CN115252828A - 一种负载棉酚的团簇型超小四氧化三铁纳米粒及其制备和应用 - Google Patents
一种负载棉酚的团簇型超小四氧化三铁纳米粒及其制备和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种负载棉酚的团簇型超小四氧化三铁纳米粒及其制备和应用，通过氨基化超小四氧化三铁纳米颗粒修饰苯硼酸PBA、偶联棉酚获得。该纳米团簇联合超声靶向微泡破坏技术(UTMD)技术，可以实现增强的T1磁共振(MR)成像，同时实现增强的化学动力学治疗和化疗联合治疗，在癌症诊疗方面具有潜在临床应用价值。
Description
技术领域
本发明属于功能性纳米材料领域，特别涉及一种负载棉酚的团簇型超小四氧化三铁纳米粒及其制备和应用。
背景技术
目前临床上常用的肿瘤治疗有手术切除、放射疗法、化学疗法等。尤其是化学疗法，一直是临床上治疗原发性和转移性癌症的标准疗法。化疗药物有细胞毒性，能够促使肿瘤细胞的凋亡或坏死。然而，化学疗法引起的各种副作用和多重耐药性(MDR)使癌症治疗极易失败。另外，由于恶劣的肿瘤微环境阻碍化疗药物渗透，原癌基因突变导致癌细胞不断复制，并侵入到正常组织，对人体的正常组织和脏器造成损害。因此，单一化疗无法达到预期的肿瘤治疗效果。然而，通过纳米材料负载小分子抗癌药物构建的纳米平台具有可靶向输送药物、病灶部位药物释放量高等优点，从而可以减少正常组织损伤，提高治疗效果。
与众多的纳米载体相比，超小四氧化三铁纳米颗粒(USIO NPS)具有生物相容性良好，无组织损伤，良好的r1弛豫率等特点，并且可以通过调控超小四氧化三铁纳米(USIONPs) 颗粒的尺寸实现对磁共振(MR)成像的调控。棉酚(Gossypol)作为一种化疗药物，可下调癌细胞内抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，上调癌细胞内促凋亡蛋白p53、PTEN、Bax的表达，进而抑制癌细胞生长，具有良好的抗肿瘤作用，但是药物利用度较低。
超声靶向微泡破坏技术(Ultrasound Targeted Microbubble Destruction,UTMD)是一种促进载药纳米材料在靶向组织周围富集的技术。在超声交变声压的作用下，提前注射的微泡或微囊会产生瞬间的空化效应，使得细胞膜的通透性增加，产生非致死性的可逆开闭的声孔，纳米材料便通过声孔进入细胞发挥作用。
检索国内外文献和专利，尚未发现关于以棉酚为偶联剂制备具有ROS响应性能的超小四氧化三铁纳米团簇，以及联合UTMD技术用于肿瘤T1磁共振成像引导的化疗/化学动力学联合治疗的相关报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种负载棉酚的团簇型超小四氧化三铁纳米粒及其制备和应用。
本发明的一种负载棉酚的超小四氧化三铁纳米材料，其特征在于，所述材料为负载棉酚的团簇型超小四氧化三铁纳米粒；其中所述材料通过氨基化超小四氧化三铁纳米颗粒修饰苯硼酸PBA、偶联棉酚获得。
本发明的一种负载棉酚的超小四氧化三铁纳米材料的制备方法，包括：
(1)将超小四氧化三铁纳米颗粒超声分散在水中，经EDC和NHS活化，然后与乙二胺溶液反应，透析，浓缩，得到表面氨基化的超小四氧化三铁纳米材料USIO NPS-NH2溶液；
(2)将四溴甲基苯硼酸水溶液加入USIO NPS-NH2溶液(500-1000μg/mL)，反应12-24h，透析，得到表面修饰苯硼酸PBA的超小四氧化三铁纳米颗粒USIO NPs-PBA溶液；
(3)将棉酚溶液加入步骤(2)中USIO NPs-PBA溶液，反应，冷冻干燥，得到负载棉酚的超小四氧化三铁纳米材料(G-USIO NCs)。
上述制备方法的优选方式如下：
所述步骤(1)中所述超小四氧化三铁纳米颗粒由下列方法制备：将三氯化铁溶于溶剂中，加入柠檬酸钠，搅拌，再加入无水乙酸钠，继续搅拌，然后溶剂热反应，冷却，离心，干燥，得到超小四氧化三铁纳米颗粒USIO NPS，其中三氯化铁、溶剂、柠檬酸钠、无水乙酸钠的比例为0.62-0.66g：38-42mL：0.46-0.51g：1.3-1.4g。
所述溶剂为二甘醇；所述溶剂热反应温度为190～220℃，溶剂热反应时间为3～5h。
所述再加入无水乙酸钠前降温至50～55℃。
所述继续搅拌为：空气氛围下50～55℃搅拌30-60min，搅拌至无水乙酸钠完全溶解。
所述干燥为50-60℃真空干燥6-8h。
所述步骤(1)中经EDC和NHS活化为：先加入EDC，搅拌反应0.5-1h，再加入NHS，搅拌反应1-4h，活化羧基；与乙二胺溶液反应的温度为室温，反应时间为3-5天。
所述步骤(1)中超小四氧化三铁纳米颗粒、EDC、NHS和乙二胺的比例为50～60mg：145～155mg：90～100mg：200～220μL。
所述步骤(2)中USIO NPS-NH2溶液、四溴甲基苯硼酸的比例为7～10mL：1～3mg；所述四溴甲基苯硼酸水溶液中四溴甲基苯硼酸和溶剂水的比例为1～3mg：4～7mL。
所述步骤(2)中所述四溴甲基苯硼酸水溶液的温度为70-90℃。
所述步骤(2)反应为在70-90℃搅拌反应24-48h。
所述步骤(2)中透析为：选取截留分子量为8000-14000的纤维透析袋，透析溶液为0.01 M NaHCO3盐溶液，pH为8-9，体积为2L，24h内换水6-8次。
所述步骤(3)中反应温度为室温，时间为24-48h。
所述步骤(3)中棉酚与USIO NPs-PBA的投料摩尔比为15:1～25:1。
所述步骤(3)中超小四氧化三铁纳米团簇G-USIO NCs具有ROS响应性能。
本发明提供一种所述负载棉酚的超小四氧化三铁纳米材料在制备T1核磁共振成像造影或化疗/化学动力学治疗联合抑制肿瘤细胞增殖药物中的应用。
本发明通过溶剂热法合成表面柠檬酸稳定的超小四氧化三铁纳米颗粒(USIONPS)，并用乙二胺(EDA)对其改性，合成表面氨基化的超小四氧化三铁纳米颗粒(USIONPS-NH2)。然后进一步修饰PBA，最后以棉酚为交联剂制备具有ROS响应性的负载棉酚团簇型超小四氧化三铁纳米粒(G-USIO NCs)，G-USIO NCs联合UTMD技术用于肿瘤模型的T1 MR成像和化疗/化学动力学联合治疗。说明书附图1为G-USIO NCs的合成及作用机理图。
本发明使用Zeta电势及动态光散射分析(DLS)、红外光谱法(FT-IR)、紫外可见光谱法 (UV-vis)、热重分析(TGA)、电感耦合等离子体原子发射光谱法(ICP-OES)等手段表征制备的G-USIO NCs的物理及化学性质。并通过MR成像仪测定G-USIO NCs的T1成像性能，通过测定材料在有无过氧化氢溶液中的弛豫性能变化，测定其体外成像性能。然后利用CCK-8法评价G-USIO NCs的细胞毒性，利用ICP-OES测试细胞对材料的吞噬情况。最后建立小白鼠皮下肿瘤模型进行MR成像以及抗肿瘤实验。具体测试结果如下：
1.Zeta电势及水动力学直径测试结果
参见说明书附表1为USIO NPs、USIO NPs-NH2、USIO NPs-PBA和G-USIO NCs的水动力学直径和电势变化情况。如附表1所示，USIO NPs的电势为-44.6mV，水合粒径为122.5nm。利用乙二胺修饰后电势升高为-17.4mV，水合粒径增加到150.0nm，证明乙二胺修饰成功。当USIO NPs-NH2进一步修饰PBA后，USIO NPs-PBA的电势变为-26.5mV，水合粒径变为198.3nm，证明成功修饰PBA。最后通过棉酚偶联制备的G-USIO NCs电势变为-15.8mV，水合粒径增加到229.3nm，表明棉酚成功偶联。
2.紫外(UV-Vis)测试结果
参见说明书附图2为USIO NPs、USIO NPs-NH2、USIO-PBA、G-USIO NCs、Gossypol和PBA的紫外吸收光谱图。如附图2所示，棉酚在380nm处有吸收峰。同时通过测试结果比对，G-USIO NCs在380nm处出现明显的吸收峰，可以证明棉酚成功偶联。
3.红外(FT-IR)测试结果
参见说明书附图3为USIO NPs、USIO NPs-NH2和G-USIO NCs的红外图谱。如附图3所示，USIO NPs曲线分析如下：3500-3400cm-1的伸缩振动峰为-OH，2987-2882cm-1为亚甲基的特征吸收峰，同时C＝O的伸缩振动峰在1700cm-1。USIO NPs-NH2曲线分析如下：1546 cm-1附近有碳氮键(C-N)的特征峰，在1680cm-1出现C＝O的伸缩振动吸收峰，证明USIO NPs 表面成功修饰乙二胺(EDA)。G-USIO NCs曲线分析如下：1708cm-1附近为C＝O特征峰， 1163cm-1附近为C-O的特征峰，800cm-1、1900cm-1附近为苯环吸收的特征峰，说明负载棉酚的团簇型超小四氧化三铁纳米粒(G-USIO NCs)成功制备。
4.热重分析(TGA)测试结果
参见说明书附图4为USIO NPs、USIO NPs-NH2、USIO NPs-PBA和G-USIO NC的热重分析图。如附图4所示，USIO NPs的热损失量29.5％，USIO NPs-NH2的热损失量32.6％，于是，可以定量出EDA的修饰量为3.1％。USIO NPs-PBA的热损失量为36.3％，可以定量出 PBA在USIO NPs-NH2上修饰的量为4.0％，G-USIO NCs的热损失量为58.7％，由此定量出负载棉酚的量为4.7％。
5.材料T1弛豫性能测试结果
参见说明书附图5和6，分别为USIO NPs在不同Fe浓度下的T1 MR成像与r1弛豫率和G-USIO NCs在不同Fe浓度下(有无H2O2)的T1 MR成像与r1弛豫率。如附图5所示，MR 信号强度与Fe浓度成线性关系，并且较高的Fe浓度导致较高的MR信号强度。通过1/T1和铁浓度函数的线性拟合，计算出USIO NPs的r1为0.6mM-1s-1。如附图6所示，在加入H2O2之后G-USIONCs的r1从0.7mM-1s-1上升到1.1mM-1s-1。经分析，加入过氧化氢后，G-USIO NCs的硼酸酯键断裂，释放出分散性比原始USIO NPs更好的USIO NPs，所以G-USIO NCs 在ROS存在下能够增强T1 MR成像能力。
6.体外药物释放和铁离子释放动力学测试结果
参见说明书附图7为G-USIO NCs在pH＝6.5和7.4条件下有无过氧化氢(H2O2)的棉酚和铁离子累计释放曲线。如附图7(a)所示，G-USIO NCs在加过氧化氢且pH＝6.5和7.4 的条件下棉酚药物释放率分别为57％和49％，而在不加过氧化氢pH＝6.5和7.4的条件下药物释放率为4％和3％，有过氧化氢的条件下明显高于无过氧化氢的条件，说明G-USIO NCs 具有活性氧响应性能。如附图7(b)所示，G-USIO NCs在酸性条件下铁离子的释放率更高，说明在酸性条件下加过氧化氢更有利于铁离子的释放，提高其在肿瘤部位的化学动力学治疗效果。
7.细胞毒性实验结果
参见说明书附图8和9，分别为不同处理方式下L929细胞和4T1细胞的CCK-8细胞活力实验。如附图8所示，随着铁浓度持续升高，L929细胞活力没有显著变化，说明不影响正常细胞活力。棉酚在一定的浓度范围内，L929细胞活力没有受到抑制，说明G-USIO NCs具有良好的生物安全性。如附图9所示，各实验组的细胞活性随棉酚浓度的升高而下降，且活力低于载体组。证明G-USIO NCs能够在一定程度上有效地抑制肿瘤细胞的生长，原因可能是G-USIO NCs在弱酸性的肿瘤微环境下解离出Fe2+，与肿瘤内部高浓度的H2O2发生芬顿反应，产生·OH，并且G-USIO NCs具有ROS响应，在肿瘤微环境下释放棉酚，实现化疗和酸响应的化学动力学治疗联合治疗。在同一棉酚浓度下，G-USIO NCs+UTMD对肿瘤细胞的杀伤力更大，这是由于UTMD技术提高了癌细胞的渗透能力，提高了G-USIO NCs材料在癌细胞内的富集，起到抑制4T1细胞增殖效果。
8.细胞吞噬实验结果
参见说明书附图10为4T1细胞与USIO NPs、G-USIO NCs和G-USIO NCs+UTMD共培养4h，肿瘤细胞对纳米平台中Fe的吞噬量。如附图10所示，当Fe浓度在不断增加时， 4T1细胞对Fe的吞噬量也在增强。并且，在相同Fe浓度条件下，吞噬关系如下：G-USIO NCs +UTMD＞G-USIO NCs＞USIO NPs。结果表明，制备的G-USIO NCs能够增加4T1细胞的吞噬。同时，联合UTMD技术能够促进4T1细胞对G-USIO NCs的摄取。
9.体内肿瘤MR成像结果
参见说明书附图11和12，分别为荷瘤小鼠经尾静脉注射USIO NPs、G-USIO NCs和G-USIO NCs+UTMD后，不同时间点的体内T1 MR成像与肿瘤区域的T1 MR成像的信噪比。如附图11所示，在相同时间点，肿瘤部位的T1 MR信号强度顺序为USIO NPs＜G-USIO NCs ＜G-USIO NCs+UTMD，可以看出联合UTMD技术后，G-USIO NCs在30min T1成像效果最好。这是由于G-USIO NCs纳米簇具有良好的T1弛豫率，通过自身的(EPR)效应和UTMD 技术的联合，增强G-USIO NCs在肿瘤部位蓄积，用于肿瘤的T1 MR成像。同时在肿瘤微环境中团簇解离，释放出T1弛豫率更强的单独超小铁纳米粒，进一步增强了T1 MR成像效果，实现了增强的T1 MR成像引导下肿瘤的精准靶向治疗。随着时间的推移，USIO NPs逐渐代谢，T1 MR信号强度也逐渐降低。如附图12所示，通过测量MR信号值并计算信噪比(SNR)，定量说明G-USIO NCs纳米平台在肿瘤部位可以实现T1 MR成像。尾静脉注射30分钟后，联合UTMD技术的G-USIO NCs组，T1 MR信噪比(SNR)值最大。G-USIO NCs+UTMD 远高于USIO NPs和G-USIO NCs组的T1 MR信噪比，主要是因为G-USIO NCs纳米簇通过自身的(EPR)效应和UTMD技术的联合，增强其在肿瘤部位蓄积用于肿瘤的T1 MR成像，同时在肿瘤微环境中团簇解离，释放出T1弛豫率更强的超小四氧化三铁纳米颗粒，进一步增强了T1 MR成像效果。30分钟以后，USIO NPs逐渐被代谢导致T1 MR信号强度也逐渐降低。
10.体内组织分布结果
参见说明书附图13分别为G-USIO NCs和G-USIO NCs+UTMD纳米平台在生物体内各器官和组织的分布及代谢情况。如附图13(a)和13(b)所示，尾静脉注射材料30min后，在肿瘤部位铁元素的滞留效率达到最高，且G-USIO NCs+UTMD组的滞留效应比G-USIO NCs高，随后肿瘤部位的铁含量逐渐降低。这是由于UTMD技术能够提高细胞膜的通透性，提高G-USIONCs材料在肿瘤细胞内的富集，增加了肿瘤细胞的吞噬量，在肿瘤微环境(TME) 下分解，解离出Fe2+，逐渐通过血液循环代谢。在注射G-USIO NCs和G-USIO NCs+UTMD 组24h后，各个器官组织的铁元素含量几乎与注射前的水平一致，由此说明G-USIO NCs能够在小鼠体内通过正常代谢而清除。
11.体内肿瘤治疗结果
参见说明书附图14和15分别为荷瘤小鼠通过12天USIO NPs、Gossypol、G-USIONCs 和G-USIO NCs+UTMD纳米平台治疗的相对肿瘤体积变化和肿瘤组织图片与小鼠的相对体重变化情况。如附图14所示，相比于PBS组：联合UTMD技术的G-USIO NCs组，通过12 天的治疗，肿瘤体积最小，对肿瘤细胞的生长有明显的抑制效果。分析原因如下：UTMD技术促进G-USIO NCs在肿瘤部位的富集，通过ROS响应，在肿瘤区域裂解棉酚，进而实现了增强的化疗/化学动力学联合治疗。如附图15所示，荷瘤鼠在接受处理后的体重未见显著改变，表明这种纳米平台的良好生物安全性。
有益效果
(1)本发明反应条件易于实现，合成步骤简单，易操作，原料环保，且成本较低，具有良好的发展前景。棉酚具有二元醇结构，可以作为偶联剂与表面修饰PBA的USIO NPs通过硼酸酯键相连，形成负载棉酚的超小四氧化三铁纳米团簇(G-USIO NCs)。肿瘤微环境具有高浓度的ROS，硼酸酯键具有ROS响应性，因此G-USIO NCs具有良好的EPR效应到达肿瘤部位后，通过ROS响应，硼酸酯键断裂，实现了棉酚的精准释放和肿瘤的化疗/化学动力学治疗联合治疗及MR成像。
(2)本发明制备得到的G-USIO NCs纳米簇在弱酸性的肿瘤微环境下解离出Fe2+，与肿瘤内部高浓度的H2O2发生芬顿反应，产生·OH，实现酸响应的化学动力学治疗。
(3)本发明制备得到的G-USIO NCs纳米簇具有ROS响应性，在ROS的作用下，团簇解离，棉酚释放率为57％，一方面实现了ROS响应的化疗，另一方面减少了棉酚在正常组织中的释放，降低了化疗药物对正常组织的毒副作用。
(4)本发明制备得到的G-USIO NCs纳米簇在肿瘤部位具有良好的T1弛豫率(r1＝1.1 mM-1s-1)，通过自身的(EPR)效应和UTMD技术的联合，增强在肿瘤部位蓄积用于肿瘤的T1MR成像；同时在肿瘤微环境中团簇解离，实现增强的T1 MR成像引导下肿瘤的化疗/化学动力学治疗联合治疗。
附图说明
图1为本发明中纳米材料G-USIO NCs的合成示意图；
图2为本发明制备的USIO NPS、USIO NPS-NH2、USIO NPs-PBA、G-USIO NCs、PBA和Gossypol的紫外光谱图；
图3为本发明制备的USIO NPS、USIO NPS-NH2和G-USIO NCs的红外光谱图；
图4为本发明制备的USIO NPs、USIO NPs-NH2、USIO NPs-PBA和G-USIO NCs的热重分析图；
图5为本发明制备的USIO NPs在pH＝6.5条件下的T1弛豫率(r1)；
图6为本发明制备的G-USIO NCs在pH＝6.5及有无过氧化氢条件下的T1弛豫率(r1)；
图7为本发明制备的G-USIO NCs在不同条件下的棉酚释放率(a)和Fe释放率(b)曲线；
图8为(a)自由Gossypol和(b)USIO NPs、G-USIO NCs和G-USIO NCs+UTMD(联合UTMD辅助)与L929细胞共孵育24h后的细胞活力图；
图9为(a)自由Gossypol和(b)USIO NPs、G-USIO NCs和G-USIO NCs+UTMD(联合UTMD辅助)与4T1细胞共孵育24h后的细胞活力图；
图10为本发明制备的USIO NPs、G-USIO NCs和G-USIO NCs+UTMD(联合UTMD辅助)在不同浓度下分别与4T1细胞孵育4h后的细胞内吞Fe元素的定量分析图；
图11为本发明制备的USIO NPs、G-USIO NCs和G-USIO NCs+UTMD(联合UTMD辅助)经尾静脉注射前和注射后不同时间点小鼠肿瘤的T1 MR成像图；
图12为本发明制备的USIO NPs、G-USIO NCs和G-USIO NCs+UTMD(联合UTMD辅助)经尾静脉注射前和注射后不同时间点小鼠肿瘤部位的T1 MR信噪比变化图；
图13为本发明制备的G-USIO NCs(a)与G-USIO NCs+UTMD(联合UTMD辅助)(b) 经尾静脉注射后不同时间点荷瘤小鼠各器官及肿瘤部位铁元素的含量；
图14为本发明制备的自由Gossypol、USIO NPs、G-USIO NCs和G-USIO NCs+UTMD(联合UTMD辅助)经尾静脉注射后治疗肿瘤，记录12天内肿瘤体积变化图(a)和肿瘤实物图(b)；
图15为本发明制备的自由Gossypol、USIO NPs、G-USIO NCs和G-USIO NCs+UTMD(联合UTMD辅助)经尾静脉注射后治疗肿瘤，记录12天内小鼠体重变化情况。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
除非特殊说明，否则所有化学试剂都是可商购的，无需进一步纯化即可直接使用。氯化铁(III)购自Adamas试剂有限公司。柠檬酸钠，无水乙酸钠，乙二胺和其他试剂购自国药控股化学试剂有限公司(中国上海)。EDC和NHS购自百灵威科技有限公司(中国上海)。四溴甲基苯硼酸购自上海毕得医药科技股份有限公司。棉酚(Gossypol)购自上海麦克林生化科技有限公司。二甘醇购自国药集团化学试剂有限公司。DMEM培养基、胎牛血清(FBS,GIBCO)、青霉素-链霉素(HyClone,Thermo Scientific,Logan,UT)和胰蛋白酶0.25％溶液(HyClone)购自杭州吉诺生物医学技术有限公司(中国杭州)。C11 BODIPY 581/591购自上海宏叶生物科技有限公司(中国上海)。Cell Counting Kit-8(CCK-8)和Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒购自7Sea Biotech Co.,Ltd.(中国上海)。GSH与GSSH检测试剂盒和ROS 检测试剂盒购自上海碧云天生物公司(中国上海)。4T1细胞(鼠类乳腺癌细胞系)来自中国科学院生物化学与细胞生物学研究所。4-5周龄的裸鼠购自上海斯莱克实验动物中心(中国上海)。所有实验中使用的电阻率高于18.2MΩ.cm的水均通过实验室水净化系统(Cascada I, PALL，北京，中国)进行净化。截留分子量(MWCO)为10000的再生纤维素透析膜购自 Fisher(宾夕法尼亚州匹兹堡)
实施例1
(1)取648.8mg无水三氯化铁，然后用移液枪取一缩二乙二醇(DEG，44.72g)溶解无水三氯化铁，称取柠檬酸钠二水合物(470mg)溶解在上述溶液中，80℃条件下搅拌2h，观察柠檬酸钠二水合物完全溶解，将温度调整为55℃，继续加无水乙酸钠(1312mg)，持续搅拌使其完全溶解(40min)。到时间后将以上反应液加入高压反应釜(50mL，200℃，4 h)，打开阀门冷却降温，以13000rpm离心30min，弃上液，再用乙醇洗沉淀物配平，13000 rpm离心30min，此操作重复做3次，最后去除悬浮液，将沉淀物放在真空干燥箱中烘干 (60℃，24h)，成功制备稳定的超小铁纳米颗粒(USIO NPs)。
(2)取56mg的超小铁(USIO NPs)纳米颗粒，超纯水(16mL)充分搅拌溶解。在1 mL超纯水中加150mg的EDC溶解，并加入到上述溶液搅拌30min。滴加NHS(95mg，1mL 超纯水)在上述溶液中，USIO NPs的羧基(-COOH)被充分活化3h。然后，用移液枪取乙二胺的水溶液(217μL，2mL超纯水)，滴加到被活化的溶液中反应3d。接着，进行3d的透析提纯，最终冷冻干燥，得到氨基化的超小铁(USIO NPs-NH2)。
(3)取1.916mg四溴甲基苯硼酸(Mw＝214.852)溶在5.736mL超纯水，并置于70℃条件下直至全部溶解，并将该溶液缓慢滴加进8334μL的USIO NPs-NH2溶液中(833μg/mL)，然后快速搅拌24h。接着，进行3d的透析提纯，最终冷冻干燥，得到USIO NPs-PBA粉末。
(4)首先将5.89mg棉酚溶解在1mL无水乙醇中，然后将溶解的棉酚缓慢滴加到10mL的USIO NPs-PBA溶液中，常温反应2d。接着，进行3d的透析提纯，最终冷冻干燥，得到负载棉酚的团簇型超小四氧化三铁纳米粒(G-USIO NCs)。
实施例2
取实施例1制备的USIO NPS、USIO NPs-NH2、USIO NPs-PBA和G-USIO NCs进行水动力学直径和表面电势表征。如表1所示，USIO NPs、USIO NPs-NH2测试的电势分别为-44.6mV和-17.4mV，电势升高，证明氨基修饰成功。USIO NPs-PBA和G-USIO NCs的电势分别为-26.5mV和-15.8mV，电势升高，其次水合粒径尺寸由最初USIO NPs的122.5nm上升至G-USIO NCs的229.3nm，说明成功制备负载棉酚的团簇型超小四氧化三铁纳米粒(G-USIO NCs)。
表1.本发明制备得到的USIO NPs、USIO NPs-NH2、USIO NPs-PBA和G-USIO NCs，其水动力学直径和zeta表面电势情况。
| Sample | Zeta potential(mV) | Hydrodynamic(nm) | PDI |
| USIO NPs | -44.6±6.2 | 122.5±2.7 | 0.3±0.2 |
| USIO NPs-NH<sub>2</sub> | -17.4±0.8 | 150.0±3.7 | 0.5±0.1 |
| USIO NPs-PBA | -26.5±0.7 | 198.3±1.4 | 0.5±0.1 |
| G-USIO NCs | -15.8±0.4 | 229.3±1.4 | 0.4±0.1 |
实施例3
取实施例1中制备的USIO NPS、USIO NPs-NH2、USIO NPs-PBA、G-USIO NCs、PBA 和Gossypol进行紫外表征。如图2所示，棉酚在380nm处有吸收峰。同时通过测试结果比对，G-USIO NCs在380nm处出现明显的吸收峰，可以证明棉酚成功偶联。
实施例4
取实施例1中制备的USIO NPS、USIO NPs-NH2和G-USIO NCs进行红外表征。如图3所示，USIO NPs曲线分析如下：3500-3400cm-1的伸缩振动峰为-OH，2987-2882cm-1为亚甲基的特征吸收峰，同时C＝O的伸缩振动峰在1700cm-1。USIO NPs-NH2曲线分析如下：1546 cm-1附近有碳氮键(C-N)的特征峰，在1680cm-1出现C＝O的伸缩振动吸收峰，证明USIO NPs 表面成功修饰乙二胺(EDA)。G-USIO NCs曲线分析如下：1708cm-1附近为C＝O特征峰， 1163cm-1附近为C-O的特征峰，800cm-1、1900cm-1附近为苯环吸收的特征峰，说明负载棉酚的团簇型超小四氧化三铁纳米粒(G-USIO NCs)成功制备。
实施例5
取实施例1制备的USIO NPS、USIO NPs-NH2、USIO NPs-PBA和G-USIO NCs进行热重表征。如图4所示，USIO NPs的热损失量29.5％，USIO NPs-NH2的热损失量32.6％，可以定量出EDA在USIO NPs纳米颗粒上的修饰量为3.1％。USIO NPs-PBA的热损失量为36.3％，可以定量出PBA在USIO NPs-NH2上的修饰量为4.0％，G-USIO NCs的热损失量为58.7％，由此定量出棉酚负载量为4.7％，证明G-USIO NCs的成功制备。
实施例6
通过ICP-OES测试法测定USIO NPs和G-USIO NCs中Fe元素的含量，为测试USIONPs 和G-USIO NCs的T1弛豫率，将USIO NPs材料中Fe浓度设置如下：0.1、0.2、0.4、0.8、1.6mM梯度各1mL。接下来评估过氧化氢(H2O2)对G-USIO NCs材料的MR成像性能影响，把G-USIONCs分别制备成有H2O2和没有H2O2的浓度梯度各1mL(其中里边铁元素的浓度是0.1、0.2、0.4、0.8、1.6mM)。将H2O2(10mM)加入G-USIO NCs反应1小时后，用0.5 T上海纽迈公司NMR分析仪测量了该材料的T1弛豫时间，并进行了线性拟合法(1/T1与Fe 离子浓度关系)。测定材料的弛豫率等于斜率(即r1＝T1 MR成像的弛豫率)。如图5所示， 1/T1与Fe浓度成线性关系，并且较高的Fe浓度导致较高的MR信号强度。通过1/T1和铁浓度函数的线性拟合，计算出USIO NPs的r1为0.6mM-1s-1，说明USIO NPs具有T1 MR成像能力。如图6所示，在加入H2O2之后G-USIO NCs的r1从0.7mM-1s-1上升到1.1mM-1s-1。经分析，加入过氧化氢后，G-USIO NCs的硼酸酯键断裂，释放分散性能由于原始USIO NPs的单独USIO NPs，所以G-USIO NCs具备在肿瘤微环境实现增强T1 MR成像的能力。
实施例7
对照组首先配制pH＝7.4和pH＝6.5的磷酸盐缓冲溶液，将制备的G-USIO NCs加入上述两种不同的pH缓冲溶液(铁浓度为10μg/mL)。透析袋中溶液体积为2mL，同时实验组也制备pH＝7.4与pH＝6.5的磷酸盐缓冲溶液。把G-USIO NCs加入上述两种不同的pH缓冲溶液，接着在两种不同pH条件下加入H2O2(10mM)，制备的密封透析袋溶液体积为2mL，然后将密封袋(2mL)加入对应pH缓冲液的容器中(9mL)，恒温摇床温度设定37℃。选取以下时间点(0、0.17、0.33、0.5、0.67、0.83、1、2、3、6、12、28、48和72h)分别使用移液枪取透析袋外液1mL，并用紫外仪器测量380nm处1mL外液的吸光值，并及时补充对应pH的1mL磷酸盐缓冲溶液。采用ICP-OES测定1mL外液中Fe的含量。绘制出有无 H2O2对G-USIO NCs在不同pH条件下(7.4，6.5)的药物释放曲线和Fe离子释放曲线。如图7(a)所示，G-USIO NCs在加过氧化氢且pH＝6.5和7.4的条件下药物释放率分别为57％和49％，而在不加过氧化氢pH＝6.5和7.4的条件下药物释放率为4％和3％，有过氧化氢的条件下明显高于无过氧化氢的条件，说明G-USIONCs具有活性氧响应性能。同理，如图7 (b)所示，探究G-USIO NCs铁离子的释放情况，发现G-USIO NCs在酸性条件下铁离子的释放率更高，说明在酸性条件下加过氧化氢更有利于铁离子的释放，提高铁离子在肿瘤部位的化学动力学治疗效果。
实施例8
以L929和4T1细胞为细胞模型来评价自由Gossypol、USIO NPs、G-USIO NCs和G-USIO NCs+UTMD的细胞毒性。将4T1细胞以1×104个孔隙的密度接种96孔板中，在细胞培养箱(5％CO2，37℃)中培育12h。再将细胞培养基替换成包含特定浓度的PBS、USIO NPs、Gossypol、G-USIO NCs和G-USIO NCs+UTMD(Fe的浓度分别为10、20、30、40和50μg/mL，对应Gossypol的浓度为7.1、14.2、21.3、28.4和35.5μg/mL)的培养基。联合UTMD技术的G-USIONCs培养基配制为(新鲜培养基共1mL，含有Fe浓度分别为10、20、30、40和 50μg/mL和20％(v/v)微泡)，在1KHz PRF频率0.4W/cm2超声30秒，继续培养24h(培养箱条件为5％CO2，37℃)。24h结束后，配制混合培养基溶液(10％(v/v)CCK-8(10μL) 的无血清100μL DMEM)，继续在培养箱培养(4h)。将细胞活力100％组设置为PBS空白对照，最后在酶标仪450nm处检测每孔的吸光度。如图8所示，随着铁浓度持续升高，L929 细胞活力没有显著变化，说明不影响正常细胞活力。棉酚在一定的浓度范围内，L929细胞活力没有受到抑制，说明G-USIO NCs具有良好的生物安全性。如图9所示，各实验组的细胞活性随棉酚浓度的升高而下降，且活力低于载体组。证明G-USIO NCs能够在一定程度上有效地抑制肿瘤细胞的生长，原因可能是G-USIO NCs在弱酸性的肿瘤微环境下解离出Fe2+，与肿瘤内部高浓度的H2O2发生芬顿反应，产生·OH，并且G-USIO NCs具有ROS响应，在肿瘤微环境下释放棉酚，实现化疗和酸响应的化学动力学治疗联合治疗。在同一棉酚浓度下， G-USIO NCs+UTMD对肿瘤细胞的杀伤力更大，这是由于UTMD技术提高了肿瘤细胞的渗透能力，提高了G-USIO NCs材料在肿瘤细胞内的富集，起到抑制4T1细胞增殖效果。
实施例9
以4T1细胞为细胞模型来评价细胞对PBS、USIO NPs、G-USIO NCs和G-USIO NCs+UTMD的吞噬能力。将4T1细胞以1×105个孔隙的密度接种12孔板中，在细胞培养箱(5％ CO2，37℃)中培育12h。去掉孔板里培养基，再将细胞培养基替换成包含特定浓度的PBS、 USIONPs、G-USIO NCs和G-USIO NCs+UTMD(Fe的浓度分别为5、10、20、30和40μg/mL) 的培养基。联合UTMD技术的G-USIO NCs培养基配制为(新鲜培养基共1mL，含有Fe的浓度分别为5、10、20、30和40μg/mL和20％(v/v)微泡)，在0.4W/cm2，在1KHz PRF 频率0.4W/cm2超声30秒，继续培养4h(培养箱条件为5％CO2，37℃)。然后，倒掉孔板里的培养基，用无菌PBS清洗三次，用胰酶(Try)将该细胞处于悬浮态，随后终止(添加完全培养基)消化，离心(5分钟，1000转/分)，用PBS溶液(1mL)重悬细胞，做细胞计数。最后，王水消化细胞，用ICP-OES法检测各组铁含量，并计算细胞对每组材料Fe离子的吞噬量。如图10所示，当Fe浓度在不断增加时，4T1细胞对Fe的吞噬量也在增强。并且，在相同Fe浓度条件下，细胞吞噬Fe元素吞噬顺序如下：G-USIO NCs+UTMD＞G-USIO NCs＞USIO NPs。结果表明，制备的G-USIO NCs能够增加4T1细胞的吞噬。同时，联合 UTMD技术能够进一步促进4T1细胞对G-USIO NCs的摄取。
实施例10
以USIO NPs为对照组，评估G-USIO NCs和G-USIO NCs+UTMD在体内的MR成像性能。每组取3只小鼠模型，腹腔内注入戊巴比妥(10mg/mL)对小白鼠进行麻醉，用临床MR 系统获取T1横、纵扫的结果。然后尾静脉注射USIO NPs、G-USIO NCs和联合UTMD技术的G-USIO NCs材料组。对于联合UTMD组，首先尾静脉注射G-USIO NCs，然后尾静脉注射微泡(1.18mg/mL，0.2mL PBS)，将耦合剂涂在肿瘤表面，采用超声探头(设置为1MHz， 0.4W/cm2，2min)达到最佳治疗效果。采集T1 MR成像图和测量肿瘤部位的MR信号值，对肿瘤区域的MR信号变化进行定量探究。如图11所示，肿瘤部位的T1 MR信号强度顺序为USIO NPs＜G-USIO NCs＜G-USIONCs+UTMD，可以看出联合UTMD技术后， G-USIO NCs在30min T1成像效果最好。这是由于G-USIO NCs纳米簇具通过自身的(EPR) 效应和UTMD技术的联合，增强G-USIO NCs在肿瘤部位蓄积，用于肿瘤的T1 MR成像。同时在肿瘤微环境中团簇解离，释放出T1弛豫率更强的超小铁颗粒，进一步增强了T1 MR成像效果。随着时间的推移，USIO NPs逐渐代谢，T1 MR信号强度也逐渐降低。如图12所示，通过测量MR信号值并计算信噪比(SNR)，定量说明G-USIO NCs纳米平台在肿瘤部位可以实现T1 MR成像。尾静脉注射30分钟后，联合UTMD技术的G-USIO NCs组T1 MR信噪比 (SNR)值最大。G-USIO NCs+UTMD远高于USIO NPs和G-USIO NCs组的T1 MR信噪比，主要因为G-USIO NCs纳米簇通过自身的(EPR)效应和UTMD技术的联合，增强其在肿瘤部位蓄积用于肿瘤的T1 MR成像，同时在肿瘤微环境中团簇解离，释放出T1弛豫率更强的超小铁，进一步增强了T1 MR成像效果。30分钟以后，USIO NPs逐渐被代谢导致T1 MR信号强度也逐渐降低。
实施例11
为研究纳米材料在生物体内各器官和组织的分布及代谢情况。4T1荷瘤小鼠以相同的铁浓度(50μg/小鼠，0.2mL PBS)尾静脉注射G-USIO NCs和G-USIO NCs+UTMD。联合UTMD技术的G-USIO NCs材料组，首先尾静脉注射G-USIO NCs，然后尾静脉注射微泡(1.18mg/mL，0.2mL PBS)，将耦合剂涂在肿瘤表面，采用超声探头(设置为1MHz，0.4W/cm2，2min)达到最佳治疗效果(Fe在混合液中的浓度为50μg/mL)，注射后不同时间点(0min、15min、30 min、1h、12h和24h)处死小鼠，取出主要器官(心、肝、脾、肺和肾)及肿瘤，称重，用王水进行消化处理两周。之后，将每个样品用水稀释至10mL，并通过ICP-OES分析量化肿瘤部位的Fe含量。如图13(a)和13(b)所示，尾静脉注射材料30min后，在肿瘤部位铁元素的滞留效率达到最高，且G-USIO NCs+UTMD组的滞留效应比G-USIO NCs高，随后肿瘤部位的铁含量逐渐降低。这是由于UTMD技术能够提高细胞膜的通透性，提高G-USIO NCs材料在肿瘤细胞内的富集，增加了肿瘤细胞的吞噬量。在肿瘤微环境(TME)下分解，解离出Fe2+，逐渐通过血液循环代谢。在注射G-USIO NCs和G-USIO NCs+UTMD组24h 后，各个器官组织的铁元素含量几乎与注射前的水平一致，由此说明G-USIO NCs能够在小鼠体内通过正常代谢而清除。
实施例12
验证纳米平台(PBS、Gossypol、USIO NPs、G-USIO NCs和G-USIO NCs+UTMD)的体内抗肿瘤效果。本研究将乳腺癌的肿瘤移植到老鼠的右后腿皮下，当肿瘤生长至约100mm3时，将其分成5个小组，每个小组5只，分别是：PBS、棉酚的PBS溶液、USIO NPs的PBS 溶液、G-USIO NCs的PBS溶液、G-USIO NCs+UTMD的PBS溶液(Gossypol的浓度为 30.0mg/mL)。治疗记录如下：每3天治疗一次，2天记录一次荷瘤小鼠的体重和肿瘤体积大小(V＝L×W2/2，L为肿瘤的长度，W为肿瘤的宽度)，持续12天，绘制小鼠肿瘤体积/ 体重变化曲线。联合UTMD技术的G-USIO NCs材料组，首先尾静脉注射G-USIO NCs，然后尾静脉注射微泡(1.18mg/mL，0.2mL PBS)，将耦合剂涂在肿瘤表面，超声探头(设置为 1MHz，0.4W/cm2，2min)以达到最佳治疗效果。如图14所示，相比于PBS组：联合UTMD 技术的G-USIO NCs组，通过12天的治疗，肿瘤体积最小，对肿瘤细胞的生长有明显的抑制效果。分析原因如下：UTMD技术促进G-USIONCs在肿瘤部位的富集，通过ROS响应，在肿瘤区域裂解棉酚，进而实现肿瘤的化疗/化学动力学治疗联合治疗。如图15所示，观察荷瘤鼠在接受处理后的体重变化表明，实验动物的体重未见显著改变，表明这种纳米平台的良好生物安全性。
Claims (10)
1.一种负载棉酚的超小四氧化三铁纳米材料，其特征在于，所述材料为负载棉酚的团簇型超小四氧化三铁纳米粒；其中所述材料通过氨基化超小四氧化三铁纳米颗粒，然后修饰苯硼酸(PBA)最后偶联棉酚获得。
2.一种负载棉酚的超小四氧化三铁纳米材料的制备方法，包括：
(1)将超小四氧化三铁纳米颗粒超声分散在水中，经EDC和NHS活化，然后与乙二胺溶液反应，透析，浓缩，得到表面氨基化的超小四氧化三铁纳米材料USIO NPS-NH2溶液；
(2)将四溴甲基苯硼酸水溶液加入USIO NPS-NH2溶液，反应12-24h，透析，得到表面修饰苯硼酸PBA的超小四氧化三铁纳米颗粒USIO NPs-PBA溶液；
(3)将棉酚溶液加入步骤(2)中USIO NPs-PBA溶液，反应，冷冻干燥，得到负载棉酚的超小四氧化三铁纳米材料(G-USIO NCs)。
3.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中所述超小四氧化三铁纳米颗粒由下列方法制备：将三氯化铁溶于溶剂中，加入柠檬酸钠，搅拌，再加入无水乙酸钠，继续搅拌，然后溶剂热反应，冷却，离心，干燥，得到超小四氧化三铁纳米颗粒USIONPS，其中三氯化铁、溶剂、柠檬酸钠、无水乙酸钠的比例为0.62-0.66g：38-42mL：0.46-0.51g：1.3-1.4g。
4.根据权利要求3所述制备方法，其特征在于，所述溶剂为二甘醇；所述溶剂热反应温度为190～220℃，溶剂热反应时间为3～5h。
5.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中经EDC和NHS活化为：先加入EDC，搅拌反应0.5-1h，再加入NHS，搅拌反应1-4h；与乙二胺溶液反应的温度为室温，反应时间为3-5天。
6.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中超小四氧化三铁纳米颗粒、EDC、NHS和乙二胺的比例为50～60mg：145～155mg：90～100mg：200～220μL。
7.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中USIO NPS-NH2溶液、四溴甲基苯硼酸的比例为7～10mL：1～3mg；所述四溴甲基苯硼酸水溶液中四溴甲基苯硼酸和溶剂水的比例为1～3mg：4～7mL；所述四溴甲基苯硼酸水溶液的温度为70-90℃。
8.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中反应温度为室温，时间为24-48h。
9.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中棉酚与USIO NPs-PBA的投料摩尔比为15:1～25:1。
10.一种权利要求1所述负载棉酚的超小四氧化三铁纳米材料在制备T1核磁共振成像造影或化疗/化学动力学治疗联合抑制肿瘤细胞增殖药物中的应用。
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