CN108395531B - 一种包裹纳米金颗粒的两性离子和吗啡啉修饰的聚酰胺-胺树状大分子的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种包裹纳米金颗粒的两性离子和吗啡啉修饰的聚酰胺‑胺树状大分子的制备方法，包括：羧酸甜菜碱丙烯酰胺CBAA制备，G5.NH2‑CBAA制备，两性离子和吗啡啉修饰的聚酰胺‑胺树状大分子溶液制备，包裹纳米金颗粒的两性离子和吗啡啉修饰的聚酰胺‑胺树状大分子制备。本发明制备的树状大分子表面具有丰富氨基，具有良好的基因转染效果，为构建安全高效的基因载体，用于基因治疗提供了应用依据；本发明反应条件简单，合成制备易操作，制备得到的包裹纳米金颗粒的两性离子和吗啡啉修饰的聚酰胺‑胺树状大分子作为载体用于基因传染，转染条件简单，转染效率高，在癌症的基因治疗等方面具有潜在的应用前景。

Description

一种包裹纳米金颗粒的两性离子和吗啡啉修饰的聚酰胺-胺 树状大分子的制备方法
技术领域
本发明属于功能化高分子纳米材料载体的制备方法领域，特别涉及一种包裹纳米金颗粒的两性离子和吗啡啉修饰的聚酰胺-胺树状大分子的制备方法。
背景技术
基因治疗是指通过一定的方式把外源治疗基因导入到靶细胞，以纠正或者补偿因基因缺陷与异常所引起的疾病，进而达到治疗疾病的目的。基因治疗作为一种革命性的治疗手段，已经广泛应用于遗传病、肿瘤和病毒性疾病的治疗当中，并且取得了一定的成效，已成为生命科学和临床科学领域中最热门的研究课题之一。
基因治疗的关键在于寻找安全高效的基因载体，通常情况下，用于基因传递的载体包括病毒载体和非病毒载体。虽然病毒载体的研究开始的早，应用的早，但是随着研究的深入，病毒载体高的免疫源性和高的毒性，限制了病毒载体在基因转染领域的深入应用。近几年来，科学研究者开始探索非病毒载体在基因转染中的应用。在非病毒载体中聚酰胺-胺(PAMAM)树状大分子成为目前研究的热点。这和其特有的有利于基因传递的性质有关联，比如，纳米级的球形结构易于被细胞吞噬，丰富的末端氨基可以被赋予不同的功能，内部大的空腔可以包裹金纳米颗粒以及其他的一些无机颗粒增加其刚性以及质粒DNA或siRNA的装载量等。
目前的报道显示，树状大分子仍具有高的毒性，因而限制了其在基因转染领域的应用。为了解决这个难题，大多数研究者采用了在树状大分子表面接枝一些功能基团，比如乙酰基、聚乙二醇(PEG)、两性离子和一些氨基酸等，希望降低树状大分子毒性的同时，增加树状大分子的基因转染效率。本课题组前期的研究从树状大分子内部空腔包裹纳米金颗粒着手，形成树状大分子包裹的纳米金颗粒，研究结果表明包裹纳米金颗粒的树状大分子不但降低了树状大分子的毒性，而且增加了树状大分子的基因转染效率(Shan etal.Biomaterials 2012,33,3025-3035)。因此探索结合上述两种改造第五代树状大分子的方式对基因传递产生的增强作用是非常有意义的，即在第五代树状大分子表面修饰功能分子，同时在树状大分子的内部包裹纳米金颗粒，并且实现其对基因的负载和靶向运输，是具有重要意义。
检索国内外相关文献和专利结果表明：以两性离子和吗啡啉修饰的包裹金纳米颗粒的PAMAM树状大分子为载体，用于基因转染的方法，尚未见报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种包裹纳米金颗粒的两性离子和吗啡啉修饰的聚酰胺-胺树状大分子的制备方法，该方法制备得到的包裹纳米金颗粒的两性离子和吗啡啉修饰的聚酰胺-胺树状大分子，可以作为载体用于基因传染，具有转染条件温和，易于操作，转染效率高等优点，可用于含血清环境中的pDNA转染，在癌症的治疗等方面具有很好的发展潜力。
本发明的一种包裹纳米金颗粒的两性离子和吗啡啉修饰的聚酰胺-胺树状大分子的制备方法，具体步骤如下：
(1)将β-丙内酯与N-[(3-二甲基)丙基]丙烯酰胺以摩尔比为1-3:1溶于溶剂中，搅拌反应，抽滤，冲洗，干燥，得到羧酸甜菜碱丙烯酰胺CBAA，其中，β-丙内酯与溶剂的比例为2g-3g:10mL；
(2)将步骤(1)中羧酸甜菜碱丙烯酰胺CBAA溶于溶剂中，得到CBAA溶液，与第五代聚酰胺-胺树状大分子G5.NH2溶液混合，搅拌反应，得到G5.NH2-CBAA溶液，透析，冷冻干燥，得到G5.NH2-CBAA，其中，CBAA与G5.NH2的质量比为1:1-1:2，CBAA与溶剂的比例为15-20mg:5mL；
(3)将R-吗啡啉-3-羧酸盐酸盐HCl.Morpholine-COOH溶于溶剂中，用EDC溶液活化，得到活化好的HCl.Morpholine-COOH溶液，加入到NH2-PEG-COOH溶液中，搅拌，得到HOOC-PEG-Morpholine溶液，记为HOOC-PEG-Mor溶液，其中HCl.Morpholine-COOH与NH2-PEG-COOH的摩尔比为1:1-1:3，HCl.Morpholine-COOH与EDC的摩尔比为1:4-1:6；
(4)将步骤(2)中G5.NH2-CBAA溶于溶剂中，得到G5.NH2-CBAA溶液，用EDC溶液活化步骤(3)中HOOC-PEG-Mor溶液，然后加入G5.NH2-CBAA溶液，搅拌反应，得到两性离子和吗啡啉修饰的聚酰胺-胺树状大分子G5.NH2-CBAA-PEG-Mor溶液，其中HOOC-PEG-Mor与EDC的摩尔比为1:3-1:6，G5.NH2-CBAA与HOOC-PEG-Mor的摩尔比为1:18-1:25；
(5)向步骤(4)中G5.NH2-CBAA-PEG-Mor溶液中加入HAuCl4溶液，搅拌，加入NaBH4溶液还原，得到包裹纳米金颗粒的两性离子和吗啡啉修饰的聚酰胺-胺树状大分子{(Au0)25-G5.NH2-CBAA-PEG-Mor}溶液，透析，冷冻干燥，得到干燥的包裹纳米金颗粒的两性离子和吗啡啉修饰的聚酰胺-胺树状大分子{(Au0)25-G5.NH2-CBAA-PEG-Mor}，其中G5.NH2-CBAA-PEG-Mor与HAuCl4的摩尔比为1:20-1:25，HAuCl4与NaBH4的质量比为20:1-25:1。
所述步骤(1)中溶剂为无水丙酮；搅拌反应的条件为：在无水、N2条件下0℃搅拌2-4h。
所述步骤(2)中溶剂为甲醇；第五代聚酰胺-胺G5.NH2溶液的溶剂为0.138M的NaCl水溶液；搅拌反应温度为室温，搅拌反应时间为2-5天。
所述步骤(3)中溶剂为DMSO；EDC溶液和NH2-PEG-COOH溶液的溶剂均为DMSO；NH2-PEG-COOH的分子量为2000。
所述步骤(3)中活化时间为2-5h；搅拌时间为3-5天。
所述步骤(4)中溶剂为DMSO；EDC溶液的溶剂为DMSO；活化时间为2-5h；搅拌反应温度为室温，搅拌反应时间为3-5天。
所述步骤(5)中搅拌时间为25-40min；还原时间为2-5h；透析为：将反应产物在PBS缓冲液中透析一天，换液3次；在蒸馏水中透析2天，换水6次，采用截留分子量为8000-14000的透析袋。
所述步骤(5)中{(Au0)25-G5.NH2-CBAA-PEG-Mor}用于基因传染。
所述{(Au0)25-G5.NH2-CBAA-PEG-Mor}用于基因传染的具体步骤为：
(1)将{(Au0)25-G5.NH2-CBAA-PEG-Mor}与pDNA制备载体/基因复合物溶液，{(Au0)25-G5.NH2-CBAA-PEG-Mor}与pDNA的N/P为0.25:1～16:1，N/P为树状大分子的伯氨基与pDNA骨架上磷酸基团摩尔比；
(2)采用步骤(1)中载体/基因复合物溶液进行细胞传染。
所述步骤(1)中pDNA包含能编码绿色荧光蛋白EGFP的基因、荧光素酶报告基因Luc或肿瘤高甲基化基因1HIC1。
本发明基于第五代聚酰胺胺树状大分子为平台，外围修饰两性离子CBAA分子以及吗啡啉，内部包裹金纳米颗粒。两性离子CBAA和吗啡啉修饰在第五代树状大分子的表面，能够增加树状大分子的抗非特异性蛋白吸附、靶向溶酶体特性，降低其细胞毒性，同时在树状大分子内部包裹纳米金颗粒增加第五代树状大分子的刚性结构。四者有机结合得到具有抗非特异性蛋白吸附性能以及高转染效率的非病毒基因载体。
本发明利用树状大分子表面存在大量氨基从而可实现多功能化修饰这一特性，首先采用化学键合法将CBAA和Morpholine-PEG连接到G5.NH2表面氨基上，进一步包裹金纳米颗粒。两性离子分子的修饰不仅可以降低G5.NH2的细胞毒性，而且可形成水化层，能够很好的降低树状大分子复合物与血清中蛋白质间的相互作用，减少非特异吸附。
本发明以功能化树状大分子纳米颗粒为载体，负载pDNA，以人宫颈癌细胞(HeLa细胞)作为研究对象，基因转染诱导肿瘤内特异性基因表达。本发明通过核磁共振(1H NMR)对修饰在树状大分子纳米颗粒表面的CBAA和Morpholine的数量进行表征；凝胶阻滞实验对载体/pDNA复合物进细胞的能力进行了表征；通过水动力学粒径和表面电势对载体/pDNA复合物的粒径和电势进行了分析；通过CCK-8测试材料对细胞的毒性；通过加强绿色荧光蛋白基因(EGFP)的转染对载体的基因传递能力进行检测；通过流式细胞术对载体负载pDNA的基因转染能力进行研究；通过刮伤愈合实验研究载体负载HIC1进入细胞后其抑制细胞转移的能力；通过western blot对载体负载HIC1进入细胞后，对特异性基因表达的能力进行检测。
有益效果
(1)本发明制备的树状大分子表面具有丰富氨基，具有良好的基因转染效果，为构建安全高效的基因载体，用于基因治疗提供了应用依据；
(2)本发明反应条件简单，合成制备易操作，制备得到的包裹纳米金颗粒的两性离子和吗啡啉修饰的聚酰胺-胺树状大分子作为载体用于基因传染，转染条件简单，转染效率高，在癌症的基因治疗等方面具有潜在的应用前景。
附图说明
图1为实施例2中核磁共振氢谱图：HOOC-PEG-Morhpoline(a)，G5.NH2-CBAA(b)，{(Au0)25-G5.NH2-CBAA-mPEG}(c)和G5.NH2-CBAA-PEG-Morhpoline(d)；
图2为实施例2中Mor+和Mor-的紫外吸收光谱图；
图3为实施例2中Mor+(a)和Mor-(b)的高分辨透射电镜图和粒径分布直方图；
图4为实施例3中Mor+和Mor-分别与pDNA1(a和c)或pDNA2(b和d)的琼脂糖凝胶电泳图谱，1-8分别表示：1:DNA标准物；2:仅有pDNA；3:N/P＝0.25:1；4:N/P＝0.5:1；5:N/P＝1:1；6:N/P＝2:1；7:N/P＝4:1和8:N/P＝8:1(其中pDNA1和pDNA2分别为携带EGFP和HIC1基因的质粒DNA)；
图5为实施例4中Mor+和Mor-分别与pDNA1或pDNA2复合后形成复合物的电势图(a、c)和水动力学粒径图(b、d)，其中(a)和(b)为pDNA1，(c)和(d)为pDNA2，pDNA1和pDNA2分别为携带EGFP和HIC1基因的质粒DNA；
图6为实施例5中Mor+、Mor-、Mor+/pDNA1复合物、Mor-/pDNA1复合物、Mor+/pDNA2复合物和Mor-/pDNA2复合物在不同Mor+或Mor-浓度下对HeLa细胞毒性实验图，其中pDNA1和pDNA2分别为携带EGFP和HIC1基因的质粒DNA；
图7为实施例6中Mor+和Mor-分别与pDNA在不同N/P比下复合后对HeLa细胞的荧光素酶基因转染效率图(FBS-表示细胞与载体/pDNA孵育时培养基中无血清，FBS+则表示有血清)；
图8为实施例7中Mor+和Mor-分别与pDNA在不同N/P比下复合后对HeLa细胞的增强型绿色荧光蛋白基因转染的荧光显微镜图(FBS-表示细胞与载体/pDNA孵育时培养基中无血清，FBS+则表示有血清)；
图9为实施例8中Mor+和Mor-分别与Cy3标记的pDNA在N/P＝4下所形成的复合物被HeLa细胞内吞的流式细胞仪检测结果图(FBS-表示细胞与载体/pDNA孵育时培养基中无血清，FBS+则表示有血清)；
图10为实施例9中Mor+和Mor-分别与含HIC1基因的pDNA在N/P＝4下所形成的复合物用于Hela细胞的刮伤愈合实验图(FBS-表示细胞与载体/pDNA孵育时培养基中无血清，FBS+则表示有血清)；
图11为实施例9中Mor+和Mor-分别与含HIC1基因的pDNA在N/P＝4下所形成的复合物用于Hela细胞的刮伤愈合实验结果柱状图(FBS-表示细胞与载体/pDNA孵育时培养基中无血清，FBS+则表示有血清)；
图12为实施例10中Mor+和Mor-与含HIC1基因的pDNA在N/P＝4下所形成的复合物转染Hela细胞后的蛋白印记分析图(FBS-表示细胞与载体/pDNA孵育时培养基中无血清，FBS+则表示有血清)；
图13为本发明包裹纳米金颗粒的两性离子和吗啡啉修饰的聚酰胺-胺树状大分子的制备原理示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
(1)以10mL无水丙醇为溶剂，将β-丙内酯(2.97g)与N-[(3-二甲基)丙基]丙烯酰胺(DMAPA，4.62g)在无水、N2以及0℃条件下搅拌反应3小时，抽滤，无水丙酮洗三次，每次5mL，真空干燥后得到羧酸甜菜碱丙烯酰胺(CBAA)白色粉末。
(2)称量10mg的第五代聚酰胺-胺树状大分子G5.NH2和16.9mg的CBAA，分别溶解在5mL的NaCl溶液(0.138M)和5mL的甲醇中，待各自完全溶解后，放一起搅拌，反应3天，得到G5.NH2-CBAA溶液。用截留分子量为8000-14000的透析袋透析三天(PBS缓冲液中透析一天，换液3次；蒸馏水中透析2天，换水6次)，冷冻干燥，得到干燥的G5.NH2-CBAA。
(3)称取(R)-吗啡啉-3-羧酸盐酸盐(HCl.Morpholine-COOH)1.29mg溶于5mL DMSO中，称取7.38mg EDC溶于2mL DMSO中，将EDC溶液加到HCl.Morpholine-COOH溶液中，搅拌反应3小时。称取HOOC-PEG-NH2 15.4mg溶于10mL DMSO中，按照HOOC-PEG-NH2/HCl.Morpholine-COOH摩尔比为1/1，将活化好的HCl.Morpholine-COOH溶液加入到HOOC-PEG-NH2溶液中，室温下磁力搅拌，反应3天，得到HOOC-PEG-Morpholine溶液。
(4)称取7.38mg EDC溶于2mL DMSO中，将EDC溶液加到步骤(3)中HOOC-PEG-Morpholine溶液中，搅拌反应3小时。称取G5.NH2-CBAA 11.76mg溶于8mL DMSO中，然后将其加入至上述活化的HOOC-PEG-Morpholine溶液中，室温下磁力搅拌，反应3天。得到G5.NH2-CBAA-PEG-Morpholine溶液。
(5)在上述G5.NH2-CBAA-PEG-Morpholine溶液中逐滴加入131.67μL HAuCl4水溶液(30mg/mL)，混合搅拌30min，然后快速加入18.18μL浓度为10mg/mL的NaBH4溶液，还原反应3h。反应结束后，用截留分子量为8000-14000的透析袋透析三天(PBS缓冲液中透析一天，换液3次；蒸馏水中透析2天，换水6次)，冷冻干燥，得到干燥的{(Au0)25-G5.NH2-CBAA-PEG-Morpholine}(记为Mor+)。
实施例2
对实施例1制备的HOOC-PEG-Morpholine、G5.NH2-CBAA，Mor+以及对比例1中制备的{(Au0)25-G5.NH2-CBAA-mPEG}(记为Mor-)进行表征。1H NMR表征结果如图1所示，图1(a)中6.32ppm出现-NH-CO-的质子峰，说明PEG与HCl.Morpholine-COOH通过-NH-CO-成功连接，经积分得每个PEG上连接上了0.25个Morpholine。图1(b)为G5.NH2-CBAA的核磁氢谱，1.89ppm处出现的是CBAA的特征峰，经积分得平均每个G5上负载了18.5个CBAA分子。图1(c)为对比例1中制备的{(Au0)25-G5.NH2-CBAA-mPEG}核磁氢谱，3.5-3.8ppm处出现的是mPEG的特征峰，经积分得平均每个G5上负载了15.3个mPEG分子。图1(d)为G5.NH2-CBAA-PEG-Morpholine的核磁氢谱，PEG上–CH2–特征峰在3.5-3.8ppm处出现，经积分得平均每个G5上负载了17.8Morpholine-PEG。UV-vis结果如图2所示，可以看出两种材料的表面等离子体共振特征峰在521nm左右，代表金纳米颗粒的成功合成。TEM结果如图3所示，制备的Mor+(a)以及Mor-(b)纳米颗粒平均直径分别为1.5nm和1.6nm，且分布均匀。
实施例3
将实施例1中Mor+和对比例1中Mor-这两种材料以不同的N/P分别制备载体/pDNA复合物，并进行凝胶阻滞实验。配制8孔含有溴化乙锭(1mg/mL)的1％的琼脂糖凝胶，室温放置待琼脂糖凝胶凝固。N/P比值分别为：0.25:1，0.5:1，1:1，2:1，4:1，8:1。每孔加1μg pDNA，配制载体/pDNA复合物，37℃下孵育30min。以不加载体的单独pDNA作为对照。制成载体/pDNA复合物后，将对应的复合物分别加到琼脂糖凝胶的孔中，在80V电压下，电泳30min。电泳结束后将凝胶放置于凝胶成像仪中对pDNA在凝胶中的迁移进行分析。结果如图4所示，两种材料均可在较低的N/P(N/P＝0.5)下与两种pDNA很好复合，阻滞了pDNA的迁移。压缩、包裹DNA的能力是将pDNA成功传递到靶细胞内的前提。
实施例4
将实施例1中Mor+和对比例1中Mor-在不同N/P比条件下(0，0.25，0.5，1，2，4，8)分别与5μg pDNA制备成不同的载体/pDNA复合物，使总体积为100μL，室温下孵育30min，然后加入1mL PBS。通过马尔文激光粒度仪(Malvern，MK，633nm激光)对其电势以及水动力学直径进行表征，结果如图5所示。结果表明，在N/P＝0.25时载体/pDNA复合物的电势均为负数，然后随着N/P的增加，电势逐渐增加。复合物的粒径大小在一定N/P范围内都在200nm左右，这个尺寸有利于细胞的吞噬。
实施例5
以HeLa细胞为模型细胞来评价实施例1中Mor+和对比例1中Mor-以及载体/pDNA复合物的细胞毒性。以8000/孔的密度将HeLa细胞种于96孔板中，在添加了100U/mL青霉素，100U/mL链霉素和10％FBS的100μL DMEM培养液中，37℃、5％CO2浓度下过夜培养。然后将培养基换成材料浓度分别为0nM、50nM、100nM、500nM、1000nM、2000nM、3000nM的含Mor-或者Mor+载体/1μg pDNA复合物、Mor+和Mor-的细胞培养基与细胞共培养24h，其中材料浓度为0nM时即加入相同体积PBS作为对照，随后倒掉含有复合物的培养基，加入含10μL CCK-8的DMEM培养基溶液100μL，继续培养2h。随后，在测试波长450nm下于多功能酶标仪中测试吸光值，结果如图6所示。结果表明，随着材料浓度的增加，细胞存活率下降，但在一定范围内具有良好的细胞相容性。
实施例6
以HeLa细胞作为模型细胞，选用带有荧光素酶基因的质粒作为pDNA，以此作为模型评价实施例1中Mor+和对比例1中Mor-这两种材料作为基因载体在是否含血清环境中的基因转染效率。以5x 104/孔的密度将HeLa细胞种于24孔板中，在添加了100U/mL青霉素，100U/mL链霉素和10％FBS的100μL DMEM培养液中，37℃，5％CO2浓度下过夜培养。待细胞长满到整个孔板的70％-80％时，按照N/P值为0，1，2，4,8,16制备载体/pDNA复合物，其中每孔中pDNA的量为1μg。将培养基分别换成含FBS的DMEM培养基、不含FBS的DMEM培养基，再加入上述复合物与细胞共培养4h。然后更换含10％FBS的新鲜DMEM培养基，继续培养24h。培养结束后，将细胞裂解，并通过Promega公司的Luciferase assay来检测荧光素酶活性，结果如图7所示。结果表明，在所有实验组中当N/P为4时，其转染效率达到最高，而且Mor-组高于Mor+组，有血清组高于无血清组。在Mor-实验组中，血清组的转染效率是无血清组的1.66倍，在Mor+实验组中，血清组的转染效率是无血清组的1.42倍。这说明两性离子对载体的修饰使得载体能在含血清的环境中高效传递基因，并且含血清环境有利于后期转染基因表达更高。
实施例7
以HeLa细胞作为模型细胞，选用带有增强型绿色荧光蛋白基因的质粒作为pDNA，以此作为模型评价实施例1中Mor+和对比例1中Mor-这两种材料作为基因载体在是否含血清环境中的基因转染效率。以5x 104/孔的密度将HeLa细胞种于24孔板中，在添加了100U/mL青霉素，100U/mL链霉素和10％FBS的100μL DMEM培养液中，37℃，5％CO2浓度下过夜培养。待细胞长满到整个孔板的70％-80％时，按照N/P值为1、2、4、8和16，制备载体/pDNA复合物，其中每孔中pDNA的量为1μg。将培养基分别换成含FBS的DMEM培养基、不含FBS的DMEM培养基，再加入上述复合物与细胞共培养4h。然后更换含10％FBS的新鲜DMEM培养基，继续培养24h。培养结束后，用荧光显微镜观察，结果如图8所示。结果与荧光素酶基因表达实验结果相一致，在所有实验组中当N/P为4时，其转染效率达到最高，而且Mor-组高于Mor+组，有血清组高于无血清组。
实施例8
以HeLa细胞作为模型细胞，选用带有Cy3标记的pDNA，以此为模型评价实施例1中Mor+和对比例1中Mor-这两种材料作为基因载体在是否含血清环境中被细胞吞噬的效率。以1x 105/孔的密度将HeLa细胞种于12孔板中，在添加了100U/mL青霉素、100U/mL链霉素和10％FBS的100μL DMEM培养液中，37℃、5％CO2浓度下过夜培养。待细胞长满到整个孔板的70％-80％时，按照N/P比为4制备载体/pDNA复合物，其中每孔中pDNA的量为1μg。将培养基分别换成含FBS的DMEM培养基、不含FBS的DMEM培养基，再加入上述复合物与细胞共培养4h。培养结束后，胰酶消化，并收集细胞，采用流式细胞仪检测细胞对载体/pDNA复合物的内吞，以只添加单独pDNA为对照组。结果如图9所示。结果表明，对照组都未检测到明显的荧光，同一载体在血清或无血清环境中细胞吞噬量没显著性差异，但是相应的Mor+组的吞噬量要显著高于Mor-组。这说明修饰了两性离子以后，在是否有血清环境中细胞对载体/复合物的吞噬基本一样，但是Morpholine的修饰则在一定程度上促进了细胞对载体/复合物的吞噬。
实施例9
以HeLa细胞作为模型细胞，利用伤口愈合划痕试验来评价实施例1中Mor+和对比例1中Mor-这两种材料转染HIC1基因后对细胞迁移的影响。以2x 105/孔的密度将HeLa细胞种于6孔板中，在添加了100U/mL青霉素、100U/mL链霉素和10％FBS的100μL DMEM培养液中，37℃、5％CO2浓度下过夜培养。待细胞长满到整个孔板的70％-80％时，用枪头在培养皿底部划出3条平行直线，用PBS洗细胞3次，除去划下的细胞。然后按照N/P比为4制备载体/pDNA复合物，其中每孔中pDNA的量为4μg。将培养基分别换成含FBS的DMEM培养基、不含FBS的DMEM培养基，再加入上述复合物与细胞共培养4h。然后倒掉培养基和载体复合物，PBS洗三次后，加入含FBS的DMEM培养基培养12小时，24小时后分别取出用倒置显微镜进行拍照，观察划痕“伤口”的愈合情况，即细胞迁移情况，以只添加单独pDNA为对照组。结果如图10和11所示，结果表明，培养12小时后，无论是否是在含血清环境的转染，相比较于对照组，载体/pDNA复合物均能很好地抑制细胞的迁移。培养24小时后，各实验组间细胞相对迁移距离有着显著性差异。血清环境下转染的Mor+组以及Mor-组细胞相对迁移距离分别为：37.04％，26.69％，对应的无血清环境下细胞相对迁移距离为：36.02％，28.94％。可以看出未经Morpholine修饰的载体能将HIC1基因转染至Hela细胞并更好地表达从而抑制细胞的转移。
实施例10
以HeLa细胞作为模型细胞，通过western blot来检测实施例1中Mor+和对比例1中Mor-这两种材料转染HIC1基因后细胞内HIC1蛋白的表达水平。以2.5×105/孔的密度将Hela种于6孔板中，培养于添加100U/mL青霉素、100U/mL链霉素和10％FBS的2mL DMEM培养液中，37℃、5％二氧化碳浓度下过夜培养。待细胞长满到整个孔板的70％-80％时，按照N/P比为4制备载体/pDNA复合物，其中每孔中pDNA的量为4μg。将培养基分别换成含FBS的DMEM培养基、不含FBS的DMEM培养基，再加入上述复合物与细胞共培养4h。然后再更换含10％FBS的新鲜DMEM培养基，继续培养48h，用细胞裂解液裂解细胞，释放出胞内蛋白，以只添加单独pDNA和单独加入等体积PBS为对照组。通过western blot来检测细胞内HIC1蛋白的表达水平，结果见图12。在N/P为4时，未转染的细胞组和单独pDNA细胞组的细胞HIC1蛋白的表达低，而Mor-或者Mor+负载了pDNA转染细胞培养一段时间后，细胞中的HIC1蛋白的表达明显的提高。血清环境下转染的Mor+组以及Mor-组细胞HIC1蛋白相对GAPDH的表达水平为：2.08，2.40，对应的无血清环境下细胞HIC1蛋白相对表达水平为：2.08，2.35。从结果可以看出Mor-/pDNA复合物相比较Mor+/pDNA复合物，有更多的HIC1蛋白在细胞中表达，但两种材料与pDNA复合后都可高效地转入至HeLa细胞中表达HIC1蛋白。
对比例1
(1)称量10mg的第五代聚酰胺-胺树状大分子G5.NH2和16.9mg实施例1中CBAA，分别溶解在5mL的NaCl溶液(0.138M)和5mL的甲醇中，待各自完全溶解后，放一起搅拌反应3天，得到G5.NH2-CBAA溶液。用截留分子量为8000-14000的透析袋透析三天(PBS缓冲液中透析一天，换液3次；蒸馏水中透析2天，换水6次)，冷冻干燥，得到干燥的G5.NH2-CBAA。
(2)称mPEG 15.38mg溶于10mL DMSO中，称取7.38mg EDC溶于3ml DMSO中，将EDC溶液加到上述溶液中，搅拌反应3小时。称取G5.NH2-CBAA11.76mg溶于8mLDMSO中，然后将其加入至上述活化的mPEG溶液中，室温下磁力搅拌，反应3天，得到G5.NH2-CBAA-mPEG溶液。
(3)在上述G5.NH2-CBAA-mPEG溶液中逐滴加入131.67μL HAuCl4水溶液(30mg/mL)，混合搅拌30min，然后快速的加入18.18μL浓度为10mg/mL的NaBH4溶液，还原反应3h。反应结束后，用截留分子量为8000-14000的透析袋透析三天(PBS缓冲液中透析一天，换液3次；蒸馏水中透析2天，换水6次)，冷冻干燥，得到干燥的{(Au0)25-G5.NH2-CBAA-mPEG}(记为Mor-)。

Claims (10)

1.一种包裹纳米金颗粒的两性离子和吗啡啉修饰的聚酰胺-胺树状大分子的制备方法，具体步骤如下：
(1)将β-丙内酯与N-[(3-二甲基)丙基]丙烯酰胺以摩尔比为1-3:1溶于溶剂中，搅拌反应，抽滤，冲洗，干燥，得到羧酸甜菜碱丙烯酰胺CBAA，其中，β-丙内酯与溶剂的比例为2g-3g:10mL；
(2)将步骤(1)中羧酸甜菜碱丙烯酰胺CBAA溶于溶剂中，得到CBAA溶液，与第五代聚酰胺-胺树状大分子G5.NH2溶液混合，搅拌反应，得到G5.NH2-CBAA溶液，透析，冷冻干燥，得到G5.NH2-CBAA，其中，CBAA与G5.NH2的质量比为1:1-1:2，CBAA与溶剂的比例为15-20mg:5mL；
(3)将R-吗啡啉-3-羧酸盐酸盐HCl.Morpholine-COOH溶于溶剂中，用EDC溶液活化，得到活化好的HCl.Morpholine-COOH溶液，加入到NH2-PEG-COOH溶液中，搅拌，得到HOOC-PEG-Morpholine溶液，记为HOOC-PEG-Mor溶液，其中HCl.Morpholine-COOH与NH2-PEG-COOH的摩尔比为1:1-1:3，HCl.Morpholine-COOH与EDC的摩尔比为1:4-1:6；
(4)将步骤(2)中G5.NH2-CBAA溶于溶剂中，得到G5.NH2-CBAA溶液，用EDC溶液活化步骤(3)中HOOC-PEG-Mor溶液，然后加入G5.NH2-CBAA溶液，搅拌反应，得到两性离子和吗啡啉修饰的聚酰胺-胺树状大分子G5.NH2-CBAA-PEG-Mor溶液，其中HOOC-PEG-Mor与EDC的摩尔比为1:3-1:6，G5.NH2-CBAA与HOOC-PEG-Mor的摩尔比为1:18-1:25；
(5)向步骤(4)中G5.NH2-CBAA-PEG-Mor溶液中加入HAuCl4溶液，搅拌，加入NaBH4溶液还原，透析，冷冻干燥，得到干燥的包裹纳米金颗粒的两性离子和吗啡啉修饰的聚酰胺-胺树状大分子{(Au0)25-G5.NH2-CBAA-PEG-Mor}，其中G5.NH2-CBAA-PEG-Mor与HAuCl4的摩尔比为1:20-1:25，HAuCl4与NaBH4的质量比为20:1-25:1。
2.按照权利要求1所述的一种包裹纳米金颗粒的两性离子和吗啡啉修饰的聚酰胺-胺树状大分子的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中溶剂为无水丙酮；搅拌反应的条件为：在无水和N2条件下0℃搅拌2-4h。
3.按照权利要求1所述的一种包裹纳米金颗粒的两性离子和吗啡啉修饰的聚酰胺-胺树状大分子的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中溶剂为甲醇；第五代聚酰胺-胺G5.NH2溶液的溶剂为0.138M的NaCl水溶液；搅拌反应温度为室温，搅拌反应时间为2-5天。
4.按照权利要求1所述的一种包裹纳米金颗粒的两性离子和吗啡啉修饰的聚酰胺-胺树状大分子的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中溶剂为DMSO；EDC溶液和NH2-PEG-COOH溶液的溶剂均为DMSO；NH2-PEG-COOH的分子量为2000。
5.按照权利要求1所述的一种包裹纳米金颗粒的两性离子和吗啡啉修饰的聚酰胺-胺树状大分子的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中活化时间为2-5h；搅拌时间为3-5天。
6.按照权利要求1所述的一种包裹纳米金颗粒的两性离子和吗啡啉修饰的聚酰胺-胺树状大分子的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中溶剂为DMSO；EDC溶液的溶剂为DMSO；活化时间为2-5h；搅拌反应温度为室温，搅拌反应时间为3-5天。
7.按照权利要求1所述的一种包裹纳米金颗粒的两性离子和吗啡啉修饰的聚酰胺-胺树状大分子的制备方法，其特征在于，所述步骤(5)中搅拌时间为25-40min；还原时间为2-5h；透析为：将反应产物在PBS缓冲液中透析一天，换液3次；在蒸馏水中透析2天，换水6次，采用截留分子量为8000-14000的透析袋。
8.按照权利要求1所述的一种包裹纳米金颗粒的两性离子和吗啡啉修饰的聚酰胺-胺树状大分子的制备方法，其特征在于，所述步骤(5)中{(Au0)25-G5.NH2-CBAA-PEG-Mor}用于基因传染。
9.按照权利要求8所述的一种包裹纳米金颗粒的两性离子和吗啡啉修饰的聚酰胺-胺树状大分子的制备方法，其特征在于，所述{(Au0)25-G5.NH2-CBAA-PEG-Mor}用于基因传染的具体步骤为：
(1)将{(Au0)25-G5.NH2-CBAA-PEG-Mor}与pDNA制备载体/基因复合物溶液，{(Au0)25-G5.NH2-CBAA-PEG-Mor}与pDNA的N/P为0.25:1～16:1，N/P为树状大分子的伯氨基与pDNA骨架上磷酸基团摩尔比；
(2)采用步骤(1)中载体/基因复合物溶液进行细胞传染。
10.按照权利要求9所述的一种包裹纳米金颗粒的两性离子和吗啡啉修饰的聚酰胺-胺树状大分子的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中pDNA包含能编码绿色荧光蛋白EGFP的基因、荧光素酶报告基因Luc或肿瘤高甲基化基因1HIC1。
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