CN109793896B - 一种基于树状大分子的放疗增敏型乏氧双模态造影剂的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种基于树状大分子的放疗增敏型乏氧双模态造影剂的制备方法，包括：将三价金离子与功能化树状大分子G5.NH₂‑DOTA直接络合并经还原形成杂化金纳米颗粒(Au⁰)₁₀₀‑G5.NH₂‑DOTA；将硝基咪唑修饰的聚乙二醇通过酰胺键修饰在杂化金纳米颗粒上得到功能化金纳米颗粒(Au⁰)₁₀₀‑G5.NH₂‑DOTA‑PEG‑Ni，然后螯合钆离子并作乙酰化处理得到功能化杂化纳米材料Gd‑Au DENPs‑Ni。本发明材料具有良好的成像性能和稳定性，制备的纳米材料联合放疗达到放疗增敏效果，具有良好的应用前景。

Description

一种基于树状大分子的放疗增敏型乏氧双模态造影剂的制备 方法

技术领域

本发明属于功能性杂化纳米材料的制备领域，特别涉及一种基于树状大分子的放疗增敏型乏氧双模态造影剂的制备方法。

背景技术

放疗是利用放射线治疗肿瘤的一种局部治疗方法，目前已成为临床上最常用、最有效的恶性肿瘤治疗手段之一。但在临床治疗过程中，大多数肿瘤对放疗都存在一定的放射抗拒性。通过研究表明，实体瘤由于肿瘤细胞的增殖和血管发育不完全、分布不均一导致其内部氧气等供应不足，最终导致肿瘤内乏氧区域的存在，这一区域的肿瘤细胞抵抗电离辐射的能力超过含氧量正常的肿瘤细胞的2～3倍。实体瘤的乏氧区域减少了放疗过程中氧自由基对DNA增殖的损伤，限制了放疗的效果，因此克服乏氧所导致的放疗抵抗是提高肿瘤放疗效果的一个重要途径。

随着纳米医学的发展，多功能纳米放疗增敏剂为增强肿瘤细胞放射敏感性、提高放疗效果提供了新机遇。新型的金属纳米材料具有较高的原子序数，可以有效增强光电吸收和二次电子的产率，从而提高放疗效果。已有文献报道一种具有线粒体靶向功能的金-二氧化钛的纳米增敏剂(Li et al.,Chem.Sci.,2018,9,3159,DOI:10.1039/C7SC04458E)以及钆掺杂的二氧化钛纳米增敏剂(Chen et al.,Theranostics,2019；9(1):167-178)可以在X射线的作用下产生大量活性氧，激活细胞线粒体凋亡通路，导致细胞不可逆的凋亡，并用于恶性肿瘤的治疗。

目前已有多种以树状大分子为载体的成像造影剂报道，例如Chen等人(Chen etal.,Biomaterials,2013,34(21):5200-5209)在树状大分子内部包裹金纳米颗粒，并通过树状大分子外围修饰的钆螯合剂负载Gd(III)离子。利用金纳米颗粒用于CT成像，钆离子用于T₁加权磁共振成像，所制备的纳米材料可用于荷瘤鼠模型的CT/MR双模态成像。在此类研究中，研究者往往使用树状大分子作为载体，结合金属离子或者金属纳米颗粒，并修饰靶向分子、染料等达到多模态成像效果。但其研究往往仅涉及肿瘤成像，并不涉及肿瘤治疗。本发明针对乏氧放疗抵抗问题，设计乏氧靶向双模态成像造影剂，利用该探针达到放疗增敏的效果，进一步拓展造影剂的应用范围，填补了树状大分子造影剂用于肿瘤治疗的空白。

检索国内外文献尚没有发现关于利用功能化树状大分子杂化纳米材料用于乏氧靶向成像和乏氧肿瘤放疗增敏的研究。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种基于树状大分子的放疗增敏型乏氧双模态造影剂的制备方法，将双模态成像造影剂应用于放疗增敏中，进一步拓展造影剂的应用范围，克服现有技术制备造影剂仅用于分子影像的缺陷，本发明针对乏氧放疗抵抗问题，设计合成乏氧靶向的双模态造影剂作为放疗增敏剂。以聚酰胺-胺型树状大分子作为载体材料，构建乏氧靶向树状大分子-金-钆杂化纳米材料，针对肿瘤乏氧区域实现分子影像功能和放疗增敏效果。所制得的杂化纳米材料具有CT/MR双模态成像效果，可作为纳米探针用于肿瘤成像，同时又可作为一种有效的放疗增敏剂更多地聚集在肿瘤乏氧区域，提高放疗效果。

本发明的一种功能化树状大分子杂化纳米材料的制备方法，包括：

(1)将2-(2-硝基咪唑-1-基)乙酸Ni-COOH溶液中加入EDC进行活化，然后滴加入到双官能团的聚乙二醇COOH-PEG-NH₂溶液中，室温搅拌反应48-72h，透析纯化，冷冻干燥，得到硝基咪唑修饰的聚乙二醇Ni-PEG-COOH；

(2)将第五代聚酰胺-胺型树状大分子G5.NH₂溶于水中，逐滴加入金属螯合剂DOTA活性酯DOTA-NHS的水溶液，室温搅拌12-24h，透析纯化和冷冻干燥，得到功能化树状大分子G5.NH₂-DOTA；

(3)将上述功能化树状大分子G5.NH₂-DOTA溶于水中，加入HAuCl₄·4H₂O的水溶液，搅拌0.25-0.5h后快速加入还原剂的冰水溶液，搅拌过夜，经透析、冷冻干燥得到杂化金纳米颗粒(Au⁰)₁₀₀-G5.NH₂-DOTA；

(4)将步骤(1)的硝基咪唑修饰的聚乙二醇Ni-PEG-COOH溶于水中，滴加EDC水溶液，15-30min后加入NHS的水溶液，活化反应1-3h后，滴加入到(Au⁰)₁₀₀-G5.NH₂-DOTA的水溶液中，搅拌2-3天，冷冻干燥，得到功能化金纳米颗粒(Au⁰)₁₀₀-G5.NH₂-DOTA-PEG-Ni；

(5)将上述(Au⁰)₁₀₀-G5.NH₂-DOTA-PEG-Ni溶于水中，加入六水硝酸钆Gd(NO₃)₃·6H₂O的水溶液混合搅拌12-24h，随后加入三乙胺混合均匀，逐滴加入醋酸酐溶液，室温搅拌12-24h，经透析纯化和冷冻干燥得到功能化杂化材料Gd-Au DENPs-Ni。

上述制备方法的优选方式如下：

所述步骤(1)中2-(2-硝基咪唑-1-基)乙酸(2-(2-nitroimidazol-1-yl)aceticacid，Ni-COOH)。

所述步骤(1)中COOH-PEG-NH₂、Ni-COOH和EDC的摩尔比为1:1.2:1.2～1:3:6；

Ni-COOH溶液的浓度为1mg/mL；COOH-PEG-NH₂溶液的浓度为4mg/mL。

所述步骤(1)中溶剂为二甲基亚砜DMSO。

优选地，所述步骤(1)中活化时间为0.5h；室温搅拌反应72h。

所述步骤(1)所述的透析为用截留分子量为1000的纤维素透析膜在超纯水(4L×9)中透析3天。

所述步骤(2)中G5.NH₂与DOTA-NHS的摩尔比为1:15～1:25；G5.NH₂的水溶液的浓度为5mg/mL，DOTA-NHS的水溶液的浓度为5mg/mL。

所述步骤(2)中室温搅拌24h。

所述步骤(2)所述的透析为用截留分子量为5000的纤维素透析膜在超纯水(4L×9)中透析3天。

所述步骤(3)中G5.NH₂-DOTA、HAuCl₄·4H₂O和还原剂的摩尔比为1:100:400～1:100:600；G5.NH₂-DOTA的水溶液的浓度为5mg/mL，HAuCl₄·4H₂O水溶液的浓度为30mg/mL，还原剂的冰水溶液的浓度为5mg/mL。

所述步骤(3)中还原剂为NaBH₄。

所述步骤(3)中搅拌0.5h后快速加入还原剂的冰水溶液。

所述步骤(4)中(Au⁰)₁₀₀-G5.NH₂-DOTA、Ni-PEG-COOH、EDC和NHS的摩尔比为1:10:50:60～1:20:100:120；Ni-PEG-COOH的水溶液的浓度为1mg/mL；EDC的水溶液的浓度为10mg/mL，NHS的水溶液的浓度为10mg/mL，(Au⁰)₁₀₀-G5.NH₂-DOTA的水溶液的浓度为10mg/mL。

所述步骤(4)中活化反应3h；搅拌3天。

所述步骤(5)中(Au⁰)₁₀₀-G5.NH₂-DOTA-PEG-Ni、Gd(NO₃)₃·6H₂O、三乙胺和乙酸酐的摩尔比为1:20:100:120～1:30:150:200；(Au⁰)₁₀₀-G5.NH₂-DOTA-PEG-Ni的水溶液的浓度为10mg/mL；六水合硝酸钆的水溶液的浓度为10mg/mL。

所述步骤(5)中搅拌均为24h。

所述步骤(3)、(4)和(5)所述的透析为用截留分子量为8000～14000的纤维素透析膜在超纯水(4L×9)中透析3天。

本发明还提供一种所述功能化树状大分子杂化纳米材料作为放疗增敏型乏氧双模态造影剂的应用。本发明制备的杂化纳米材料(Gd-Au DENPs-Ni)具有X射线衰减性能和T₁弛豫性能，可用于CT成像和T₁加权MR成像；本发明利用杂化纳米材料(Gd-Au DENPs-Ni)作为放疗增敏剂用于乏氧肿瘤的放疗增敏。

本发明首先在氨基末端的聚酰胺-胺型树状大分子上通过DOTA-NHS修饰得到功能化树状大分子G5.NH₂-DOTA；然后将三价金离子与G5.NH₂-DOTA直接络合并经硼氢化钠还原形成杂化金纳米颗粒(Au⁰)₁₀₀-G5.NH₂-DOTA；再将硝基咪唑修饰的聚乙二醇通过酰胺键修饰在杂化金纳米颗粒上得到功能化金纳米颗粒(Au⁰)₁₀₀-G5.NH₂-DOTA-PEG-Ni；最后利用功能化金纳米颗粒螯合钆离子并作乙酰化处理得到功能化杂化纳米材料Gd-Au DENPs-Ni。

本发明使用核磁共振氢谱(¹H NMR)、透射电子显微镜(TEM)、动态光散射(DLS)及紫外可见吸收光谱(UV-Vis)等手段表征制备的杂化纳米材料(Gd-Au DENPs-Ni)，其合成示意图如图1所示。然后利用CCK-8法评价杂化纳米材料的细胞毒性，对比靶向和非靶向材料在乏氧细胞内吞噬情况。分析并对比杂化纳米材料联合放疗处理后在乏氧细胞内的凋亡情况并通过克隆实验计算放疗增敏比，同时测定其体外成像性能。最后进行裸鼠体内肿瘤模型的抗肿瘤实验，考察所制备的杂化纳米材料在裸鼠体内放疗增敏效果。具体测试结果如下：

(1)¹H NMR表征

参见说明书附图2，在2-(2-硝基咪唑-1-基)乙酸的核磁共振氢谱图中，7.1和7.3ppm是咪唑环上的的特征质子峰。参见说明书附图3，在Ni-PEG-COOH的核磁共振氢谱图中，3.6ppm是聚乙二醇中CH₂的质子峰，7.1和7.3ppm是咪唑环上的的特征质子峰，根据它们积分面积之比，计算出每个PEG上链接了0.54个硝基咪唑基团。在本研究中，我们选择环形的螯合物DOTA与聚酰胺-胺型树状大分子化学键合构建成像体系。说明书附图4和附图5分别为单纯G5.NH₂和G5.NH₂-DOTA乙酰化后的核磁共振氢谱图，首先通过将树状大分子G5.NH₂表面氨基全部乙酰化可计算出每个树状大分子上氨基数目，与此同时将修饰了DOTA后的树状大分子完全乙酰化，计算出表面剩余氨基的数目，通过差减法将树状大分子表面氨基的总数减去剩余氨基的数目即为已修饰的DOTA的数目。计算可知，每个树状大分子表面大约有17.8个DOTA分子修饰。参见说明书附图6A，在(Au⁰)₁₀₀-G5.NH₂-DOTA-PEG-Ni的核磁共振氢谱图中，2.0-3.6ppm是树状大分子G5.NH₂-DOTA的亚甲基质子峰，3.6ppm是聚乙二醇中CH₂的质子峰，根据它们积分面积之比，计算出每个(Au⁰)₁₀₀-G5.NH₂-DOTA连接了12.4个硝基咪唑修饰的聚乙二醇。

(2)UV-Vis光谱测试和粒径分析

参见说明书附图7紫外图谱显示所制备的杂化纳米材料在520nm左右处有明显的紫外吸收，该特征峰的出现说明金纳米颗粒的成功制备。说明书图8为合成的(Au⁰)₁₀₀-G5.NHAc-DOTA/Gd-PEG-Ni的TEM图片和粒度分布直方图，表明形成的金纳米颗粒分布均匀、粒径较窄(3.2±0.7nm)。参见说明书附图9，修饰功能化聚乙二醇后杂化纳米材料(Au⁰)₁₀₀-G5.NHAc-DOTA/Gd-PEG-Ni的水动力学直径为较(Au⁰)₁₀₀-G5.NH₂-DOTA相比有所增加，从112.3nm增加至141.4nm。

(3)细胞相容性及靶向性评价

参见说明书附图10，以乏氧鼻咽癌CNE-1细胞为细胞模型，利用CCK-8法研究不同浓度的杂化纳米材料对细胞的毒性，以生理盐水处理的细胞为对照组。与对照组相比，不同浓度的杂化纳米材料处理后的细胞存活率均在85％以上。这说明合成的乏氧靶向材料(Au⁰)₁₀₀-G5.NHAc-DOTA/Gd-PEG-Ni和非靶向材料(Au⁰)₁₀₀-G5.NHAc-DOTA/Gd-PEG在一定浓度下无明显细胞毒性。为了研究硝基咪唑修饰的纳米颗粒的乏氧靶向性，我们采用ICP-OES技术对比乏氧细胞吞噬靶向和非靶向杂化纳米材料的情况。结果如图11所示，随着共孵育时间的延长，细胞吞噬的材料越多，并且在相同的金浓度下乏氧靶向杂化纳米材料在乏氧细胞中含量明显高于非靶向杂化纳米材料(**p<0.01)。说明(Au⁰)₁₀₀-G5.NHAc-DOTA/Gd-PEG-Ni能够被癌细胞吞噬，并且更多地富集在乏氧细胞内。

(4)细胞凋亡及放疗增敏比检测

说明书附图12显示在无X射线的情况下，经靶向及非靶向的杂化纳米材料处理后，细胞未表现出明显的凋亡现象。在经X射线处理后，靶向及非靶向杂化纳米材料孵育的细胞与无材料孵育的细胞相比表现出了更多的凋亡现象，其中靶向杂化纳米材料经X射线辐射后比非靶向材料表现出了更多的细胞凋亡现象。参见说明书附图13，通过改变电子束的辐射剂量(0，2，4，6及8Gy)，研究辐射剂量对细胞存活分数的影响，利用经典的单击多靶模型确定材料的辐射增敏比(SER)为1.24。

(5)成像性能分析

配制Gd浓度为0.05，0.1，0.2，0.4和0.8mM的Gd-Au DENPs-Ni的水溶液，通过磁共振成像分析仪测定材料在不同Gd浓度下的T₁弛豫效应(如图14),通过计算得出Gd-AuDENPs-Ni的r₁值为1.32mM^-1s^-1。如图15所示，在相同的金或碘浓度下，Gd-Au DENPs-Ni的X-射线衰减系数比Omnipaque的要高，说明在同等浓度下，Gd-Au DENPs-Ni比Omnipaque拥有更好的CT成像性能。

(6)体内抗肿瘤效果评价

说明书附图16A显示放疗增敏组荷瘤鼠模型构建及放疗增敏治疗过程。附图16B说明每组裸鼠在经过24天的治疗后其重量无明显变化。附图16C说明，本发明制备的Gd-AuDENPs-Ni结合放疗处理后裸鼠肿瘤体积增长最少，单独放疗组裸鼠次之，生理盐水组和Gd-Au DENPs-Ni材料组肿瘤体积增长最大。综上所述，本发明制备的杂化纳米材料Gd-AuDENPs-Ni具有良好的放疗增敏效果。

有益效果

(1)本发明的方法简单，易于操作分离，原料来源商品化，具有良好的应用前景；

(2)本发明制备得到的基于树状大分子的杂化纳米材料，具有良好的水溶性、胶体稳定性，具有良好的X-射线衰减性能同时具有一定的r₁弛豫率，可用于双模态CT/MR成像；

(3)本发明利用杂化纳米材料进行了乏氧肿瘤放疗增敏研究，在动物层面利用杂化纳米材料达到放疗增敏的效果，在医疗领域具有潜在的应用价值。

附图说明

图1为本发明制备的杂化纳米材料Gd-Au DENPs-Ni的合成示意图；

图2为Ni-COOH的核磁共振氢谱图；

图3为Ni-PEG-COOH的核磁共振氢谱图；

图4为G5.NHAc的核磁共振氢谱图；

图5为G5.NHAc-DOTA的核磁共振氢谱图；

图6为(Au⁰)₁₀₀-G5.NH₂-DOTA-PEG-Ni(A)和(Au⁰)₁₀₀-G5.NH₂-DOTA-PEG(B)的核磁共振氢谱图；

图7为(Au⁰)₁₀₀-G5.NH₂-DOTA和(Au⁰)₁₀₀-G5.NHAc-DOTA/Gd-PEG-Ni的UV-Vis图；

图8为Gd-Au DENPs-Ni的TEM图(A)和粒径分布图(B)；

图9为(Au⁰)₁₀₀-G5.NH₂-DOTA和(Au⁰)₁₀₀-G5.NHAc-DOTA/Gd-PEG-Ni的水动力学直径分布图；

图10为在乏氧条件下经靶向和非靶向材料孵育24小时后的鼻咽癌细胞CNE-1的细胞存活率；

图11为在乏氧细胞与靶向及非靶向杂化纳米材料([Au]＝100μM)共培养不同时间后，细胞吞噬的金含量浓度的柱状图；

图12为经Gd-Au DENPs或Gd-Au DENPs-Ni([Au]＝100μM)处理24小时经X射线辐射后的细胞流式检测分析图；

图13为单独X射线辐照及杂化纳米材料([Au]＝100μM)联合X射线辐照的克隆拟合细胞存活分数曲线；

图14为不同浓度下Gd-Au DENPs-Ni的MR成像图(A)和T₁弛豫时间的倒数随Gd浓度变化的线性关系图(B)；

图15为在不同的金或碘的浓度下，Gd-Au DENPs-Ni和Omnipaque的CT成像图(A)和CT值与浓度之间的线性关系图(B)；

图16为放疗增敏组荷瘤鼠模型构建及放疗增敏治疗过程示意图(A)，和治疗两周内裸鼠体重变化图(B)及肿瘤体积变化图(C)。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1

(1)取2-(2-硝基咪唑-1-基)乙酸(5.13mg)溶于5mL DMSO中，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(11.5mg)活化30min；然后将上述溶液逐滴加入到10mL溶有双官能团的聚乙二醇(COOH-PEG-NH₂,40mg)的DMSO溶液中，室温搅拌72小时，然后使用截留分子量1000的透析袋对水溶液透析3天(2L/次，3次/天)，最后冷冻干燥得到硝基咪唑修饰的聚乙二醇Ni-PEG-COOH；

(2)将第5代聚酰胺-胺型树状大分子G5.NH₂(20mg)溶于4mL超纯水中，逐滴加入溶有金属螯合剂DOTA活性酯(DOTA-NHS,11.71mg)的超纯水溶液，室温搅拌24小时，然后使用截留分子量5000的透析袋对水溶液透析3天(2L/次，3次/天)，最后冷冻干燥得到功能化树状大分子G5.NH₂-DOTA；

实施例2

G5.NHAc-DOTA的制备方法为：取实施例1(2)中制备的G5.NH₂-DOTA(20mg)溶于超纯水中，加入三乙胺(8.5μL)混合均匀，随后逐滴加入醋酸酐溶液(6.9μL)，室温搅拌24小时，使用截留分子量5000的透析袋对水溶液透析3天(2L/次，3次/天)，冷冻干燥得到G5.NHAc-DOTA。

G5.NHAc的制备方法为：取中G5.NH₂(20mg)溶于超纯水中，加入三乙胺(10.6μL)混合均匀，随后逐滴加入醋酸酐溶液(8.7μL)，室温搅拌24小时，使用截留分子量5000的透析袋对水溶液透析3天(2L/次，3次/天)，冷冻干燥得到G5.NHAc。

实施例3

将实施例1(2)中制备的G5.NH₂-DOTA(20mg)溶于水中，加入0.83mL HAuCl₄·4H₂O水溶液(30mg/mL)，搅拌0.5h，然后向其中快速加入NaBH₄的冰水溶液(11.5mg,5mg/mL)作为还原剂，搅拌过夜，然后使用截留分子量8000-14000的透析袋对水溶液透析3天(2L/次，3次/天)，最后冷冻干燥得到杂化金纳米颗粒(Au⁰)₁₀₀-G5.NH₂-DOTA；

将实施例1(1)中Ni-PEG-COOH(26.19mg)溶于超纯水中，随后先后滴加溶有EDC(11.66mg)和NHS(8.4mg)的水溶液活化3小时。将活化好的上述溶液逐滴加入到溶有(Au⁰)₁₀₀-G5.NH₂-DOTA的水溶液中，磁力搅拌反应3天后，使用截留分子量8000-14000的透析袋对水溶液透析3天(2L/次，3次/天)，冷冻干燥得到功能化金纳米颗粒(Au⁰)₁₀₀-G5.NH₂-DOTA-PEG-Ni；

将上述制备的(Au⁰)₁₀₀-G5.NH₂-DOTA-PEG-Ni溶于超纯水中，加入溶有5.49mg Gd(NO₃)₃·6H₂O的水溶液混合搅拌24小时，随后加入三乙胺(8.45μL)混合均匀，逐滴加入醋酸酐溶液(6.89μL)，室温搅拌24小时，使用截留分子量8000-14000的透析袋对水溶液透析3天(2L/次，3次/天)，冷冻干燥得到功能化杂化材料Gd-Au DENPs-Ni。

实施例4

取Ni-COOH和实施例1制备的Ni-PEG-COOH溶于氘代水中，使用Bruker 400MHz核磁共振仪进行氢谱测试。参见附图2和附图3，3.6ppm是聚乙二醇中CH₂的质子峰，7.1和7.3ppm是咪唑环上的的特征质子峰，根据它们积分面积之比，计算出每个PEG上链接了0.54个硝基咪唑基团。

取实施例2制备的G5.NHAc和G5.NHAc-DOTA溶于氘代水中，使用核磁共振仪进行氢谱测试。G5.NH₂经过乙酰化反应之后，在1.9ppm之间出现乙酰基的甲基质子峰(参见附图4),2.0-3.6ppm是树状大分子G5.NH₂的亚甲基质子峰，根据它们积分面积之比，计算出经乙酰化后每个G5.NH₂上约有108个乙酰基。通过乙酰差减法算得，每个树状大分子表面大约有17.8个DOTA分子修饰(参见附图5)。

取实施例3制备的(Au⁰)₁₀₀-G5.NH₂-DOTA-PEG-Ni溶于氘代水中进行氢谱测试。根据其核磁共振氢谱图计算出每个(Au⁰)₁₀₀-G5.NH₂-DOTA上链接了12.4个硝基咪唑修饰的聚乙二醇(参见附图6A)。

用去离子水溶解(Au⁰)₁₀₀-G5.NH₂-DOTA和Gd-Au DENPs-Ni用紫外-可见分光光度计分析。参见说明书附图7紫外图谱显示所制备的杂化纳米材料在520nm左右处有明显的紫外吸收，该特征峰的出现说明金纳米颗粒的成功制备。将制备的Gd-Au DENPs-Ni配成浓度为0.1mg/mL的水溶液，将铜网浸入该溶液中，捞起晾干，如此循环两次左右。之后用透射电镜(TEM)观察Gd-Au DENPs-Ni的形状和尺寸(工作电压为200kV)。通过TEM表明形成的金纳米颗粒粒径为3.2±0.7nm(参见附图8)。制备的杂化纳米材料Gd-Au DENPs-Ni的水动力学直径为141.4nm(参见附图9)。

实施例5

收集对数生长期乏氧CNE-1细胞，按照10000细胞每孔的密度接种在96孔细胞培养板上，置于5％CO₂，1％O₂，37℃条件下培养过夜。弃掉培养基后，每孔更换90μL无血清RPMI1640培养基，并添加10μL含不同浓度的材料([Au]＝50、100、250、500、750、1000、2000mM)或生理盐水(对照组)。之后将细胞培养板继续放置在5％CO₂，1％O₂，37℃继续培养24小时。随后弃掉原培养基，加入100μL含有10％CCK-8的新鲜培养基溶液，继续培养2h后，放置在多功能酶标仪中于测试波长450nm下测试吸光值。结果如图10所示。与生理盐水对照组相比，Gd-Au DENPs-Ni和Gd-Au DENPs在试验浓度范围内对CNE-1细胞没有明显细胞毒性，细胞存活率均在85％以上。

实施例6

将制备的Gd-Au DENPs-Ni与Gd-Au DENPs([Au]＝100μM)和乏氧CNE-1细胞共培养不同时间(0、6、12和24h)，用生理盐水洗三遍后用胰酶消化并离心收集细胞计数。用王水溶解消化细胞，用电感耦合等离子体原子发射光谱(ICP-OES)分别测量细胞吞噬的Au的含量(参见附图11)。结果表明随着共孵育时间的延长，细胞吞噬的材料越多，并且在相同的金浓度下乏氧靶向杂化纳米材料在乏氧细胞中含量明显高于非靶向杂化纳米材料。

实施例7

将每孔1×10⁶乏氧CNE-1细胞种植于6孔板中，培养过夜后倒掉培养基，加入含有Gd-Au DENPs-Ni或Gd-Au DENPs([Au]＝100μM)的培养基共培养24小时。之后倒掉培养基，经PBS洗3次，换上新的培养基后经4Gy X射线处理,再培养24h后用胰酶将细胞消化下来，转移到5mL离心管中，1000转离心5分钟去除上清液，加PBS 1mL吹匀，放入冰盒，经Annexin VFITC/PI凋亡检测试剂盒染色后用300目(孔径40～50微米)尼龙网过滤，上机检测。结果表明在无X射线的情况下，经靶向及非靶向的杂化纳米材料处理后，细胞未表现出明显的凋亡现象。在同等X射线剂量和实验浓度下，经Gd-Au DENPs-Ni处理过CNE-1细胞比经Gd-AuDENPs处理过的CNE-1细胞表现出更明显的凋亡现象(参见附图12)。

实施例8

克隆形成实验作为评估放射治疗增敏效应的经典方法，用于评估杂化纳米材料介导的放疗增敏效应。具体地，取50000个乏氧CNE-1细胞接种于6孔板孵育24h。待细胞汇合度达80％左右时，分为以下2组：

(a)放射治疗组(X-ray only)：细胞经不同剂量(0、2、4、6、8Gy)X射线处理；

(b)Gd-Au DENPs-Ni联合放射治疗组(Gd-Au DENPs-Ni+X-ray)：Gd-Au DENPs-Ni([Au]＝100μM)处理细胞24h后,经不同剂量(0、2、4、6、8Gy)X射线处理。

每组细胞经不同处理后，用胰酶消化收集，并计数。依照放疗剂量(0、2、4、6、8Gy)的不同，分别取100、200、500、1000、2000个细胞接种于6孔板中。每组设置3个复孔。所有接种的细胞均放置于37℃培养箱中孵育两周左右，及时补充培养液，视细胞增殖速率停止培养，弃去原来细胞培养基，PBS缓冲液漂洗三次。每组细胞经甲醇固定、结晶紫染色后，以至少50个细胞为一个克隆，显微镜计数每组细胞克隆数。根据照射处理组细胞克隆形成数目，计算细胞接种效率及各照射处理组细胞存活分数。

细胞接种效率＝对照组形成克隆数/接种细胞数

细胞存活分数＝各组细胞形成克隆数/(接种细胞数×接种效率)

哺乳动物细胞接受不同剂量的电离辐射后，细胞存活规律大多符合单击多靶模型公式：

S＝1-(1-e^-kD)ⁿ

其中，k为细胞存活曲线的钝化常数，其值可由拟合曲线方程直接给出；n为外推数，其值可由拟合曲线方程直接给出；D₀和D_q根据k、n值演算出来的，D₀为平均致死剂量，是理论上每个细胞平均被击中一次所需要的辐射剂量，D₀＝1/k；D_q为准阈剂量，表征修复亚致死损伤的能力；D_q＝ln n×D₀；根据实验实测细胞存活数，用Graphpad Prism 5软件对单击多靶模型公式拟合，可获得公式中一系列有意义的参数，如k、n、D₀和D_q。细胞接受不同因素(如增敏剂)处理后再行照射，细胞存活曲线及其参数会发生变化，根据这些参数的变化可进一步计算出增敏比(SER)，增敏比反映细胞放射敏感性的不同及其变化。SER一般大于或等于1，SER越大说明经该试剂处理后对辐射更加敏感。其中，

SER＝D₀(对照组)/D₀(处理组)

结果表明通过改变电子束的辐射剂量(0，2，4，6及8Gy)，研究剂量对细胞存活分数的影响，利用经典的单击多靶模型确定Gd-Au DENPs-Ni的辐射增敏比(SER)为1.24(参见附图13)。

实施例9

为了检测Gd-Au DENPs-Ni的材料MR成像效果，分别配制Gd浓度为0.01，0.02，0.04，0.08和0.1M的Gd-Au DENPs-Ni的水溶液2mL，通过磁共振成像分析仪测定材料在不同Gd浓度下的T₁弛豫效应和MR成像图(参见附图14)。通过计算得出Gd-Au DENPs-Ni的r₁值分别为1.32mM^-1s^-1。为了检测Gd-Au DENPs-Ni的材料CT成像效果，在离心管中用超纯水配制Au浓度依次为0.05、0.1、0.2、0.4、0.8M的溶液各0.2mL，然后用CT成像仪测定不同浓度的Gd-Au DENPs-Ni的X-射线衰减特性，碘海醇作为对照组。如图15所示，在相同的金或碘浓度下，Gd-Au DENPs-Ni的X-射线衰减系数比Omnipaque的要高，说明在同等浓度下，Gd-AuDENPs-Ni比Omnipaque拥有更好的CT成像性能。以上结果说明Gd-Au DENPs-Ni可以作为CT/MR双模态造影剂。

实施例10

所有动物实验均严格按照动物保护协会标准进行。实验用的4-6周的雌性裸鼠购自上海斯莱克实验动物中心。按照5×10⁶个CNE-1细胞/鼠的剂量在裸鼠右腿皮下注射，此时记作实验开始的第0天。在肿瘤体积达到0.5cm³左右时随机将成瘤裸鼠分为4组(对照组、放疗组、材料组和材料-放疗组)，每组裸鼠数量为8只。在第11天对材料组和材料-放疗组经尾静脉注射Gd-Au DENPs-Ni([Au]＝0.1M，100μL生理盐水),放疗组和放疗-治疗组经行放疗尾静脉注射100μL生理盐水。一小时后对放疗组和放疗-治疗组经行X射线放疗(10Gy)。肿瘤体积每天测量一次，裸鼠体重量每天称一次。肿瘤体积用下面的公式计算。

肿瘤体积(V)＝a×b²/2

a和b分别代表肿瘤直径的最大值和最小值。

说明书附图16A显示放疗增敏组荷瘤鼠模型构建及放疗增敏治疗过程。附图16B说明每组裸鼠在经过治疗后的14天内重量无明显变化。附图16C说明，本发明制备的Gd-AuDENPs-Ni结合放疗处理后裸鼠肿瘤体积增长最少，单独放疗组裸鼠次之，生理盐水组和Gd-Au DENPs-Ni材料组肿瘤体积增长最大。综上所述，本发明制备的杂化纳米材料Gd-AuDENPs-Ni具有良好的放疗增敏效果。

对比例1

对照材料非靶向杂化纳米材料Gd-Au DENPs的制备方法为：将mPEG-COOH(30.43mg)溶于超纯水中，随后先后滴加溶有EDC(14.53mg)和NHS(10.5mg)的水溶液活化3h。将活化好的上述溶液逐滴加入到溶有(Au⁰)₁₀₀-G5.NH₂-DOTA的水溶液中，磁力搅拌反应3天后，加入6.87mg Gd(NO₃)₃·6H₂O的水溶液混合搅拌24小时。随后加入三乙胺(10.52μL)混合均匀，逐滴加入醋酸酐溶液(8.62μL)，室温搅拌24小时，经透析纯化和冷冻干燥得到非靶向杂化纳米材料Gd-Au DENPs。

参见说明书附图6B，在(Au⁰)₁₀₀-G5.NH₂-DOTA-PEG的核磁共振氢谱图中，2.0-3.6ppm是树状大分子G5.NH₂-DOTA的亚甲基质子峰，3.6ppm是聚乙二醇中CH₂的质子峰，根据它们积分面积之比，计算出每个(Au⁰)₁₀₀-G5.NH₂-DOTA连接了14.1个聚乙二醇。

Claims (10)

1.一种功能化树状大分子杂化纳米材料的制备方法，包括：

(1)将2-(2-硝基咪唑-1-基)乙酸Ni-COOH溶液中加入EDC进行活化，然后滴加入到双官能团的聚乙二醇COOH-PEG-NH₂溶液中，室温搅拌反应48-72h，透析纯化，冷冻干燥，得到硝基咪唑修饰的聚乙二醇Ni-PEG-COOH；

(2)将第五代聚酰胺-胺型树状大分子G5.NH₂溶于水中，逐滴加入金属螯合剂DOTA活性酯DOTA-NHS的水溶液，室温搅拌12-24h，透析纯化和冷冻干燥，得到功能化树状大分子G5.NH₂-DOTA；

(3)将上述功能化树状大分子G5.NH₂-DOTA溶于水中，加入HAuCl₄·4H₂O的水溶液，搅拌0.25-0.5h后快速加入还原剂的冰水溶液，搅拌过夜，经透析、冷冻干燥得到杂化金纳米颗粒(Au⁰)₁₀₀-G5.NH₂-DOTA；

(4)将步骤(1)的硝基咪唑修饰的聚乙二醇Ni-PEG-COOH溶于水中，滴加EDC水溶液，15-30min后加入NHS的水溶液，活化反应1-3h后，滴加入到(Au⁰)₁₀₀-G5.NH₂-DOTA的水溶液中，搅拌2-3天，冷冻干燥，得到功能化金纳米颗粒(Au⁰)₁₀₀-G5.NH₂-DOTA-PEG-Ni；

(5)将上述(Au⁰)₁₀₀-G5.NH₂-DOTA-PEG-Ni溶于水中，加入六水硝酸钆Gd(NO₃)₃·6H₂O的水溶液混合搅拌12-24h，随后加入三乙胺混合均匀，逐滴加入醋酸酐溶液，室温搅拌12-24h，经透析纯化和冷冻干燥得到功能化杂化材料Gd-Au DENPs-Ni。

2.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中COOH-PEG-NH₂、Ni-COOH和EDC的摩尔比为1:1.2:1.2～1:3:6；Ni-COOH溶液的浓度为1mg/mL；COOH-PEG-NH₂溶液的浓度为4mg/mL。

3.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中溶剂为二甲基亚砜DMSO。

4.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中G5.NH₂与DOTA-NHS的摩尔比为1:15～1:25；G5.NH₂的水溶液的浓度为5mg/mL，DOTA-NHS的水溶液的浓度为5mg/mL。

5.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中G5.NH₂-DOTA、HAuCl₄·4H₂O和还原剂的摩尔比为1:100:400～1:100:600；G5.NH₂-DOTA的水溶液的浓度为5mg/mL，HAuCl₄·4H₂O水溶液的浓度为30mg/mL，还原剂的冰水溶液的浓度为5mg/mL。

6.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中还原剂为NaBH₄。

7.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中(Au⁰)₁₀₀-G5.NH₂-DOTA、Ni-PEG-COOH、EDC和NHS的摩尔比为1:10:50:60～1:20:100:120；Ni-PEG-COOH的水溶液的浓度为1mg/mL；EDC的水溶液的浓度为10mg/mL，NHS的水溶液的浓度为10mg/mL，(Au⁰)₁₀₀-G5.NH₂-DOTA的水溶液的浓度为10mg/mL。

8.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述步骤(5)中(Au⁰)₁₀₀-G5.NH₂-DOTA-PEG-Ni、Gd(NO₃)₃·6H₂O、三乙胺和乙酸酐的摩尔比为1:20:100:120～1:30:150:200；(Au⁰)₁₀₀-G5.NH₂-DOTA-PEG-Ni的水溶液的浓度为10mg/mL；六水合硝酸钆的水溶液的浓度为10mg/mL。

9.一种权利要求1所述方法制备的功能化树状大分子杂化纳米材料。

10.一种权利要求9所述功能化树状大分子杂化纳米材料在制备放疗增敏型乏氧双模态造影剂中的应用。

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