CN110368359A - 一种基于支化聚乙烯亚胺合成的杂化纳米水凝胶及其制备和应用 - Google Patents

一种基于支化聚乙烯亚胺合成的杂化纳米水凝胶及其制备和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种基于支化聚乙烯亚胺合成的杂化纳米水凝胶及其制备和应用，所述水凝胶为聚乙烯亚胺纳米凝胶氧化铁杂化物Fe3O4/PEI NGs。制备：将柠檬酸稳定的超小磁性氧化铁溶于水中，加入EDC活化，然后加入PEI纳米凝胶水溶液，反应，离心，透析纯化后，即得。本发明制备得到的PEI纳米凝胶Fe3O4杂化物纳米诊疗一体化平台，具有良好的水溶液分散性、胶体稳定性，具有较好的r1弛豫率，可有效抑制癌细胞的生长，可用于肿瘤模型的化疗和MR成像一体化，具有产业化应用前景。

Description

一种基于支化聚乙烯亚胺合成的杂化纳米水凝胶及其制备和 应用
技术领域
本发明属于功能性杂化纳米诊疗平台及其制备和应用领域，特别涉及一种基于支化聚乙烯亚胺合成的杂化纳米水凝胶及其制备和应用。
背景技术
纳米凝胶具有大量内腔的亲水或两亲聚合物的三维网络，同时还有活性的化学官能团，可以设计成对pH值、温度和光热变化敏感的智能纳米材料(Li et al.,Chem.Soc.Rev.,2012,41,2193-2221)。此外，纳米凝胶中的专用网络可以作为载体封装药物和基因。纳米凝胶具有与人体组织相似的特性和良好的生物相容性，是药物传输、基因传递、热传感、伤口愈合和生物成像等生物医学应用的理想平台。
聚乙烯亚胺(polyethyleneimine，PEI)是一种含胺量较高的聚合物，广泛应用于药物控释、基因治疗、抗菌药物和生物医学成像等领域。PEI表面大量的氨基官能团为生物医学应用提供了机会，可用于不同有机和无机杂化材料的合成，另外其表面氨基还可以通过与生物分子的共价偶联来修饰，因而可用于靶向纳米药物或基因载体体系。此外，pH敏感性聚乙烯亚胺适用于药物控释。此外，聚合物聚乙烯亚胺能够与带负电荷的分子结合，如DNA、RNA和蛋白质，用于组织工程和基因治疗。
因为氧化铁纳米颗粒的磁性能与他们的大小密切相关。当氧化铁纳米颗粒由于其体积磁各向异性的减小以及纳米颗粒表面自旋紊乱的减小，使其尺寸减小，磁矩急剧减小，从而抑制了T2效应，相反使得T1对比度效应最大化。因此小尺寸氧化铁纳米颗粒(小于5纳米)可以被用作MR成像的T1造影剂(A.G.Roca,J.F.Marco,M.P.Morales and C.J.Serna,J.Phys.Chem.C,2007,111,18577–18584)。
检索国内外相关文献和专利结果表明：聚乙烯亚胺纳米水凝胶与氧化铁复合物作为诊疗一体化平台的研究尚未见报道。
CN 109078196 A公开了一种骨髓间充质干细胞介导的纳米水凝胶及其制备和应用，该技术通过双乳化法合成的海藻酸钠和聚乙烯亚胺修饰的超小四氧化三铁纳米水凝胶，主要应用于MR成像方面，而本发明是利用乙酰化聚乙烯亚胺纳米凝胶氧化铁杂化物负载盐酸阿霉素构建了具有肿瘤MR成像及化疗效果的诊疗一体化杂化纳米材料。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种基于支化聚乙烯亚胺合成的杂化纳米水凝胶及其制备和应用，同时拥有MR成像以及化疗效果，本发明利用支化聚乙烯亚胺与柠檬酸稳定的超顺磁性氧化铁通过氨基与羧基化学键合并作乙酰化处理，得到化学结构更加稳定的乙酰化聚乙烯亚胺纳米凝胶氧化铁杂化物，从而负载盐酸阿霉素构建杂化纳米材料用于化疗研究。在此基础上，作为磁性氧化物，超顺磁性氧化铁具有T1驰豫效率，其驰豫效率随尺寸大小变化已有文献报道(A.G.Roca,J.F.Marco,M.P.Morales and C.J.Serna,J.Phys.Chem.C,2007,111,18577–18584)。本发明利用超顺磁性氧化铁杂化纳米材料应用于核磁共振成像，取得不错的成像效果。通过对纳米材料的理性设计和精准合成，将目前临床上诊断和治疗两个分离的过程/功能集成于一个纳米材料中，利用乙酰化聚乙烯亚胺纳米凝胶氧化铁杂化物负载盐酸阿霉素构建了具有肿瘤MR成像及化疗效果的诊疗一体化杂化纳米材料。
本发明的制备为：将支化PEI通过反相微乳液法以迈克尔加成交联的方法合成纳米水凝胶；通过溶剂热法制备柠檬酸稳定的超小磁性Fe3O4纳米颗粒，利用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)对超小磁性Fe3O4纳米颗粒表面的柠檬酸羧基活化，进而键合在表面富含氨基的纳米凝胶上，将纳米凝胶表面的富余氨基乙酰化处理，得到乙酰化PEI纳米凝胶Fe3O4杂化物Fe3O4/PEI-Ac NGs；经物理吸附作用将失去盐酸盐形式的阿霉素(DOX)负载在纳米凝胶内部，最终得到DOX负载的杂化纳米材料Fe3O4/PEI-Ac NGs/DOX。
本发明的一种杂化纳米水凝胶，所述水凝胶为聚乙烯亚胺纳米凝胶氧化铁杂化物Fe3O4/PEI NGs。
本发明的一种杂化纳米水凝胶的制备方法，包括：
(1)将支化聚乙烯亚胺PEI水溶液中，加入交联剂后，室温搅拌，与溶解有80的甲苯溶液混合，室温搅拌，超声处理后，加入三乙胺催化交联反应，室温搅拌12-16h，离心，透析纯化，得到PEI纳米凝胶水溶液；
(2)将柠檬酸稳定的超小磁性氧化铁溶于水中，加入EDC活化，再加入NHS避光室温搅拌2h，然后加入步骤(1)中PEI纳米凝胶水溶液，室温搅拌反应12-16h，离心，透析纯化后，得到聚乙烯亚胺纳米凝胶氧化铁杂化物Fe3O4/PEI NGs。
上述制备方法的优选方式如下：
所述步骤(1)中交联剂为N,N′-亚甲基双丙烯酰胺；支化聚乙烯亚胺PEI水溶液、溶解有80的甲苯溶液的质量比为1：4～1：4.1。
进一步地，所述支化聚乙烯亚胺PEI水溶液、溶解有80的甲苯溶液的质量比为1：4～1：4.1。
所述步骤(1)中加入交联剂后，室温搅拌10-30min，与溶解有80的甲苯溶液混合，室温搅拌1-2h，超声处理2-5min。
所述步骤(2)中EDC活化时间为15min。
所述步骤(2)中EDC与柠檬酸稳定的超小磁性氧化铁中的柠檬酸的摩尔比为3：1～3.1：1；PEI纳米凝胶与柠檬酸稳定的超小磁性氧化铁的质量比为5：1～5.2：1。
进一步地，所述EDC与柠檬酸稳定的超小磁性氧化铁中的柠檬酸的摩尔比为3：1～3.1：1；PEI纳米凝胶与柠檬酸稳定的超小磁性氧化铁的质量比为5：1～5.2：1。
所述步骤(2)中柠檬酸稳定的超小磁性氧化铁由下列方法制备：取无水三氯化铁溶于一缩二乙二醇中搅拌溶解，待三氯化铁完全溶解后加入柠檬酸钠，并搅拌至柠檬酸钠完全溶解，随后将澄清的溶液放入80℃水浴锅中反应2h，反应结束后将溶液冷却至55℃，并加入乙酸钠，搅拌至完全溶解，将澄清的溶液转移至高温高压反应釜并放入烘箱内，以200℃反应4h，待反应完全结束后冷却过夜，将所得产物离心纯化，并用无水乙醇洗涤分散，重复纯化3次后将所得产物后放入真空干燥箱中干燥24h，得到产物为超小磁性Fe3O4(Citric-Fe3O4)纳米颗粒。
EDC即为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐。
所述步骤(1)、(2)中纯化具体为：采用13,000rpm的速度离心20分钟，采用截留分子量为8000-14000的纤维素透析膜在超纯水中透析3天。
本发明的一种所述方法制备的杂化纳米水凝胶。
本发明的一种乙酰化聚乙烯亚胺纳米凝胶氧化铁杂化物，具体为：将所述杂化纳米水凝胶、三乙胺混合均匀后，逐滴加入醋酸酐溶液，室温搅拌12-16h，离心和透析纯化后得到乙酰化聚乙烯亚胺纳米凝胶氧化铁杂化物Fe3O4/PEI-Ac NGs，其中Fe3O4/PEI-Ac NGs中PEI、醋酸酐与三乙胺的摩尔比为1:200:200～1:200:220。
所述透析纯化为采用13,000rpm的速度离心20分钟，采用截留分子量为8000-14000的纤维素透析膜在超纯水中透析3天。
本发明的一种负载药物的杂化纳米水凝胶，将所述乙酰化聚乙烯亚胺纳米凝胶氧化铁杂化物和药物混合，室温避光搅拌12-16h。
进一步地，优选药物为盐酸阿霉素DOX·HCl。
进一步地，负载药物的杂化纳米水凝胶具体为：将盐酸阿霉素DOX·HCl溶于超纯水中，加入三乙胺中和其盐酸盐，随后将失去盐酸盐的DOX加入Fe3O4/PEI-Ac NGs水溶液，室温避光搅拌12-16h，得到负载DOX的PEI纳米凝胶Fe3O4杂化物Fe3O4/PEI-Ac NGs/DOX。
所述Fe3O4/PEI-Ac NGs与DOX的质量比为2：1～2.1：1。
本发明的一种所述负载药物的杂化纳米水凝胶的应用，如在制备用于化疗和肿瘤核磁共振成像(MRI)诊疗一体化效应的药物中的应用。
本发明的杂化纳米材料具有诊疗一体化性能，可用于肿瘤核磁共振成像(MRI)和化疗的应用，包括：
(1)利用杂化纳米材料(Fe3O4/PEI-Ac NGs/DOX)通过尾静脉注射用于荷瘤鼠模型的肿瘤MR成像；
(2)利用杂化纳米材料(Fe3O4/PEI-Ac NGs/DOX)通过尾静脉注射用于体外抗肿瘤研究及皮下荷瘤鼠模型的肿瘤化疗。
有益效果
(1)本发明方法简单，易于操作分离，原料来源商品化；
(2)本发明制备得到的乙酰化聚乙烯亚胺纳米凝胶氧化铁杂化纳米材料，具有良好的生物相容性，在对肿瘤细胞具有抑制性的同时可以有一定的r1弛豫率，可用于老鼠肿瘤的化疗和MR成像，具有诊疗一体化效应；
(3)本发明得到的负载阿霉素的聚乙烯亚胺纳米水凝胶与氧化铁复合物的杂化纳米材料，具有良好的水溶性、胶体稳定性，在对肿瘤细胞具有抑制性的同时可以有一定的r1弛豫率，可用于老鼠肿瘤的化疗和MR成像，具有诊疗一体化效应；
(4)本发明利用化疗促进了诊疗一体化效果，在动物层面利用杂化纳米材料的MR成像效果；利用杂化纳米材料的肿瘤抑制效果，在诊疗一体化领域具有潜在的应用价值；
(5)本发明以荷瘤小鼠作为模型，研究杂化纳米材料的小鼠体内诊疗一体化性能的变化，结果发现杂化纳米材料的MR成像效果有明显增强，并且联合盐酸阿霉素使杂化物的肿瘤抑制效果得到了显著的提高。
附图说明
图1为实施例1中的材料的热重曲线图；
图2为实施例1中的PEI NGs(a)和Fe3O4/PEI-Ac NGs(b)材料的AFM成像图；
图3为超小铁与PEI纳米凝胶杂化物的T1MR成像图(上图)及其T1驰豫率时间的倒数随Fe浓度变化的线性关系图(下图)；
图4为在不同pH条件下DOX从Fe3O4/PEI-Ac NGs/DOX中的积累释放曲线；
图5为经CCK-8法测试得到的经过不同纳米材料处理24h后的4T1细胞活力检测图；
图6为4T1细胞经PBS、Free DOX、Fe3O4/PEI-Ac NGs/DOX处理4h后细胞内荧光分布，其中材料中DOX浓度均为20μg/mL，细胞核用DAPI染成蓝色；每个图片标尺均为20μm；
图7为流式细胞术测试得到经不同DOX浓度的Fe3O4/PEI-Ac NGs/DOX处理4h后4T1对DOX的吞噬情况；左图为流式细胞仪测试的直方图，右图为相对荧光强度比较图。
图8为4T1细胞经不同Fe浓度的Fe3O4/PEI-Ac NGs/DOX处理24h后细胞吞噬铁的量。
图9为实施例8中将实施例1制备的Citric-Fe3O4和Fe3O4/PEI-Ac NGs/DOX的溶液(200μLPBS缓冲液，[Fe]＝150μg)分别经尾静脉注射前和注射后不同时间点小鼠肿瘤的MR成像图(a)；Citric-Fe3O4和Fe3O4/PEI-Ac NGs/DOX的PBS缓冲液溶液(200μL，[Fe]＝150μg)分别经尾静脉注射前和注射后不同时间点小鼠的MR信噪比图(b)；
图10为实施例9中尾静脉注射PBS、Free DOX以及实施例1制备的Fe3O4/PEI-AcNGs/DOX和Fe3O4/PEI-Ac NGs的PBS缓冲液溶液(200μL，[DOX]＝20μg/mL)体内抗肿瘤效果；(a)为治疗组老鼠经治疗处理的过程示意图，经22天治疗后小鼠相对肿瘤体积变化图(b)及体重变化图(c)；以及小鼠开始治疗30天后的生存率(d)。
图11为本发明中制备支化聚乙烯亚胺合成的杂化纳米水凝胶的流程图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
本发明使用原子力显微镜(AFM)、紫外可见吸收光谱(UV-Vis)、Zeta电势及动态光散射分析(DLS)等手段表征制备的杂化纳米材料(Fe3O4/PEI-Ac NGs/DOX)。然后利用CCK-8法测定杂化纳米材料(Fe3O4/PEI-Ac NGs/DOX)及相关对比材料的细胞毒性，并对比盐酸阿霉素在4T1细胞的IC50数值。分析并对比盐酸阿霉素诱导4T1细胞凋亡情况，同时测定其体外成像性能。最后进行裸鼠体内肿瘤模型的肿瘤核磁共振成像(MRI)和化疗实验，考察所制备的杂化纳米材料(Fe3O4/PEI-Ac NGs/DOX)的体内MR成像及治疗效果。
实施例1
(1)取支化聚乙烯亚胺(272mg)和N,N'-亚甲基双丙烯酰胺(32mg)分别溶于5mL水中。待上述溶液完全溶解后，室温搅拌30min。将PEI和BIS混合溶液滴加到溶解有80(1.2g)的甲苯(60mL)中，室温下搅拌2h，混合溶液呈白色，不透明。然后再用超声破碎仪破乳。随后加入三乙胺作为催化剂引发PEI交联。混合液在室温下搅拌12-16h。通过离心(13000rpm,15min)收集纳米凝胶，再分散到甲醇中3次，除去甲苯。所得产物经截留分子量8000–14 000的透析袋对蒸馏水透析3天(2L/次，4次/天)，得到产物即PEI纳米水凝胶，记录为材料1。
(2)称取无水三氯化铁(324.4mg)在20mL一缩二乙二醇中搅拌溶解，形成均匀溶液。待三氯化铁完全溶解后加入柠檬酸三钠(235.5mg)继续搅拌，待柠檬酸三钠完全溶解后将澄清的溶液放入80℃的水浴锅中反应2小时。反应完全结束时将溶液冷却至55℃后加入乙酸钠(656mg)继续搅拌。待完全溶液溶解后转移至高温反应釜中，放入200℃烘箱内反应4小时。待反应完全结束后冷却过夜。将所得产物离心纯化，并用无水乙醇洗涤并分散3次。随后将纯化后的产物放入真空干燥箱中烘干，得到产物即超小磁性铁Fe3O4(Citric-Fe3O4)，记录为材料2。
(3)取材料2(50mg)溶于10mL超纯水中。加入EDC(75mg)避光室温搅拌15min，然后加入NHS(45mg)避光室温搅拌2h，再加入材料1(250mg，25mL)避光室温搅拌12-16h，通过离心(13 000rpm,15min)收集纳米凝胶杂化物，再分散到水中3次，除去多余的EDC/NHS。然后使用截留分子量8000-14000的透析袋对水溶液透析3天(2L/次，4次/天)后得到超小磁性铁修饰的PEI纳米凝胶Fe3O4/PEI NGs。
(4)用乙酸酐对Fe3O4/PEI NGs进行乙酰化。以三乙胺(134.1μL)为催化剂滴入Fe3O4/PEINGs(20mg,2mL)溶液中搅拌30min后，加入乙酸酐(75.9μL)后搅拌过夜。产品经截留分子量8000～14000的透析袋对水溶液透析3天(2L/次，4次/天)后得到乙酰化杂化PEI纳米凝胶Fe3O4/PEI-Ac NGs。
(5)取盐酸阿霉素(10mg)溶于超纯水中(5mL)，与实施例3中制备的乙酰化杂化聚乙烯亚胺纳米凝胶(20mg，4mL)混合，在避光条件下磁力搅拌反应24h，反应结束后通过离心(8000rpm,15min)，得到的沉淀用超纯水洗涤3次，即可得到载药纳米凝胶Fe3O4/PEI-AcNGs/DOX。
实施例2
取实施例1制备的超小磁性铁Citric-Fe3O4和Fe3O4/PEI NGs通过冷冻干燥后，使用TG209F1热重分析仪进行热重分析。从图1分析从200℃到900℃重量损失可知，Citric-Fe3O4和Fe3O4/PEI NGs在升温过程中分别损失了总质量的40.1％和63.8％。这一结果证明了超小铁与聚乙烯亚胺纳米凝胶成功聚合，且由此可知实施例1制备的超小磁性铁中柠檬酸的含量为40.1％，杂化PEI纳米凝胶中PEI的含量为23.7％。
取实施例1制备的Citric-Fe3O4、PEI NGs、Fe3O4/PEI NGs、Fe3O4/PEI-Ac NGs、Fe3O4/PEI-Ac NGs/DOX的水溶液用于测表面电势和和水动力直径。Zeta电势测定结果(表1)表明PEI NGs的表面电势为38.9±0.624mV，修饰超小铁后表面电势有所下降，为+29.3±0.88mV，进一步乙酰化后表面电势降为+13.3±1.15mV。水动力直径测定结果(表1)表明修饰超小铁后Fe3O4/PEI NGs的水动力直径较PEI NGs相比有所增加，从180.38±5.48nm增加至251.4±6.34nm，乙酰化之后水动力直径稍稍增大至263.8±3.81nm
表1.Citric-Fe3O4、PEI NGs、Fe3O4/PEI NGs、Fe3O4/PEI-Ac NGs的水动力直径和表面电势。
Sample Size(nm) PDI Zeta potential(mV)
Fe<sub>3</sub>O<sub>4</sub> 27.5±3.2 0.162±0.058 -37.9±1.35
PEI NGs 180.38±5.48 0.234±0.024 38.9±0.624
Fe<sub>3</sub>O<sub>4</sub>/PEI NGs 251.4±6.34 0.242±0.003 29.3±0.88
Fe<sub>3</sub>O<sub>4</sub>/PEI-Ac NGs 263.8±3.81 0.334±0.03 13.3±1.15
取实施例1制备的PEI NGs和Fe3O4/PEI NGs稀释到1mg/mL，各取1mL逐级稀释106倍得到稀溶液。在洁净工作台中，将制得的稀溶液滴加到超平硅片上，室温干燥24h后，使用MFP-3D原子力显微镜检测并成像。结果如图2a)所示，PEI NGs脱水后直径大小在137nm左右，Fe3O4/PEI-Ac NGs脱水后直径大小增加到157nm左右，且有良好的单分散性。原子力显微镜检测结果与水动力学直径检测结果不同原因是因为在水中纳米凝胶能吸收大量水分，并在纳米凝胶表面形成一层膜包裹并增大纳米凝胶的直径。
取实施例1中制备的Citric-Fe3O4和Fe3O4/PEI-Ac NGs，分别配置铁浓度为3.2mmol/L的母液，并逐级稀释至0.1、0.2、0.4、0.8和1.6mmol/L。使用核磁共振成像仪对制备的材料进行表征。结果如图3所示，超小铁的r1驰豫率为1.15mM-1s-1，经过与聚乙烯亚胺纳米凝胶键合之后，杂化纳米凝胶r1驰豫率2.29mM-1s-1，是超小铁r1驰豫率的近2倍。
实施例3
取实施例1中制备的Fe3O4/PEI-Ac NGs/DOX，分别用pH＝7.4和pH＝5.5的PBS缓冲液溶解成浓度为1mg/mL的溶液，取1mL放入透析袋中固定，置于含有9mL不同pH的缓冲液的容器中，放在37℃摇床中振荡。在不同时间点取样，每次取透析袋外液体1mL，测量其在480nm处吸光度，再向容器中加入对应的缓冲溶液1mL。结果如图4所示，DOX在pH＝5.5的弱酸环境中从Fe3O4/PEI-Ac NGs/DOX中累计释放了44.1±2.05％，比pH＝7.4的中性环境中累计释放量高。这说明聚乙烯亚胺纳米凝胶诊疗一体化平台具有pH响应性，即在与肿瘤组织类似的弱酸性环境中的释放速度快，累积释放率高，而在正常组织的中性环境中释放速度慢，累积释放率低。
实施例4
取对数生长期的4T1细胞以1万细胞/孔的密度接种在96孔细胞培养板，在5％CO2，37℃条件下孵育12h。弃掉培养基后，每孔更换90μL无血清培养基，并添加10μL含不同浓度的材料(最终溶液中盐酸阿霉素的浓度为2.5、5、10、20和40μg/mL)或磷酸缓冲液(对照组)。之后将细胞培养板继续放置在5％CO2，37℃继续孵育24小时。随后弃掉原培养基，加入含100μL含有10％CCK-8的新鲜培养基溶液，继续培养3h后，放置在多功能酶标仪中于测试波长450nm下测试吸光值，结果如图5所示。与磷酸缓冲液对照组相比，Fe3O4/PEI-Ac NGs在试验浓度范围内对4T1细胞没有明显细胞毒性，细胞存活率均在95％以上，说明Fe3O4/PEI-AcNGs本身不具有肿瘤细胞抑制性。与Fe3O4/PEI-Ac NGs组相比，Fe3O4/PEI-Ac NGs/DOX在试验浓度范围内对4T1细胞具有一定的细胞毒性，浓度为20μg/mL时细胞存活率为76.58％，同时盐酸阿霉素组和Fe3O4/PEI-Ac NGs/DOX组各浓度的细胞存活率较Fe3O4/PEI-Ac NGs组相比有了明显的下降，说明盐酸阿霉素的具有肿瘤细胞抑制性。同时，对比Fe3O4/PEI-Ac NGs/DOX组与Free DOX组发现，负载了盐酸阿霉素的乙酰化杂化聚乙烯纳米凝胶的肿瘤细胞抑制性要更低一些，证明乙酰化杂化聚乙烯纳米凝胶具有药物缓释效果。
实施例5
取对数生长期的4T1细胞以15万细胞/孔的密度接种在圆底玻璃培养皿中,每孔加入1.5mL培养液浸泡过夜。弃掉浸泡培养液后，置于5％CO2，37℃条件下培养24小时。弃掉培养液后，每孔更换1.5mL含10％Fe3O4/PEI-Ac NGs/DOX的培养液或PBS(对照组)。继续置于5％CO2，37℃条件下培养4小时。弃掉培养液，用无菌PBS洗1-2遍，每孔加2.5％戊二醛的PBS溶液1.5mL，静置于4℃条件下固定30分钟。弃掉戊二醛溶液，用无菌PBS洗1-2遍，加DAPI(1ug/ml)，覆盖细胞即可，静置于37℃染色15分钟。将DAPI液吸出，用无菌PBS洗3遍，用激光扫描共焦显微镜观察细胞形态及细胞内荧光分布。结果如图6所示，PBS组只有蓝色荧光，表明未有DOX进入细胞。Free DOX组有明显红色荧光出现，证明DOX已进入细胞核内。Fe3O4/PEI-Ac NGs/DOX组同样在细胞核有红色荧光出现，证明PEI纳米水凝胶诊疗一体化平台能携带DOX进入细胞，并部分释放负载DOX进入胞核。
实施例6
配制DOX浓度分别为1.25、2.5、5、10、20μg/mL的Fe3O4/PEI-Ac NGs/DOX无菌PBS溶液。紫外照射过夜杀菌，收集对数期4T1细胞，按照2.0×105cells/孔接种在12孔细胞培养板上，置于5％CO2，37℃条件下培养24小时。弃掉培养液后，每孔更换900μL培养液，并添加100μL含不同DOX浓度的Fe3O4/PEI-Ac NGs/DOX的PBS溶液或PBS(对照组)，。继续置于5％CO2，37℃条件下培养4小时。倒去培养液，用PBS洗涤3次，加入100μL胰酶消化约3分钟后，立即加入1mL左右PBS吹打并收集细胞，转移到10mL离心管中1000rpm离心5分钟，继续用1mLPBS重悬。流式细胞仪检测，得到细胞对药物的吞噬结果如图7所示，随着材料浓度的提升，DOX的平均红色荧光值也随之提升。
实施例7
取对数生长期的4T1细胞以2万细胞/孔的密度接种在48孔细胞培养板，在5％CO2，37℃条件下孵育12h。弃掉培养基后，每孔更换90μL无血清培养基，并添加10μL含不同浓度的材料(最终材料中铁的浓度为11.25、22.5、45、90μg/mL)或PBS(对照组)。之后将细胞培养板继续放置在5％CO2，37℃继续孵育24小时。随后弃掉原培养基，加入王水消化24h后，使用电感耦合等离子体原子发射光谱仪测定细胞所吞噬的铁的浓度，结果如图8所示。细胞吞噬的铁的量随着材料浓度的提高而提高。
实施例8
在BALB/c裸鼠体内构建4T1皮下瘤模型，分别通过尾静脉注射例1制备的超小磁性Fe3O4和Fe3O4/PEI-Ac NGs/DOX的缓冲液溶液(0.2mL，[Fe]＝200μg)来评价肿瘤部位MR成像效果。如图9所示，与注射前的空白组相比较，在分别注射两组材料10min后，小鼠肿瘤部位的MR信号逐渐增强。注射超小磁性Fe3O4和Fe3O4/PEI-Ac NGs/DOX的缓冲液溶液后小鼠肿瘤部位的MR信号都呈现出增强趋势(图9a)，说明超小磁性Fe3O4和Fe3O4/PEI-AcNGs/DOX可以随着血液流通在肿瘤部位富集并显示出MR信号，而Fe3O4/PEI-Ac NGs/DOX注射后在小鼠肿瘤部位的MR信号迅速增长，在30分钟左右达到峰值后缓慢递减，MR成像信号至少维持时间在75分钟。通过MR信号值定量分析结果(图9b所示)，注射后产生的MR信噪比值远远大于超小磁性Fe3O4在同时间内产生的值。
实施例9
所有动物实验均严格按照动物保护协会标准进行。实验用的4-6周的雌性BALB/c裸鼠购自上海斯莱克实验动物中心(中国，上海)。按照将培养好的对数生长期4T1细胞1.5×106细胞/鼠的剂量在白鼠右腿部注射肿瘤细胞。在肿瘤体积达到0.5-1.2cm3(大约在注射肿瘤细胞两周后)时随机将成瘤裸鼠分为4组(对照组、Free DOX组、治疗组和非载药组)，每组白鼠数量为5只，此时记作实验开始的第0天。在第1天对对照组、Free DOX组、治疗组和非载药组分别注射200μL磷酸缓冲液(PBS)、盐酸阿霉素(20μg/mL,200μL)的缓冲液溶液、Fe3O4/PEI-Ac NGs/DOX的缓冲液溶液(200μL，DOX最终浓度为20μg/mL)，Fe3O4/PEI-Ac NGs(NGs浓度与治疗组相同)的缓冲液溶液通过尾静脉注射到各组白鼠体内，记为第一次给药。间隔3天给药一次，总共给药4次。肿瘤体积每3天测量一次，小鼠重量每3天称一次。肿瘤体积以及相对肿瘤体积用下面的公式(1)和(2)分别计算。
肿瘤体积(V)＝a×b2/2 (1)
a和b分别代表肿瘤直径的最大值和最小值。
相对肿瘤体积＝V/V0 (2)
V和V0分别代表给药后的肿瘤体积和给药前的肿瘤体积。
在给药治疗30天后，每组选出代表性的小鼠，将其处死取其主要器官和肿瘤。图10A显示治疗组老鼠经治疗处理的过程。图10b说明，Free DOX组小鼠相对肿瘤体积变化较小，本发明制备的Fe3O4/PEI-Ac NGs/DOX组(治疗组)小鼠次之，Fe3O4/PEI-Ac NGs组再次之，缓冲液组小鼠相对肿瘤体积增长最大。图10c说明每组小鼠在经过15天的治疗后期重量无明显变化。图10d说明经过free DOX和Fe3O4/PEI-Ac NGs/DOX肿瘤鼠的生存期延长。综上所述，本发明制备的Fe3O4/PEI-Ac NGs/DOX具有体内抗肿瘤的能力。

Claims (10)

1.一种杂化纳米水凝胶，其特征在于，所述水凝胶为聚乙烯亚胺纳米凝胶氧化铁杂化物Fe3O4/PEI NGs。
2.一种杂化纳米水凝胶的制备方法，包括：
(1)将支化聚乙烯亚胺PEI水溶液中，加入交联剂后，室温搅拌，与溶解有80的甲苯溶液混合，室温搅拌，超声处理后，加入催化剂进行交联反应，室温搅拌12-16h，离心，透析纯化，得到PEI纳米凝胶水溶液；
(2)将柠檬酸稳定的超小磁性氧化铁溶于水中，加入EDC活化，再加入NHS避光室温搅拌，然后加入步骤(1)中PEI纳米凝胶水溶液，避光室温搅拌反应12-16h，离心，透析纯化后，得到聚乙烯亚胺纳米凝胶氧化铁杂化物Fe3O4/PEINGs。
3.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中交联剂为N,N′-亚甲基双丙烯酰胺；催化剂为三乙胺；支化聚乙烯亚胺PEI水溶液、溶解有80的甲苯溶液的质量比为1：4～1：4.1。
4.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中加入交联剂后，室温搅拌10-30min，与溶解有80的甲苯溶液混合，室温搅拌1-2h，超声处理2-5min。
5.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中EDC活化时间为15min。
6.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中EDC与柠檬酸稳定的超小磁性氧化铁中的柠檬酸的摩尔比为3：1～3.1：1；PEI纳米凝胶与柠檬酸稳定的超小磁性氧化铁的质量比为5：1～5.2：1。
7.一种权利要求2所述方法制备的杂化纳米水凝胶。
8.一种乙酰化聚乙烯亚胺纳米凝胶氧化铁杂化物，其特征在于，将权利要求1所述杂化纳米水凝胶、三乙胺混合均匀后，逐滴加入醋酸酐溶液，室温搅拌，离心和透析纯化后得到乙酰化聚乙烯亚胺纳米凝胶氧化铁杂化物。
9.一种负载药物的杂化纳米水凝胶，其特征在于，将权利要求8所述乙酰化聚乙烯亚胺纳米凝胶氧化铁杂化物和药物混合，室温避光搅拌12-16h。
10.一种权利要求9所述负载药物的杂化纳米水凝胶在制备治疗肿瘤的药物或MR成像一体化药物中的应用。
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