CN114073767B - 一种靶向响应型治疗纳米颗粒及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种靶向响应型治疗纳米颗粒及其制备方法与应用。所述靶向响应型治疗纳米颗粒包括介孔聚多巴胺纳米颗粒、装载于介孔聚多巴胺纳米颗粒孔洞中的光敏剂和原位生长封堵介孔的二氧化锰纳米片,形成的聚多巴胺‑光敏剂‑二氧化锰纳米颗粒表面修饰有生物亲和性物质和靶向物质。所述制备方法包括:将光敏剂装载于介孔聚多巴胺纳米颗粒孔洞中,并在其表面原位生长二氧化锰纳米片,之后在聚多巴胺‑光敏剂‑二氧化锰纳米颗粒表面修饰生物亲和性物质和靶向物质。本发明的靶向响应型治疗纳米颗粒能够靶向高转移性的肿瘤细胞,具有较高的载药率和包封率,能够响应肿瘤细胞内高还原性环境,可用于原位实体瘤区域和微小转移灶的光动力治疗。
Description
技术领域
本发明涉及一种治疗纳米颗粒,特别是一种靶向高转移性肿瘤、还原响应的光动力治疗纳米颗粒、其制备方法及应用,例如在制备具有光动力治疗载体、协同治疗平台产品中的应用,属于纳米生物材料制备技术领域。
背景技术
乳腺癌是一种异质性很强的恶性肿瘤,位于全球女性肿瘤发病率之首,发病率在逐年上升,且具有年轻化的趋势,90%的乳腺癌患者最终因为远处转移而死亡。原发的乳腺癌患者在手术治疗后加以适当的放疗或者化疗,具有较好的预后结果。但是由于乳腺癌细胞丧失了正常的细胞特性,细胞之间的连接变得松散,容易脱落,进入血液系统或者淋巴系统进行转移,在远端器官,如肺,骨,肝等器官处形成转移灶,威胁患者生命。因此,构建靶向转移灶的治疗系统对高转移性肿瘤的治疗具有重要意义。
神经型钙黏附蛋白(N-cadherin)在上皮恶性肿瘤中表达上调,且与上皮细胞向间充质细胞转换(EMT)关系密切,在肿瘤的发生、浸润、转移和血管生成中发挥重要作用。近期有研究表明,乳腺癌转移过程中,肿瘤细胞的EMT具有异质性,原位肿瘤细胞会发生N-Cadherin依赖的EMT,并且发生N-Cadherin依赖的EMT的肿瘤细胞贡献形成了大部分的肺转移灶。此外,大多数上皮细胞性恶性肿瘤在获得耐药性的过程中会伴随EMT,靶向调控N-cadherin也有望用于克服肿瘤耐药。因此,为了进一步提高对转移性肿瘤的原病灶区和微小转移的治疗效率,构建针对肿瘤细胞中过表达的N-cadherin靶点的治疗系统尤为重要。
光动力治疗是一种无创的肿瘤辅助治疗手段。光敏剂在特定波长光源的照射下,与周围环境中的分子氧相互作用,产生活性氧自由基和单线态氧等,实现诱导细胞凋亡坏死、血管损伤、炎症和免疫调节等作用。但是,绝大部分光敏剂缺乏靶向性,无法在肿瘤组织大量富集,体内循环半衰期短,实体瘤内乏氧的肿瘤微环境也限制了光动力的治疗效率。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种靶向响应型治疗纳米颗粒及其制备方法,以克服现有技术中的不足。
本发明的另一目的还在于提供所述靶向响应型治疗纳米颗粒在高转移性乳腺癌中的靶向协同光动力治疗中的应用。
为实现前述发明目的,本发明采用的技术方案包括:
本发明实施例提供了一种靶向响应型治疗纳米颗粒,其包括聚多巴胺-光敏剂-二氧化锰纳米颗粒,所述聚多巴胺-光敏剂-二氧化锰纳米颗粒包括介孔聚多巴胺纳米颗粒、装载于所述介孔聚多巴胺纳米颗粒所含介孔孔洞中的光敏剂和原位生长封堵介孔的二氧化锰纳米片,并且,所述聚多巴胺-光敏剂-二氧化锰纳米颗粒表面修饰有生物亲和性物质和靶向物质。
进一步地,所述靶向响应型治疗纳米颗粒中介孔聚多巴胺纳米颗粒的含量为40~50wt%,光敏剂的含量为20~25wt%,二氧化锰纳米片的含量为20~30wt%,生物亲和性物质的含量为15~25wt%,靶向物质的含量为0.5~2wt%。
在一些实施例中,所述靶向物质具有靶向高转移性肿瘤的N-cadherin核酸适配体,所述N-cadherin核酸适配体的序列如SEQ ID NO:1所示。
在一些实施例中,所述生物亲和性物质包括两亲性离子聚合物、含有磷脂结构的细胞膜囊泡等,但不限于此。
本发明实施例还提供了一种靶向响应型治疗纳米颗粒的制备方法,其包括:
提供介孔聚多巴胺纳米颗粒;
将光敏剂装载于所述介孔聚多巴胺纳米颗粒的至少部分介孔孔洞中;
在装载有光敏剂的介孔聚多巴胺纳米颗粒表面原位生长二氧化锰纳米片,制得聚多巴胺-光敏剂-二氧化锰纳米颗粒;
至少在所述聚多巴胺-光敏剂-二氧化锰纳米颗粒表面分别修饰生物亲和性物质和靶向物质,获得所述靶向响应型治疗纳米颗粒。
在一些实施例中,所述制备方法包括:
提供表面双键功能化的聚多巴胺-光敏剂-二氧化锰纳米颗粒;
至少在所述聚多巴胺-光敏剂-二氧化锰纳米颗粒表面部分修饰生物亲和性物质;
至少在生物亲和性物质修饰的聚多巴胺-光敏剂-二氧化锰纳米颗粒表面修饰链霉亲和素;以及,
至少在链霉亲和素修饰的聚多巴胺-光敏剂-二氧化锰纳米颗粒表面修饰上具有靶向高转移性肿瘤的N-cadherin核酸适配体,获得靶向响应型治疗纳米颗粒。
本发明实施例还提供了所述靶向响应型治疗纳米颗粒于制备磁共振成像指导的靶向转移性肿瘤的光动力学治疗的产品中的用途。
进一步地,所述用途包括:将所述靶向响应型治疗纳米颗粒在20~37℃条件下,模拟肿瘤细胞还原性环境的缓冲溶液中处理后,以场强0.5~3.0T进行肿瘤的磁共振成像分析。
相应的,本发明实施例还提供了一种响应光动力学治疗剂,其包括所述靶向响应型治疗纳米颗粒。
与现有技术相比,本发明的优点包括:
1)本发明提供的利用NHS/EDC偶联在介孔聚多巴胺纳米颗粒孔洞中装载光敏剂的方法,对Ce6的载药量和包封率较直接装载提高近一倍,载药量从24%增至46.12%,包封率从48%增至92.23%;
2)本发明提供的靶向响应型治疗纳米颗粒通过二氧化锰纳米片的原位生长包覆,可以减少光敏剂在生理环境中的泄露,进入靶向细胞后,在细胞内高GSH浓度的条件下,二氧化锰纳米片被还原成二价锰离子发生解离,释放出所载的光敏剂,增加光敏剂在肿瘤细胞内的富集;此外,根据Mn2+离子产生的磁共振造影信号提示可精确施加光照,减少该治疗纳米颗粒对正常组织的副作用;
3)本发明提供的靶向响应型治疗纳米颗粒通过CBMA的修饰不仅增加体系的亲水性、阻抗巨噬细胞的非特异性内吞,还可利用其反应基团进行功能化修饰链霉亲和素,与生物素修饰的适配体发生作用增加修饰到纳米颗粒上的靶向序列或其他靶向分子;
4)较之现有技术,本发明的靶向响应型治疗纳米颗粒能够靶向高转移性的肿瘤细胞,具有较高的载药率和包封率,能够响应肿瘤细胞内高还原性环境,可用于原位实体瘤区域和微小转移灶的光动力治疗。
附图说明
为了更清楚的说明本申请实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单的介绍,显而易见,下面描述中的附图仅仅是本申请中记载的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例1中介孔聚多巴胺纳米颗粒装载光敏剂然后包覆二氧化锰纳米片的示意图;
图2a是本发明实施例1中介孔聚多巴胺纳米颗粒的透射电镜图;
图2b是本发明实施例1中介孔聚多巴胺-二氧化锰纳米颗粒的透射电镜图;
图3是本发明实施例1中介孔聚多巴胺纳米颗粒装载光敏剂Ce6前后,包覆二氧化锰纳米片前后的可见-紫外吸收光谱图;
图4是本发明实施例1中在介孔聚多巴胺-二氧化锰纳米颗粒表面逐步修饰靶向高转移肿瘤的适配体序列的工艺流程图;
图5是本发明实施例1中步骤产物CBMA的核磁共振氢谱;
图6是本发明实施例1中靶向响应型治疗纳米颗粒制备过程中的表面电势变化图;
图7a是测试例1中靶向响应型治疗纳米颗粒MPDA-Ce6@MnO2-CBMA的透射电镜图;
图7b是测试例1中靶向响应型治疗纳米颗粒MPDA-Ce6@MnO2-CBMA在pH值=5的缓冲溶液中处理30分钟后的透射电镜图;
图7c是测试例1中靶向响应型治疗纳米颗粒MPDA-Ce6@MnO2-CBMA在浓度为0.5mM的GSH还原性缓冲溶液中处理30分钟后的透射电镜图;
图7d是测试例1中靶向响应型治疗纳米颗粒MPDA-Ce6@MnO2-CBMA在浓度为2mM的GSH还原性缓冲溶液中处理30分钟后的透射电镜图;
图8是测试例1中靶向响应型治疗纳米颗粒MPDA-Ce6@MnO2-CBMA在浓度为2mM的GSH还原性缓冲溶液中处理30分钟后施加660nm激光照后生成单线态氧的随时间变化图;
图9是测试例1中靶向响应型治疗纳米颗粒MPDA-Ce6@MnO2-CBMA-apt与乳腺癌细胞MDA-MB-231共培养30分钟后的激光共聚焦照片。
具体实施方式
下文将对本发明的技术方案作更为详尽的解释说明。但是,应当理解,在本发明范围内,本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合,从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅,在此不再一一累述。
针对现有技术的诸多缺陷,本案发明人经长期研究和大量实践,得以提出本发明的技术方案。为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白,以下结合附图及实施例,对本发明进行进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。此外,下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
本发明实施例提供的一种靶向响应型治疗纳米颗粒,用于转移性肿瘤原发部位和微小转移灶的光动力治疗。本案发明人经长期研究发现,肿瘤细胞经历EMT后会高表达N-cadherin,本案发明人通过指数富集的配体系统进化技术(SELEX)体外筛选得到靶向N-cadherin的适配体序列,与纳米载体结合,用于光敏剂的靶向递送和可控响应释放。
本发明实施例的一个方面提供的一种靶向响应型治疗纳米颗粒包括聚多巴胺-光敏剂-二氧化锰纳米颗粒,所述聚多巴胺-光敏剂-二氧化锰纳米颗粒包括介孔聚多巴胺纳米颗粒、装载于所述介孔聚多巴胺纳米颗粒所含介孔孔洞中的光敏剂和原位生长封堵介孔的二氧化锰纳米片,并且,所述聚多巴胺-光敏剂-二氧化锰纳米颗粒表面修饰有生物亲和性物质和靶向物质。
在一些实施例中,在所述靶向响应型治疗纳米颗粒中,介孔聚多巴胺纳米颗粒的含量为40~50wt%,所载光敏剂占纳米颗粒的20~25wt%,二氧化锰纳米片占纳米颗粒的20~30wt%,生物亲和性物质占纳米颗粒的15~25wt%,靶向物质占纳米颗粒的0.5~2wt%。
在一些较为优选的实施方案中,至少在所述聚多巴胺-光敏剂-二氧化锰纳米颗粒表面还修饰有靶向物质。其中,通过在聚多巴胺-光敏剂-二氧化锰纳米颗粒表面修饰N-cadherin序列等靶向物质,可以修饰赋予响应治疗纳米颗粒优越的靶向性能。
在一些实施例中,所述靶向物质具有靶向高转移性肿瘤的N-cadherin核酸适配体,所述N-cadherin核酸适配体的序列如SEQ ID NO:1所示,基于工程化细胞系筛选得到的DNA核酸适配体序列具体为TTGCACTATGTTTTAGCTAGGGTTCCCTCCGGAGATAGTAAGTGCAA。
进一步地,所述靶向物质包括SELEX技术筛选得到的特定N-cadherin适配体序列。
进一步地,所述N-cadherin核酸适配体的两端修饰有荧光分子或生物素基团。
进一步地,所述生物亲和性物质与靶向物质之间通过链霉亲和素和生物素的相互作用连接。
进一步地,至少修饰在聚多巴胺-光敏剂-二氧化锰纳米颗粒表面的两性离子聚合物和靶向物质之间通过链霉亲和素和生物素的相互作用连接。
在一些较为优选的实施方案中,至少在所述聚多巴胺-光敏剂-二氧化锰纳米颗粒表面通过CBMA-链霉亲和素修饰有靶向N-Cadherin的适配体序列。
在一些实施例中,所述介孔聚多巴胺纳米颗粒的粒径为180~260nm,颗粒所含介孔孔洞的孔径为8~12nm。
在一些实施例中,所述光敏剂具有苯环结构和羧基,如羧基锌酞菁、羧基卟啉等,优选为二氢卟吩e6,但不限于此。其中,通过NHS/EDC偶联方法负载包含有羧基的光敏剂分子,可以提高介孔聚多巴胺纳米颗粒对光敏剂分子的载药量和包封率。
在一些实施例中,所述包覆于聚多巴胺外层堆叠的二氧化锰纳米片形成的聚集层的总厚度为15~40nm。该聚集体的厚度是指堆叠的二氧化锰纳米片的总厚度,该聚集体是无规则的长在多巴胺颗粒外面一圈,层层叠叠形成的。其中,原位生长的二氧化锰纳米片可以防止光敏剂分子的提前泄漏,当纳米颗粒被肿瘤细胞摄取后,二氧化锰纳米片响应细胞内高还原性的环境发生解离释放出能够产生磁共振造影信号的Mn2+,可控释放所载的光敏剂分子,实现在光敏剂在细胞内的富集量的提高。
在一些实施例中,所述生物亲和性物质包括羧酸甜菜碱类离子聚合物如CBMA、其他两亲性离子聚合物、含有磷脂结构的细胞膜囊泡等中的任意一种或两种以上的组合,但并不限于以上几种。其中,通过在聚多巴胺-光敏剂-二氧化锰纳米颗粒表面修饰CBMA等生物亲和性物质,可以提高纳米颗粒的生物相容性和稳定性,提供进一步功能化的反应位点。
进一步地,所述介孔聚多巴胺纳米颗粒对光敏剂的载药率在45%以上(即≥45%),所述介孔聚多巴胺纳米颗粒的包封率在90%以上(≥90%)。
本发明实施例的另一个方面还提供了前述靶向响应型治疗纳米颗粒的制备方法,其包括:
提供介孔聚多巴胺纳米颗粒用于装载光敏剂分子;
将光敏剂分子装载于所述介孔聚多巴胺纳米颗粒的至少部分介孔孔洞中;
在装载有光敏剂的介孔聚多巴胺纳米颗粒表面原位生长二氧化锰纳米片以封堵介孔,制得聚多巴胺-光敏剂-二氧化锰纳米颗粒;
至少在所述聚多巴胺-光敏剂-二氧化锰纳米颗粒表面分别修饰生物亲和性物质和靶向物质,获得所述靶向响应型治疗纳米颗粒。
在一些实施方案中,所述介孔聚多巴胺纳米颗粒选自采用乳化诱导的界面各向异性组装策略制备的介孔聚多巴胺纳米颗粒,即所述介孔聚多巴胺纳米颗粒是采用乳化诱导的界面各向异性组装技术制备而成的。
在一些实施方案中,所述制备方法包括:至少采用NHS/EDC偶联反应将光敏剂装载于所述介孔聚多巴胺纳米颗粒的至少部分介孔孔洞中。采用NHS/EDC偶联反应可以增加对药物分子的负载量。
进一步地,要求光敏剂药物分子带有羧基,所述光敏剂与介孔聚多巴胺纳米颗粒的质量比为1:1~1.2:1。
在一些实施方案中,所述制备方法包括:采用高锰酸钾被聚多巴胺纳米颗粒表面参与还原性基团直接还原的方法原位生长二氧化锰纳米片。具体的,该方法包括:使高锰酸钾与装载有光敏剂的介孔聚多巴胺纳米颗粒表面的还原性基团在室温下进行反应30~120分钟,从而原位生长形成所述二氧化锰纳米片,制得聚多巴胺-光敏剂-二氧化锰纳米颗粒。
进一步地,所述高锰酸钾与聚多巴胺纳米颗粒的质量比为5:1~6:1。
在一些更为优选的实施方案中,所述聚多巴胺-光敏剂-二氧化锰纳米颗粒制备方法包括以下步骤:
1)提供介孔聚多巴胺纳米颗粒用于装载光敏剂分子;
2)将光敏剂分子通过NHS/EDC偶联反应装载于介孔聚多巴胺纳米颗粒的至少部分孔洞中;
3)至少在装载了光敏剂的介孔聚多巴胺纳米颗粒表面原位生长二氧化锰纳米片封堵介孔。
其中,在一些更为具体的实施案例中,所述聚多巴胺-光敏剂-二氧化锰纳米颗粒的制备方法包括以下步骤:
1)1,3,5-三甲基苯(TMB)、嵌段聚合物F127、多巴胺单体在水和有机混合溶剂中混合均匀,超声形成胶束在碱性条件下生成介孔颗粒提供介孔聚多巴胺纳米颗粒用于装载光敏剂分子;
2)将光敏剂分子通过NHS/EDC偶联反应装载于介孔聚多巴胺纳米颗粒的至少部分孔洞中;
3)在装载了光敏剂的介孔聚多巴胺纳米颗粒表面原位生长二氧化锰纳米片封堵介孔。
在一些实施方案中,所述溶剂包括体积比为1:1的水和乙醇混合溶剂,嵌段聚合物F127的浓度为0.01g/mL混合溶剂,TMB的浓度为0.016mL/mL混合溶剂。
在一些实施方案中,所述介孔聚多巴胺纳米颗粒对光敏剂的载药量≥45%,包封率≥90%。
在一些实施方案中,所述制备方法包括:
提供表面双键功能化的聚多巴胺-光敏剂-二氧化锰纳米颗粒;
至少在所述聚多巴胺-光敏剂-二氧化锰纳米颗粒表面部分修饰生物亲和性物质;
至少在生物亲和性物质修饰的聚多巴胺-光敏剂-二氧化锰纳米颗粒表面修饰链霉亲和素;以及,
至少在链霉亲和素修饰的聚多巴胺-光敏剂-二氧化锰纳米颗粒表面修饰上具有靶向高转移性肿瘤的N-cadherin核酸适配体,获得靶向响应型治疗纳米颗粒。
在一些实施方案中,所述制备方法具体包括:采用硅烷偶联剂对聚多巴胺-光敏剂-二氧化锰纳米颗粒进行修饰,获得表面双键功能化的聚多巴胺-光敏剂-二氧化锰纳米颗粒。
在一些实施方案中,所述制备方法具体包括:使包含表面双键功能化的聚多巴胺-光敏剂-二氧化锰纳米颗粒(0.1mg/mL)、生物亲和性物质(0.5%~5%w/v)、引发剂过硫酸铵和N,N,N’,N’-四甲基乙二胺、超纯水的均匀混合反应体系在超声条件下进行引发自由基聚合反应,反应温度为35~50℃,反应时间为30~120分钟,得到生物亲和性物质修饰的聚多巴胺-光敏剂-二氧化锰纳米颗粒。
进一步地,所述引发剂包括过硫酸铵(0.1%~0.15%w/v)和N,N,N’,N’-四甲基乙二胺(0.05%~0.1%w/v),但不限于此。
进一步地,所述生物亲和性物质的浓度为0.5~5w/v%,所述过硫酸铵的浓度为0.1~0.15w/v%,所述N,N,N’,N’-四甲基乙二胺的浓度为0.05~0.1w/v%。
在一些实施方案中,所述制备方法具体包括:将生物亲和性物质修饰的聚多巴胺-光敏剂-二氧化锰纳米颗粒分散于包含EDC和NHS的PBS溶液中,常温进行NHS/EDC偶联反应20~90min后再加入链霉亲和素进行反应,得到链霉亲和素修饰的聚多巴胺-光敏剂-二氧化锰纳米颗粒。
进一步地,所述链霉亲和素的浓度为0.00005~0.0001w/v%。
在一些实施方案中,所述制备方法具体包括:向链霉亲和素修饰的聚多巴胺-光敏剂-二氧化锰纳米颗粒的PBS分散液中加入生物素基团修饰的N-cadherin核酸适配体,获得靶向响应型治疗纳米颗粒。
其中,在一些更为具体的实施案例中,所述靶向响应型治疗纳米颗粒的聚多巴胺-光敏剂-二氧化锰纳米颗粒表面还修饰有生物亲和物质和靶向分子的方法包括以下步骤:
1)在聚多巴胺-光敏剂-二氧化锰纳米颗粒表面双键功能化,提供表面双键功能化的聚多巴胺-光敏剂-二氧化锰纳米颗粒;
2)制备两亲性离子聚合物CBMA的单体并表征结构;
3)至少在聚多巴胺-光敏剂-二氧化锰纳米颗粒表面部分修饰CBMA;
4)通过NHS/EDC偶联在CBMA修饰的响应型治疗纳米颗粒表面修饰链霉亲和素SA;
5)筛选得到靶向N-cadherin的适配体序列;
6)至少在SA修饰的响应型治疗纳米颗粒表面修饰筛选得到的特定靶向N-cadherin适配体序列。
进一步地,所述双键功能化的聚多巴胺-光敏剂-二氧化锰纳米颗粒通过硅烷偶联剂修饰。
进一步地,所述制备方法包括:将N’N-二甲氨基甲基丙烯酸乙酯(DMAEM)和β-丙内酯溶解于冰丙酮中,在氮气保护下低温反应5小时得到羧酸甜菜碱离子聚合物的单体CBMA。
进一步地,CBMA在纳米粒子表面的接枝通过自由基聚合引发:将双键功能化的聚多巴胺-光敏剂-二氧化锰纳米颗粒、CBMA、引发剂过硫酸铵(APS)和N,N,N’,N’-四甲基乙二胺(TEMED)分散于/溶于水中,超声条件下引发自由基聚合,再在35~50℃的水浴中反应30~120分钟得到CBMA功能化的聚多巴胺-光敏剂-二氧化锰纳米颗粒。
进一步地,所述制备方法包括:将表面CBMA功能化的聚多巴胺-光敏剂-二氧化锰纳米颗粒分散于包含具有活化羧基的偶联试剂EDC和NHS的PBS溶液中,常温反应20-90min后,PBS清洗,然后再加入0.00005~0.0001w/v%的链霉亲和素,进行常温过夜反应,得到SA功能化的聚多巴胺-光敏剂-二氧化锰纳米颗粒。
进一步地,所述筛选得到的N-cadherin核酸适配体两端任选为荧光分子、生物素基团修饰。生物素修饰的所述N-cadherin适配体与SA功能化的聚多巴胺-光敏剂-二氧化锰纳米颗粒得到靶向响应型治疗纳米颗粒。
在一些实施方案中,在SA修饰的纳米颗粒的PBS分散液中加入生物素基团修饰的N-cadherin核酸适配体序列,避光保存于4℃冰箱中备用。
其中,在一些更为具体的实施案例中,本发明提供的一种靶向响应型治疗纳米颗粒的制备方法包括以下步骤:
1)提供以1,3,5-三甲基苯为模板剂,室温下制备的介孔聚多巴胺纳米颗粒;
2)将光敏剂二氢卟吩6通过NHS/EDC偶联装载于所述介孔聚多巴胺纳米颗粒的孔洞中;
3)至少在装载有光敏剂的介孔聚多巴胺纳米颗粒表面原位生长用于封孔和进一步修饰的二氧化锰纳米片;
4)至少使N’N-二甲氨基甲基丙烯酸乙酯和β-丙内酯反应,形成羧酸甜菜碱类离子聚合物单体CBMA;
5)在步骤3)完成后,至少在二氧化锰纳米片包覆的介孔聚多巴胺纳米颗粒表面修饰带有双键的硅烷偶联剂;
6)利用自由基激发聚合反应至少在双键修饰的二氧化锰-介孔聚多巴胺纳米颗粒表面接枝CBMA;
7)利用NHS/EDC偶联在CBMA末端修饰链霉亲和素SA;
8)利用链霉亲和素与生物素的亲和作用至少在CBMA修饰的二氧化锰-介孔聚多巴胺纳米颗粒修饰适配体序列。
本发明实施例的另一个方面还提供了前述靶向响应型治疗纳米颗粒于制备磁共振成像指导的靶向转移性肿瘤的光动力学治疗的产品中的用途。
进一步地,本发明实施例还提供了前述的靶向响应型治疗纳米颗粒于乳腺癌的光动力学治疗中的应用。
进一步地,所述用途包括:将所述靶向响应型治疗纳米颗粒在20~37℃条件下,模拟肿瘤细胞还原性环境的缓冲溶液中处理后,以场强0.5~3.0T进行肿瘤的磁共振成像分析。
进一步地,在以处理后的靶向响应型治疗纳米颗粒进行光动力学治疗中,激光器波长为660nm,光强为10~200mW/cm2,照射时间为2~20min。
相应地,本发明实施例的另一个方面还提供了一种响应光动力学治疗剂,其包括前述的靶向响应型治疗纳米颗粒。
相应地,本发明实施例还提供了一种磁共振成像指导的响应型释药的纳米颗粒,其包括前述的靶向响应型治疗纳米颗粒。
相应地,本发明实施例的另一个方面还提供了一种靶向适配体的修饰方法,其包括前述的硅烷偶联剂-CBMA-SA-Biotin-适配体逐步修饰。
本发明所述的纳米载体也可以是其他尺寸的介孔/多孔聚多巴胺纳米粒子,自聚合形成纳米粒子后仍在表面保留有多巴胺分子中的还原性基团,用其负载光敏剂或其他药物分子后原位生长二氧化锰纳米片封孔,再通过修饰生物亲和物质改善其生物相容性和稳定性,进一步修饰靶向的适配体序列或其他靶向基团用于肿瘤或其他疾病的靶向药物递送,本发明技术人员可以根据现已有的制剂技术进行。
综上所述,本发明的靶向响应型治疗纳米颗粒能够靶向高转移性的肿瘤细胞,具有较高的载药率和包封率,能够响应肿瘤细胞内高还原性环境,可用于原位实体瘤区域和微小转移灶的光动力治疗。
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚,下面结合若干优选实施例及附图对本发明的技术方案做进一步详细说明,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
在此,还需说明的是,为了避免因为不必要的细节而模糊了本发明,在附图中仅仅示出了与根据本发明的方案密切相关的结构和/或处理步骤,而省略了本发明关系不大的其他细节。
以下实施例中采用的实施条件可以根据实际需要而做进一步调整,未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。
实施例1一种响应型治疗纳米颗粒的制备方法包括如下步骤:
1、请参阅图1所示是本发明一种较为典型的实施方案中一种聚多巴胺-光敏剂-二氧化锰纳米颗粒的制备工艺原理图:
步骤一:介孔聚多巴胺纳米颗粒的制备:称取0.1g嵌段共聚物F127,0.15g盐酸多巴胺,0.16mL 1,3,5-三甲基苯(TMB)加入50mL的圆底烧瓶中,加入5mL超纯水和5mL无水乙醇。将烧瓶置于功率200W的超声清洗仪中,超声2分钟后获得白色乳液。将烧瓶转移至磁力搅拌器上,在搅拌下向烧瓶中逐滴滴加0.375mL氨水。滴加完毕后,反应液在室温下继续搅拌2个小时。反应结束后,通过离心(14500转/分钟,15分钟)收集制备得到的介孔聚多巴胺纳米颗粒(MPDA),然后用乙醇和水交替反复各洗3次,最后将颗粒分散在超纯水中,于4℃冰箱储存待用。
步骤二:介孔聚多巴胺纳米颗粒负载光敏剂:取1mg的MPDA超声分散在1mL超纯水中,室温下置于磁力搅拌器上搅拌,获得溶液A。称取1~1.2mg光敏剂二氢卟吩e6(Ce6)溶解于1mL二甲亚砜中,然后依次加入12mg EDC和24NHS,在室温下搅拌4h后获得溶液B。使光敏剂与聚多巴胺纳米颗粒的质量比为1:1~1.2:1。将溶液B滴加到溶液A中,室温下避光搅拌24小时。离心分离获得负载上Ce6的MPDA纳米颗粒,用超纯水反复超声分散离心洗至上清无色,除去未反应的NHS、EDC和没有负载上的Ce6,获得MPDA-Ce6纳米颗粒。
步骤三:MPDA纳米颗粒对Ce6的载药量和包封率的测定:首先,在容量瓶中配制一系列浓度分别为:0、0.003、0.006、0.012、0.018、0.024mg/mL的Ce6水溶液,用UV-Vis分光光度计测量上述溶液在642nm处的吸光度值,做标准曲线得到标准曲线方程。然后收集反复离心清洗MPDA-Ce6过程中得到的上清液,在容量瓶中定容至500mL。用UV-Vis分光光度计测定容量瓶中上清液的吸光度值,将其带入Ce6溶液的标准曲线方程中,计算得到该上清液中Ce6的浓度,进而得到上清液中没有被负载上的Ce6的质量。MPDA纳米颗粒的载药量和包封率分别根据以下公式计算得到:
以MPDA和Ce6的浓度为例,在两者质量为1:1时,可以计算得到MPDA对Ce6的载药量为46.12%,包封率为92.23%。
步骤四:原位生长MnO2纳米片封堵MPDA的介孔:称取5mg MPDA-Ce6纳米颗粒超声分散在5mL超纯水中,室温下置于磁力搅拌器上搅拌,获得溶液C。称取30mg高锰酸钾KMnO4溶于20mL超纯水中,获得溶液D。将溶液D在搅拌下迅速加入溶液C中,在室温下继续搅拌0.5-2小时,其中,所述高锰酸钾与聚多巴胺纳米颗粒的质量比可以是5:1~6:1。反应结束后,离心收集得到的MPDA-Ce6@MnO2纳米颗粒,用超纯水超声分散反复离心洗3次以上,除去未反应的高锰酸钾,此时得到的沉淀为深棕色。最后将MPDA-Ce6@MnO2颗粒分散在超纯水中,于4℃冰箱储存待用。
其中,介孔聚多巴胺MPDA和二氧化锰包覆的载药聚多巴胺MPDA-Ce6@MnO2纳米颗粒的透射电镜照片如图2a和图2b所示。光敏剂Ce6、MPDA、MPDA-Ce6和MPDA-Ce6@MnO2的紫外-可见吸收光谱如图3所示。
2、响应型治疗纳米颗粒的生物亲和物质和靶向序列修饰包括如下步骤:
请参阅图4所示是本发明一较为典型的实施方案中一种靶向响应型治疗纳米颗粒的制备,即响应型治疗纳米颗粒的生物亲和物质和靶向序列修饰工艺原理图。
步骤一:聚多巴胺-光敏剂-二氧化锰纳米颗粒修饰双键:将MPDA-Ce6@MnO2纳米颗粒超声分散于5mL乙醇中,置于磁力搅拌器上,滴加2%(v/v)的硅烷偶联剂甲基丙烯酸-3-(三甲氧基甲硅烷基)丙酯(MPS),室温搅拌过夜。然后离心收集双键修饰的纳米颗粒,用乙醇和水反复超声离心各洗3次得到MPDA-Ce6@MnO2-MPS,置于4℃冰箱储存待用。
步骤二:CBMA的制备:在氮气保护下,将11.89g(75.7mmol)N’N-二甲氨基甲基丙烯酸乙酯(DMAEM,98%)溶解于80mL的无水丙酮置于250mL的三口烧瓶中,冰水浴剧烈搅拌。同时将5.73g(79.5mmol)β-丙内酯溶于20mL无水丙酮置于恒压漏斗中并逐滴滴入三口烧瓶内的反应液中,随着反应的进行,有白色的沉淀生成。控制温度在15℃以下,使反应在氮气保护下持续5个小时。反应结束后,在4℃高速离心分离沉淀,粗产物分别用200mL无水丙酮以及100mL无水乙醚洗涤,最后真空抽干得到白色粉状产物7.25g,产率41.15%,于4℃冰箱储存待用。合成路线可由以下化学方程式表示:
CBMA的核磁共振氢谱如图5所示,以D2O为溶剂,典型特征峰为:δ6.01(s,1H,dCH),5.63(s,1H,dCH),4.51(t,2H,OCH2),3.65(t,2H,CH2N),3.54(t,2H,NCH2),3.05(s,6H,NCH3),2.59(t,2H,CH2COO),1.80(s,3H,dCCH3)。
步骤三:聚多巴胺-光敏剂-二氧化锰纳米颗粒表面部分接枝CBMA:MPDA-Ce6@MnO2-MPS以0.1mg/mL的浓度超声分散于5mL去离子水中,置于磁力搅拌器上搅拌,通入氮气,依次加入0.5%-5%(w/v)的CBMA,0.1%-0.15%(w/v)的过硫酸铵APS(10%w/v)和0.05%-0.1%(w/v)的N,N,N’,N’-四甲基乙二胺TEMED,橡胶塞密封插氮气球,超声1-5分钟后转移至35-50℃的水浴中继续搅拌30-120分钟。反应结束后,离心收集,用超纯水反复超声清洗3次以上,最终将产物MPDA-Ce6@MnO2-CBMA分散在超纯水中,于4℃冰箱储存待用。
步骤四:链霉亲和素修饰CBMA接枝的聚多巴胺-光敏剂-二氧化锰纳米颗粒:MPDA-Ce6@MnO2-CBMA超声分散于0.1M的EDC和0.025M的NHS的PBS缓冲液中活化20~90min,离心用PBS洗两次次之后重新分散于PBS中,然后加入0.00005-0.0001w/v%的链霉亲和素SA,常温过夜反应。离心收集MPDA-Ce6@MnO2-CBMA-SA,用PBS洗3次除去为反应的SA,重新分散于PBS中置于4℃冰箱储存待用。
步骤五:基于工程化细胞系进行N-cadherin适配体的筛选,获得与N-cadherin高亲和力的适配体序列TTGCACTATGTTTTAGCTAGGGTTCCCTCCGGAGATAGTAAGTGCAA,以N-cadherin细胞为阳性细胞,CHO/K1细胞系为对照细胞,利用流式技术考察了所筛选到的序列对不同细胞之间的特异性作用。以肺转移的人乳腺癌细胞MDA-MB-231为例,将已培养两天而且生长状态良好的MDA-MB-231细胞利用0.25%的胰酶消化,然后弃去胰蛋白酶液,加入新鲜的培养液并将细胞吹打均匀后进行细胞计数,调整细胞悬液至4×105/mL。将0.5mL细胞悬液在1000rpm条件下离心5min去除培养基,然后加入100μL 2X结合缓冲液以及100μL500nM的荧光修饰的靶向适配体序列和相同碱基数的随机序列,4℃条件下进行孵育50min,然后用700μL洗涤缓冲液进行离心清洗,并加入350μL洗涤缓冲液进行流式分析。流式数据结果表明所筛选到的靶向序列与MDA-MB-231系具有较强的特异性作用。
步骤六:靶向序列修饰响应型治疗纳米颗粒:订购一端生物素修饰或一端生物素修饰/另一端荧光分子FITC修饰的靶向序列;将MPDA-Ce6@MnO2-CBMA-SA分散于PBS缓冲溶液中,加入生物素修饰的适配体序列,搅拌30min后避光保存于4℃冰箱待用。
通过马尔文激光粒度仪测定该实施例所获各材料(MPDA、MPDA@MnO2、MPDA@MnO2-MPS、MPDA@MnO2-CBMA和MPDA-Ce6@MnO2-CBMA)的表面电势的变化,如图6所示。结果显示每步表面修饰过程都伴随着材料表面电势的变化,充分表明二氧化锰纳米片、双键和CBMA成功修饰在颗粒表面。
性能测试例一
为了确定靶向响应型治疗纳米颗粒能够响应肿瘤酸性微环境或肿瘤细胞内高还原性的环境,本案发明人将所述响应型治疗纳米颗粒MPDA-Ce6@MnO2-CBMA在25℃室温条件下,置于模拟肿瘤弱酸性微环境(pH=5),肿瘤细胞中还原性环境(谷胱甘肽(GSH)浓度=0.5mM和GSH浓度=2mM)的缓冲溶液中处理30min后,离心收集处理后的纳米颗粒,加超纯水超声洗2次除去多余盐溶液,将离心得到的沉淀超声分散于适量的乙醇中,滴一滴于300目的碳支撑膜铜网上,烘干后用透射电镜表征响应后纳米颗粒的形貌。结果如图7a-图7d所示,弱酸性或还原性环境都能导致纳米颗粒的破碎和分解,当置于模拟肿瘤细胞内高还原性环境(肿瘤细胞内GSH浓度为2-10mM),纳米颗粒可几乎全部分解释放出Mn2+和所载药物分子。
性能测试例二
为了验证所述的靶向响应型治疗纳米粒在肿瘤组织或肿瘤细胞内响应后能够启动MRI信号,本案发明人在0.5T的MRI测试仪上测试本发明所获的响应型治疗纳米颗粒与2mM GSH孵育24小时之前和之后的纵向弛豫时间T1及T1加权成像,其操作方法包括:
分别配制Mn浓度为0.17~0.68mmol/L(mmol/L可简写为mM)的上述两种样品,在0.5T的MRI测试仪上测试后,以锰离子浓度为横坐标,纵向弛豫时间的倒数为纵坐标进行线性拟合得到本发明的造影剂与GSH孵育前以及孵育后的纵向弛豫率分别为1.7906mM-1·s-1和9.5063mM-1·s-1,可见本发明的靶向响应型治疗纳米颗粒与GSH孵育后其纵向弛豫率升高,即纳米颗粒崩解释放出Mn2+产生纵向弛豫信号。
性能测试例三
为表征所述的靶向响应型治疗纳米颗粒响应释放后能够有效生成杀伤肿瘤细胞的1O2,将所述响应型治疗纳米颗粒MPDA-Ce6@MnO2-CBMA在25℃室温条件下,置于模拟肿瘤细胞中还原性环境(GSH浓度=2mM)的缓冲溶液中处理30min后,加入单线态氧探针DPBF(浓度=20μM),在波长为660nm、光强为100mW/cm2的近红外光激光器下照射不同时间,取不同时间点的含有DPBF的混合溶液用紫外-可见吸收光谱扫描表征,获得DPBF的吸收峰和吸收强度随光照时间变化的光谱图,表明单线态氧的生成,结果如图8所示,即纳米颗粒崩解后释放出所载光敏剂Ce6,在光照下与周围的氧分子生成单线态氧导致探针吸收强度的减弱。
性能测试例四
以N-cadherin阳性细胞MDA-MB-231细胞为模型细胞,将所述靶向响应型治疗纳米颗粒MPDA-Ce6@MnO2-CBMA-Apt按50μg/mL的浓度与细胞共培养30min,然后弃去培养基,用PBS洗3次之后加入5μg/mL的细胞核染色液Hoechst33342在细胞培养箱中孵育10min后,用PBS洗3次后用激光共聚焦显微镜观察,结果如图9所示,在靶向序列的帮助下,纳米颗粒30min内就大量在MDA-MB-231细胞表面富集,有部分纳米颗粒可在细胞胞浆中观察到。同时,该靶向响应型治疗纳米颗粒具有良好的生物相容性,可以保持细胞的活性。
性能测试例五
以N-cadherin阳性细胞MDA-MB-231细胞为模型细胞,在96孔板中以8000细胞/孔的密度种入细胞悬液100μL,将96孔板置于CO2培养箱中,在37℃中培养24小时。将所述靶向响应型治疗纳米颗粒MPDA-Ce6@MnO2-CBMA-Apt灭菌后按10、25、50、100、175、250μg/mL的浓度分散在培养基中。24h后弃去培养基,然后再将不同浓度的纳米颗粒分散液加入到96孔板中,每孔加100μL,对照组加入100μL完全培养基,继续培养24h。最后弃去培养基,每孔加入100μL新鲜培养基,然后每孔加入10μL WST,置于培养箱中培养2h,用酶标仪测定450nm处的OD值。每个材料浓度组做5个平行样。根据OD值计算细胞的相对存活率。空白组即不加细胞及纳米颗粒分散液,对照组即不加纳米颗粒的培养基溶液。
细胞相对存活率(%)=100×(实验组OD-空白组OD)/(对照组OD-空白组OD)
MDA-MB-231细胞与该实施纳米颗粒孵育后的存活率有浓度依赖性,至50μg/mL时仍在95%以上,表明该实施例纳米颗粒的细胞毒性很低。
性能测试例六
以N-cadherin阳性细胞MDA-MB-231细胞为模型细胞,用实施例7中所叙述的WST方法测定施加光照后的治疗纳米颗粒的细胞毒性。
在96孔板中以8000细胞/孔的密度种入细胞悬液100μL后置于培养箱中培养24h。然后弃去培养基,每孔加入浓度为10、25、50、100、175、250μg/mL的靶向响应型治疗纳米颗粒的分散液。放入培养箱继续培养12h后,取出96孔板,在波长为660nm、光强为100mW/cm2的近红外光激光器下照射10-30分钟,然后放回培养箱继续培养12h。最后弃去培养基,每孔加入100μL新鲜培养基,然后每孔加入10μL WST,置于培养箱中培养2h,用酶标仪测定450nm处的OD值。每个材料浓度组做3个平行样。根据实施例7中的公示OD值计算细胞的相对存活率。以施加波长为660nm、光强为100mW/cm2的近红外光照射10分钟为例,光照组的细胞存活率从非光照对照组的82.6%降至58.2%,表明所述的靶向响应型治疗纳米颗粒被细胞摄取后能够释放出所载的光敏剂,在激光照射下发挥光动治疗效果,杀伤肿瘤细胞。
性能测试例七
将本实施例制得的靶向响应型治疗纳米颗粒用于活体裸鼠的磁共振成像和肿瘤的光动力学治疗。培育无胸腺裸鼠并进行肿瘤植入,待肿瘤直径达到约5mm。将长瘤裸鼠腹腔注射氨基甲酸酯溶液使裸鼠麻醉,并将裸鼠固定到固定器上,于尾静脉注射200μL含靶向响应型治疗纳米颗粒的生理盐水溶液,然后将裸鼠转移到1.5T(可以是0.5~3.0T)小动物磁共振成像仪进行扫描成像,温度保持为35℃(可以是20~37℃)。得到随时间变化的磁共振成像结果。将荷瘤裸鼠分别进行尾静脉注射制备的靶向响应型治疗纳米颗粒,根据MRI成像信号最强时得到的时间点,采用660nm光垂直均匀照射肿瘤20min。光强为100mW/cm2。光照后,继续在SPF条件下饲养裸鼠。7天后,重复一次上述实验步骤,共治疗3次,总周期为28天,得到靶向响应型治疗纳米颗粒对肿瘤的光动力学治疗结果。
其中涉及的未说明部分与现有技术相同或采用现有技术加以实现。
本发明的各方面、实施例、特征及实例应视为在所有方面为说明性的且不打算限制本发明,本发明的范围仅由权利要求书界定。在不背离所主张的本发明的精神及范围的情况下,所属领域的技术人员将明了其它实施例、修改及使用。
在本发明案中标题及章节的使用不意味着限制本发明;每一章节可应用于本发明的任何方面、实施例或特征。
在本发明案通篇中,在将组合物描述为具有、包含或包括特定组份之处或者在将过程描述为具有、包含或包括特定过程步骤之处,预期本发明教示的组合物也基本上由所叙述组份组成或由所叙述组份组成,且本发明教示的过程也基本上由所叙述过程步骤组成或由所叙述过程步骤组组成。
应理解,各步骤的次序或执行特定动作的次序并非十分重要,只要本发明教示保持可操作即可。此外,可同时进行两个或两个以上步骤或动作。
此外,本案发明人还利用前文所列出的其它工艺条件等替代实施例1中的相应工艺条件进行了相应试验,所需要验证的内容和与实施例1产品均接近。故而此处不对各个实施例的验证内容进行逐一说明,仅以实施例1作为代表说明本发明申请优异之处。
尽管已参考说明性实施例描述了本发明,但所属领域的技术人员将理解,在不背离本发明的精神及范围的情况下可做出各种其它改变、省略及/或添加且可用实质等效物替代所述实施例的元件。另外,可在不背离本发明的范围的情况下做出许多修改以使特定情形或材料适应本发明的教示。因此,本文并不打算将本发明限制于用于执行本发明的所揭示特定实施例,而是打算使本发明将包含归属于所附权利要求书的范围内的所有实施例。
序列表
<110> 中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所
<120> 一种靶向响应型治疗纳米颗粒及其制备方法与应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 1
ttgcactatg ttttagctag ggttccctcc ggagatagta agtgcaa 47
Claims (19)
1.一种靶向响应型治疗纳米颗粒,其特征在于包括聚多巴胺-光敏剂-二氧化锰纳米颗粒,所述聚多巴胺-光敏剂-二氧化锰纳米颗粒包括介孔聚多巴胺纳米颗粒、装载于所述介孔聚多巴胺纳米颗粒所含介孔孔洞中的光敏剂和原位生长封堵介孔的二氧化锰纳米片,并且,所述聚多巴胺-光敏剂-二氧化锰纳米颗粒表面修饰有生物亲和性物质和靶向物质;
所述介孔聚多巴胺纳米颗粒的粒径为180~260 nm,所含介孔孔洞的孔径为8~12 nm;
包覆于聚多巴胺外层堆叠的二氧化锰纳米片形成的聚集层的总厚度为15~40 nm;
所述靶向物质为靶向高转移性肿瘤的N-cadherin核酸适配体,所述N-cadherin核酸适配体的序列如SEQ ID NO:1所示;
所述介孔聚多巴胺纳米颗粒对光敏剂的载药率在45%以上,所述介孔聚多巴胺纳米颗粒的包封率在90%以上。
2. 根据权利要求1所述的靶向响应型治疗纳米颗粒,其特征在于:所述靶向响应型治疗纳米颗粒中介孔聚多巴胺纳米颗粒的含量为40~50 wt%,光敏剂的含量为20~25 wt%,二氧化锰纳米片的含量为20~30 wt%,生物亲和性物质的含量为15~25 wt%,靶向物质的含量为0.5~2 wt%。
3.根据权利要求1所述的靶向响应型治疗纳米颗粒,其特征在于:所述N-cadherin核酸适配体的两端修饰有荧光分子或生物素基团;所述生物亲和性物质与靶向物质之间通过链霉亲和素和生物素的相互作用连接。
4.根据权利要求1所述的靶向响应型治疗纳米颗粒,其特征在于:所述光敏剂选自羧基锌酞菁和/或羧基卟啉。
5.根据权利要求4所述的靶向响应型治疗纳米颗粒,其特征在于:所述光敏剂为二氢卟吩e6。
6.根据权利要求1所述的靶向响应型治疗纳米颗粒,其特征在于:所述生物亲和性物质为羧酸甜菜碱离子聚合物。
7.如权利要求1-6中任一项所述靶向响应型治疗纳米颗粒的制备方法,其特征在于包括:
提供介孔聚多巴胺纳米颗粒;
将光敏剂装载于所述介孔聚多巴胺纳米颗粒的至少部分介孔孔洞中;
在装载有光敏剂的介孔聚多巴胺纳米颗粒表面原位生长二氧化锰纳米片,制得聚多巴胺-光敏剂-二氧化锰纳米颗粒;
至少在所述聚多巴胺-光敏剂-二氧化锰纳米颗粒表面分别修饰生物亲和性物质和靶向物质,获得所述靶向响应型治疗纳米颗粒。
8.根据权利要求7所述的制备方法,其特征在于:所述介孔聚多巴胺纳米颗粒是采用乳化诱导的界面各向异性组装技术制备而成的。
9.根据权利要求7所述的制备方法,其特征在于包括:至少采用NHS/EDC偶联反应将光敏剂装载于所述介孔聚多巴胺纳米颗粒的至少部分介孔孔洞中。
10.根据权利要求7所述的制备方法,其特征在于:所述光敏剂与介孔聚多巴胺纳米颗粒的质量比为1:1~1.2:1。
11.根据权利要求7所述的制备方法,其特征在于包括:使高锰酸钾与装载有光敏剂的介孔聚多巴胺纳米颗粒表面的还原性基团在室温下反应30~120min,从而原位生长形成所述二氧化锰纳米片,制得所述聚多巴胺-光敏剂-二氧化锰纳米颗粒;其中,所述高锰酸钾与聚多巴胺纳米颗粒的质量比为5:1~6:1。
12.根据权利要求7所述的制备方法,其特征在于包括:
提供表面双键功能化的聚多巴胺-光敏剂-二氧化锰纳米颗粒;
至少在所述聚多巴胺-光敏剂-二氧化锰纳米颗粒表面部分修饰生物亲和性物质;
至少在生物亲和性物质修饰的聚多巴胺-光敏剂-二氧化锰纳米颗粒表面修饰链霉亲和素;以及,
至少在链霉亲和素修饰的聚多巴胺-光敏剂-二氧化锰纳米颗粒表面修饰上靶向高转移性肿瘤的N-cadherin核酸适配体,获得靶向响应型治疗纳米颗粒。
13.根据权利要求12所述的制备方法,其特征在于具体包括:采用硅烷偶联剂对聚多巴胺-光敏剂-二氧化锰纳米颗粒进行修饰,获得表面双键功能化的聚多巴胺-光敏剂-二氧化锰纳米颗粒。
14. 根据权利要求12所述的制备方法,其特征在于具体包括:使包含表面双键功能化的聚多巴胺-光敏剂-二氧化锰纳米颗粒、生物亲和性物质、引发剂和水的均匀混合反应体系在超声条件下进行引发自由基聚合反应,得到生物亲和性物质修饰的聚多巴胺-光敏剂-二氧化锰纳米颗粒;其中,所述引发剂选自过硫酸铵和/或N,N,N’,N’-四甲基乙二胺;所述自由基聚合反应的温度为35~50 oC,反应时间为30~120min;所述生物亲和性物质的浓度为0.5~5 w/v%;所述过硫酸铵的浓度为0.1~0.15 w/v%;所述N,N,N’,N’-四甲基乙二胺的浓度为0.05~0.1 w/v%。
15. 根据权利要求12所述的制备方法,其特征在于具体包括:将生物亲和性物质修饰的聚多巴胺-光敏剂-二氧化锰纳米颗粒分散于包含EDC和NHS的PBS溶液中,常温进行NHS/EDC偶联反应20~90 min后再加入链霉亲和素进行反应,得到链霉亲和素修饰的聚多巴胺-光敏剂-二氧化锰纳米颗粒;其中,所述链霉亲和素的浓度为0.00005~0.0001w/v%。
16.根据权利要求12所述的制备方法,其特征在于具体包括:向链霉亲和素修饰的聚多巴胺-光敏剂-二氧化锰纳米颗粒的PBS分散液中加入生物素基团修饰的N-cadherin核酸适配体,获得靶向响应型治疗纳米颗粒。
17.权利要求1-6中任一项所述的靶向响应型治疗纳米颗粒于制备磁共振成像指导的靶向转移性肿瘤的光动力学治疗的产品中的用途。
18. 根据权利要求17所述的用途,其特征在于,所述用途包括:将所述靶向响应型治疗纳米颗粒在20~37℃条件下,模拟肿瘤细胞还原性环境的缓冲溶液中处理后,以场强0.5~3.0 T进行肿瘤的磁共振成像分析;其中,在以处理后的靶向响应型治疗纳米颗粒进行光动力学治疗中,激光器波长为660 nm,光强为10~200 mW/cm2,照射时间为2~20 min。
19.一种响应光动力学治疗剂,其特征在于包括权利要求1-6中任一项所述的靶向响应型治疗纳米颗粒。
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CN107670040A (zh) * | 2017-10-25 | 2018-02-09 | 深圳先进技术研究院 | 金纳米笼‑二氧化锰复合纳米颗粒及其制备方法和应用 |
CN110857335A (zh) * | 2018-08-07 | 2020-03-03 | 中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所 | 二维金属-有机骨架结构纳米片及其制备方法与应用 |
CN109364245A (zh) * | 2018-09-04 | 2019-02-22 | 中山大学 | 一种聚多巴胺纳米诊疗剂及其制备方法 |
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