CN113332454B - 一种负载超小四氧化三铁的聚乙烯亚胺纳米凝胶/siRNA复合物 - Google Patents

一种负载超小四氧化三铁的聚乙烯亚胺纳米凝胶/siRNA复合物 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种负载超小四氧化三铁的聚乙烯亚胺纳米凝胶/siRNA复合物，所述复合物为：负载超小四氧化三铁的低分子量聚乙烯亚胺Fe3O4/PEI‑PEG复合纳米凝胶与TGF‑βsiRNA复合形成负载超小四氧化三铁的低分子量聚乙烯亚胺纳米凝胶/siRNA复合物。该方法制备过程简单，反应条件温和，易于操作；制备得到的纳米凝胶具有良好的生物相容性、单分散性、胶体稳定性、优良的基因传递效率和MR成像功能，可用于肿瘤的基因治疗，在诊疗一体化领域具有潜在的应用价值。

Description

一种负载超小四氧化三铁的聚乙烯亚胺纳米凝胶/siRNA复 合物
技术领域
本发明属于诊疗一体化功能纳米材料领域，特别涉及一种负载超小四氧化三铁的聚乙烯亚胺纳米凝胶/siRNA复合物。
背景技术
癌症的快速生长与转移是肿瘤患者高致死率的根本原因。然而，根治癌症的扩散依然是当前生物医学领域的重大挑战。对癌症的发展进行实时监控同时抑制其生长与转移是治疗恶性肿瘤的新策略。而随着基因组学的发展，基因治疗由于其较高的特异性和较低的毒副作用被认为是一种极具潜力的癌症治疗手段。其中RNA干扰(RNAi)技术可以特异性的沉默或者抑制相关基因的表达，该技术已经广泛应用于恶性肿瘤的治疗领域。基于此项技术，全球已经有多款小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)药物处于临床阶段，不过siRNA存在稳定性差，容易被肾脏吸收代谢，难以穿过生理屏障的缺陷，无法发挥它的全部作用。
近年来，超小四氧化三铁(Fe3O4)以其制备简单、来源广泛及较高的T1弛豫率等特性在核磁成像领域受到了较多的关注(Zhou,M.,Zhang,R.,et al.J.Am.Chem.Soc.,2010,132(43):15351-15358)。超小Fe3O4可以作为核磁共振成像(MR)造影剂，并广泛的应用于诊疗一体化。但是当超小Fe3O4进入体内后往往会很快的被代谢出体外，难以到达肿瘤部位，这限制了它在MR成像中的应用。
聚乙烯亚胺(PEI)是一种常见的纳米药物载体，它可以用于递送基因类药物和多种诊疗试剂。不过高分子量的PEI往往伴随着巨大的细胞毒性，在运用中要对其进行进一步的处理。邹等人通过反相微乳液法合成聚乙烯亚胺纳米凝胶，之后利用EDC键合负载超小Fe3O4来降低材料的细胞毒性，并且通过物理吸附的方式负载盐酸阿霉素，用于肿瘤模型的化学治疗和核磁成像(Zou,Y.,Li,D.,et al.Bioconjugate Chem.2020,31(3):907-915)。但是该方法制备的纳米凝胶在降低细胞毒性的同时也大幅降低它的基因负载能力，无法转运基因类药物，在一定程度上限制了聚乙烯亚胺的应用。
检索国内外文献，目前尚未发现关于负载超小四氧化三铁的低分子量聚乙烯亚胺纳米凝胶/siRNA复合物的制备及其应用于MR成像和基因治疗的相关报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种负载超小四氧化三铁的聚乙烯亚胺纳米凝胶 /siRNA复合物，在保证材料优越细胞相容性的同时也赋予了其基因负载和成像能力，同时能够实现肿瘤的抗增殖抗转移基因治疗和MR成像。
本发明的一种聚乙烯亚胺复合纳米凝胶的制备方法，包括：
(1)将Span 80和Tween 60溶解到环己烷溶液中，超声得到微乳液；
(2)分别配置聚乙烯亚胺PEI水溶液和聚乙二醇二丙烯酸酯PEG-DA水溶液，将超小四氧化三铁纳米颗粒加入聚乙烯亚胺PEI水溶液中，然后与聚乙二醇二丙烯酸酯PEG-DA 水溶液混合并迅速超声0.5-2min，然后加入到步骤(1)所得微乳液中，超声分散，搅拌，
得到O/W聚合物乳液，离心洗涤，减压蒸馏，冻干，得到聚乙烯亚胺复合纳米凝胶。
上述制备方法的优选方式如下：
所述步骤(1)中Span 80、Tween 60和环己烷的质量比为1:3:16～1:4:21。
所述步骤(2)中之后分别将PEI(30.6mg)和PEG-DA(19.4mg)各溶解在1mL水中，充分溶解后将柠檬酸钠稳定的超小Fe3O4纳米颗粒(3mg)加入到PEI溶液中，之后将两份溶液混合并迅速超声1min，然后加入到步骤(1)所得微乳液中，超声分散，搅拌，得到O/W 聚合物乳液，离心洗涤，减压蒸馏，冻干，得到聚乙烯亚胺复合纳米凝胶。
所述步骤(2)中超小四氧化三铁纳米颗粒为柠檬酸钠稳定的超小四氧化三铁纳米颗粒；所述聚乙烯亚胺PEI的分子量大小700-900Da；聚乙二醇二丙烯酸酯PEG-DA的分子量大小 300-500Da。
所述柠檬酸钠稳定的超小四氧化三铁纳米颗粒由下列方法制备：将三价铁盐溶于溶剂中，加入柠檬酸钠，搅拌溶解，然后加入无水醋酸钠，搅拌溶解，190～200℃溶剂热反应3～4小时，冷却，离心，干燥，得到柠檬酸钠稳定的超小四氧化三铁纳米颗粒；其中三价铁盐、溶剂、柠檬酸钠和无水醋酸钠的比例为1.081～1.09g:38～40mL:0.47～0.50g:1.312～1.33g。
所述三价铁盐为无水氯化铁，溶剂为一缩二乙二醇DEG。
所述加入柠檬酸钠后搅拌的条件为：空气气氛下80℃搅拌1～2小时。
所述溶剂热反应的容器为50ml的高压反应釜。
所述离心，干燥具体为：离心的条件为：8500～9000rpm离心10～15分钟，弃上清液，用无水乙醇回溶，8500～9000rpm离心10～15分钟，重复操作2～3次；所述干燥的条件为： 60～65℃烘干。
所述步骤(2)中超小四氧化三铁纳米颗粒、聚乙二醇二丙烯酸酯和聚乙烯亚胺的质量比为1:6:10～1:8:13。
所述步骤(2)中超小四氧化三铁纳米颗粒/聚乙烯亚胺溶液和超小四氧化三铁纳米颗粒/ 聚乙二醇二丙烯酸酯溶液的体积比为1:1～1:2。
所述步骤(2)中超声分散时间为15～20min；搅拌反应温度为室温，搅拌反应时间为4～5 天。
所述步骤(2)中离心洗涤具体为：得到的O/W聚合物乳液加入120～140mL四氢呋喃，离心，弃上清液，继续加入10～15mL四氢呋喃，离心，反复洗涤三次得到沉淀；其中离心条件为：转速7500rpm，时间3～5min；所述减压蒸馏为：减压蒸馏去除沉淀中多余的四氢呋喃；所述冻干为：加入5～10mL超纯水进行冻干。
所述步骤(2)中减压蒸馏反应温度为55～60℃，反应时间为10～15min。
本发明提供一种聚乙烯亚胺复合纳米凝胶/siRNA复合物，所述复合物为所述方法制备的聚乙烯亚胺复合纳米凝胶与TGF-β1siRNA的复合物。
所述复合物包括使用低分子量聚乙烯亚胺降低其生物毒性，利用聚乙二醇二丙烯酸酯进行交联负载超小四氧化三铁并增强基因传递效果，同时赋予其MR成像性能，最后吸附 TGF-β1siRNA，形成负载超小四氧化三铁的低分子量聚乙烯亚胺纳米凝胶/siRNA复合物。
本发明提供一种所述聚乙烯亚胺复合纳米凝胶/siRNA复合物的制备方法，包括：
将所述方法制备的聚乙烯亚胺复合纳米凝胶与TGF-β1siRNA共同孵育，得到复合物。
所述聚乙烯亚胺复合纳米凝胶与TGF-β1siRNA的N/P为1:1～60:1；共同孵育时间为 15-30min。
本发明提供一种所述聚乙烯亚胺复合纳米凝胶/siRNA复合物在制备MR成像诊断试剂和基因治疗的诊疗剂中的应用。
本发明提供一种所述聚乙烯亚胺复合纳米凝胶/siRNA复合物在制备治疗或预防S180癌症的药物中的应用。
本发明提供一种所述聚乙烯亚胺复合纳米凝胶/siRNA复合物在制备防止癌细胞转移药物中的应用。
本发明先利用一步溶剂热法合成柠檬酸钠稳定的Fe3O4磁性纳米颗粒，再使用PEG-DA 作为交联剂，通过迈克尔加成反应的原理，利用反相微乳液法，在水相中原位交联PEI并负载超小四氧化三铁，形成负载超小四氧化三铁的低分子量PEI纳米凝胶。之后设置不同的N/P 比，利用静电吸附的原理将TGF-β1siRNA吸附到复合纳米凝胶上，最终形成TGF-β1复合纳米凝胶。该方法制备的纳米水凝胶不仅可以作为优良的造影剂同时可以用于基因传递，在肿瘤诊断和治疗方面有潜在的应用价值。
进一步，(1)以纳米水凝胶作为造影材料和基因载体：(2)首先利用一步溶剂热法合成得到表面柠檬酸钠稳定的超小四氧化三铁(Fe3O4)纳米颗粒，之后由于聚乙烯亚胺(PEI800Da)材料含有丰富的氨基，聚乙二醇二丙烯酸酯(PEG-DA 400Da)含有不饱和双键，利用PEI和PEG-DA作为正电和负电基团，调控反应条件，构建反相微乳液体系，将超小四氧化三铁与PEI和PEG-DA混合在水相中，利用迈克尔加成反应，交联PEI，合成负载超小四氧化三铁的低分子量聚乙烯亚胺(Fe3O4/PEI-PEG)复合纳米凝胶，之后再与TGF-β1 siRNA复合形成负载超小四氧化三铁的低分子量聚乙烯亚胺纳米凝胶/siRNA复合物。该方法制备过程简单，反应条件温和，易于操作；制备得到的纳米凝胶具有良好的生物相容性、单分散性、胶体稳定性、优良的基因传递效率和MR成像功能，可用于肿瘤的基因治疗，在诊疗一体化领域具有潜在的应用价值。
本发明使用Zeta电势及动态光散射分析(DLS)、热重分析(TGA)、透射电子显微镜(TEM)、傅里叶变换红外光谱(FTIR)、凝胶阻滞实验、电感耦合等离子体原子发射光谱法(ICP-AES)和核磁共振(MR)成像分析等手段表征制备的负载超小四氧化三铁的低分子量聚乙烯亚胺纳米凝胶/siRNA复合物。
有益效果
本发明第一次使用了低分子量PEI凝胶包裹的超小四氧化三铁，合成了一种具备良好生物相容性的多功能基因载体，实现对肿瘤组织T1加权核磁共振诊断。同时选择TGF-β1siRNA 作为治疗试剂，对其抑制小鼠肿瘤的生长和转移进行研究。本发明在动物实验中表明，采用负载超小四氧化三铁的低分子量聚乙烯亚胺纳米凝胶体系可以促进超小铁在肿瘤内的分布浸润，相比单独的超小四氧化三铁有更好的MR成像效果，同时可以有效地抑制小鼠体内肿瘤的生长与转移，为进一步的肿瘤治疗研究打下基础。
本发明方法工艺简单，反应条件温和，易于操作。制备得到的负载超小四氧化三铁的低分子量聚乙烯亚胺纳米凝胶/siRNA复合物具有良好的单分散性、胶体稳定性和、MR成像性能和生物相容性。所用的合成原料均为环境友好型材料，具有产业化实施的前景。
本发明方法制备得到的纳米凝胶具有良好的生物相容性、单分散性、胶体稳定性、优良的基因传递效率和MR成像功能，可用于肿瘤的基因治疗，在诊疗一体化领域具有潜在的应用价值。
附图说明
图1为实施例1中的Fe3O4/PEI-PEG纳米凝胶的合成示意图；
图2为实施例1中的Fe3O4纳米材料透射电子显微镜(a)及粒径分布(b)图；
图3为实施例1中的Fe3O4/PEI-PEG纳米材料的透射电子显微镜图；
图4为实施例3中的纳米材料的热重分析曲线；
图5为实施例3中的纳米材料的红外吸收光谱图；
图6为实施例4中Fe3O4纳米颗粒和Fe3O4/PEI-PEG纳米凝胶的体外成像(a)和T1弛豫时间倒数与Fe浓度的线性关系(b)图；
图7是实施例5中不同铁浓度下Fe3O4/PEI-PEG纳米凝胶对S180细胞的细胞毒性图；
图8是实施例6中Fe3O4/PEI-PEG纳米凝胶与TGF-β1siRNA共孵育后不同N/P值下TGF-β1 复合物凝胶阻滞实验图，1-6分别为N/P值1、5、10、20、30和60；
图9是实施例7中Fe3O4/PEI-PEG纳米凝胶与TGF-β1siRNA共孵育后不同N/P值下TGF-β1 复合物的Zeta电势图；
图10是实施例8中不同N/P值下cy3标记的TGF-β1复合物的荧光强度(a)及定量(b)图；
图11是实施例9中cy3标记的TGF-β1siRNA和TGF-β1复合物与S180细胞共孵育6h后的共聚焦荧光图；
图12是实施例10是各组治疗试剂与S180细胞共孵育后TGF-β1细胞因子表达含量定量图；
图13是实施例11中各组治疗试剂与S180细胞共孵育48h后S180细胞细胞活力图；
图14是实施例11中各组治疗试剂与S180细胞共孵育24h后S180细胞Transwell迁移细胞数量图；
图15是实施例12中(a)和(b)为尾静脉注射制备得到Fe3O4纳米颗粒和Fe3O4/PEI-PEG纳米凝胶后不同时间点小白鼠S180皮下瘤的T1加权MR成像。
图16是实施例13中瘤内注射各组治疗试剂14天内小鼠体重变化(a)、肿瘤相对体积变化(b) 和小鼠肿瘤(c)图；其中(a)、(b)中标注的物质，从上到下依次具体为PBS、Fe3O4/PEI-PEG NGs、TGF-β1siRNA、Scr siRNA NGs、TGF-β1NGs、Scr siRNA；(c)中从左到右依次为PBS、Fe3O4/PEI-PEG NGs、Scr siRNA NGs、TGF-β1siRNA、Scr siRNA、TGF-β1NGs。
图17是实施例13中瘤内注射各组治疗试剂42天后小鼠肺部H&E染色图。
注：附图12-14、附图17中Fe3O4/PEI-PEG NGs为Fe3O4/PEI-PEG复合纳米凝胶、TGF-β1 NGs为TGF-β1复合物、Scr siRNA NGs为Scr siRNA复合物。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
主要实验试剂
Figure BDA0002930723690000052
Figure BDA0002930723690000061
实施例1
(1)将1.09g六水合氯化铁溶解在40mL一缩二乙二醇(又名二甘醇，DEG)中，然后将0.47g柠檬酸钠(Na3Cit)溶解在上述溶液，并于空气气氛下80℃搅拌1小时，待柠檬酸钠完全溶解后再将1.312g无水醋酸钠加入到上述溶液中，持续搅拌至醋酸钠粉末完全溶解，然后将溶液转移至50mL的高压反应釜中，于200℃反应4小时；反应结束后，自然冷却至室温，将产物转移至 50mL离心管中8500rpm离心15分钟，弃上清液看，用无水乙醇回溶，8500rpm离心15分钟，重复操作3次，然后将沉淀物在60℃烘干得到超小四氧化三铁纳米颗粒，即表面柠檬酸钠稳定的超小氧化铁纳米颗粒。
(2)之后利用反相微乳液法原位合成Fe3O4/PEI-PEG凝胶。具体步骤如下，首先称取1.25mg 的Span 80和3.75mg的Tween 60，将二者溶解在环己烷(20mg)中，超声15min以形成澄清的油包水(W/O)乳液。之后分别将PEI(30.6mg)和PEG-DA(19.4mg)各溶解在1mL水中，充分溶解后将柠檬酸钠稳定的超小Fe3O4纳米颗粒(3mg)加入到PEI溶液中，之后将两份溶液混合并迅速超声1min，然后快速加入到配置好的微乳液中，超声分散15min以形成均匀的微乳液，最后在室温下搅拌反应4天。往反应后的溶液中加入120mL四氢呋喃，用四氢呋喃在7500rpm下离心数次以便除去表面活性剂，之后在55℃下减压蒸馏除去多余的四氢呋喃。将得到的凝胶溶于5mL水中，冻干得到Fe3O4/PEI-PEG纳米凝胶。制备得到的Fe3O4纳米颗粒表面有大量的柠檬酸钠，具有较高的负电荷，这使得纳米颗粒之间产生相互的排斥作用而具有很好的胶体稳定性。通过对合成纳米材料进行透射电子显微镜分析如图2所示表明：Fe3O4纳米颗粒，尺寸均匀，纳米颗粒大小约为2.15nm，没有明显的团聚现象，在溶液中分散良好而且不发生聚集。如图3所示表明：Fe3O4/PEI-PEG纳米凝胶的形貌呈球形或准球形，尺寸均匀，凝胶直径大小约为52.33nm，没有明显的团聚现象，在溶液中分散良好而且不发生聚集。
实施例2
分别取实施例1制备Fe浓度为0.01mM的Fe3O4纳米颗粒和Fe3O4/PEI-PEG纳米凝胶溶解在 1mL超纯水中，超声均匀，测表面电势和水合粒径。如表1所示：制备得的Fe3O4纳米颗粒和 Fe3O4/PEI-PEG纳米凝胶的Zeta电势分别为-26.8mV和25.8mV；水合粒径分别为27.5nm和 252.5nm。从实验结果得出，Fe3O4/PEI-PEG纳米凝胶Zeta电势的改变可能是因为柠檬酸钠中的羧基中和了部分氨基，此外其水动力学直径也有所增加，并且粒径均一，这说明超小四氧化三铁纳米颗粒被成功负载到纳米凝胶中同时具有良好的胶体稳定性。
表1Fe3O4纳米颗粒和Fe3O4/PEI-PEG纳米凝胶的性能数据表
样品名称 电势(mV) 水动力直径(nm) 多分散系数
Fe<sub>3</sub>O<sub>4</sub> -26.8 27.5 0.162
Fe<sub>3</sub>O<sub>4</sub>/PEI-PEG -25.8 252.5 0.330
实施例3
分别称取实施例1制备得到的两种材料：Fe3O4纳米颗粒和Fe3O4/PEI-PEG纳米凝胶进行热重分析(如图4所示)和红外光谱测试和(如图5所示)。TGA测试结果表明，Fe3O4的减重为30.2％，而Fe3O4/PEI-PEG纳米凝胶的减重为24.7％。通过计算Fe3O4纳米颗粒纳米的失重数据，得到两种材料的失重曲线，通过两条失重曲线计算分析得出而Fe3O4/PEI-PEG纳米凝胶中Fe3O4的比例为5.5％，与投料比基本保持一致。红外测试表明在OH吸收了水分子后如图5中a和b在 3397cm-1处出现了伸缩振动峰，另一处明显的峰为柠檬酸钠中亚甲基的伸缩峰，出现在 2926cm-1和2855cm-1处。此外同时，在Fe3O4纳米颗粒和Fe3O4/PEI-PEG纳米凝胶试样上观察到 1396-1642cm-1(C＝O的伸缩振动)1028-1075cm-1(C-O-C的伸缩振动)处的峰。其中在 Fe3O4/PEI-PEG纳米材料中的Fe-O键的吸收峰减弱，可能是由于水凝胶包裹的缘故。同时在图 5c中1670cm-1处出现的C＝C伸缩振动峰在图5b已消失，因为凝胶交联过程中发生的加成反应使双键消失，这一结果证明凝胶PEI被成功交联。红外光谱图结果表明Fe3O4/PEI-PEG纳米凝胶有Fe3O4的存在，红外光谱图中峰位的变动都定性的表征了成功合成了负载超小四氧化三铁的低分子量聚乙烯亚胺纳米凝胶。
实施例4
将实施例1中制备的Fe3O4纳米颗粒和Fe3O4/PEI-PEG纳米凝胶通过ICP-OES测试法测得溶液中Fe元素的浓度，再用超纯水配制Fe浓度依次为0.1、0.2、0.4、0.8和1.6mM的水溶液2mL，测定不同Fe浓度下的T1弛豫时间(如图6所示Fe3O4纳米颗粒和Fe3O4/PEI-PEG纳米水凝胶的T1弛豫时间倒数与Fe浓度的线性拟合图)和T1加权成像。弛豫率测试结果表明Fe3O4纳米颗粒和 Fe3O4/PEI-PEG纳米凝胶的T1弛豫时间倒数在Fe浓度为0.1-1.6mM范围内随着铁浓度的增加具有很好的线性关系。并且通过计算可得Fe3O4纳米颗粒和Fe3O4/PEI-PEG纳米水凝胶的r1弛豫率分别为0.8065mM-1s-1和1.0346mM-1s-1。可以看出随着Fe浓度提高，MRI信号逐渐增强，并且呈良好的梯度关系，测试结果说明实施例1制备Fe3O4/PEI-PEG纳米凝胶可以作为MR分子影像诊断中的优良T1阳性造影剂。
实施例5
收集对数生长期S180细胞，按照10000细胞每孔的密度接种在96孔细胞培养板上，置于5％ CO2，37℃条件下孵育24小时。1000rpm离心5min后弃掉培养基后，每孔更换180μL培养基，并添加20μL含不同浓度的Fe3O4/PEI-PEG纳米凝胶(最终凝胶浓度为25、50、100、200、300nM) 或纯PBS(对照组)。将细胞培养板继续放置在5％CO2，37℃继续孵育24小时。接着1000rpm 离心5min后弃掉原培养基，加入含10μL CCK-8的新鲜培养基溶液，继续培养2h后，放置在多功能酶标仪中于测试波长450nm下测试吸光值。结果如图7所示，与PBS对照组相比 Fe3O4/PEI-PEG纳米凝胶在试验浓度范围内对S180细胞没有明显细胞毒性，细胞存活率均在 80％以上，说明Fe3O4/PEI-PEG纳米凝胶具有良好的生物相容性。
实施例6
取实施例1中制备的Fe3O4/PEI-PEG纳米凝胶，将其配置成浓度为2mg/mL的溶液，采用定氮试剂盒法测定Fe3O4/PEI-PEG纳米凝胶的氨基的浓度，然后将Fe3O4/PEI-PEG纳米凝胶与TGF-β1siRNA按照不同的氮磷比(1、5、10、20、30和60)孵育15-30分钟，孵育完之后进行琼脂糖凝胶电泳(如图8所示)，实验结果表明Fe3O4/PEI-PEG纳米凝胶在N/P为 30的条件下可以完全包裹siRNA，说明该材料具有很好的siRNA包裹能力。
实施例7
取实施例1中制备的Fe3O4/PEI-PEG纳米凝胶，将其配置成浓度为2mg/mL的溶液，采用定氮试剂盒法测定Fe3O4/PEI-PEG纳米凝胶的氨基的浓度，然后将Fe3O4/PEI-PEG纳米凝胶与TGF-β1siRNA按照不同的氮磷比(1、5、10、20、30和60)孵育15-30分钟，孵育完之后进行Zeta电势实验(如图9所示)，TGF-β1复合物的电势随着N/P值的增加而逐渐增高，当N/P值到达20以上后，复合物的表面电势便没有显著变化，这表明siRNA已经被完全包覆在材料内。
实施例8
细胞吞噬实验：
收集对数生长期S180细胞。首先将每孔1×105的S180细胞种于24孔板中，每孔加入 1mL RPMI 1640完全培养基，在培养箱中培养24h。之后取实施例1中制备的Fe3O4/PEI-PEG 纳米凝胶用PBS配备一系列不同N/P的cy3荧光标记的TGF-β1复合物(N/P为0、30、60、90和120，TGF-β1siRNA为1μg)，将Fe3O4/PEI-PEG纳米凝胶与cy3标记的TGF-β1siRNA 共孵育20-30min。孔板离心(1000rpm，5min)除去细胞上清液，并用PBS洗涤三次，之后每孔加入先前配备好的TGF-β1复合物，并用RPMI 1640培养定容至1mL。将细胞与TGF-β1 复合物在培养箱中共同培养4-6h后，孔板离心(1000rpm，5min)除去上清液中的材料，并用PBS洗涤数次。将各组细胞转移到流式管中，利用流式细胞仪检测细胞内的TGF-β1siRNA 带的红色cy3荧光强度，筛选出细胞吞噬量最大时TGF-β1复合物的N/P值。如图10所示当 N/P值到达60时，细胞吞噬量达到了最高，随着N/P值继续增加，细胞吞噬效果有所下降。
实施例9
胞内定位实验：
收集对数生长期S180细胞。首先将每孔1×105的S180细胞种于24孔板中，每孔加入 1mL RPMI 1640完全培养基，在培养箱中培养24h。根据实施例8得到的N/P值，将实施例1中制备的Fe3O4/PEI-PEG纳米凝胶与cy3标记的TGF-β1siRNA共孵育20-30min，单独的 cy3标记的TGF-β1siRNA作为对照组。孔板离心(1000rpm，5min)去细胞上清液，并用PBS 洗涤三次，之后每孔加入先前配备好的TGF-β1复合物，并用RPMI 1640培养定容至1mL。将细胞与TGF-β1复合物在培养箱中共同培养4-6h后，用孔板离心(1000rpm，5min)除去上清液中的材料，并用PBS洗涤数次。然后，依据DAPI染色说明书对细胞核进行DAPI染色。染色结束后，将S180转移到共聚焦皿中，并通过激光共聚焦显微镜观察S180的图像并拍照记录。其中，红色荧光表示cy3标记的TGF-β1siRNA，蓝色荧光表示DAPI标记的细胞核。通过共聚焦显微镜定性检测S180的细胞吞噬效果和Fe3O4/PEI-PEG纳米凝胶对siRNA 的运输效果。如图11所示发现与单独的TGF-β1siRNA相比，TGF-β1复合物组能够在细胞核附近发现明显的红色荧光，这说明Fe3O4/PEI-PEG纳米凝胶能够成功将TGF-β1siRNA运送到细胞核附近。
实施例10
Elisa酶联检测实验
收集对数生长期S180细胞，按照10000细胞每孔的密度接种在96孔细胞培养板上，置于5％CO2，37℃条件下孵育24小时。配备S180所需要的RPMI 1640完全培养基，根据实施例8得到的结果，用培养基制备6组对照组的溶液(PBS、TGF-β1siRNA、Fe3O4/PEI-PEG 复合纳米凝胶、Scr siRNA、TGF-β1复合物和Scr siRNA复合物，TGF-β1/Scr siRNA＝1μg)。每孔加入100μL RPMI 1640完全培养基，之后在37℃恒温培养箱中过夜培养。培养完毕后对孔板中的细胞进行孔板离心(1000rpm，5min)，去除上清液，各组中加入配备好的溶液(100μL) 共孵育6h。共孵育完成后，孔板离心(1000rpm，5min)洗掉上清液，并用PBS洗涤多次，继续培养48h，之后孔板离心(1000rpm，5min)并收集上清液。根据Elisa操作手册进行实验，并测量记录吸光值。如图12所示，在细胞上清液中TGF-β1复合物组的TGF-β1分泌蛋白有所减少，而其他各组的TGF-β1分泌蛋白与PBS基本相同。这一结果证明，Fe3O4/PEI-PEG 纳米凝胶可以成功将TGF-β1siRNA递送至细胞内，同时siRNA也在胞内成功干扰了TGF-β1 mRNA的合成从而能够降低其蛋白表达。
实施例11
体外治疗实验
(1)体外抗增殖实验
收集对数生长期的S180细胞，按照细胞以每孔10000密度将S180细胞种植于96孔细胞培养板中，在37℃培养箱中过夜，之后根据实施例8得到的结果，用RPMI 1640培养基配备 TGF-β1siRNA,Fe3O4/PEI-PEG纳米凝胶,Scr siRNA，TGF-β1复物和Scr siRNA复合物六组材料的溶液，保持TGF-β1siRNA和Scr siRNA浓度为10μg/mL，将孔板取出在显微镜下观察过夜培养后S180的数量，当细胞密度达到95％左右进行孔板离心(1000rpm，5min)去除上清液，利用无菌的PBS清洗并再次离心，重复多次后每孔加入100μL配制好的材料并放入恒温培养箱中共孵育48小时。接着配备CCK-8溶液，利用RPMI 1640培养基将CCK-8试剂稀释至10％。当结束材料和细胞的共孵育后，在避光条件下，利用平板离心去除材料并加入无菌的PBS再次离心将多余的材料清洗干净，之后将预先配制的CCK-8溶液(100μL/孔)加入到各孔中，放至温度为37℃二氧化碳含量为5％的恒温培养箱中培养4小时。培养完毕后，在避光条件下将孔板置入酶标仪中，在450nm波长下测试各孔中的吸光值并记录。结果如图 13显示，当材料与细胞共孵育48h后TGF-β1复合物组中S180细胞的存活率明显降低，细胞存活率降低到60％左右，而其他各组中S180细胞的存活率均在80％以上。这说明TGF-β1复合物成功地将TGF-β1siRNA递送到细胞内，并沉默了TGF-β1的表达，对S180细胞具有一定的治疗效果。
(2)体外抗转移实验
首先对S180细胞在无血清培养基中进行饥饿培养(12h)，以消除血清对后续实验的影响。制备Transwell小室，在上室中加入70μL Matrigel(3.9μg/μL)使其可以铺满聚碳酸酯膜，之后将24孔Transwell板置入37℃的恒温箱中孵育30min使Matrigel聚合成凝胶。之后根据实施例8得到的结果，用RPMI 1640培养基配备TGF-β1siRNA、Fe3O4/PEI-PEG复合纳米凝胶、 Scr siRNA、TGF-β1复合物和Scr siRNA复合物六组材料的溶液。将S180细胞转移至5mL EP 管中，用先前配好的各组溶液调整细胞密度至1×106个/mL。对细胞悬液进行充分分散，各组取200μL加入Transwell小室，每组有三个平行对照。之后将500μl含FBS培养基加入到下室中，注意下室与小室之间不要有气泡，培养24h。培养结束后用酒精棉多次清洗小室内基质胶上层的细胞，注意不要用力过猛将膜捅破。最后将各组小室上层底部置于相差显微镜下随机取10-15个视野对细胞数量进行计数。为了排除因癌细胞生长被抑制而导致细胞侵袭的结果产生误差，选择将材料与S180细胞孵育24h这一时间点进行实验。结果由图14可得，在材料与S180细胞共孵育24h后，TGF-β1复合物组中S180细胞的转移能力显著降低，与其他组相比仅有一半的细胞转移到Transwell小室下方。体外实验的结果说明TGF-β1复合物成功地将TGF-β1siRNA递送到细胞内，并沉默了TGF-β1的表达，对S180细胞具有一定的治疗效果。体外实验的结果证明TGF-β1siRNA可以抑制S180细胞的增殖与转移能力。
实施例12
体内MR成像实验
在BALB/c体内构建S180皮下瘤模型。通过尾静脉注射实施例1制备的Fe3O4/PEI-PEG纳米凝胶和对照材料(实施例1制备得到Fe3O4纳米颗粒)的PBS溶液(100μg,200μl)来评价肿瘤部位 MR成像效果(参见图15)。与没有注射造影剂的BALB/c小鼠相比，在注射造影剂后90min内，在Fe3O4/PEI-PEG纳米凝胶和对照材料Fe3O4纳米颗粒都可以在肿瘤区域观察到MR信号有所增强。但是与Fe3O4纳米颗粒组相比，Fe3O4/PEI-PEG纳米凝胶组呈现出更亮更强的M信号。此外在45min以后，Fe3O4纳米颗粒组的信号已经有所减弱，但Fe3O4/PEI-PEG纳米凝胶组依然可以看见明显的MR信号。如图15(b)MRI信号值定量分析结果所示，注射前肿瘤部位信噪比SNR为62.0，注射Fe3O4/PEI-PEG纳米凝胶组45min后肿瘤部位信噪比SNR为121.4,ΔSNR为 59.4。注射对照材料Fe3O4纳米颗粒的对照组，小鼠肿瘤部位信号增强不明显，注射后45min，肿瘤部位信噪比SNR从57.3增长到73.7，ΔSNR为16.4，明显小于注射Fe3O4/PEI-PEG纳米凝胶的实验组。肿瘤MR成像结果，说明制备的Fe3O4/PEI-PEG纳米凝胶可以作为造影剂应用于增强的体内肿瘤MR成像诊断。定量结果还显示，在Fe3O4/PEI-PEG纳米凝胶当MR信号值达到最高时，相比于单独的Fe3O4纳米颗粒，MR成像的S/N信号升高约1.64倍。肿瘤MR成像结果说明实施例1制备Fe3O4/PEI-PEG纳米凝胶可以作为造影剂应用于增强的体内肿瘤MR成像诊断。
实施例13
体内抗肿瘤效果评价
(1)抗增殖实验
根据实施例8得到的结果，用PBS配备TGF-β1siRNA、Fe3O4/PEI-PEG纳米凝胶、ScrsiRNA、TGF-β1复合物和Scr siRNA复合物六组材料的溶液(TGF-β1/Scr siRNA＝8μg)。第一组(PBS对照)仅注射100μL PBS。第2组(Scr siRNA)和第3组(TGF-β1siRNA)接受100μL 含裸露Scr siRNA或TGF-β1siRNA(siRNA浓度等于TGF-β1复合物)的PBS。第4组(未处理的Fe3O4/PEI-PEG纳米凝胶)接受100μL PBS。第5组(Scr siRNA复合物)和第6组(TGF-β1 复合物)分别接受2000μg/mL Fe3O4/PEI-PEG纳米凝胶递送的Scr siRNA或TGF-β1siRNA。每隔两天进行一次肿瘤体积测量，并使用公式＝(π×长轴×短轴2)/6估算小鼠的肿瘤体积，并记录小鼠体重。结果如图16显示，与其他对照组相比，TGF-β1复合物中小鼠肿瘤生长明显受到了抑制，说明具有治疗S180癌症的效果。
(2)抗转移实验
根据实施例8得到的结果，用PBS配备TGF-β1siRNA,Fe3O4/PEI-PEG纳米凝胶，ScrsiRNA、TGF-β1复合物和Scr siRNA复合物六组材料的溶液(TGF-β1/Scr siRNA＝8μg)。第一组(PBS对照)仅注射100μL PBS。第2组(Scr siRNA)和第3组(TGF-β1siRNA)接受 100μL含裸露Scr siRNA或TGF-β1siRNA(siRNA浓度等于TGF-β1复合物)的PBS。第4 组(未处理的Fe3O4/PEI-PEG纳米凝胶)接受100μL PBS。第5组(Scr siRNA复合物)和第 6组(TGF-β1复合物)分别接受2000μg/mL Fe3O4/PEI-PEG纳米凝胶递送的Scr siRNA或 TGF-β1siRNA。根据实施例12中的实验步骤，将肿瘤接种在小鼠后右大腿根部，每周对小鼠瘤内注射一次进行治疗，培育6周后处死小鼠，取出小鼠肺部放入组织固定液中固定，进行H&E染色。结果如图17显示，与其他对照组相比，TGF-β1复合物中小鼠肺部没有发现明显的紫色聚集区域，说明癌细胞没有往肺部进行侵袭，TGF-β1复合物具有阻止癌细胞发生转移的效果。

Claims (9)

1.一种聚乙烯亚胺复合纳米凝胶/siRNA复合物的制备方法，包括：
（1）将Span 80和Tween 60溶解到环己烷溶液中，超声得到微乳液；
（2）分别配置聚乙烯亚胺PEI水溶液和聚乙二醇二丙烯酸酯PEG-DA水溶液，将超小四氧化三铁纳米颗粒加入聚乙烯亚胺PEI水溶液中，然后与聚乙二醇二丙烯酸酯PEG-DA水溶液混合并超声，然后加入到步骤（1）所得微乳液中，超声分散，搅拌，得到O/W聚合物乳液，离心洗涤，冻干，得到聚乙烯亚胺复合纳米凝胶；
将聚乙烯亚胺复合纳米凝胶与TGF-β1 siRNA共同孵育，得到复合物；其中超小四氧化三铁纳米颗粒为柠檬酸钠稳定的超小四氧化三铁纳米颗粒；所述聚乙烯亚胺PEI的分子量大小700～900Da。
2.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中Span 80、Tween 60和环己烷的质量比为1:3:16～1:4:21。
3.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中聚乙二醇二丙烯酸酯PEG-DA的分子量大小300～500Da。
4.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中柠檬酸钠稳定的超小四氧化三铁纳米颗粒由下列方法制备：将三价铁盐溶于溶剂中，加入柠檬酸钠，搅拌溶解，然后加入无水醋酸钠，搅拌溶解，190～200℃溶剂热反应3～4小时，冷却，离心，干燥，得到柠檬酸钠稳定的超小四氧化三铁纳米颗粒；其中三价铁盐、溶剂、柠檬酸钠和无水醋酸钠的比例为1 .081～1 .09g:38～40mL:0 .47～0 .50g:1 .312～1 .33g。
5.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中超小四氧化三铁纳米颗粒、聚乙二醇二丙烯酸酯和聚乙烯亚胺的质量比为1:6:10～1:8:13；
所述步骤（2）中超声分散时间为15~20min；搅拌反应温度为室温，搅拌反应时间为4~5天。
6.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述聚乙烯亚胺复合纳米凝胶与TGF-β1siRNA的N/P为1:1~60:1；共同孵育时间为15-30min。
7.一种权利要求1所述方法制备的聚乙烯亚胺复合纳米凝胶/siRNA复合物，其特征在于，所述复合物为聚乙烯亚胺复合纳米凝胶与TGF-β1 siRNA的复合物。
8.一种权利要求7所述聚乙烯亚胺复合纳米凝胶/siRNA复合物在制备MR成像诊断试剂和基因治疗的诊疗剂中的应用。
9.一种权利要求7所述聚乙烯亚胺复合纳米凝胶/siRNA复合物在制备治疗或预防S180癌症并防止癌细胞转移的药物中的应用。
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