CN113663086B - 一种树突细胞靶向的杂化树状大分子/YTHDF1 siRNA复合物及其制备和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种树突细胞靶向的杂化树状大分子/YTHDF1siRNA复合物及其制备方法和应用。该方法包括：G5.NH2‑Man制备，G5.NH2‑Man‑PS制备，{(Au0)25‑G5.NH2‑Man‑PS20}DENPs制备，树突细胞靶向的杂化树状大分子/YTHDF1siRNA复合物制备。该方法操作工艺简单，反应条件温和；制备得到的复合物能高效被树突细胞所吞噬并不影响树突细胞活力，能实现树突细胞转染并沉默YTHDF1的表达，用于增强肿瘤免疫治疗。

Description

一种树突细胞靶向的杂化树状大分子/YTHDF1 siRNA复合物 及其制备和应用
技术领域
本发明属于肿瘤免疫治疗杂化纳米材料及其制备和应用领域，特别涉及一种树突细胞靶向的杂化树状大分子/YTHDF1 siRNA复合物及其制备方法和应用。
背景技术
免疫疗法因其在肿瘤根除和预防复发方面的强大效果，已成为近年来最热门的肿瘤治疗策略之一。免疫疗法可以通过提高自身免疫敏感性来杀死肿瘤细胞，并且比传统治疗方法具有更低的毒性和更长的疗效。肿瘤新生抗原在产生自发的抗肿瘤免疫反应和预测免疫治疗的临床反应中具有重要作用。尽管患者体内存在大量新生抗原，但由于未能获得足够和持久的抗肿瘤免疫应答，完全治愈肿瘤基本上很难达成。有研究发现，YTHDF1蛋白(一种RNA m6A甲基化重要的阅读器蛋白)在树突细胞参与的抗肿瘤免疫过程中发挥重要作用，其基因缺失能有效增强树突细胞向CD8+T杀伤性细胞交叉呈递肿瘤抗原的能力，从而增强体内抗肿瘤免疫反应(Han et al.,Nature,2019,566(7743),270)。该研究表明YTHDF1是肿瘤免疫治疗的一个潜在治疗靶点。因此，进一步对树突细胞进行YTHDF1的基因沉默有望用于增强肿瘤免疫治疗。其中，siRNA介导的RNA干扰是一种高效可行的基因沉默手段，可以通过寻找一种稳定、安全、高效的纳米载体体系负载siRNA诱导YTHDF1基因沉默，从而增强肿瘤抗原交叉提呈，提高机体免疫反应，实现对肿瘤更为高效的免疫治疗。
聚酰胺-胺(PAMAM)树状大分子由于其典型的结构特征，包括单分散性、三维立体结构、表面可多功能化等，被广泛应用于生物医学领域，也被视为具有优良基因传递效率的非病毒载体之一。研究表明，PAMAM树状大分子一方面可以通过质子海绵效应从溶酶体中逃逸，保护基因不被溶酶体中的各种酶降解(Hou et al.,J.Mater.Chem.B,2016,4(17)2933-2943)。另一方面，其表面具有大量的氨基，赋予了它强大的基因压缩能力，同时可以进行不同的功能化，能够与其它分子产生物理或化学的作用，内部的空腔可以负载药物或无机纳米颗粒，并可进行表面聚乙二醇化修饰来降低细胞毒性并提高基因转染效率(Shan etal.,Biomaterials,2012,33(10),3025-3035；Kong L,et al.,Nanomedicine,2016,12(23),3103-3115)。此外，树状大分子包裹纳米金颗粒可用来压缩PD-L1 siRNA，转染诱导肿瘤组织中的PD-L1沉默，以恢复T细胞活力，增强肿瘤免疫治疗效果(Xue et al.,Sci.ChinaMater.,2021,DOI:10.1007/s40843-020-1591-1)。但目前这些研究并没有选择树突细胞作为新的研究的靶点，未尝试对其进行基因转染，并用于肿瘤的免疫治疗中。
根据国内外文献检索结果，目前尚未发现关于树突细胞靶向的树状大分子包裹纳米金颗粒/YTHDF1 siRNA复合物的制备及其在沉默树突细胞的YTHDF1基因及其免疫治疗等应用中的相关报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种树突细胞靶向的杂化树状大分子/YTHDF1siRNA复合物及其制备方法和应用，以填补现有技术的空白。
本发明提供一种树突细胞靶向的杂化树状大分子/YTHDF1 siRNA复合物，所述复合物为：表面修饰两性离子1，3-丙烷磺内酯(1,3-PS)和靶向试剂甘露糖(Mannose)、内部包裹纳米金颗粒的第五代聚酰胺-胺树状大分子G5.NH2负载YTHDF1 siRNA。
本发明还提供一种树突细胞靶向的杂化树状大分子/YTHDF1 siRNA复合物的制备方法，包括：
(1)将甘露糖Mannose、第五代聚酰胺-胺树状大分子G5.NH2与溶剂混合，搅拌反应，透析，冷冻干燥，得到G5.NH2-Man；
(2)将步骤(1)中G5.NH2-Man溶解于超纯水中，滴加1,3-PS溶液，搅拌反应，透析，冷冻干燥，得到G5.NH2-Man-PS；
(3)将步骤(2)中G5.NH2-Man-PS溶于超纯水中，置于冰浴中，加入HAuCl4·4H2O水溶液，搅拌，迅速加入含NaBH4冰水溶液，反应，透析，冷冻干燥，得到Man和1,3-PS修饰的第五代树状大分子包裹纳米金颗粒{(Au0)25-G5.NH2-Man-PS20}DENPs；
(4)将步骤(3)中{(Au0)25-G5.NH2-Man-PS20}DENPs与YTHDF1 siRNA共同孵育，得到树突细胞靶向的杂化树状大分子/YTHDF1 siRNA复合物。
优选地，上述方法中，所述步骤(1)中G5.NH2和Mannose的摩尔比为1:10～13。
优选地，上述方法中，所述步骤(1)中溶剂为磷酸盐缓冲盐溶液。
优选地，上述方法中，所述步骤(1)中搅拌反应温度为80～100℃，搅拌反应时间为3～5h。
优选地，上述方法中，所述步骤(1)中透析是采用截留分子量为1000的纤维素透析膜在超纯水中透析2-3天。
优选地，上述方法中，所述步骤(2)中G5.NH2-Man与1,3-PS的摩尔比为1:20～23。
优选地，上述方法中，所述步骤(2)中搅拌反应温度为25～35℃，搅拌反应时间为1～2天。
优选地，上述方法中，所述步骤(2)中透析是采用截留分子量为8000～14000的纤维素透析膜在超纯水中透析2-3天。
优选地，上述方法中，所述步骤(3)中G5.NH2-Man-PS与HAuCl4·4H2O的摩尔比为1:20～30；HAuCl4·4H2O与NaBH4的摩尔比为1:4～1:6。
优选地，上述方法中，所述步骤(3)中搅拌时间为15～30min；反应时间为2～3h。
优选地，上述方法中，所述步骤(3)中透析是采用截留分子量为8000～14000的纤维素透析膜在超纯水中透析2-3天。
优选地，上述方法中，所述步骤(4)中YTHDF1 siRNA为YTHDF1 1696 siRNA、YTHDF1410 siRNA或YTHDF1 1033 siRNA。
更优选地，所述YTHDF1 1696 siRNA、YTHDF1 410 siRNA、YTHDF1 1033 siRNA的意义链序列分别为5'-GCACAUCAGACUGGAGAAUTT-3'、5'-CCAUCCAUUGGAUUUCCUUTT-3'、5'-GGACAUUGGUACUUGGGAUTT-3'。
优选地，上述方法中，所述步骤(4)中{(Au0)25-G5.NH2-Man-PS20}DENPs与YTHDF1siRNA的N/P为0.25～12。
优选地，上述方法中，所述步骤(4)中将步骤(3)中{(Au0)25-G5.NH2-Man-PS20}DENPs与YTHDF1 siRNA共同孵育为：将{(Au0)25-G5.NH2-Man-PS20}DENPs溶于超纯水中，将YTHDF1 siRNA溶解于DEPC水中，将两种溶液混匀后共同孵育。
优选地，上述方法中，所述步骤(4)中共同孵育时间为20～30min。
本发明还提供一种树突细胞靶向的杂化树状大分子/YTHDF1 siRNA复合物在制备肿瘤免疫治疗药物中的应用。
本发明基于第五代聚酰胺-胺树状大分子，表面修饰两性离子1,3-PS、Mannose、内部包裹纳米金颗粒，最终通过静电吸附YTHDF1 siRNA形成MDNP/siYTH的复合物，实验结果表明，通过对小鼠淋巴结注射MDNP/siYTH，可有效增强机体免疫反应，抑制肿瘤生长。
本发明使用核磁共振氢谱(1H NMR)、紫外可见吸收光谱(UV-vis)、电感耦合等离子体原子发射光谱法(ICP-OES)、Zeta电势测试、动态光散射(DLS)测试和透射电镜(TEM)等方法表征了制备得到的纳米材料和siRNA复合物，利用CCK-8法在体外验证了杂化纳米材料及杂化纳米材料/YTHDF1 siRNA的生物相容性，采用凝胶阻滞实验等初步研究了材料的基因压缩能力，再利用流式细胞仪、共聚焦显微镜来评价该复合物在树突细胞吞噬能力和胞内定位情况，采用了RT-PCR、Western Blot评价YTHDF1 siRNA介导的基因沉默情况，及采用了流式细胞仪评价了其抗原交叉提呈能力，最后在小鼠体内评价了其抗肿瘤免疫治疗效果。具体测试结果如下：
(1)1H NMR表征结果
氢谱分析结果如图2所示，图2A为G5.NH2-PS的核磁共振氢谱，1.93ppm处为1,3-PS的特征归属，通过积分计算可得每个G5上连接的1,3-PS为19.8个。图2B为G5.NH2-Man-PS的核磁共振氢谱，8.05ppm处为席夫碱的特征峰，通过积分得每个G5上连接了6个Man；1.93ppm处为1,3-PS的特征归属，经计算得每个G5上连接的1,3-PS为20.1个。
(2)Uv-vis测试结果
Uv-vis测试结果如图3所示，分析结果可知，合成的{(Au0)25-G5.NH2-PS20}DENPs(DNP)(A)及MDNP(B)在510nm左右处有紫外吸收，说明成功合成了有独特吸收峰的纳米金颗粒。
(3)透射电镜(TEM)测试
TEM测试结果如图4A-B所示，可以发现DNP及MDNP的单分散性良好，粒径统计结果表明包裹的纳米金颗粒尺寸分别在1.9和1.8nm左右。
(4)凝胶阻滞实验结果
取DNP及MDNP溶于水中配置成2mg/mL的溶液，采用定氮试剂盒测定氨基的个数分别为56和50，然后DNP分别与YTHDF1 1696 siRNA、YTHDF1 410 siRNA或YTHDF1 1033 siRNA按照不同的氮磷比(0、0.25、0.5、1、2、3、4)孵育30分钟，孵育完之后进行琼脂糖凝胶电泳(图5A-C)，实验结果表明DNP在N/P大于等于2的条件下就可以完全压缩YTHDF1 siRNA，说明该材料具有很好的基因压缩能力。图5D为MDNP与YTHDF1 1033 siRNA按照不同的氮磷比(0、0.25、0.5、1、2、3、4)孵育30分钟，孵育完之后进行琼脂糖凝胶电泳，实验结果表明MDNP在N/P大于等于2的条件下就可以完全压缩YTHDF1 1033 siRNA，说明该材料具有很好的基因压缩能力。
(5)材料稳定性测试
取实施例1中的MDNP溶于水中配置成1mg/mL的溶液，通过纳米激光粒度仪，在1-7天之内每两天测试材料的水合粒径来研究材料的稳定性。结果如图6所示，随着时间的推移，MDNP在水溶液中的粒径没有发生明显的变化，证明了合成的材料具有良好的胶体稳定性。(6)体外细胞毒性(CCK-8)测试
利用CCK-8细胞活力实验验证了材料对树突细胞的毒性。如图7A所示DNP或DNP/YTHDF1 1696 siRNA、YTHDF1 410 siRNA或YTHDF1 1033 siRNA复合物本身均不影响树突细胞的活力。此外，如图7B所示，经MDNP或MDNP/YTHDF1 1033 siRNA处理的树突细胞，显示与对照组相比，细胞活力基本没有发生变化，说明MDNP或MDNP/YTHDF1 1033 siRNA复合物具有良好的细胞相容性。
(7)体外RT-PCR实验结果
将树突细胞种于12孔培养板中，加入含PBS、free siRNA、DNP/YTHDF1 1696siRNA、YTHDF1 410 siRNA或YTHDF1 1033 siRNA(N/P＝2)(每孔2μg siRNA)复合物的培养基孵育4小时后，更换为新鲜的培养基继续培养24小时后，提取总蛋白、反转录进行实时荧光定量PCR(RT-PCR)测试。如图8所示，三种siRNA都可以沉默树突细胞中的YTHDF1表达，其中YTHDF1 1033 siRNA沉默效果最佳，沉默效率为53.3％，与此同时，PBS组则对YTHDF1mRNA的表达无明显影响，至此，我们筛选出沉默效果最佳的YTHDF1 1033 siRNA用于后续的实验。
与上述类似，将树突细胞种于12孔培养板中，加入含PBS、free siRNA、MDNP/YTHDF1 1033 siRNA(N/P＝8)复合物，即MDNP/siYTH(每孔2μg siRNA)的培养基孵育4小时后，更换为新鲜的培养基继续培养24小时后，提取总蛋白、反转录进行实时荧光定量PCR(RT-PCR)测试。如图13A所示，相比于PBS组及MDNP/阴性siRNA(siNC)组，MDNP/siYTH的沉默效果最佳，沉默效率为68.6％，说明我们制备的复合物具有优异的树突细胞YTHDF1基因的沉默效果。
(8)Zeta电势及水动力学直径测试
将本发明制备的MDNP与YTHDF1 1033 siRNA按不同N/P比(N/P＝0、2、4、6、8、10、12)复合，室温孵育30分钟，然后加入1mL的PBS进行Zeta电势和水动力学直径测试(如图9A-B所示)。测试结果表明，MDNP/YTHDF1 1033 siRNA在N/P大于等于2下，纳米尺寸在168.4-268.8nm之间，电势在14.7-25.6mV之间，表明复合物带有正电荷及较小的水动力学直径，有利于后续基因传递应用。
(9)流式细胞仪检测吞噬情况
在将带有Cy3标记的YTHDF1 1033 siRNA按照不同的N/P值(N/P＝0、2、4、6、8、10、12)与MDNP共同孵育30分钟，制得MDNP/YTHDF1 1033 siRNA复合物，然后用此复合物与含完全培养基的树突细胞共培养4小时。之后将细胞消化、离心、收集，用流式细胞仪检测细胞的荧光强度(如图10所示)。实验结果表明，在N/P＝8的时候，荧光强度最高，表明在MDNP与YTHDF1 1033 siRNA在N/P＝8的时候的细胞内吞效果更好。
为了验证甘露糖修饰的树状大分子包裹的纳米金颗粒对树突细胞具有靶向作用，自由甘露糖阻断实验用于表征载体的靶向转染能力，在树突细胞培养基中添加自由的甘露糖来阻断甘露糖受体的表达，使用MDNP与Cy3-siRNA复合物分别转染未经处理的树突细胞和阻断的细胞。将自由的甘露糖加入到树突细胞的培养基中，作用1小时，再加入PBS、freesiRNA和MDNP/Cy3-siRNA(N/P＝8)复合物与树突细胞共培养4小时，随后通过流式细胞仪检测复合物的荧光强度，结果如图12所示，在N/P＝8的时候，未经处理的树突细胞相较于阻断的细胞来说表现出较高的荧光强度，且二者相比具有显著性差异，这也表明了甘露糖修饰的纳米材料对树突细胞具有较好的靶向作用。
(10)细胞定位实验结果
将带有Cy3标记的YTHDF1 1033 siRNA按照不同氮磷比(N/P＝0、2、4、6、8、10、12)与MDNP室温孵育30分钟，制得复合物MDNP/YTHDF1 1033 siRNA。将树突细胞与含PBS、freesiRNA或MDNP/YTHDF1 1033 siRNA的完全培养基共培养4小时。培养结束后用PBS清洗三次，随后用戊二醛固定后用DAPI染色。使用共聚焦显微镜的油镜下观察细胞的荧光信号。如图11所示，相比于PBS和单独的siRNA组，MDNP/YTHDF1 1033 siRNA处理的细胞显示了较高的荧光强度。说明本发明制备的MDNP/YTHDF1 1033 siRNA能很好的被树突细胞内吞。
(11)体外Western Blot实验结果
采用Western Blot来评价树突细胞内YTHDF1蛋白表达情况，将树突细胞与PBS、free siRNA、MDNP/siNC复合物或MDNP/siYTH(N/P＝8)复合物的完全培养基条件下共培养4小时后，更换为新鲜的培养基继续培养24小时后，裂解提取树突细胞总蛋白，后将蛋白质变性，进行SDS-PAGE凝胶电泳，电泳结束后转膜，免疫反应，ECL化学发光，显影，定影。结果如图13B-C所示。以PBS为空白对照组，β-Actin作为内参蛋白。实验结果表明，在实验组和对照组中内参蛋白量表达都很正常，相比于PBS、free siRNA和MDNP/siNC组，MDNP/siYTH处理的实验组YTHDF1蛋白有明显的下调。这一结果也证明了本发明合成的载体可以有效地携带siRNA进入细胞，从而达到基因治疗的目的。
(12)体外抗原交叉提呈能力实验结果
将树突细胞种于Transwell板上室，细胞培养过夜后，加入含PBS、free siRNA、MDNP/siNC复合物或MDNP/siYTH(N/P＝8)复合物的完全培养基，孵育4小时后，更换为新鲜的培养基，将上室的树突细胞转移至预先种在Transwell板下室的肿瘤细胞孔板中，培养24小时。之后消化、离心、收集，使用标有FITC-CD86抗体及PE-CD80抗体对其进行染色30分钟，用流式细胞仪检测样品的荧光强度(如图13D所示)。实验结果表明，相比于PBS、siRNA和阴性对照组，MDNP/siYTH实验组能明显增强抗原交叉提呈能力。
(13)体内抗肿瘤效果评价
将皮下种植B16黑色素瘤的小黑鼠随机分成5组用于评价抗肿瘤效果。第一组：淋巴结注射PBS；第二组：淋巴结注射MDNP/siNC；第三组：淋巴结注射MDNP/siYTH；第四组：瘤内注射PD-L1抗体，第五组：淋巴结注射MDNP/siYTH及瘤内注射PD-L1抗体。小鼠肿瘤治疗过程示意图如图14A所示。
如图14B所示，随着时间推移小鼠年龄增长且肿瘤体积增加，尤其是PBS组，小鼠体重也有所增加。如图14C-H所示，每个治疗组中的肿瘤抑制效果排序为：PBS＜MDNP/siNC＜PD-L1＜MDNP/siYTH＜MDNP/siYTH+PD-L1，其中MDNP/siYTH+PD-L1实验组的肿瘤抑制效果最好。
同时在第12天，取小鼠的血清进行了细胞因子如肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、干扰素-γ(IFN-γ)、白细胞介素-6(IL-6)的检测，如图14I-K所示，结果显示，治疗组能有效增强T细胞活力，增强抗肿瘤促炎因子的产生，帮助更好的杀伤肿瘤细胞。
为进一步验证机体免疫治疗，治疗过程中的第12天，将小鼠进行安乐死，如图15-16所示，各组小鼠脾脏及肿瘤组织中的T细胞被提取并收集，将带有荧光标记的FITC-CD4、PE-CD8抗体处理后，使用流式细胞仪对各组T细胞进行检测分析。如图15-16所示，相比于对照组及其它实验组、MDNP/siYTH+PD-L1组小鼠脾脏及肿瘤组织中的CD4+及CD8+效应T细胞表达最多。此外，两者结果表明，MDNP/siYTH复合物的基因沉默并联合PD-L1抗体能进一步增强肿瘤免疫治疗。同时，如图17所示，我们也对小鼠脾脏及肿瘤进行了CD4+/CD8+效应T细胞荧光染色，结果与流式所测得结果相符，MDNP/siYTH+PD-L1组CD4+/CD8+ T细胞的分布最多，进一步表明了MDNP/siYTH+PD-L1具有最好的免疫治疗效果。
随后，将治疗最后一天的小鼠肿瘤及淋巴结取出分别对其PD-L1、YTHDF1蛋白表达进行Western blot实验。同时也对治疗最后一天的小鼠肿瘤取出切片进行PD-L1荧光染色。如图18A-D所示，相比于对照组及其它实验组，MDNP/siYTH+PD-L1组的淋巴结组织中YTHDF1蛋白有明显下调，其表达水平为66％，表明MDNP/siYTH能顺利进入体内淋巴结区域沉默树突细胞YTHDF1的表达。此外，其肿瘤组织PD-L1蛋白有明显上调，其表达水平为159％。类似地，荧光结果如图18E所示，MDNP/siYTH+PD-L1实验组的PD-L1表达细胞最多，这一结果显示γ干扰素会导致PD-L1的表达上调，使得PD-L1抗体更好的发挥作用，从而提高肿瘤治疗效率。
此外，将治疗第12天的小鼠的肿瘤取出切片进行TUNEL染色，如图18F所示，MDNP/siYTH+PD-L1实验组的凋亡细胞数最多。同时，也将治疗第12天的小鼠心、肝、脾、肺、肾取出进行H&E染色测试，如图19所示，不同治疗组的小鼠心、肝、脾、肺、肾均无明显异常病理出现，表明了MDNP/siYTH+PD-L1的良好生物相容性。
有益效果
(1)本发明操作工艺简单，反应条件温和，易操作，易于实现，所用的合成原料均为环境友好型材料，具有良好的发展前景；
(2)本发明制备的复合物MDNP/siYTH治疗试剂，能高效被树突细胞所吞噬并不影响树突细胞活力，能实现树突细胞转染并沉默YTHDF1的表达；
(3)本发明制备的复合物MDNP/siYTH具有多功能性，可以用于体外、体内的树突细胞的YTHDF1基因沉默改造，用于增强肿瘤免疫治疗，在纳米医学、肿瘤免疫治疗领域具有潜在的应用价值。
附图说明
图1为本发明树突细胞靶向树状大分子包裹纳米金颗粒/YTHDF1复合物的合成及其应用于肿瘤免疫治疗示意图。
图2为本发明制备的G5.NH2-PS(A)和G5.NH2-Man-PS的(B)的1H NMR谱图。
图3为本发明制备的DNP(A)及MDNP(B)的UV-vis谱图。
图4为本发明制备的DNP(A)及MDNP(B)的高分辨透射电镜图片以及对应的粒径分布直方图。
图5为本发明制备的DNP复合YTHDF1 1696 siRNA(A)、YTHDF1 410 siRNA(B)或YTHDF1 1033 siRNA(C)及MDNP复合YTHDF1 1033 siRNA(D)后在不同N/P下的凝胶阻滞实验电泳图谱(条带1：裸YTHDF1 siRNA；条带2：N/P＝0.25:1；条带3:N/P＝0.5:1；条带4:N/P＝1:1；条带5:N/P＝2:1；条带6:N/P＝3:1；条带7:N/P＝4:1)。
图6为本发明制备MDNP在水溶液中于不同时间通过纳米激光粒度仪测得的水动力学直径变化图。
图7为本发明制备的DNP和DNP/YTHDF1 1696 siRNA、YTHDF1 410 siRNA或YTHDF11033 siRNA复合物(A)，MDNP和MDNP/siYTH复合物(B)与树突细胞共培养后的CCK-8细胞活力检测结果。
图8为本发明制备的DNP和DNP/YTHDF1 1696 siRNA、YTHDF1 410 siRNA或YTHDF11033 siRNA与树突细胞处理24小时后的RT-PCR结果图。
图9为本发明制备MDNP复合YTHDF1 1033 siRNA后在不同N/P下的水动力学直径(A)和Zeta电势(B)结果。
图10为本发明制备的MDNP在不同N/P下复合Cy3标记的YTHDF1 1033 siRNA后与树突细胞共孵育4小时，经流式细胞仪测定的吞噬结果图(左图为荧光强度直方图，右图为平均荧光强度图)。
图11为本发明制备的MDNP在不同N/P下复合Cy3标记的YTHDF1 1033 siRNA后与树突细胞共孵育4小时，经荧光染色后的激光共聚焦显微镜图片。
图12为本发明制备的MDNP/Cy3-siYTH复合物在N/P＝8时，以PBS、free siRNA和正常树突细胞为对照，与预先用甘露糖处理的树突细胞处理后的细胞吞噬流式细胞术分析结果图(左图为荧光强度直方图，右图为平均荧光强度图)。
图13为PBS、free siRNA、MDNP/siNC和MDNP/siYTH复合物与树突细胞处理24小时后的RT-PCR结果图(A)、Western blot图(B)及其定量数据图(C)和树突细胞CD80、CD86表达结果图(D)。
图14为B16黑色素瘤荷瘤小鼠接受PBS、MDNP/siNC、PD-L1、MDNP/siYTH、MDNP/siYTH+PD-L1处理12天治疗过程示意图(A)、体重变化(B)、每组的肿瘤体积变化图{PBS(C)、MDNP/siNC(D)、PD-L1(E)、MDNP/siYTH(F)、MDNP/siYTH+PD-L1(G)}、每组肿瘤体积相对体积变化图(H)和治疗12天后荷瘤小鼠血清中的TNF-α(I)、IFN-γ(G)、IL-6(K)细胞因子的酶联免疫吸附检测结果。
图15为接受PBS、MDNP/siNC、PD-L1、MDNP/siYTH、MDNP/siYTH+PD-L1处理12天后荷瘤小鼠脾脏组织中CD4+、CD8+效应T细胞检测结果，其中CD4+、CD8+效应T细胞流式结果图(A)及CD4+(B)、CD8+(C)效应T细胞表达定量结果图。
图16为接受PBS、MDNP/siNC、PD-L1、MDNP/siYTH、MDNP/siYTH+PD-L1处理12天后荷瘤小鼠肿瘤组织中的CD4+、CD8+效应T细胞检测结果，其中CD4+、CD8+效应T细胞流式结果图(A)及CD4+(B)、CD8+(C)效应T细胞表达定量结果图。
图17为接受PBS、MDNP/siNC、PD-L1、MDNP/siYTH、MDNP/siYTH+PD-L1处理12天后荷瘤小鼠脾脏(A)及肿瘤组织中(B)中的CD4+、CD8+效应T细胞荧光染色图。
图18为接受PBS、MDNP/siNC、PD-L1、MDNP/siYTH、MDNP/siYTH+PD-L1处理12天后荷瘤小鼠淋巴结组织YTHDF1蛋白表达结果图(A)(其中1,2,3,4,5分别代表PBS、MDNNP/siNC、PD-L1、MDNP/siYTH、MDNP/siYTH+PD-L1组)、肿瘤组织PD-L1蛋白表达结果图(B)(其中1,2,3,4,5分别代表PBS、MDNNP/siNC、PD-L1、MDNP/siYTH、MDNP/siYTH+PD-L1组)，及YTHDF1蛋白表达(C)和PD-L1蛋白表达(D)定量数据图；肿瘤切片的PD-L1(E)及TUNEL(F)荧光染色结果图。
图19为接受PBS、MDNP/siNC、PD-L1、MDNP/siYTH、MDNP/siYTH+PD-L1处理12天后荷瘤小鼠心、肝、脾、肺、肾切片的H&E染色结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
(1)称取10mg第五代PAMAM树状大分子(G5.NH2)(购自美国Dendritech公司)和0.94mg的1,3-PS(购自上海百灵威科技有限公司)，分别溶解于5mL超纯水和2mL超纯水中，30℃下水浴搅拌反应24小时。反应结束后，使用截留分子量为8000～14000的纤维素透析袋在纯水(2L)中透析3天(每日换水3-4次)后冷冻干燥，得到G5.NH2-PS；
(2)称取10mg G5.NH2-PS，溶于5mL的超纯水中。随后，加入121μL的HAuCl4·4H2O(购自国药集团化学试剂有限公司)水溶液(30mg/mL)，搅拌15分钟后，迅速加入2mL含1.67mg NaBH4的冰水溶液，反应3小时。随后使用截留分子量为8000～14000的纤维素透析袋在纯水(2L)中透析3天(每日换水3-4次)，冷冻干燥，得到{(Au0)25-G5.NH2-PS20}DENPs(DNP)；
(3)称取20mg第五代PAMAM树状大分子(G5.NH2)和1.4mg的甘露糖(Mannose)分别溶于3mL和2mL的PBS缓冲液中，在90℃水浴搅拌反应4小时，使用截留分子量为1000的纤维素透析袋在纯水(2L)中透析3天(每日换水3-4次)后冷冻干燥，得到G5.NH2-Man；称取10mg的G5.NH2-Man，配置成2mg/mL的超纯水溶液，将0.89mg的1,3-PS溶于1毫升超纯水中，在30℃下水浴搅拌反应24小时。反应结束后，使用截留分子量为8000～14000的纤维素透析袋在纯水(2L)中透析3天(每日换水3-4次)后冷冻干燥，得到G5.NH2-Man-PS；
(4)称取10mg G5.NH2-Man-PS，将其溶于5mL的超纯水中。随后，加入112μL的HAuCl4·4H2O水溶液(30mg/mL)，搅拌15分钟后，迅速加入2mL含1.58mg NaBH4的冰水溶液，反应3小时。随后使用截留分子量为8000～14000的纤维素透析袋在纯水(2L)中透析3天(每日换水3-4次)，冷冻干燥，得到{(Au0)25-G5.NH2-Man-PS20}(MDNP)；
(5)称取DNP配置成2mg/mL的超纯水溶液，将YTHDF1 siRNA(YTHDF1 siRNA购自上海吉玛基因公司，含21个碱基对，其中YTHDF1 1696 siRNA、YTHDF1 410 siRNA或YTHDF11033 siRNA的意义链序列分别为5'-GCACAUCAGACUGGAGAAUTT-3'、5'-CCAUCCAUUGGAUUUCCUUTT-3'、5'-GGACAUUGGUACUUGGGAUTT-3')溶解于DEPC水中配置成0.5μg/mL的溶液，取2μL YTHDF1 1696 siRNA、YTHDF1 410 siRNA或YTHDF1 1033 siRNA(即1μg)，与DNP溶液按N/P＝2充分混匀后共孵育30分钟，即得到DNP/YTHDF1 1696 siRNA、YTHDF1410 siRNA或YTHDF1 1033 siRNA三种复合物；
(6)称取MDNP配置成2mg/mL的超纯水溶液，将YTHDF1 1033 siRNA溶解于DEPC水中配置成0.5μg/mL的溶液，取2μL YTHDF1 1033 siRNA(即1μg)，与MDNP溶液按N/P＝8充分混匀后共孵育30分钟，即得到MDNP/siYTH复合物。
实施例2
对实施例1步骤(1)和步骤(3)中制备的G5.NH2-PS和G5-Man-PS各称取5mg，分别溶于500μL D2O中，进行核磁氢谱分析(如图2所示)。如图2A所示，其中2.2～3.4ppm为第五代树状大分子的特征峰，1.93ppm处为1,3-PS的特征峰，通过积分计算得到每个树状大分子上连接了19.8个1,3-PS。如图2B所示，8.05ppm处为席夫碱的特征峰，2.2～3.4ppm为第五代树状大分子的特征峰，1.93ppm处为1,3-PS的特征峰，并通过积分计算得到每个树状大分子上连接了6个Man和20.1个1,3-PS。
实施例3
对实施例1步骤(2)和步骤(4)中制备的DNP和MDNP进行表征。
(1)取实施例1步骤(2)中和步骤(4)中制备的DNP和MDNP，配置成0.5mg/mL的水溶液，进行紫外可见吸收光谱(UV-vis)测试，测量紫外吸收，结果如图3所示。紫外结果表明，Au纳米颗粒在510nm左右有吸收峰，此结果说明纳米金颗粒的成功合成；
(2)为了对制备得到的纳米颗粒的形貌和尺寸进行表征，分别取本发明实取实施例1步骤(2)中和步骤(4)中制备的DNP和MDNP 1mg溶解在1mL超纯水中配成纳米颗粒悬浮液，并取悬浮液5μL滴在铜网表面，进行TEM测试(如图4所示)。TEM结果显示DNP(图4A)和MDNP(图4B)尺寸均一、分散性良好，纳米金平均粒径分别为1.9和1.8nm左右；
(3)取0.2mg/mL的MDNP水溶液进行水动力学直径和Zeta电势测试，如表1所示，MDNP水动力学直径在180.6nm，Zeta电势为22.2mV，单分散性系数较小为0.3；
(4)取1mg的MDNP粉末加入1ml王水(浓硝酸:浓盐酸＝1:3配置)消化4小时后加入3mL超纯水稀释进行原子发射光谱ICP-OES测试，如表1所示，每摩尔MDNP约含25.0mol Au元素。
表1
Figure BDA0003169759680000111
实施例4
选取YTHDF1 1696 siRNA、YTHDF1 410 siRNA或YTHDF1 1033 siRNA探究实施例1步骤(2)制备的DNP压缩基因的能力。
首先进行凝胶阻滞实验，取DNP，将其配置成浓度为2mg/mL的超纯水溶液，采用定氮试剂盒测定DNP的氨基的个数为56，然后将DNP与YTHDF1 1696 siRNA、YTHDF1 410 siRNA或YTHDF1 1033 siRNA按照不同的氮磷比(0、0.25、0.5、1、2、3、4)孵育30分钟，孵育完之后进行琼脂糖凝胶电泳(100V，30分钟)。如图5A-C所示，DNP在N/P大于等于2的条件下就可以完全压缩YTHDF1 siRNA，表明DNP具有很好的基因压缩能力。
实施例5
对实施例1步骤(4)制备的MDNP进行材料稳定性测试。将实施例1步骤(4)制备的MDNP溶解于超纯水中配置成1mg/mL的溶液。如图6所示，可以发现，7天内，MDNP的水动力学直径无明显变化，表明所合成的材料具有良好的胶体稳定性。
实施例6
将树突细胞按照每孔8×103的密度种植与96孔细胞培养板中，过夜、贴壁后更换成含Au浓度为0、5、10、20、40、80、100、200μM的DNP或DNP/YTHDF1 1696 siRNA、YTHDF1 410siRNA或YTHDF1 1033 siRNA复合物(siRNA含量均为1μg/孔)完全培养基培养24小时后，用PBS清洗2-3次，更换培养基为含10％CCK-8溶液的无血清培养基，37℃培养箱中培养2小时后用酶标仪在450nm波长下测定吸光度值，计算细胞活力。如图7A所示，实施例1步骤(2)制备DNP及DNP/YTHDF1 1696 siRNA、YTHDF1 410 siRNA或YTHDF1 1033 siRNA复合物本身均不影响树突细胞的活力。
实施例7
评价实施例1步骤(5)中三种复合物转染树突细胞后的YTHDF1基因沉默效果。将树突细胞按1×105种于12孔细胞培养板中，加入含PBS、DNP/YTHDF1 1696 siRNA、YTHDF1 410siRNA或YTHDF1 1033 siRNA(N/P＝2)复合物的完全培养基在37℃培养箱中培养4小时后，用PBS清洗2-3次，最后更换为新鲜的培养基继续培养24小时后，提取总蛋白、反转录进行实时荧光定量PCR(RT-PCR)测试。如图8所示，相比于YTHDF1 1696 siRNA、YTHDF1 410 siRNA这两种siRNA，YTHDF1 1033 siRNA复合物的基因沉默效率最高，从而筛选出YTHDF1 1033siRNA为后续实验用。
实施例8
选取YTHDF1 1033 siRNA探究实施例1步骤(4)制备的MDNP压缩基因能力。首先进行凝胶阻滞实验，将MDNP配置成浓度为2mg/mL的超纯水溶液，采用定氮试剂盒测定MDNP氨基的个数为50，然后将MDNP与YTHDF1 1033 siRNA按照不同的氮磷比(0、0.25、0.5、1、2、3、4)孵育30分钟，孵育完之后对复合物进行琼脂糖凝胶电泳(100V，30分钟)。如图5D所示，MDNP在N/P大于等于2的条件下就可以完全压缩YTHDF1 1033 siRNA，表明MDNP具有很好的基因压缩能力。
实施例9
将树突细胞按照每孔8×103的密度种植与96孔细胞培养板中，过夜、贴壁后更换成含Au浓度为0、5、10、20、40、80、100、200μM的MDNP或MDNP/YTHDF1 1033 siRNA复合物(siRNA含量均为1μg/孔)的完全培养基培养24小时后，用PBS清洗2-3次，更换培养基为含10％CCK-8溶液的无血清培养基，37℃培养箱中培养2小时，后用酶标仪在450nm波长下测定吸光度值，计算细胞活力。如图7B所示，实施例1步骤(4)制备MDNP及MDNP/YTHDF1 1033siRNA复合物本身均不影响树突细胞的活力。
实施例10
进行实施例1步骤(4)中MDNP/YTHDF1 1033 siRNA复合物在不同N/P下被树突细胞吞噬的能力评价。将树突细胞按照以每孔5×104密度种植于24孔细胞培养板中，过夜、贴壁后，再将带有Cy3标记的YTHDF1 1033 siRNA按照不同的N/P值(N/P＝0、2、4、6、8、10、12)与MDNP共同孵育30分钟，然后用此复合物在完全培养基条件下37℃培养4小时。之后将所有孔板的细胞用PBS清洗2-3次、消化、离心、收集，用流式细胞仪检测样品的荧光强度(如图10所示)。实验结果表明，在N/P＝8的时候，荧光强度最高，树突细胞的吞噬效果最好。
实施例11
对实施例1步骤(4)中MDNP与YTHDF1 1033 siRNA在不同N/P下形成的复合物进行细胞内定位实验。将树突细胞以每孔1×105密度种植于激光共聚焦显微镜皿中，过夜、贴壁后，在将带有Cy3标记的YTHDF1 1033 siRNA按照不同的N/P值(N/P＝0、2、4、6、8、10、12)与MDNP共同孵育30分钟，然后用此复合物在完全培养基条件下37℃培养箱中培养4小时。培养结束后用PBS清洗2-3次，随后用4％的戊二醛4℃固定15分钟，固定后用DAPI染色15分钟，然后在共聚焦显微镜的油镜下观察细胞的荧光信号。如图11所示，实验结果表明，相比于PBS和单独的siRNA组，MDNP/YTHDF1 1033 siRNA复合物处理的细胞显示了较强Cy3的红色荧光强度。说明本发明制备的MDNP/YTHDF1 1033 siRNA复合物能很好的被树突细胞内吞，进一步使得siRNA发挥作用。
实施例12
进行实施例1步骤(6)中MDNP/siYTH复合物靶向吞噬效果评价。为了验证甘露糖修饰的树状大分子包裹的纳米金颗粒复合物(MDNP/siYTH)对树突细胞具有靶向作用，自由甘露糖阻断实验用于表征载体材料的靶向转染能力，在树突细胞培养基中添加自由的甘露糖来阻断细胞表面甘露糖受体的表达，使用MDNP/Cy3-siRNA复合物分别转染正常树突细胞和阻断的树突细胞。将自由的甘露糖加入到树突细胞的培养基中，作用1小时，再加入PBS、siRNA和MDNP/Cy3-siRNA(N/P＝8)复合物在完全培养基中37℃培养4小时，用PBS清洗2-3次、消化、离心、收集，用流式细胞仪检测样品的荧光强度。结果如图12所示，在N/P＝8的时候，正常树突细胞相较于阻断的树突细胞来说表现出了较高的荧光强度，且二者相比具有显著性差异，这也表明了甘露糖修饰的纳米材料对树突细胞具有较好的特异靶向作用。
实施例13
评价实施例1步骤(6)中MDNP/siYTH复合物转染树突细胞后的YTHDF1基因沉默效果。将树突细胞按1×105种于12孔细胞培养板中，在37℃培养箱培养过夜，待细胞贴壁后，加入含PBS、free siRNA、MDNP/siNC复合物(其制备过程与MDNP/siYTH复合物制备过程类似，即MDNP与阴性对照siRNA在N/P＝8的情况下共同孵育30分钟获得MDNP/siNC复合物)或MDNP/siYTH复合物(N/P＝8，每孔2μg siRNA，载体与siRNA共同孵育30分钟)，在完全培养基中37℃培养4小时。培养结束后用PBS清洗2-3次，最后更换为新鲜培养基继续培养24小时后，提取总蛋白、反转录进行实时荧光定量PCR(RT-PCR)测试。如图13A所示，MDNP/siYTH复合物组树突细胞表达了更少的YTHDF1 mRNA，表明MDNP/siYTH介导的基因转染有效降低了YTHDF1的表达，相对于PBS组，mRNA水平的YTHDF1沉默效率为31.4％。与此同时，对照MDNP/siNC复合物则对YTHDF1 mRNA的表达无明显影响。
随后采用Western Blot来评价树突细胞内YTHDF1蛋白表达情况。将树突细胞以每孔1×105的密度种植于12孔板中，在37℃培养箱培养过夜，待细胞贴壁后，更换含有PBS、free siRNA、MDNP/siNC或MDNP/siYTH复合物(N/P＝8，每孔2μg siRNA，载体与siRNA共同孵育30分钟)的培养基，孵育4小时，用PBS清洗2-3次，加入新鲜培养基，继续培养24小时，然后用细胞裂解液提取树突细胞的总蛋白，后将蛋白质变性，进行SDS-PAGE凝胶电泳，电泳结束后转膜，免疫反应，ECL化学发光，显影，定影，成像及定量结果如图13B-C所示。以PBS为空白对照组，β-Actin作为内参蛋白。实验结果表明，在实验组和对照组中内参蛋白量表达都很正常，相较于PBS、free siRNA和MDNP/siNC复合物组，MDNP/siYTH处理的实验组YTHDF1蛋白有明显的下调，这一结果也证明了本发明合成的载体可以有效地携带siRNA进入细胞，沉默YTHDF1基因的表达，从而达到基因治疗的目的。
实施例14
评价实施例1步骤(6)中MDNP/siYTH对树突细胞的抗原交叉提呈能力。将树突细胞以每孔5×104种于种于Transwell板上室，细胞培养过夜后，加入含PBS、free siRNA、MDNP/siNC或MDNP/siYTH复合物(N/P＝8，每孔2μg siRNA，载体与siRNA共同孵育30分钟)的培养基，培养4小时，用PBS清洗2-3次，更换为新鲜的培养基，并将上室的树突细胞转移至预先种在Transwell板下室的肿瘤细胞的孔板中，继续培养24小时。之后将上室的树突细胞消化、离心、收集，用FITC-CD86及PE-CD80抗体对其进行染色30分钟，用流式细胞仪检测样品的荧光强度(图13D)。实验结果表明，相比于PBS、free siRNA和MDNP/siNC组，MDNP/siYTH实验组处理后的树突细胞中CD80、CD86明显增多，表示MDNP/siYTH复合物能够明显增强树突细胞抗原交叉提呈能力。
实施例15
评价实施例1步骤(6)中的MDNP/siYTH联合PD-L1抗体后对于B16黑色素瘤的抑制效果。将取5-6周龄的雌性C57BL/6小黑鼠，每只皮下种植1×106的B16黑色素瘤，构建肿瘤模型。肿瘤体积达到0.3-0.6cm3后，将小黑鼠随机分成5组，第一组：淋巴结注射PBS；第二组：淋巴结注射MDNP/siNC；第三组：淋巴结注射MDNP/siYTH；第四组：瘤内注射PD-L1抗体；第五组：淋巴结注射MDNP/siYTH及瘤内PD-L1抗体。治疗过程如图14A所示，从第0天开始，每三天注射一次材料，治疗三次，其中第五组的PD-L1抗体在每次注射材料后的后一天进行注射，总共注射三次。每两天测量和记录小鼠的体重变化，并测算每组小鼠的肿瘤体积及相对肿瘤体积，计算公式如下：
肿瘤体积(V)＝a×b2/2 (1)
*a和b分别代表肿瘤直径的最大值和最小值。
相对肿瘤体积＝V/V0 (2)
*V和V0分别代表给药后的肿瘤体积和给药前的肿瘤体积。
如图14B所示，随着时间推移小鼠体重有所增加。相对其他组，PBS组老鼠体重增长较快，这可能是由于肿瘤体积增长较快所致。如图14C-H所示，可以看出，相对于PBS组、MDNP/siNC组，PD-L1抗体组、MDNP/siYTH及MDNP/siYTH+PD-L1组都表现出一定程度的抑制肿瘤效果。其中MDNP/siYTH+PD-L1肿瘤抑制效果最好。
同时在第12天，取小鼠的血清进行了细胞因子TNF-α、IFN-γ和IL-6进行的检测，如图14I-K所示，相比于PBS组和MDNP/siNC组，PD-L1抗体组、MDNP/siYTH及MDNP/siYTH+PD-L1组能有效增强T细胞活力，增强抗肿瘤促炎因子的产生，帮助更好的杀伤肿瘤细胞。
随后在治疗后12天，将各组小鼠各取一只，将小鼠进行安乐死，无菌条件下取出其肿瘤及脾脏组织，提取脾脏及肿瘤的T细胞，然后将上述获取的T细胞分别用不同荧光标记的FITC-CD4、PE-CD8抗体进行处理，通过流式细胞仪对肿瘤组织中CD4+T细胞与CD8+T细胞进行定量分析。如图15-16所示，结果表明相比于PBS组和MDNP/siNC组，PD-L1抗体组、MDNP/siYTH及MDNP/siYTH+PD-L1组CD4+及CD8+效应T细胞表达都有提高，但其中MDNP/siYTH+PD-L1组中CD4+、CD8+效应T细胞表达最多，这是由于MDNP/siYTH+PD-L1组治疗后增强了荷瘤小鼠体内抗原交叉提呈能力以及PD-L1抗体能够与肿瘤细胞表面PD-L1相结合，从而恢复了T细胞的免疫应答功能，进而高效的杀死肿瘤。这说明，结合PD-L1抗体和MDNP/siYTH可以增强T细胞的免疫应答功能，从而增强机体免疫治疗效果。此外，将治疗后第12天的肿瘤取出切片进行CD4+/CD8+T细胞荧光染色，结果如图17所示，MDNP/siYTH及MDNP/siYTH+PD-L1两组的CD4+/CD8+T细胞在脾脏(17A)及肿瘤组织(17B)细胞数最多，这一结果与流式结果相符，进一步表明了MDNP/siYTH+PD-L1具有最好的免疫治疗效果。
此外，将治疗最后一天的小鼠肿瘤及淋巴结组织取出并分别对其PD-L1、YTHDF1蛋白表达进行Western blot实验。同时也对治疗最后一天的小鼠肿瘤取出切片进行PD-L1荧光染色。如图18A-D所示，相比于对照组及其它实验组，MDNP/siYTH+PD-L1组的淋巴结组织中YTHDF1蛋白有明显下调，其表达水平为66％，表明MDNP/siYTH能顺利进入体内淋巴结区域沉默树突细胞中YTHDF1的表达。此外，其肿瘤组织PD-L1蛋白有明显上调，其表达水平为159％。类似地，荧光结果如图18E所示，MDNP/siYTH+PD-L1实验组的PD-L1表达细胞最多，这一结果显示γ干扰素会导致PD-L1的表达上调，使得PD-L1抗体更好的发挥作用，从而提高肿瘤治疗效率。
将治疗后第12天的小鼠肿瘤取出切片，进行TUNEL染色，如图18F所示，MDNP/siYTH+PD-L1组的凋亡细胞数最多。同时，将治疗第12天的小鼠心、肝、脾、肺、肾取出进行H&E染色检测，如图19所示，不同治疗组的小鼠心、肝、脾、肺、肾均无明显病理出现，表明MDNP/siYTH+PD-L1的良好生物相容性。
SEQUENCE LISTING
<110> 东华大学
<120> 一种树突细胞靶向的杂化树状大分子/YTHDF1 siRNA复合物及其制备和应用
<130> 1
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
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<212> DNA
<213> 人工序列
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gcacaucaga cuggagaaut t 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ccauccauug gauuuccuut t 21
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ggacauuggu acuugggaut t 21

Claims (8)

1.一种树突细胞靶向的杂化树状大分子/YTHDF1 siRNA复合物，其特征在于，所述复合物为：表面修饰1，3-丙烷磺内酯和甘露糖、内部包裹纳米金颗粒的第五代聚酰胺-胺树状大分子G5.NH2负载YTHDF1 siRNA，所述YTHDF1 siRNA为YTHDF1 1696 siRNA、YTHDF1 410siRNA或YTHDF1 1033 siRNA，所述YTHDF1 1696 siRNA、YTHDF1 410 siRNA、YTHDF1 1033siRNA的意义链序列分别为5'-GCACAUCAGACUGGAGAAUTT-3'、5'-CCAUCCAUUGGAUUUCCUUTT-3'、5'-GGACAUUGGUACUUGGGAUTT-3'。
2.一种树突细胞靶向的杂化树状大分子/YTHDF1 siRNA复合物的制备方法，包括：
（1）将甘露糖Mannose、第五代聚酰胺-胺树状大分子G5.NH2与溶剂混合，搅拌反应，透析，冷冻干燥，得到G5.NH2-Man，其中G5.NH2和Mannose的摩尔比为1:10~13，搅拌反应温度为80~100℃，搅拌反应时间为3~5h；
（2）将步骤（1）中G5.NH2-Man溶解于超纯水中，滴加1，3-丙烷磺内酯1,3-PS溶液，搅拌反应，透析，冷冻干燥，得到G5.NH2-Man-PS；
（3）将步骤（2）中G5.NH2-Man-PS溶于超纯水中，加入HAuCl4·4H2O水溶液，搅拌，迅速加入含NaBH4冰水溶液，反应，透析，冷冻干燥，得到Man和1,3-PS修饰的第五代树状大分子包裹纳米金颗粒{(Au0)25-G5.NH2-Man-PS20} DENPs；
（4）将步骤（3）中{(Au0)25-G5.NH2-Man-PS20} DENPs与YTHDF1 siRNA共同孵育，得到树突细胞靶向的杂化树状大分子/YTHDF1 siRNA复合物，其中YTHDF1 siRNA为YTHDF1 1696siRNA、YTHDF1 410 siRNA或YTHDF1 1033 siRNA，所述YTHDF1 1696 siRNA、YTHDF1 410siRNA、YTHDF1 1033 siRNA的意义链序列分别为5'-GCACAUCAGACUGGAGAAUTT-3'、5'-CCAUCCAUUGGAUUUCCUUTT-3'、5'-GGACAUUGGUACUUGGGAUTT-3'。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中溶剂为磷酸盐缓冲盐溶液。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中G5.NH2-Man与1,3-PS的摩尔比为1:20~23；搅拌反应温度为25~35℃，搅拌反应时间为1~2天。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）中G5.NH2-Man-PS与HAuCl4·4H2O的摩尔比为1:20~30；HAuCl4·4H2O与NaBH4的摩尔比为1:4~1:6。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）中搅拌时间为15~30min；反应时间为2~3h。
7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（4）中{(Au0)25-G5.NH2-Man-PS20} DENPs与YTHDF1 siRNA的 N/P为0.25~12；共同孵育时间为20~30min。
8.一种如权利要求1所述的复合物在制备肿瘤免疫治疗药物中的应用。
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