROS水平明显下降,证明ROS主要通过铁离子介导的芬顿反应而产生。
实施例11
将B16细胞按照2×105个细胞每孔的密度接种至Transwell孔板的上室中,置于5%CO2、37℃培养箱中孵育12h。然后将培养基换成含有PBS、DOX、TAF、DOX-TAF@BSA、DOX-TAF@FN(含DOX组DOX浓度均为5μg/mL)的培养基与细胞在5%CO2、37℃条件下共培养24h。将培养液倒掉,将细胞用无菌的PBS洗三次,再加入新鲜培养基。随后将上室细胞与以2×105个DC每孔的密度接种的下室细胞共孵育24h。然后将DC用胰酶消化,离心收集,加入无菌的PBS重悬细胞,再加入CD80、CD86抗体及对应的同型对照标记,并设置空白对照,在4℃条件下避光孵育20-30min。随后用无菌的PBS离心洗涤三次,除去过量未结合的抗体。将DC重悬于300μL的PBS中并转移到流式管中,通过流式细胞仪分别检测CD80、CD86的荧光强度。从图11中a和b中可以看出,DOX-TAF@FN组的CD80、CD86的荧光强度最高,即DC的熟化程度最高,说明其诱导免疫原性效果最佳。
为了进一步验证经材料处理的B16细胞免疫原性死亡的机制,将B16细胞按照2×105个细胞每孔的密度接种在6孔细胞培养板,置于5%CO2、37℃培养箱中孵育12h。然后将培养基换成含有PBS、DOX、TAF、DOX-TAF@BSA、DOX-TAF@FN(含DOX组DOX浓度均为5μg/mL)的培养基与细胞在5%CO2、37℃条件下共培养24h。随后将培养液倒掉,将细胞用无菌的PBS洗三次,随后将各个孔板中的细胞胰酶消化、离心收集,通过蛋白免疫印迹法(WB)分析B16细胞中CRT的表达情况,以及酶联免疫吸附剂测定法(ELISA)检测HMGB-1的表达量。通过图12中a和b均可以看出,铁死亡及化疗均能引起B16细胞的免疫原性死亡,导致CRT外翻高表达,同时HMGB-1表达也增加。其中,DOX-TAF@FN组的蛋白表达量最高,说明其导致的免疫原性死亡的程度最高。
实施例12
将制备的两组纳米材料(DOX-TAF@BSA、DOX-TAF@FN)配置成Fe浓度为50μg/mL的PBS溶液。将2×106个B16细胞接种到黑鼠的大腿内侧,待肿瘤体积达到200mm3左右时,通过小鼠尾静脉注射(200μL)各组材料。经过不同时间点(1、2、8、12、24和48h)处死荷瘤鼠并解剖,以尾静脉注射PBS(200μL)的荷瘤鼠作为空白对照,取出心、肝、脾、肺、肾称重,剪成2×2mm的碎块,然后用王水消化3-5天。同时,在不同时间点(15min、30min、1h、1.5h、2h、4h、12h和24h)处死荷瘤鼠并解剖,以尾静脉注射PBS(200μL)的荷瘤鼠作为空白对照,取出肿瘤称重,剪成2×2mm的碎块,然后用王水消化3-5天。最后,通过ICP-OES测定各个样品中铁元素的含量,计算出各个器官和肿瘤中铁元素的含量(图13)。从图13中a-c中可以看出,在尾静脉注射完各组材料24小时之后,各器官(心、肝、脾、肺、肾)的铁元素含量恢复到了注射前,这些结果证明了制备的材料(DOX-TAF@BSA、DOX-TAF@FN)能够在小鼠体内正常代谢清除。从图13中c可以看出,在尾静脉注射完各组材料(DOX-TAF@BSA、DOX-TAF@FN)30min后,肿瘤部位的相对Fe含量明显增加,2h左右达到峰值,可能是肿瘤内高通透性和滞留效应引起的材料滞留;而4h后,相对Fe含量开始下降,可能是材料解离后经血液循环代谢输送至小鼠其他器官和组织。
实施例13
将材料DOX-TAF@BSA、DOX-TAF@FN配置成Fe浓度为50μg/mL的生理盐水溶液。将2×106个B16细胞接种到黑鼠的大腿内侧,待肿瘤体积达到200mm3左右时,通过小鼠尾静脉注射各组材料(200μL)。由于材料在2h的时间点处在肿瘤部位的富集最高值,所以通过核磁共振成像仪扫描荷瘤鼠在注射材料前和注射后2h的肿瘤部位进行MR成像,评价其T1双模态MR造影效果(如图14)。注射2h后,DOX-TAF@BSA和DOX-TAF@FN两组的肿瘤部位变亮,但DOX-TAF@FN组比DOX-TAF@BSA组的肿瘤部位更亮,这是由于FN的靶向功能,使得其在肿瘤部位聚集和滞留效果更优,说明DOX-TAF@FN纳米材料在体内具有良好的MR成像性能。
实施例14
以实施例12构建的B16黑鼠肿瘤模型,将小鼠随机分为5组(每组5只),分组情况如下:对照组(PBS,100μL)、DOX([DOX]=5mg/kg,100μL)、TAF([Fe]=50μg/mL,100μL)、DOX-TAF@BSA([DOX]=5mg/kg,100μL)、DOX-TAF@FN([DOX]=5mg/kg,100μL)、DOX-TAF@FN+anti-PD-L1([DOX]=5mg/kg,100μL;[PD-L1]=2mg/mL,100μL),通过尾静脉将各组材料注射至老鼠体内。开始治疗的当天记为第0天,每4天治疗一次,每隔2天记录老鼠体重和肿瘤尺寸。从图15中a可以看出,相对于PBS组,单独DOX、TAF、DOX-TAF@FN和DOX-TAF@FN+anti-PD-L1组均表现出一定程度的抗肿瘤效果。在相同条件下,相比于DOX-TAF@BSA组,DOX-TAF@FN组抗肿瘤效果更好,可能是由于DOX-TAF@FN具有靶向特异性,能够通过主动靶向更有效地到达肿瘤内部。同时,DOX-TAF@FN+anti-PD-L1组抗肿瘤效果优于DOX-TAF@FN组,这是由于PD-L1抗体通过免疫检查点阻断增强T细胞的肿瘤免疫治疗。从图15中b可以看出,单独DOX处理组的黑鼠体重明显下降,其余各组小鼠的体重变化不明显,说明自由DOX具有一定的毒副作用。
对比例1
将无水乙醇的单宁酸(TA)溶液(0.2mg/mL)与三氯化铁(FeCl3)水溶液(0.5mg/mL)混合搅拌12h过夜,离心(13000rpm,20-30min),弃上清,干燥12~24h,得到单宁酸/铁配合物纳米材料TAF,其中TA/FeCl3的摩尔比例为1:1。
称取3.48mg盐酸阿霉素将其溶解于甲醇(1mL)中,加入三乙胺去质子化,其中盐酸阿霉素与三乙胺的摩尔比为1:1,经过充分反应4h以后,得到疏水性阿霉素(DOX);DOX的甲醇溶液与溶于无水乙醇的单宁酸(TA)(0.2mg/mL)混合搅拌,边搅拌边加入三氯化铁(FeCl3)水溶液(0.5mg/mL),以上混合溶液搅拌12h过夜,将甲醇和乙醇挥发除尽,以13000rpm转速4℃离心30min,得到负载阿霉素的单宁酸/铁配合物的载药纳米材料(DOX-TAF),其中TA/FeCl3/DOX的摩尔比例为1:1:2。将负载阿霉素的单宁酸/铁配合物的载药纳米材料(DOX-TAF)(1mg)溶于超纯水(1.5mL)中,加入牛血清白蛋白(BSA)溶液(0.1mg/mL,5mL超纯水)混合,磁力搅拌12h,利用Avanti微型挤出机将溶液挤出11次,离心(13000rpm,20-30min),弃上清,干燥12~24h,得到BSA包覆的单宁酸/铁配合物的载药纳米材料DOX-TAF@BSA。
Claims (9)
1.一种纤连蛋白包覆的单宁酸/铁配合物的载药纳米材料,其特征在于,将疏水性阿霉素与单宁酸溶液混合,搅拌下加入铁盐反应,将得到的负载阿霉素的单宁酸/铁配合物的载药纳米材料与纤连蛋白溶液混合搅拌,通过挤压获得。
2.根据权利要求1所述的载药纳米材料,其特征在于,所述铁盐为FeCl3。
3.一种纤连蛋白包覆的单宁酸/铁配合物的载药纳米材料的制备方法,包括:
(1)将盐酸阿霉素溶解于溶剂中,加入三乙胺去质子化,得到疏水性阿霉素DOX溶液;
(2)将步骤(1)中DOX溶液与单宁酸TA溶液混合,搅拌下加入铁盐反应,离心,得到负载阿霉素的单宁酸/铁配合物的载药纳米材料DOX-TAF;
(3)将步骤(2)中DOX-TAF溶于超纯水中,加入纤连蛋白FN溶液,搅拌,挤压,离心,真空干燥,得到纤连蛋白包覆的单宁酸/铁配合物的载药纳米材料。
4.根据权利要求3所述的制备方法,其特征在于,所述步骤(1)中盐酸阿霉素与三乙胺的摩尔比为1:1~3;溶剂为甲醇;去质子化时间为2~4h。
5.根据权利要求3所述的制备方法,其特征在于,所述步骤(2)中单宁酸TA溶液的溶剂为无水乙醇;TA、铁盐和DOX的质量比为5.14~7.12:0.45~1:2.5~3.5。
6.根据权利要求3所述的制备方法,其特征在于,所述步骤(2)中反应为:室温搅拌12~24h。
7.根据权利要求3所述的制备方法,其特征在于,所述步骤(3)中DOX-TAF和纤连蛋白FN的质量比为1:0.5~1;纤连蛋白FN溶液浓度为0.5~2.5mg/mL。
8.根据权利要求3所述的制备方法,其特征在于,所述步骤(3)中搅拌温度为室温,搅拌时间为12~24h。
9.一种如权利要求1所述的载药纳米材料在制备化疗/免疫联合治疗和MR成像一体化药物中的应用。
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