CN107417672A

CN107417672A - 一种基于2,2‑二甲基‑3‑（2‑硝基咪唑基）丙酸的低氧激活前药

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Publication number: CN107417672A
Application number: CN201710234935.XA
Authority: CN
Inventors: 吕伟; 金沉; 文帅; 余家会
Original assignee: East China Normal University
Current assignee: East China Normal University
Priority date: 2017-04-12
Filing date: 2017-04-12
Publication date: 2017-12-01

Abstract

本发明公开了一类基于2,2‑二甲基‑3‑（2‑硝基咪唑基）丙酸的低氧激活前药,该类前药由2,2‑二甲基‑3‑（2‑硝基咪唑基）丙酸通过酯键与抗肿瘤药物相连接，具有通式I 结构，其中，R₁、R₂包括但不限于以下结构：氢、羟基、氯、溴、氟、C1 ~C6烷基、C1 ~C6含烯基的烷基、C1 ~C6含炔基的烷基；抗肿瘤药物包括紫杉醇、多西紫杉醇。该类药物的特点是能够靶向肿瘤低氧区域，被低氧肿瘤组织中高表达的特异性酶还原，被还原的氨基咪唑烷酸类化合物通过分子内环合作用，释放出原药。本发明所提供的前药，在体内外稳定，在低氧肿瘤组织中特异性还原释放药物，能够提高抗肿瘤药物的靶向性，降低毒副作用，增强疗效。

Description

一种基于2,2-二甲基-3-(2-硝基咪唑基)丙酸的低氧激活前药

技术领域

本发明涉及一种药物，尤其是一种通式I所示的2,2-二甲基-3-(2-硝基咪唑基)丙酸的低氧激活前药及其合成方法，该类前药具有良好的体内、外的稳定性，能够被低氧肿瘤组织中高表达的特异性酶还原释放药物，提高抗肿瘤疗效和靶向性。

背景技术

传统抗肿瘤药物，如紫杉醇，由于其同时作用于肿瘤细胞和正常细胞，对实体瘤疗效差、毒副作用大、生物利用度低、易产生耐药性。同时，肿瘤组织中普遍存在低氧区域，低氧肿瘤组织对传统放、化疗具有较强的抵抗性和耐受性。

2-硝基咪唑烷酸类化合物属于2-硝基咪唑类化合物，该类化合物能靶向低氧肿瘤组织，是肿瘤低氧治疗的一类全新的前药，可被用作肿瘤靶向分子和药物制剂。

近期已有专利公开了一类3-(2-硝基咪唑)丙酸前药，然而由于这类前药存在以下可逆的迈克尔加成反应，使得该类化合物存在合成收率低，结构不稳定的问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于2,2-二甲基-3-(2-硝基咪唑基)丙酸的低氧激活前药，利用2-硝基咪唑类化合物容易在低氧环境下转化为2-氨基咪唑类化合物，然后利用其分子内的环合作用，获得在低氧环境下容易离解的抗肿瘤前药。

本发明的目的是这样实现的：

一种基于2,2-二甲基-3-(2-硝基咪唑基)丙酸的低氧激活前药，特点是该前药由2,2-二甲基-3-(2-硝基咪唑基)丙酸类化合物通过酯键与抗肿瘤药物相连接，具有式I结构：

其中，R1、R2包括但不限于以下结构：氢、羟基、氯、溴、氟、C1～C6烷基、C1～C6含烯基的烷基、C1～C6含炔基的烷基。

所述抗肿瘤药物包括：紫杉醇、多西紫杉醇；

所述2,2-二甲基-3-(2-硝基咪唑基)丙酸类化合物具有通式II所示结构，其中，R₁、R₂包括但不限于以下结构：氢、羟基、氯、溴、氟、C1～C6烷基、C1～C6含烯基的烷基、C1～C6含炔基的烷基；

本发明的前药在低氧条件下，经硝基还原酶还原形成2-氨基咪唑前药，进而通过分子内关环作用，释放出原药。

2，2-二甲基-3-(2-硝基咪唑基)丙酸类前药具有通式I所示结构：

其中，优选结构为：

该类化合物合成是以2-硝基咪唑为原料，在1位上进行烷基化得到的，合成方法如下：

a)化合物1碱性条件下与二碘甲烷反应，得到化合物2。碱为二异丙基氨基锂，丁基锂等，优选二异丙基氨基锂；溶剂为二氯甲烷，N,N-二甲基甲酰胺，四氢呋喃等，优选四氢呋喃；温度-78～0℃，优选-78℃。

b)化合物2碱性条件下与化合物3反应，得到化合物4。碱为碳酸铯、碳酸钾、碳酸钠等，优选碳酸铯；溶剂为二氯甲烷，N,N-二甲基甲酰胺，四氢呋喃等，优选N,N-二甲基甲酰胺；温度0～100℃，优选100℃。

c)化合物4碱性条件下水解，得到化合物5。碱为氢氧化钠、氢氧化钾等，优选氢氧化钠；溶剂为水；温度0～100℃，优选25℃。

d)化合物5与紫杉醇反应，得到化合物4。催化剂为4-二甲氨基吡啶，脱水缩合剂为N,N′-二环己基碳酰亚胺，N,N--二异丙基碳二亚胺，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，优选1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐；溶剂为二氯甲烷，N,N-二甲基甲酰胺，四氢呋喃等，优选二氯甲烷；温度0～100℃，优选25℃。

本发明所述的前药用于卵巢癌、乳腺癌、肺癌、大肠癌、黑色素瘤、头颈部癌、淋巴瘤、脑瘤的治疗。

本发明所提供的前药，利用2-硝基咪唑能够在低氧肿瘤组织中被还原成2-氨基咪唑，进而通过分子内环合作用，释放出原药。该类前药在体内外稳定，在低氧肿瘤组织中特异性还原释放药物，能够提高抗肿瘤药物的靶向性，降低毒副作用，增强疗效。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(a)2，2-二甲基-3-(2-硝基咪唑)丙酸羧基α位的两个甲基的存在，避免了逆迈克尔加成，提高了前药的稳定性。

(b)2，2-二甲基-3-(2-硝基咪唑)丙酸羧基α位的两个甲基的存在，使得还原后的氨基咪唑烷酸前药更容易形成六元环，从而促进原药的释放。

(c)新型2，2-二甲基-3-(2-硝基咪唑)丙酸化合物的合成更为方便高效。

附图说明

图1为本发明化合物6针对pH值7.4的PBS和人血浆稳定性实验谱图；

图2为本发明化合物6的硝基还原酶稳定性实验谱图。

具体实施方式

本发明的2,2-二甲基-3-(2-硝基咪唑基)丙酸的低氧激活前药的制备方法在如下实施例中更详细地叙述，但实施例不构成对本发明的限制。

实施例1

化合物2的制备

将二异丙基胺(15.4mL，0.11mol)溶于无水四氢呋喃(100mL)，混合液冷却至-30℃，缓慢往体系中滴加正丁基锂(44.0mL，0.106mol)。滴加完毕后，反应体系于0℃反应30分钟，再次冷却至-78℃，往反应体系中滴加化合物1(13.6mL，0.10mol)，并在此温度下反应1小时后往混合体系中滴加二碘甲烷(5.20mL，0.065mol)，反应混合液室温反应16小时后，化合物1反应完全。将反应混合液倒入饱和氯化铵水溶液(100mL)中，用乙酸乙酯萃取，合并有机相，用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩。浓缩物通过油泵减压蒸馏得到无色油状化合物2(25.0g，94％)。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ4.17(q,J＝7.1Hz,2H),3.35(s,2H),1.33(s,6H),1.28(t,J＝7.1Hz,3H)，MS(ESI)m/z＝255.99[M+H]⁺。

实施例2

化合物4的制备

将碳酸铯(2.88g，8.84mmol)加入到化合物3(0.500g，4.42mmol)的N,N-二甲基甲酰胺(15mL)溶液中，混合物于室温搅拌15分钟后，往体系中加入化合物2(2.26g，8.84mmol)。反应混合液于100℃反应16小时，反应液颜色由黄色变为棕红色，化合物3反应完全。反应液冷却至室温，往体系中加入乙酸乙酯(60mL)，过滤，滤液用饱和碳酸氢钠(30mL)洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，浓缩物通过柱层析(石油醚:乙酸乙酯＝3:1)分离纯化得到浅黄色油状物4(1,1g，98％)。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.13(s,1H),7.11(s,1H),4.74(s,2H),4.15(q,J＝7.2Hz,2H),1.25(t,J＝6.7Hz,3H),1.21(d,J＝5.8Hz,6H)，MS(ESI)m/z＝241.11[M+H]⁺。

实施例3

化合物5的制备

将一水合氢氧化锂(418mg，9.96mmol)分批加入到化合物4(600mg，2.49mmol)的甲醇(20mL)和水(4mL)的混合溶液中，反应体系室温搅拌16小时，反应完毕。将体系中的甲醇通过水泵除去，混合体系用稀盐酸(2N)溶液调节pH至4.0后，水相用乙酸乙酯(30mL*2)萃取，有机相经过饱和氯化钠水溶液洗涤、无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，得到浅黄色固体5(448mg，84％)。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.21(s,1H),7.16(s,1H),4.76(s,2H),1.27(s,6H),MS(ESI)m/z＝213.08[M+H]⁺。

实施例4

化合物6的制备

将化合物5(13mg，0.06mmol)和紫杉醇(43mg，0.05mmol)溶于二氯甲烷(2mL)，加入4-二甲氨基吡啶(7mg，0.06mmol)，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(12mg，0.06mmol)，室温搅拌16小时，旋除溶剂，柱层析(二氯甲烷:甲醇＝30：1)分离纯化得到淡黄色固体6(30mg，47％)。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.17–8.10(m,2H),7.76–7.69(m,2H),7.64–7.58(m,1H),7.56–7.46(m,3H),7.45–7.37(m,4H),7.36–7.28(m,3H),7.01(s,1H),6.99(s,1H),6.86(d,J＝9.2Hz,1H),6.30(s,1H),6.23(t,J＝8.7Hz,1H),6.03(dd,J＝9.1,3.6Hz,1H),5.67(d,J＝7.1Hz,1H),5.45(d,J＝3.7Hz,1H),4.97(d,J＝7.9Hz,1H),4.76(d,J＝14.3Hz,1H),4.67(d,J＝14.3Hz,1H),4.50–4.40(m,1H),4.31(d,J＝8.4Hz,1H),4.20(d,J＝8.4Hz,1H),3.81(d,J＝7.1Hz,1H),2.61–2.46(m,5H),2.39–2.29(m,1H),2.22(s,3H),2.13–2.00(m,1H),1.96–1.84(m,5H),1.68(s,3H),1.22(d,J＝4.6Hz,3H),1.17(s,3H),1.15(s,3H),1.13(s,3H).HRMS(ESI):m/z Calcd for C₅₅H₆₀N₄O₁₇Na[M+Na]⁺1071.3846,found:1071.3844。

HPLC色谱条件

Agilent 1200四元泵(G1311A quat pump)，自动进样系统(G1329A，ALS)、恒温箱(G1316A，TCC)、紫外检测器(G1314B，VWD)、(G1321A，FLD)，chemstation B工作站；色谱柱：Diamonsil C18(4.6*250mm，5uL)；流速：1.0mL/min；柱温：25℃，波长227、365nm；流动相:5％乙腈/95％水——95％乙腈/5％水，梯度洗脱15min，95％乙腈/5％水，5min。

PBS稳定性实验

本发明针对化合物6设计了pH值7.4的PBS的稳定性实验。将化合物6加入PBS的缓冲液中，在37℃实验温度下于恒温振荡器中反应，每个固定的实验间隔取样后用有机溶剂淬灭，并用高效液相色谱测定底物的含量。

将化合物6配成DMSO溶液(10μM)，取10μL加入到1mL PBS缓冲液中，在37℃实验温度下于恒温振荡器中反应，并分别于0h、2h、4h、6h、8h、12h、24h取样100μL，加入100μL甲醇混合均匀，精密量取50μL注入液相色谱仪。

人血浆稳定性实验

将化合物6配成DMSO溶液(10μM)，取10μL加入到800μL的人/小鼠血浆中，在37℃实验温度下于恒温振荡器中反应，并分别于0h、1h、2h、4h、8h、12h、24h取样100μL，加入100μL甲醇混合均匀，离心机离心，精密量取50μL上清液注入液相色谱仪。

稳定性实验结果如图1所示，经过24h孵育，化合物6在PBS中稳定性为65％，人血浆中稳定性为50％。

硝基还原酶稳定性实验

为了验证化合物6在硝基还原酶条件下药物的释放，本发明设计了体外酶实验，将化合物6加入到一定浓度的硝基还原酶储备液中，在37℃实验温度下于恒温振荡器中反应，每个固定的实验间隔取样后用有机溶剂淬灭，并用高效液相色谱测定底物的含量和药物的释放量。

硝基还原酶储备液的制备

取硝基还原酶10μg,溶于1mL pH＝7.4的PBS缓冲液中即得。

将化合物6配成DMSO溶液(10μM)，各取10μL加入到1mL的硝基还原酶储备液中，取样100μL加入100μL甲醇混合均匀，离心机离心，精密量取50μL上清液注入液相色谱仪测定0时刻色谱图；测定完毕加入1μmol的NADPH，在37℃实验温度下于恒温振荡器中反应，并分别于0.25h、0.5h、1h、2h、4h、6h取样100μL，加入100μL甲醇混合均匀，离心机离心，精密量取50μL上清液注入液相色谱仪。

硝基还原酶实验结果如图2所示，化合物6迅速被还原，最终释放出60％的紫杉醇。

细胞毒测试

方法：细胞种板后，分别放置正常培养箱和低氧培养箱(1％O₂,5％CO₂,94％N₂)培养24h，使细胞贴壁。然后加入相应药物，分别放入正常培养箱和乏氧培养箱中，作用72h后，MTT测定IC₅₀，结果如下：

Claims

1.一种基于2,2-二甲基-3-(2-硝基咪唑基)丙酸的低氧激活前药，其特征在于，该前药由2,2-二甲基-3-(2-硝基咪唑基)丙酸类化合物通过酯键与抗肿瘤药物相连接，具有式I结构：

其中，R₁、R₂包括但不限于以下结构：氢、羟基、氯、溴、氟、C1～C6烷基、C1～C6含烯基的烷基、C1～C6含炔基的烷基。

2.根据权利要求1所述的低氧激活前药，其特征在于，所述抗肿瘤药物包括：紫杉醇、多西紫杉醇；

3.根据权利要求1所述的低氧激活前药，其特征在于所述2,2-二甲基-3-(2-硝基咪唑基)丙酸类化合物具有通式II所示结构，其中，R₁、R₂包括但不限于以下结构：氢、羟基、氯、溴、氟、C1～C6烷基、C1～C6含烯基的烷基、C1～C6含炔基的烷基；

4.一种权利要求1所述低氧激活前药的用途，其特征在于，该前药用于卵巢癌、乳腺癌、肺癌、大肠癌、黑色素瘤、头颈部癌、淋巴瘤及脑瘤的治疗。