CN113499452B - 一种负载金和二氧化锰纳米颗粒的聚n-乙烯基己内酰胺纳米凝胶及其制备和应用 - Google Patents

一种负载金和二氧化锰纳米颗粒的聚n-乙烯基己内酰胺纳米凝胶及其制备和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种负载金和二氧化锰纳米颗粒的聚N‑乙烯基己内酰胺纳米凝胶及其制备方法和应用。该纳米凝胶包括：金纳米颗粒、二氧化锰纳米颗粒、乙酰乙酸甲基丙烯酸乙二醇酯和聚N‑乙烯基己内酰胺纳米凝胶。该方法包括：聚N‑乙烯基己内酰胺纳米凝胶制备，载金纳米颗粒的聚N‑乙烯基己内酰胺纳米凝胶制备，负载金和二氧化锰纳米颗粒的聚N‑乙烯基己内酰胺纳米凝胶制备。该方法工艺简单，易于操作分离，同时原料来源广泛，具有良好的发展应用前景；制备得到的纳米凝胶具有良好的胶体稳定性、细胞相容性、良好的X射线衰减性、较高的r1弛豫率以及良好的“全过程”放疗增敏性。

Description

一种负载金和二氧化锰纳米颗粒的聚N-乙烯基己内酰胺纳米 凝胶及其制备和应用
技术领域
本发明属于纳米诊疗剂及其制备和应用领域，特别涉及一种负载金和二氧化锰纳米颗粒的聚N-乙烯基己内酰胺纳米凝胶及其制备方法和应用。
背景技术
随着人类生活环境污染日趋加剧，恶性肿瘤(癌症)已经成为严重威胁人类健康的公共卫生问题之一。放疗是利用放射线进行局部肿瘤治疗的一种方法，直到目前仍是恶性肿瘤重要的局部治疗方法。据统计，大约70％的癌症病人在治疗癌症的不同阶段需要放疗。但在临床治疗过程中，其疗效常常受到射线辐射剂量的限制，过低的辐射剂量可能会导致肿瘤无法完全根除并导致肿瘤复发或转移，而过高的辐射剂量可能会损害周围的健康组织并产生其他毒副作用。据研究表明，肿瘤组织常有供血不足及乏氧细胞比率高的问题，而细胞的含氧状态对放疗杀伤作用有很大影响，乏氧肿瘤细胞抵抗电离辐射能力是含氧量正常的肿瘤细胞的2～3倍，另外，乏氧细胞在照射后自身修复能力更强。因此，乏氧细胞的存在不仅容易导致放疗失败，而且也容易导致基因突变和肿瘤转移的发生。还有研究表明，肿瘤区域的癌细胞常处于不同的细胞增殖周期中，而处在不同增殖周期的细胞对射线的敏感程度也不一致。最敏感的是M期细胞，G2期细胞对射线的敏感性接近M期，S期细胞对射线敏感性最差。所以，在放疗过程中，有很大一部分的癌细胞可逃避放射损伤，从而导致放疗后肿瘤再生长和复发。因此，克服肿瘤乏氧，增强肿瘤细胞对射线的敏感性，在较低的辐射剂量下实现肿瘤放疗增敏，具有重大科学意义和应用前景。
近年来，随着纳米材料在生物医学应用中的蓬勃发展，大量研究表明多功能纳米材料可作为放疗增敏剂，通过光电效应、热效应或调节乏氧等手段，直接或间接增强各类射线对乏氧肿瘤细胞的杀伤，且可降低放射线对正常组织的伤害，由此提高放疗疗效，具有巨大的研究价值与临床转化前景。金纳米粒子因具有较高的原子序数(Z＝79)和较大的光电吸收截面积，可以产生更强的辐射增强效果，成为近年来人们关注的焦点。例如Chang等人(Chang et al.,ACS Nano,2017,11,5,4848–4858)通过整合金纳米棒的放射增敏特性和硒纳米颗粒的抗肿瘤活性，设计出核壳结构的金/硒纳米复合体系，并将表面修饰双靶向分子作为一种新型的纳米放疗增敏剂，实现靶向肿瘤的放化疗联合治疗。该纳米放疗增敏剂和X射线联合应用能够通过死亡受体途径诱导肿瘤细胞凋亡并促进活性氧(ROS)过量产生，从而激活下游ROS介导的信号通路，大大提高抗肿瘤活性。
将氧气直接递送到肿瘤区域，是改善肿瘤乏氧最直接的方法。但是，由于生物体内环境的复杂性以及大部分纳米材料溶氧和蓄氧能力不足等问题，大部分氧气并不能有效到达肿瘤部位。近年来，利用肿瘤微环境原位产生氧气的新型纳米材料已被设计用于增加肿瘤细胞周围的氧分子浓度，直接有效改善肿瘤部位的乏氧情况，从而增强放疗疗效。例如Liu等人(Liu et al.,Inorg.Chem.,2020,59,3482-3493)设计合成了一种含有氧缺陷的超薄氧化铋纳米片(BiO2-x)。由于氧缺陷的存在，BiO2-x纳米片具有类过氧化氢酶活性，可以催化肿瘤微环境中双氧水产生氧气，改善肿瘤乏氧，下调乏氧诱导因子HIF-1α表达，提高肿瘤放疗敏感性。另外，目前研究报道的众多放疗增敏剂中，多数仅能在放疗过程中的某一阶段起到增敏的作用。例如Huang等人(ACS Nano,2019,13,1342-1353)制备了一种Cu2-xSe-Au纳米颗粒，在X射线照射下，Au纳米颗粒能够增强光电和康普顿效应，从而放大射线对DNA的损伤效果；Song等人(Nano Lett.2016,16,6145-6153)通过氟化碳将氧气带入肿瘤区域，在超声作用下，释放氧气改善肿瘤内乏氧环境，增强了肿瘤对X射线的敏感性，从而增强肿瘤的放疗效果。但是，这些单一的放疗增敏过程往往只能起到暂时抑制肿瘤生长的目的，无法防止肿瘤的进一步复发或转移。因此，设计一种能对放疗进行“全过程”(放疗前增强肿瘤细胞对X射线的敏感性，在放疗过程中增强X射线对细胞DNA的破坏作用，在放疗后进一步抑制DNA修复，巩固放疗效果)增敏的新型纳米材料，具有重大的研究意义。
纳米凝胶是由亲水性或两亲性的高分子链通过物理或者化学交联的方式组成的三维网状结构的水凝胶颗粒。良好的胶体稳定性、生物相容性、高负载能力、易于多功能化、易被细胞吞噬、易进入肿瘤组织等，促进了其在生物医学领域中的应用。目前已有多个报道将无机纳米颗粒与水凝胶相结合用于肿瘤的诊疗应用。本课题组之前的文献报道(Zhanget al.,ACS Appl.Mater.Interfaces,2020,12,8,9107–9117)，以聚乙烯亚胺纳米水凝胶为载体，修饰MR造影分子Gd-DTPA和靶向分子叶酸，并原位负载硫化铜纳米颗粒，可用于MR增强成像的造影剂，快速显示肿瘤位置，为光热治疗提供精准的肿瘤定位；在波长1064nm激光照射下，局部产生的高热可使肿瘤完全消融。
检索国内外有关CT/MR双模态造影剂以及肿瘤放疗增敏方面的文献和专利结果表明：目前尚未发现关于负载金和二氧化锰纳米颗粒的聚N-乙烯基己内酰胺纳米凝胶的制备，以及其用于CT/MR双模态成像和“全过程”放疗增敏方面的报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种负载金和二氧化锰纳米颗粒的聚N-乙烯基己内酰胺纳米凝胶及其制备方法和应用，以克服现有技术中纳米诊疗剂放疗敏感性低等缺陷。
本发明提供一种负载金和二氧化锰纳米颗粒的聚N-乙烯基己内酰胺纳米凝胶，所述纳米凝胶包括：金纳米颗粒、二氧化锰纳米颗粒、乙酰乙酸甲基丙烯酸乙二醇酯和聚N-乙烯基己内酰胺纳米凝胶；所述乙酰乙酸甲基丙烯酸乙二醇酯作为共聚单体通过沉淀聚合的方法均匀分布在聚N-乙烯基己内酰胺纳米凝胶中，所述金纳米颗粒和二氧化锰纳米颗粒原位负载在纳米凝胶内部。
本发明还提供一种负载金和二氧化锰纳米颗粒的聚N-乙烯基己内酰胺纳米凝胶的制备方法，包括：
(1)将表面活性剂、交联剂、一半量的乙酰乙酸甲基丙烯酸乙二醇酯AAEM和N-乙烯基己内酰胺VCL溶解于水中，在N2环境下搅拌，加入引发剂搅拌，加入另一半量的AAEM，继续搅拌反应，冷却，透析，冻干，得到聚N-乙烯基己内酰胺纳米凝胶PVCL NGs；
(2)将步骤(1)中PVCL NGs分散在在超纯水中，加入氯金酸溶液搅拌，加入硼氢化钠溶液，继续搅拌反应，离心，透析，冻干，得到载金纳米颗粒的聚N-乙烯基己内酰胺纳米凝胶PVCL-Au NGs；
(3)将步骤(2)中PVCL-Au NGs分散在超纯水中，加入高锰酸钾溶液，搅拌反应，透析，冻干，得到负载金和二氧化锰纳米颗粒的聚N-乙烯基己内酰胺纳米凝胶PVCL-Au-MnO2NGs。
优选地，上述方法中，所述步骤(1)中表面活性剂为十二烷基硫酸钠。
优选地，上述方法中，所述步骤(1)中交联剂为N,N-亚甲基双丙烯酰胺。
优选地，上述方法中，所述步骤(1)中引发剂为偶氮二羧乙基-2-异丁基脒水合物ACMA。
优选地，上述方法中，所述步骤(1)中交联剂、表面活性剂、VCL和AAEM的摩尔比为1:0.1～0.5:30～40:3～5。
优选地，上述方法中，所述步骤(1)中在N2环境下搅拌温度为50～70℃，搅拌时间为20～40min。
优选地，上述方法中，所述步骤(1)中加入引发剂搅拌时间为2～5min。
优选地，上述方法中，所述步骤(1)中继续搅拌反应时间为2～5h。
优选地，上述方法中，所述步骤(1)、(2)和(3)中透析是采用截留分子量为8-14kDa透析袋，透析时间为2～5d。
优选地，上述方法中，所述步骤(2)中氯金酸、硼氢化钠和PVCL NGs的质量比为1:1～5:5～10。
优选地，上述方法中，所述步骤(2)中搅拌温度为2～10℃，搅拌时间为0.5～2h。
优选地，上述方法中，所述步骤(2)中继续搅拌反应温度为2～10℃，反应时间为5～10h。
优选地，上述方法中，所述步骤(2)中离心采用低速离心，除去未负载的金纳米颗粒，离心转速为1000～3000rpm。
优选地，上述方法中，所述步骤(3)中高锰酸钾和PVCL-Au NGs的质量比为1:10～15。
优选地，上述方法中，所述步骤(3)中搅拌反应温度为室温，搅拌反应时间为5～10h。
本发明还提供一种负载金和二氧化锰纳米颗粒的聚N-乙烯基己内酰胺纳米凝胶在制备具有CT/MR双模态成像和“全过程”放疗增敏的诊疗剂中的应用。
本发明针对肿瘤放疗抵抗问题，设计合成能够克服肿瘤乏氧，调节肿瘤细胞周期，进而增强肿瘤细胞对射线敏感性的复合纳米凝胶材料。以聚N-乙烯基己内酰胺纳米凝胶为载体，构建负载金和二氧化锰纳米颗粒的多功能杂化纳米材料，实现肿瘤分子影像功能和“全过程”放疗增敏效果，从而实现肿瘤的精准诊断和高效治疗一体化。
本发明首先通过沉淀聚合的方法制备合成富含乙酰乙酸甲基丙烯酸乙二醇酯(AAEM)的聚N-乙烯基己内酰胺(PVCL)纳米凝胶，然后将三价金离子与AAEM络合并经硼氢化钠还原形成负载金纳米颗粒的聚N-乙烯基己内酰胺纳米凝胶(PVCL-Au NGs)；最后利用纳米凝胶中的β-二羰基原位还原高锰酸钾形成负载金和二氧化锰纳米颗粒的聚N-乙烯基己内酰胺纳米凝胶(PVCL-Au-MnO2 NGs)。
本发明使用Zeta电势及动态光散射分析(DLS)、紫外可见吸收光谱(UV-Vis)、X射线光电子能谱(XPS)、场发射扫描电子显微镜(SEM)和透射电子显微镜(TEM)等手段表征制备的负载金和二氧化锰纳米颗粒的聚N-乙烯基己内酰胺纳米凝胶(PVCL-Au-MnO2 NGs)，同时测定纳米凝胶的体外成像性能。然后利用CCK-8法评价纳米凝胶的细胞毒性，利用生物透射电镜(Bio-TEM)评价细胞对纳米凝胶的吞噬情况。通过流式细胞术检测放疗前纳米凝胶对细胞增殖周期的调节情况，同时对比纳米凝胶联合放疗处理后细胞的凋亡以及DNA损伤和修复情况，并通过克隆实验计算放疗增敏比。最后进行裸鼠体内肿瘤模型的成像和抗肿瘤实验，考察所制备的纳米凝胶在裸鼠体内的成像效果以及放疗增敏效果。PVCL-Au-MnO2NGs的合成以及体内放疗增敏效果示意图如图1所示。具体测试结果如下：
1.Zeta电势及水动力学直径测试结果
参见说明书附图2，PVCL NGs的表面电势为-5.31mV，水动力学直径为207.2nm。负载金纳米颗粒后，表面电势变为-7.25mV，水动力学直径变为215.3nm，表明了金纳米颗粒的成功负载。进一步原位负载二氧化锰纳米颗粒后，表面电势变为-9.73mV，水动力学直径变为220.7nm，表明二氧化锰纳米颗粒的成功负载。说明书图3为PVCL NGs、PVCL-Au NGs和PVCL-Au-MnO2 NGs在水中存储不同时间的粒径变化图，在储存长达30天后，三种纳米凝胶的尺寸并未发生较大变化，表明纳米凝胶良好的胶体稳定性。
2.XPS测试结果
参见说明书附图4a，在PVCL-Au-MnO2 NGs的XPS谱图中，相比于PVCL NGs的谱图明显多出了金和锰元素的特征峰，说明了金和二氧化锰纳米颗粒的成功负载。说明书附图4b显示，在Mn元素的2p1/2和2p3/2轨道信号在653.3和641.5eV处具有明显的吸收峰，表明PVCL-Au-MnO2 NGs中Mn元素的主要价态是4+价。
3.SEM和TEM测试结果
参见说明书附图5，SEM图显示所制备的PVCL NGs形态均匀，呈规则的圆球状。根据SEM图统计得出的粒径分布直方图可知，PVCL NGs的尺寸分布均匀，粒径分布较窄(107.3±2.4nm)。说明书附图6为合成的PVCL-Au-MnO2 NGs的TEM图，表明负载金和二氧化锰纳米颗粒后，纳米凝胶依然呈圆球形，尺寸也没有发生显著变化，从放大图中可清晰观察到纳米颗粒在纳米凝胶中均匀分布。
4.体外氧气生成性能评价
将PVCL NGs、PVCL-Au NGs和PVCL-Au-MnO2 NGs分别分散于水中(1mg/mL)，并调节pH至6.5。随后，向各溶液中加入H2O2，使得H2O2浓度为100×10-6M，之后用溶氧仪记录各溶液中的氧气变化情况。参见说明书附图7，与对照组(单独H2O2)相比，PVCL-Au-MnO2 NGs组中的溶解氧浓度显著升高，表明本发明合成的PVCL-Au-MnO2 NGs在酸性条件下能够很好地催化H2O2，并产生氧气。相反，PVCL NGs和PVCL-Au NGs组中的氧气浓度没有明显变化，表明PVCLNGs和PVCL-Au NGs无法催化H2O2产生氧气。
5.体外成像性能评价
配制Mn浓度为0.0625、0.125、0.25、0.5和1.0mM的PVCL-Au-MnO2 NGs的水溶液，通过磁共振成像分析仪测定含不同Mn浓度的材料在不同环境下(不同pH及有无谷胱甘肽GSH存在)的T1弛豫效应(如图8)。通过计算后得出PVCL-Au-MnO2 NGs在无GSH、pH值为7.4和6.5环境中的r1值分别为0.06和3.37mM-1s-1；在有GSH，pH值为7.4和6.5环境中的r1值分别为6.69和14.04mM-1s-1。表明PVCL-Au-MnO2 NGs在肿瘤微环境下(酸性、GSH)，拥有良好的T1造影性能。为了检测PVCL-Au-MnO2 NGs的CT成像效果，分别配制Au浓度依次为5、10、20、30和60mM的PVCL-Au-MnO2 NGs水溶液，然后用CT成像仪测定不同浓度的PVCL-Au-MnO2 NGs的X-射线衰减特性。如图9所示，PVCL-Au-MnO2 NGs展现出了较高的X-射线衰减系数，表明其具有良好的CT成像性能。
6.细胞相容性和材料吞噬评价
参见说明书附图10，以小鼠成纤维细胞L929和小鼠胰腺癌细胞Pan02为细胞模型，利用CCK-8法研究不同浓度的PVCL NGs、PVCL-Au NGs、PVCL-MnO2 NGs和PVCL-Au-MnO2 NGs对细胞的毒性，以PBS处理的细胞作为对照组。与对照组相比，PVCL NGs、PVCL-Au NGs、PVCL-MnO2 NGs和PVCL-Au-MnO2 NGs在试验浓度范围内对L929细胞没有显著细胞毒性，细胞存活率均在85％以上，说明PVCL NGs、PVCL-Au NGs、PVCL-MnO2 NGs和PVCL-Au-MnO2 NGs对正常细胞具有良好的细胞相容性。当以Pan02为细胞模型时，与对照组相比，PVCL NGs和PVCL-Au NGs在实验浓度范围内均未表现出明显毒性，而PVCL-MnO2 NGs和PVCL-Au-MnO2NGs随着NGs的浓度升高逐渐开始对Pan02细胞表现出了细胞毒性。当PVCL-MnO2 NGs和PVCL-Au-MnO2 NGs浓度为400μg/mL时，Pan02细胞的细胞存活率约为70％。表明Mn2+在Pan02细胞中产生的·OH对细胞具有一定毒性。如图11所示，和PBS孵育的细胞相比，PVCL-Au-MnO2 NGs孵育后细胞的细胞质中可明显观察到被吞噬的球形凝胶材料，表明PVCL-Au-MnO2NGs能够被Pan02细胞吞噬。
7.细胞周期调节效果评价
参见说明书附图12，将PVCL NGs、PVCL-Au NGs、PVCL-MnO2 NGs和PVCL-Au-MnO2NGs和Pan02细胞共孵育12h，以PBS处理的细胞作为对照组。处理后的细胞，与对照组相比，PVCL NGs和PVCL-Au NGs处理的细胞并未表现出较大的细胞周期分布变化，说明PVCL NGs和PVCL-Au NGs无法调节细胞的周期。相反，PVCL-MnO2 NGs和PVCL-Au-MnO2 NGs处理后，处于G2/M期的细胞比率大大提高，说明PVCL-MnO2 NGs和PVCL-Au-MnO2 NGs可显著调节细胞周期，使细胞周期处于对放疗最为敏感的G2/M期。
8.放疗增敏比以及细胞凋亡检测
参见说明书附图13，研究辐射剂量对细胞存活分数的影响，结果表明随着辐射剂量的增强，不同组别中的细胞存活分数均有下降，其中PVCL-Au-MnO2 NGs联合放疗组中的细胞存活分数下降最为明显，进一步利用经典的单击多靶模型确定PVCL-Au-MnO2 NGs的辐射增敏比(SER)为1.49。参见说明书附图14，在无X射线的情况下，对照组未表现出明显的凋亡现象，而在经过X射线处理后，经不同类型纳米凝胶材料孵育后的细胞均表现出了凋亡。其中，单独X射线照射组的凋亡率为21.5％，PVCL-Au NGs组的凋亡率约为30.3％，PVCL-MnO2 NGs组的凋亡率为31.5％，PVCL-Au-MnO2 NGs组的凋亡率为42.4％。
9.DNA损伤以及修复抑制效果评价
将2×105的Pan02细胞种在激光共聚焦皿上培养过夜后，将制备的PVCL NGs、PVCL-Au NGs、PVCL-MnO2 NGs和PVCL-Au-MnO2 NGs(200μg/mL)和Pan02细胞共培养12h。之后倒掉培养基，经PBS洗涤3次，换上新的培养基后经4Gy的X射线处理，每组分别再各培养0、1和24h后，细胞经PBS洗涤3次，用多聚甲醛固定30min，再加入1％的Triton X-100，增加细胞的通透性。之后，再用1％的牛血清蛋白处理1h，然后加入γ-H2AX抗体，4℃孵育过夜。然后，加入山羊抗小鼠IgG(H&L)二抗，并用DAPI染细胞核。最后，将处理后的各组细胞置于激光共聚焦显微镜下观察。用ImageJ软件对细胞中γ-H2AX数目进行统计。如图15，各组细胞在经X射线照射后，均表现出了明显的DNA损伤，其中PVCL-Au-MnO2 NGs组的DNA损伤效果最明显。在X射线照射24h后，各组细胞的DNA均有不同程度的修复。相比其他组，PVCL-Au-MnO2 NGs组对DNA的修复抑制效果最为明显。
10.体内成像性能评价
在裸鼠体内构建Pan02皮下瘤模型，通过尾静脉注射PVCL-Au-MnO2 NGs的PBS溶液(100μL，[Mn]＝10mM)来评价肿瘤部位MR成像效果(参见附图16)。如图16a和b所示，与注射前相比，在注射PVCL-Au-MnO2 NGs 24h后，小鼠肿瘤部位的MR信号明显增强，信噪比(SNR)为88.7，远大于注射前(SNR＝22.5)。之后，评价了PVCL-Au-MnO2 NGs通过小鼠尾静脉注射后(100μL，[Au]＝10mM)在肿瘤部位的CT成像效果。如图17所示，在注射PVCL-Au-MnO2NGs24 h后，小鼠肿瘤部位的CT信号明显增强(436.28HU)，远远高于注射前肿瘤部位的CT信号值(21.74HU)。上述结果说明PVCL-Au-MnO2 NGs在荷瘤鼠体内有良好的肿瘤MR和CT成像效果，可以作为造影剂应用于体内肿瘤成像。
11.体内抗肿瘤效果评价
说明书附图18a显示了荷瘤鼠模型的构建以及“全过程”放疗增敏的治疗过程。如图18b所示，PVCL-Au-MnO2 NGs通过尾静脉注射进小鼠体内后，主要能够被肝脏和脾脏代谢，在注射24小时后，材料在小鼠肿瘤部位富集量达到最高值。附图18c说明，本发明制备的PVCL-Au-MnO2 NGs结合放疗处理后能够明显抑制小鼠肿瘤的生长，单独放疗组，PVCL NGs+放疗组和单独PVCL-Au-MnO2 NGs组在抑制了肿瘤生长一段时间后，肿瘤继续增长，而空白对照组和PVCL NGs处理组的肿瘤体积增长最大。附图18d说明，PVCL-Au-MnO2 NGs结合放疗处理后，小鼠的肿瘤质量最小。上述结果表明，本发明制备的PVCL-Au-MnO2 NGs具有良好的放疗增敏效果。
有益效果
(1)本发明工艺简单，易于操作分离，同时原料来源广泛，具有良好的发展应用前景；
(2)本发明制备得到的负载金和二氧化锰的聚N-乙烯基己内酰胺纳米凝胶，具有良好的胶体稳定性和细胞相容性，具有良好的X射线衰减性能以及在肿瘤微环境下具有较高的r1弛豫率，可应用于CT/MR双模态成像；
(3)本发明利用杂化纳米水凝胶进行了肿瘤的放疗增敏研究，其在放疗前可显著调节细胞周期，使细胞周期处于对放疗最为敏感的G2/M期，并在放疗过程中通过纳米金颗粒的增强的光电和康普顿效放大射线对DNA的损伤效果。同时，由于该杂化纳米凝胶在肿瘤区域能够持续催化释放氧气，在放疗后能够进一步抑制DNA修复，巩固放疗效果，最终达到良好的“全过程”放疗增敏效果，具有潜在的临床应用价值。
附图说明
图1为本发明制备的PVCL-Au-MnO2 NGs的合成以及体内放疗增强效果示意图；
图2为本发明制备的PVCL NGs、PVCL-Au NGs和PVCL-Au-MnO2 NGs的Zeta电位图(a)和粒径分布图(b)；
图3为本发明制备的PVCL NGs、PVCL-Au NGs和PVCL-Au-MnO2 NGs在水中分散不同时间的粒径变化图；
图4为本发明制备的PVCL NGs和PVCL-Au-MnO2 NGs的XPS图(a)和Mn元素的XPS图(b)；
图5为本发明制备的PVCL NGs的SEM图(a)和粒径分布图(b)；
图6为本发明制备的PVCL-Au-MnO2 NGs的TEM图，其中插图为高倍数下PVCL-Au-MnO2 NGs的TEM图；
图7为本发明制备的PVCL NGs、PVCL-Au NGs和PVCL-Au-MnO2 NGs和H2O2混合后20min内溶液中溶解氧的浓度变化图；
图8为本发明制备的PVCL-Au-MnO2 NGs在不同条件下的T1弛豫时间的倒数随Mn浓度变化的线性关系图；
图9为本发明在不同Au浓度下，PVCL-Au-MnO2 NGs的CT成像图以及CT值与Au浓度之间的线性关系图；
图10为本发明制备的PVCL NGs、PVCL-Au NGs、PVCL-MnO2 NGs和PVCL-Au-MnO2 NGs经CCK8法测得L929细胞(a)和Pan02细胞(b)在不同NG浓度(0-400μg/mL)下处理24h后的细胞活力；
图11为本发明制备的PVCL-Au-MnO2 NGs和Pan02细胞共孵育6h后细胞的TEM图；
图12为本发明制备的PVCL NGs、PVCL-Au NGs、PVCL-MnO2 NGs和PVCL-Au-MnO2 NGs和Pan02细胞共孵育12h后细胞周期的分布图；
图13为本发明单独X射线辐照及杂化凝胶材料(200μg/mL)联合X射线辐照的克隆拟合细胞存活分数曲线(a)以及细胞经不同杂化凝胶材料+X射线辐照处理后的增敏比图(b)；
图14为本发明Pan02细胞经单独X射线辐射以及经PVCL-Au NGs、PVCL-MnO2 NGs和PVCL-Au-MnO2 NGs处理并经X射线辐射后的细胞流式检测分析图；
图15为本发明Pan02细胞经单独X射线辐射以及经PVCL-Au NGs、PVCL-MnO2 NGs和PVCL-Au-MnO2 NGs处理并经X射线辐射后不同时间点(0、1和24h)的细胞DNA损伤统计图；
图16为本发明制备的PVCL-Au-MnO2 NGs的PBS溶液(100μL，[Mn]＝10mM)经尾静脉注射前和注射24h后小鼠肿瘤的MR成像图(a)以及相应的肿瘤部位信噪比(b)；
图17为将本发明制备的PVCL-Au-MnO2 NGs的PBS溶液(100μL，[Au]＝10mM)经尾静脉注射前和注射24h后小鼠肿瘤的CT成像图；
图18为荷瘤鼠模型构建及放疗增敏治疗过程示意图(a)，PVCL-Au-MnO2 NGs通过小鼠尾静脉注射后48h内在小鼠体内的分布情况图(b)，治疗20天内小鼠的相对肿瘤体积变化图(c)和治疗20天后小鼠肿瘤的质量统计图(d)。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
除非特殊说明，否则所有化学试剂都是可商购的，无需进一步纯化即可直接使用。N-乙烯基己内酰胺(VCL)、N,N－亚甲基双丙烯酰胺(BIS)、十二烷基硫酸钠、硼氢化钠和高锰酸钾均购自百灵威科技有限公司。乙酰乙酸甲基丙烯酸乙二醇酯(AAEM)和谷胱甘肽购自梯希爱(上海)化成工业有限公司。偶氮二羧乙基-2-异丁基脒水合物(ACMA)购自Wako日本和光纯药工业株式会社。三水合氯金酸、亚甲基蓝和双氧水购自国药集团化学试剂有限公司。透析袋购自美国SECOMA公司。Pan02细胞(小鼠胰腺癌细胞)购自国家生物医学实验细胞资源库。L929细胞(小鼠成纤维细胞)购自中科院-上海生化与细胞所。磷酸盐缓冲液(PBS)购自迪申生物技术(上海)有限公司。胎牛血清购自美国Gibco公司。RPMI-1640培养基、DMEM培养基、胰蛋白酶和青霉素-链霉素双抗均购自美国HyClone公司。细胞增殖检测试剂盒(CCK-8)和细胞周期检测试剂盒购自上海碧云天生物有限公司。
实施例1
(1)取469.5mg N-乙烯基己内酰胺(VCL)，14.5mg N,N-亚甲基双丙烯酰胺(BIS)和8.8mg十二烷基硫酸钠溶解于30mL提前除氧的超纯水中，向其中加入3mL乙酰乙酸甲基丙烯酸乙二醇酯的水溶液(AAEM，14mg/mL)，在N2环境下，70℃搅拌30min。然后，向上述溶液中加入1.5mL偶氮二羧乙基-2-异丁基脒的水溶液(ACMA，11.7mg/mL)。搅拌反应5min后，向溶液中加入3mL AAEM的水溶液(14mg/mL)，继续搅拌反应4h。之后，将反应后的溶液置于8-14kDa透析袋中透析3d，冷冻干燥得到聚N-乙烯基己内酰胺纳米凝胶PVCL NGs。
(2)取步骤(1)中制备的PVCL NGs(100mg)分散在18mL超纯水中，然后滴加1mL氯金酸水溶液(15mg/mL)，冰浴搅拌30min，然后向其中快速加入2mL硼氢化钠的冰水溶液(22.5mg/mL)作为还原剂，搅拌过夜。之后，将反应后的溶液置于8-14kDa透析袋中透析3d，冷冻干燥得到负载金纳米颗粒的聚N-乙烯基己内酰胺纳米凝胶PVCL-Au NGs。
(3)取步骤(2)中制备的PVCL-Au NGs(15mg)分散在3mL超纯水中，然后缓慢滴加200μL高锰酸钾水溶液(38mM)，搅拌过夜。之后，将反应后的溶液置于8-14kDa透析袋中透析3d，冷冻干燥得到负载金和二氧化锰纳米颗粒的聚N-乙烯基己内酰胺纳米凝胶(PVCL-Au-MnO2 NGs)。
实施例2
取实施例1制备的PVCL NGs、PVCL-Au NGs和PVCL-Au-MnO2 NGs溶液(500μg/mL)，用于测表面电势和水动力直径。测定结果(图2)表明，PVCL NGs的表面电势为-5.31mV，水动力学直径为207.2nm。负载金纳米颗粒后，表面电势变为-7.25mV，水动力学直径变为215.3nm，表明了金纳米颗粒的成功负载。进一步原位负载二氧化锰纳米颗粒后，表面电势变为-9.73mV，水动力学直径变为220.7nm，表明二氧化锰纳米颗粒的成功负载。同时，PVCLNGs、PVCL-Au NGs和PVCL-Au-MnO2 NGs在水中存储长达30天后，尺寸并未发生较大变化(图3)，表明纳米凝胶良好的胶体稳定性。之后，测定了实施例1制备的PVCL NGs和PVCL-Au-MnO2 NGs的XPS谱图(图4a)。相比于PVCL NGs的谱图，在PVCL-Au-MnO2 NGs的XPS谱图中明显多出了金和锰元素的特征峰，说明了金和二氧化锰纳米颗粒的成功负载。图4b显示，在Mn元素的2p1/2和2p3/2轨道信号在653.3和641.5eV处具有明显的吸收峰，表明PVCL-Au-MnO2NGs中Mn元素的主要价态是4+价。随后通过SEM观察PVCL NGs的形态(图5a)，结果表明所制备的PVCL NGs形态均匀，呈规则的圆球状。根据SEM图统计得出的粒径分布直方图(图5b)可知，PVCL NGs的尺寸分布均匀，粒径分布较窄(107.3±2.4nm)。TEM结果(图6)显示，负载金和二氧化锰纳米颗粒后，得到的PVCL-Au-MnO2 NGs依然呈圆球形，尺寸也没有发生显著变化，从放大图中可清晰观察到纳米颗粒在纳米凝胶中均匀分布。
实施例3
将PVCL NGs、PVCL-Au NGs和PVCL-Au-MnO2 NGs分别分散于水中(1mg/mL)，并调节pH至6.5。随后，向各溶液中加入H2O2，使得H2O2浓度为100×10-6M，之后用溶氧仪记录各溶液中的氧气变化情况。参见说明书附图7，与对照组(单独H2O2)相比，PVCL-Au-MnO2 NGs组中的溶解氧浓度显著升高，表明本发明合成的PVCL-Au-MnO2 NGs在酸性条件下能够很好地催化H2O2，并产生氧气。相反，PVCL NGs和PVCL-Au NGs组中的氧气浓度没有明显变化，表明PVCLNGs和PVCL-Au NGs无法催化H2O2产生氧气。
实施例4
分别配制Mn浓度为0.0625、0.125、0.25、0.5和1.0mM的PVCL-Au-MnO2 NGs的水溶液，通过磁共振成像分析仪测定含不同Mn浓度的材料在不同环境下(不同pH和有无还原型谷胱甘肽GSH存在)的T1弛豫效应(图8)。通过计算后得出PVCL-Au-MnO2 NGs在无GSH，pH值为7.4和6.5环境中的r1值分别为0.06和3.37mM-1s-1；在有GSH，pH值为7.4和6.5环境中的r1值分别为6.69和14.04mM-1s-1。表明PVCL-Au-MnO2 NGs在肿瘤微环境下(弱酸性和GSH)，拥有良好的T1造影性能。为了检测PVCL-Au-MnO2 NGs的CT成像效果，分别配制Au浓度依次为5、10、20、30和60mM的PVCL-Au-MnO2 NGs水溶液，然后用CT成像仪测定不同浓度的PVCL-Au-MnO2NGs的X-射线衰减特性。如图9所示，PVCL-Au-MnO2 NGs展现出了较高的X-射线衰减系数，表明其具有良好的CT成像性能。
实施例5
收集对数生长期L929和Pan02细胞，按照1×104细胞每孔的密度接种在96孔细胞培养板上，置于5％CO2，37℃条件下孵育24小时。弃掉培养基后，每孔更换90μL培养基，并添加10μL含不同浓度的纳米凝胶(最终纳米凝胶浓度为6.25、12.5、25、50、100、200、300、400μg/mL)或纯PBS(对照组)。之后将细胞培养板继续放置在5％CO2，37℃继续孵育24小时。随后弃掉原培养基，加入含10μL CCK-8的新鲜培养基溶液100μL，继续培养2h后，放置在多功能酶标仪中于测试波长450nm下测试吸光值，结果如图10所示。与对照组相比，PVCL NGs、PVCL-Au NGs、PVCL-MnO2 NGs和PVCL-Au-MnO2 NGs在试验浓度范围内对L929细胞没有显著细胞毒性，细胞存活率均在85％以上，说明PVCL NGs、PVCL-Au NGs、PVCL-MnO2 NGs和PVCL-Au-MnO2 NGs对正常细胞具有良好的细胞相容性。当以Pan02为细胞模型时，与对照组相比，PVCL NGs和PVCL-Au NGs在实验浓度范围内均未表现出明显毒性，而PVCL-MnO2 NGs和PVCL-Au-MnO2 NGs随着NGs的浓度升高逐渐开始对Pan02细胞表现出了细胞毒性。当PVCL-MnO2 NGs和PVCL-Au-MnO2 NGs浓度为400μg/mL时，Pan02细胞的细胞存活率约为70％。表明Mn2+在Pan02细胞中产生的·OH对细胞能产生一定毒性。
将1×106的Pan02细胞种在6孔板上培养过夜后，将制备的PVCL-Au-MnO2 NGs(100μg/mL)和Pan02细胞共培养6h。之后倒掉培养基，用PBS洗涤三遍后，将细胞用细胞刮刀刮下，1500-3000转离心5-10min，收集细胞于管底肉眼可见2-3粒大米状样品，弃上清，沿管壁缓慢加入4℃预冷的2.5％的戊二醛溶液，固定，脱水，包埋，切片，晾干后在透射电镜下观察。如图11所示，和PBS孵育的细胞相比，PVCL-Au-MnO2 NGs孵育后细胞的细胞质中可明显观察到被吞噬的球形凝胶材料，表明PVCL-Au-MnO2 NGs能够被Pan02细胞吞噬。
实施例6
将2×105的Pan02细胞种在6孔板上培养过夜后，将制备的PVCL-Au-MnO2 NGs(100μg/mL)和Pan02细胞共培养12h。之后将细胞洗涤，消化，离心，收集在1.5mL离心管中。向管中加入1mL冰浴预冷的70％乙醇固定细胞，固定12h。将细胞离心，洗涤3遍，吸除上清，每孔加入0.5mL碘化吡啶染色液，重悬细胞，37℃避光温浴30min。随后用流式细胞仪检测，分析细胞周期。如图12，处理后的细胞，与对照组相比，PVCL NGs和PVCL-Au NGs处理的细胞并未表现出较大的细胞周期分布变化，说明PVCL NGs和PVCL-Au NGs无法调节细胞的周期。相反，PVCL-MnO2 NGs和PVCL-Au-MnO2 NGs处理后，处于G2/M期的细胞比率大大提高，说明PVCL-MnO2 NGs和PVCL-Au-MnO2 NGs可显著调节细胞周期，使细胞周期处于对放疗最为敏感的G2/M期。
实施例7
采用克隆形成实验来评估纳米凝胶介导的放疗增敏效应。具体地，取5×105个Pan02细胞接种于6孔板孵育24h。待细胞汇合度达80％左右时，分为以下5组：(I)单独放疗组；(II)PVCL NGs联合放射治疗组；(III)PVCL-Au NGs联合放射治疗组；(IV)PVCL-MnO2NGs联合放射治疗组和(V)PVCL-Au-MnO2 NGs联合放射治疗组。
每组细胞经不同处理后，用胰酶消化收集，并计数。依照放疗剂量(0、2、4、6、8Gy)的不同，分别取200、400、800、2000、4000个细胞接种于6孔板中。每组设置3个复孔。所有接种的细胞均放置于37℃培养箱中孵育10天，弃去原来细胞培养基，PBS缓冲液漂洗三次。每组细胞经甲醇固定、结晶紫染色后，以至少50个细胞为一个克隆，显微镜计数每组细胞克隆数。根据照射处理组细胞克隆形成数目，计算细胞接种效率及各照射处理组细胞存活分数。
细胞接种效率＝对照组形成克隆数/接种细胞数
细胞存活分数＝各组细胞形成克隆数/(各组接种细胞数×接种效率)
哺乳动物细胞接受不同剂量的电离辐射后，细胞存活规律大多符合单击多靶模型公式：
S＝1-(1-e-kD)n
其中，k为细胞存活曲线的钝化常数，其值可由拟合曲线方程直接给出；n为外推数，其值可由拟合曲线方程直接给出；D0和Dq根据k、n值演算出来的，D0为平均致死剂量，是理论上每个细胞平均被击中一次所需要的辐射剂量，D0＝1/k；Dq为准阈剂量，表征修复亚致死损伤的能力；Dq＝ln n×D0；根据实验实测细胞存活数，用Graphpad Prism 5软件对单击多靶模型公式拟合，可获得公式中一系列有意义的参数，如k、n、D0和Dq。细胞接受不同因素(如增敏剂)处理后再行照射，细胞存活曲线及其参数会发生变化，根据这些参数的变化可进一步计算出增敏比(SER)，增敏比反映细胞放疗敏感性的不同及其变化。SER一般大于或等于1，SER越大说明放疗越敏感。其中，
SER＝D0(对照组)/D0(处理组)
结果表明随着辐射剂量的增强，不同组别中的细胞存活分数均有下降，其中PVCL-Au-MnO2 NGs联合放疗组中的细胞存活分数下降最为明显，进一步利用经典的单击多靶模型确定PVCL-Au-MnO2 NGs的辐射增敏比(SER)为1.49。
实施例8
将2×105的Pan02细胞种在6孔板上培养过夜后，将制备的PVCL NGs、PVCL-AuNGs、PVCL-MnO2 NGs和PVCL-Au-MnO2 NGs(200μg/mL)和Pan02细胞共培养12h。之后倒掉培养基，经PBS洗涤3次，换上新的培养基后经4Gy的X射线处理，再培养24h后用胰酶将细胞消化下来，转移到5mL离心管中，1000rpm离心5min去除上清，加入1mL PBS将细胞重悬，放入冰盒，经Annexin V FITC/PI凋亡检测试剂盒染色后，用流式细胞仪检测。如图14，在无X射线的情况下，对照组未表现出明显的凋亡现象，在经过X射线处理后，经不同类型纳米凝胶材料孵育后的细胞均表现出了凋亡。其中，单独X射线照射组的凋亡率为21.5％，PVCL-Au NGs组的凋亡率为30.3％，PVCL-MnO2 NGs组的凋亡率为31.5％，PVCL-Au-MnO2 NGs组的凋亡率为42.4％。
实施例9
将2×105的Pan02细胞种在激光共聚焦皿上培养过夜后，将制备的PVCL NGs、PVCL-Au NGs、PVCL-MnO2 NGs和PVCL-Au-MnO2 NGs(200μg/mL)和Pan02细胞共培养12h。之后倒掉培养基，经PBS洗涤3次，换上新的培养基后经4Gy的X射线处理，每组分别再各培养0、1和24h后，细胞经PBS洗涤3次，用多聚甲醛固定30min，再加入1％的Triton X-100，增加细胞的通透性。之后，再用1％的牛血清蛋白处理1h，然后加入γ-H2AX抗体，4℃孵育过夜。然后，加入山羊抗小鼠IgG(H&L)二抗，并用DAPI染细胞核。最后，将处理后的各组细胞置于激光共聚焦显微镜下观察。用ImageJ软件对细胞中γ-H2AX数目进行统计。如图15，各组细胞在经X射线照射后，均表现出了明显的DNA损伤，其中PVCL-Au-MnO2 NGs组的DNA损伤效果最明显。在X射线照射24h后，各组细胞的DNA均有不同程度的修复。相比其他组，PVCL-Au-MnO2 NGs组对DNA的修复抑制效果最为明显。
实施例10
从上海斯莱克实验动物中心购得4-6周的C57BL/6雌鼠进行动物实验，所有动物实验均严格按照动物保护协会标准进行。按照2×106个细胞/鼠的剂量在C57BL/6雌鼠右腿皮下注射。待肿瘤体积达到～90mm3时，通过尾静脉注射PVCL-Au-MnO2 NGs的PBS溶液(100μL)来评价肿瘤部位MR和CT成像效果。如图16a和b所示，与注射前相比，在注射PVCL-Au-MnO2NGs([Mn]＝10mM)24h后，小鼠肿瘤部位的MR信号明显增强，SNR为88.7，远大于注射前肿瘤部位的信号(SNR＝22.5)。之后，评价了PVCL-Au-MnO2 NGs通过小鼠尾静脉注射后([Au]＝10mM)在肿瘤部位的CT成像效果。如图17所示，在注射PVCL-Au-MnO2 NGs 24h后，小鼠肿瘤部位的CT信号明显增强(436.3HU)，远远高于注射前肿瘤部位的CT信号值(21.7HU)。上述结果说明PVCL-Au-MnO2 NGs在荷瘤鼠体内有良好的肿瘤MR和CT成像效果，可以作为造影剂应用于体内肿瘤成像。
实施例11
待肿瘤体积达到～90mm3时，随机将成瘤小鼠分为6组(每组5只)：尾静脉注射生理盐水(100μL)没有射线照射(组I)；尾静脉注射生理盐水(100μL)并对肿瘤实施4Gy X射线照射(组II)；尾静脉注射PVCL NGs(100μL)，没有射线照射(组III)；尾静脉注射PVCL NGs(100μL)，24h后对肿瘤实施4Gy X射线照射(组IV)；尾静脉注射PVCL-Au-MnO2 NGs(100μL)，没有射线照射(组V)；尾静脉注射PVCL-Au-MnO2 NGs(100μL)，24h后对肿瘤实施4Gy X射线照射(组VI)。说明书附图18a显示了荷瘤鼠模型的构建以及放疗增敏的治疗过程。如图18b所示，PVCL-Au-MnO2 NGs通过尾静脉注射进小鼠体内后，主要能够被肝脏和脾脏代谢，在注射24小时后，材料在小鼠肿瘤部位富集量达到最高值。附图18c说明，本发明制备的PVCL-Au-MnO2 NGs结合放疗处理后能够明显抑制小鼠肿瘤的生长，单独放疗组，PVCL NGs+放疗组和单独PVCL-Au-MnO2 NGs组在抑制了肿瘤生长一段时间后，肿瘤继续增长，空白对照组和PVCL NGs处理组的肿瘤体积增长最大。附图18d说明，PVCL-Au-MnO2 NGs结合放疗处理后，小鼠的肿瘤重量最小。上述结果表明，本发明制备的PVCL-Au-MnO2 NGs具有良好的放疗增敏效果。
对比例1
对比材料PVCL-MnO2 NGs的制备方法为：取实施例1中制备的PVCL NGs(15mg)分散在3mL超纯水中，然后缓慢滴加200μL高锰酸钾的水溶液(38mM)，搅拌过夜。之后，将反应后的溶液置于8-14kDa透析袋中透析3d，冷冻干燥得到负载二氧化锰纳米颗粒的聚N-乙烯基己内酰胺纳米凝胶PVCL-MnO2 NGs。

Claims (10)

1.一种负载金和二氧化锰纳米颗粒的聚N-乙烯基己内酰胺纳米凝胶，其特征在于，所述纳米凝胶包括：金纳米颗粒、二氧化锰纳米颗粒、乙酰乙酸甲基丙烯酸乙二醇酯和聚N-乙烯基己内酰胺纳米凝胶；所述乙酰乙酸甲基丙烯酸乙二醇酯作为共聚单体通过沉淀聚合的方法均匀分布在聚N-乙烯基己内酰胺纳米凝胶中，所述金纳米颗粒和二氧化锰纳米颗粒原位负载在纳米凝胶内部；
所述负载金和二氧化锰纳米颗粒的聚N-乙烯基己内酰胺纳米凝胶的制备方法，包括：
(1)将表面活性剂、交联剂、一半量的乙酰乙酸甲基丙烯酸乙二醇酯AAEM和N-乙烯基己内酰胺VCL溶解于水中，在N2环境下搅拌，加入引发剂搅拌，加入另一半量的AAEM，继续搅拌反应，冷却，透析，冻干，得到聚N-乙烯基己内酰胺纳米凝胶PVCL NGs；
(2)将步骤(1)中PVCL NGs分散在超纯水中，加入氯金酸溶液搅拌，加入硼氢化钠溶液，继续搅拌反应，离心，透析，冻干，得到载金纳米颗粒的聚N-乙烯基己内酰胺纳米凝胶PVCL-Au NGs；
(3)将步骤(2)中PVCL-Au NGs分散在超纯水中，加入高锰酸钾溶液，搅拌反应，透析，冻干，得到负载金和二氧化锰纳米颗粒的聚N-乙烯基己内酰胺纳米凝胶PVCL-Au-MnO2NGs。
2.一种负载金和二氧化锰纳米颗粒的聚N-乙烯基己内酰胺纳米凝胶的制备方法，包括：
(1)将表面活性剂、交联剂、一半量的乙酰乙酸甲基丙烯酸乙二醇酯AAEM和N-乙烯基己内酰胺VCL溶解于水中，在N2环境下搅拌，加入引发剂搅拌，加入另一半量的AAEM，继续搅拌反应，冷却，透析，冻干，得到聚N-乙烯基己内酰胺纳米凝胶PVCL NGs；
(2)将步骤(1)中PVCL NGs分散在超纯水中，加入氯金酸溶液搅拌，加入硼氢化钠溶液，继续搅拌反应，离心，透析，冻干，得到载金纳米颗粒的聚N-乙烯基己内酰胺纳米凝胶PVCL-Au NGs；
(3)将步骤(2)中PVCL-Au NGs分散在超纯水中，加入高锰酸钾溶液，搅拌反应，透析，冻干，得到负载金和二氧化锰纳米颗粒的聚N-乙烯基己内酰胺纳米凝胶PVCL-Au-MnO2NGs。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中表面活性剂为十二烷基硫酸钠；交联剂为N,N-亚甲基双丙烯酰胺；引发剂为偶氮二羧乙基-2-异丁基脒水合物ACMA。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述交联剂、表面活性剂、VCL和AAEM的摩尔比为1:0.1～0.5:30～40:3～5。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中在N2环境下搅拌温度为50～70℃，搅拌时间为20～40min；加入引发剂搅拌时间为2～5min；继续搅拌反应时间为2～5h。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)、(2)和(3)中透析是采用截留分子量为8-14kDa透析袋，透析时间为2～5d。
7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中氯金酸、硼氢化钠和PVCL NGs的质量比为1:1～5:5～10。
8.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中搅拌温度为2～10℃，搅拌时间为0.5～2h；继续搅拌反应温度为2～10℃，反应时间为5～10h。
9.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中高锰酸钾和PVCL-AuNGs的质量比为1:10～15；搅拌反应温度为室温，搅拌反应时间为5～10h。
10.一种如权利要求1所述纳米凝胶在制备具有CT/MR双模态成像和“全过程”放疗增敏的诊疗剂中的应用。
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