CN113248721B - 一种具有刚性内核的核-壳结构树状大分子及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种具有刚性内核的核‑壳结构树状大分子及其制备方法，该方法为：以第2.5代含磷树状大分子(P‑G2.5)作为内核，以第3代聚酰胺‑胺树状大分子(PAMAM‑G3)作为外壳，通过化学键合制备得到P‑G2.5/PAMAM‑G3核‑壳结构树状大分子，即为具有刚性内核的核‑壳结构树状大分子。与现有技术相比，本发明通过化学键合的方法制备了P‑G2.5/PAMAM‑G3核‑壳结构树状大分子，与通过超分子主客体自组装合成的纯聚酰胺‑胺核‑壳结构树状大分子G3‑CD/Ad‑G3相比，具有较好的基因压缩能力和传递效果，合成过程更加简单，易于操作，且具有良好的分散性、细胞相容性和更高的基因转染效率，为发展新型安全高效的基因载体系统用于肿瘤精准诊断和高效治疗提供了新思路。

Description

一种具有刚性内核的核-壳结构树状大分子及其制备方法
技术领域
本发明属于增强基因传递材料技术领域，涉及一种具有刚性内核的核-壳结构树状大分子及其制备方法。
背景技术
构建安全、高效的基因传递载体，将具有治疗功能的目的片段传递至靶细胞内并高效表达，是整个基因治疗技术的关键。目前，常见的基因传递载体系统主要有两种：病毒载体系统和非病毒载体系统。由于病毒载体系统固有的缺陷，如易引发免疫反应等，促使研究人员开发设计非病毒载体系统。非病毒载体与病毒载体相比具有更高的安全性以及更低的致免疫反应性。
聚酰胺-胺(PAMAM)树状大分子由于其独特的结构、表面易功能化和带正电的特性，越来越受到研究者们的关注(Hecht S.et al.Angewandte Chemie InternationalEdition.2001,40(1):74-91)。然而，由于其自身结构刚性不足，通常需要在其内部包裹金属纳米颗粒，以维持其3D立体结构，保证足够的DNA结合位点，进而使其具有较高的DNA压缩能力，从而提高其基因传递效率(Shan Y.et al.Biomaterials 2012,33,3025-3035)。一般而言，相比于低代树状大分子，高代树状大分子具有更好的三维尺寸，更稳定的分子结构，因而具有较高的基因传递效率。但由于现阶段合成方法的限制、纯化方法的复杂，商业化的高代树状大分子价格昂贵，大大限制了其转化应用。为解决这一问题，早在2000年，Tomalia课题组就提出了共价合成法制备核-壳树状大分子的方法，然而该法难以制备表面为氨基的核-壳树状大分子(Adv.Mater.2000,12,796-800)。有研究者通过超分子主客体自组装的方法制备了表面为氨基的核-壳树状大分子(Chen F.et al.J.Mater.Chem.B,2017,5,8459)，但采用的材料以G5为内核，其成本仍然较高。
作为树状大分子家族的一员，含磷树状大分子以其自身独特的刚性结构脱颖而出，成为一种潜在的高效基因载体(Chen L.et al.Biomacromolecules,2020,21(6):2502-2511)。这主要是由于其本身分子骨架具有较好的刚性结构。一般而言，含磷树状大分子的水溶性远弱于PAMAM树状大分子，为获得较高的水溶性，往往还需要对其表面的胺基基团进行适当的质子化，因而应用于临床，其步骤仍相对繁琐。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有刚性内核的核-壳结构树状大分子及其制备方法。本发明以低代(第三代，G3)PAMAM树状大分子为壳，利用具有相似代数的低代含磷树状大分子(P-G2.5)为核，通过化学键合制备了具有刚性内核的核-壳结构树状大分子(P-G2.5/PAMAM-G3)，得到具有较高基因传递效率的基于树状大分子的纳米载体体系，可用于增强型基因传递。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
一种具有刚性内核的核-壳结构树状大分子的制备方法，该方法为：以第2.5代含磷树状大分子(P-G2.5)作为内核，以第3代聚酰胺-胺树状大分子(PAMAM-G3)作为外壳，通过化学键合制备得到P-G2.5/PAMAM-G3核-壳结构树状大分子，即为所述的具有刚性内核的核-壳结构树状大分子。
进一步地，所述的第2.5代含磷树状大分子的表面含有-CHO，所述的第3代聚酰胺-胺树状大分子的表面含有-NH2。一方面，分别具有这两种基团的树状大分子可以通过化学键合合成类似更高代数的树状大分子，且具有刚性内核，增强其基因递送；另一方面，外面修饰表面氨基的PAMAM树状大分子在提高材料水溶性的同时，可以提高表面正电荷密度。
进一步地，该方法包括以下步骤：
1)将无水硫酸钠加入至PAMAM-G3的DMSO溶液中，之后滴加P-G2.5的DMSO溶液，并在冰浴条件下进行反应；
2)反应结束后，进行后处理，得到P-G2.5/PAMAM-G3核-壳结构树状大分子。制得的P-G2.5/PAMAM-G3核-壳结构树状大分子于-20℃保存备用。
进一步地，步骤1)中，所述的P-G2.5与PAMAM-G3的摩尔比为1:(18-22)。
进一步地，步骤1)中，所述的PAMAM-G3的DMSO溶液中，PAMAM-G3的质量浓度为9-10mg/ml；所述的P-G2.5的DMSO溶液中，P-G2.5的质量浓度为0.4-0.5mg/ml。
进一步地，步骤1)中，所述的无水硫酸钠与PAMAM-G3的质量比为(40-45):1。
进一步地，步骤1)中，冰浴温度为4-9℃，反应时间为20-28h。
优选地，步骤1)中，滴加过程在冰浴条件下进行。
进一步地，步骤2)中，所述的后处理依次包括透析及冻干。
进一步地，透析过程中，透析袋的截留分子量为450-550Da。透析过程优选为：用水透析3天，每天3次，每次2L水。
一种具有刚性内核的核-壳结构树状大分子，该树状大分子采用所述的方法制备而成。
与现有技术相比，本发明具有以下特点：
1)本发明通过化学键合的方法制备了P-G2.5/PAMAM-G3核-壳结构树状大分子，与通过超分子主客体自组装合成的纯聚酰胺-胺核-壳结构树状大分子G3-CD/Ad-G3相比，具有较好的基因压缩能力和传递效果，合成过程更加简单，易于操作。
2)本发明制备的P-G2.5/PAMAM-G3核-壳结构树状大分子具有良好的分散性和细胞相容性，体外实验证实刚性内核的P-G2.5/PAMAM-G3/pDNA复合物具有更高的基因转染效率，为发展新型安全高效的基因载体系统用于肿瘤精准诊断和高效治疗提供了新思路。
附图说明
图1为两种不同刚性内核的核-壳结构树状大分子的合成过程示意图(A为P-G2.5/PAMAM-G3核-壳结构树状大分子，B为G3-CD/Ad-G3核-壳结构树状大分子)；
图2为本发明制备的P-G2.5/PAMAM-G3核-壳结构树状大分子的一维核磁共振氢谱图；
图3为G3-Ad(a)、G3-CD(b)、G3-CD/Ad-G3(c)的一维核磁共振氢谱图；
图4为G3-CD/Ad-G3的二维核磁共振氢谱图；
图5为本发明制备的P-G2.5/PAMAM-G3/pDNA和G3-CD/Ad-G3/pDNA的凝胶阻滞实验电泳图谱(泳道1为DNA marker，泳道2为纯质粒DNA，泳道3-8为不同N/P比下的纳米复合物)；
图6为本发明制备的P-G2.5/PAMAM-G3/pDNA和G3-CD/Ad-G3/pDNA的水动力学直径(A)和电势(B)图；
图7为载体以及载体/pDNA复合物对HeLa细胞的毒性结果图；其中，A为P-G2.5/PAMAM-G3以及G3-CD/Ad-G3，B为P-G2.5/PAMAM-G3/pDNA以及G3-CD/Ad-G3/pDNA；
图8为不同N/P比下载体/pDNA复合物在HeLa细胞中的绿色荧光蛋白基因转染的荧光显微镜图；
图9为不同N/P比下流式细胞仪表征纳米复合物在HeLa细胞中的绿色荧光蛋白基因转染效率的流式定量图；
图10为不同N/P比下多功能酶标仪表征纳米复合物在HeLa细胞中的荧光素酶基因转染效率效果图；
图11为不同N/P比下流式细胞仪表征HeLa细胞对本发明制备的纳米复合物的吞噬能力的评价结果图；
图12为最佳N/P比下共聚焦显微镜表征HeLa细胞对本发明制备的纳米复合物的吞噬能力的评价结果图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。本实施例以本发明技术方案为前提进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1：
如图1中A所示，将PAMAM-G3的DMSO溶液(46.85mg PAMAM-G3，5ml DMSO)加到100ml的反应瓶中，并在反应瓶中加入2g的无水硫酸钠，再缓慢滴加P-G2.5的DMSO溶液(2.32mgP-G2.5，5ml DMSO)，P-G2.5与PAMAM-G3的投料摩尔比为1:20，起始反应温度控制为在4℃-9℃，磁力搅拌反应24h。将得到的产物转移至截留分子量为500Da的透析袋中，在蒸馏水中透析三天，然后进行冷冻干燥处理，最后得到干燥的P-G2.5/PAMAM-G3，-20℃保存备用。
对比例：
为便于对比，参照中国发明专利CN107353408A制备纯聚酰胺-胺核-壳结构树状大分子(G3-CD/Ad-G3)。如图1中B所示，具体包括以下步骤：
(1)将2.36mg Ad-COOH、23.07mg EDC、12.64mg NHS溶于5mL的DMSO溶液，而后将EDC和NHS溶液逐滴加入到Ad-COOH的DMSO溶液中，室温搅拌活化3h。然后将活化的Ad-COOH溶液逐滴加入G3.NH2溶液(53.07mg G3.NH2，5mL DMSO)中，反应3天后将产物转移至截留分子量为500Da的透析袋中，在蒸馏水中透析三天，然后进行冷冻干燥处理，最后得到干燥的G3-Ad，-20℃保存备用。
(2)将20.59mgβ-CD、28.74mg CDI溶于5mL的DMSO溶液，而后将CDI溶液逐滴加入到β-CD的DMSO溶液中，室温搅拌活化8h。而后将活化的β-CD溶液逐滴加入G3.NH2溶液(4.95mgG3.NH2，5ml DMSO)中，反应3天后将得到的产物转移至截留分子量为3500Da的透析袋中，在蒸馏水中透析三天，然后进行冷冻干燥处理，最后得到干燥的G3-CD，-20℃保存备用。
(3)以实施例1中P-G2.5/PAMAM-G3的摩尔比制备G3-CD/Ad-G3，以保证两种核壳材料表面具有等量的PAMAM-G3。按摩尔比为10:1的比例分别称取步骤(1)和步骤(2)得到的产物，然后用超纯水溶解后混合，磁力搅拌下室温反应24h，将得到的产物转移至截留分子量为10000的透析袋中，在蒸馏水中透析三天，然后进行冷冻干燥处理，最后得到干燥的G3-CD/Ad-G3，-20℃保存备用。
对实施例1及对比例中制得的核壳结构树状大分子的基因传递效率进行评价，方法如下：
将得到的P-G2.5/PAMAM-G3和G3-CD/Ad-G3与pDNA按照不同的N/P比在室温下进行孵育，20min后得到P-G2.5/PAMAM-G3/pDNA复合物与G3-CD/Ad-G3/pDNA复合物。随后，研究不同N/P比条件下载体压缩pDNA的能力及复合物的电势和粒径。其中N/P比为树状大分子的伯胺基与pDNA骨架上磷酸基团摩尔比，数值范围为0.5:1-5:1；
将HeLa细胞种于96孔板上，于37℃、5％CO2在添加了双抗和血清的培养基中培养过夜，更换含有材料的新鲜培养基，培养24小时后利用CCK-8法评价材料的细胞毒性。
将HeLa细胞种于12孔板上，于37℃、5％CO2在添加了双抗和血清的培养基中培养过夜，更换含有材料的新鲜培养基，孵育4小时，然后更换新鲜培养基，培养24小时，检测绿色荧光蛋白表达量。
所用培养基为添加了100U/mL青霉素、100U/mL链霉素和10％FBS的DMEM培养基，吞噬时间为4小时，吞噬后转染培养时间为24小时。所述pDNA为含有可表达增强绿色荧光蛋白基因的EGFP质粒。
通过核磁共振(1H NMR)、Zeta电势及动态光散射(DLS)、2D NOESY、定氮实验等方法表征P-G2.5/PAMAM-G3和G3-CD/Ad-G3；采用凝胶阻滞实验评价纳米载体压缩基因的能力；利用CCK-8法来评价纳米载体的细胞毒性；利用多功能酶标仪、流式细胞仪、共聚焦显微镜来评价该纳米载体的基因转染效率和胞内定位情况。
试验结果分别如下：
(1)1H NMR表征
1H NMR图谱用于表征PAMAM-G3对P-G2.5表面的修饰和对比材料Ad对G3表面的修饰、β-CD对G3表面的修饰以及G3-Ad对G3-CD表面的修饰。
对实施例1制备的P-G2.5/PAMAM-G3进行核磁表征，1H NMR表征结果如图2所示，在化学位移7.5-8.9ppm的质子峰是P-G2.5中苯环上质子峰，化学位移2.2-3.4ppm处的质子峰代表G3结构中的质子峰，通过对特征峰进行积分，一个P-G2.5表面连接了4个PAMAM-G3。
对对比例的步骤(1)、步骤(2)、步骤(3)制备的G3-Ad、G3-CD、G3-CD/Ad-G3进行核磁表征。1H NMR表征结果如图3中A所示，1.4-1.9ppm处的的质子峰为Ad的特征峰，2.2-3.4ppm处的质子峰代表G3的特征峰，通过积分可知一个G3表面修饰了1.2个Ad分子。如图3中B所示，3.5-4.1ppm和5.0ppm处为β-CD的特征峰，通过积分可知一个G3表面修饰了4.2个β-CD。如图3中C所示：通过对β-CD和Ad的特征峰进行积分，一个G3-CD表面连接了4个G3-Ad分子。
(2)2D NOESY测试结果
2D NOESY用于表征G3-CD/Ad-G3超分子主客体自组装结构的形成，参见图4：化学位移3.5-4.1ppm处β-CD的内部质子基团与化学位移1.4-1.9ppm处的Ad基团出现了明显的相关交叉信号(灰色区域)，由此可以说明Ad基团与β-CD发生了相互作用，紧密结合。同时证明了主体单元G3-CD与客体单元G3-Ad通过Ad基团与β-CD的主客体作用，成功构建了表面氨基的核-壳结构树状大分子G3-CD/Ad-G3。
(3)凝胶阻滞试验结果
凝胶阻滞实验用于表征P-G2.5/PAMAM-G3和G3-CD/Ad-G3对EGFP-pDNA的压缩能力。
配制8孔含有溴化乙锭(1mg/mL)的琼脂糖凝胶(1.0％w/v)，室温放置待琼脂糖凝胶凝固。pDNA(具有EGFP基因，能够表达绿色荧光蛋白)量为1μg/孔，按照不同N/P比(0、0.125、0.25、0.5、1、2和5)分别配制P-G2.5/PAMAM-G3/pDNA和G3-CD/Ad-G3/pDNA复合物，于室温下孵育20min，并以裸pDNA为对照。将对应的载体/pDNA复合物分别加到琼脂糖凝胶的孔中，电压80V，时间30min，结果如图5所示。结果表明，在N/P比≥1的时候，P-G2.5/PAMAM-G3能够完全压缩pDNA；在N/P比≥2时，G3-CD/Ad-G3能够完全压缩pDNA压缩，这说明两种载体都具有良好的压缩pDNA的能力，且P-G2.5/PAMAM-G3的pDNA压缩能力更强。
(4)复合物材料水动力学直径和表面电势测定结果
将P-G2.5/PAMAM-G3和G3-CD/Ad-G3在不同的N/P比条件下(5，10，20，40和60)，分别与5μg pDNA质粒在室温下孵育20min后，加入PBS缓冲液至终体积为1mL。通过马尔文激光粒度仪(Malvern,MK，633nm激光)对其水动力学粒径及表面电势进行了表征，结果如图6所示。结果表明，在不同的N/P比条件下，载体/基因复合物的水动力学粒径都大致在150-200nm左右，并且载体/基因复合物的表面电势都在25-35mV之间。P-G2.5/PAMAM-G3相比于G3-CD/Ad-G3能够将EGFP-pDNA压缩为粒径更小的载体/基因复合物，说明P-G2.5/PAMAM-G3有更强的DNA压缩能力。
由此可知，在各个N/P比条件下，各载体/pDNA复合物的水动力学粒径与表面电势都处于合适的基因传递范围内，适合被细胞吸附和内吞，有利于细胞内基因的传递。
(5)细胞毒性试验结果
细胞毒性试验用于表征载体和载体/基因复合物对细胞的毒性。
以HeLa细胞作为模型，选有带有增强型绿色荧光蛋白基因的质粒作为pDNA，来检验P-G2.5/PAMAM-G3和G3-CD/Ad-G3以及P-G2.5/PAMAM-G3/pDNA和G3-CD/Ad-G3/pDNA复合物在不同条件下的细胞毒性。按照8000个细胞每孔的密度接种在96孔细胞培养板上，置于5％CO2，37℃条件下孵育过夜，将培养基换成含材料的培养基(材料浓度分别为0nM、50nM、100nM、500nM、1000nM、2000nM、3000nM)，5％CO2，37℃继续培养24小时。随后弃掉原培养基，加入含100μL含有10％CCK-8的无血清培养基，孵育3小时后，多功能酶标仪(波长450nm)检测，以同样的方法对载体/pDNA复合物的细胞活力进行评价，结果如图7所示。结果表明，P-G2.5/PAMAM-G3和G3-CD/Ad-G3在试验浓度范围内对HeLa细胞略有毒性，浓度为3000nM时细胞存活率为60％左右，负载pDNA后，P-G2.5/PAMAM-G3和G3-CD/Ad-G3与基因复合物的细胞存活率较纯材料相比有了明显的上升，说明负载基因减少了表面正电荷，有助于增强材料的细胞相容性。
由此可知，随着载体浓度的增加，细胞存活率下降。然而，当载体浓度高达3000nM的时候，细胞的存活率依然维持在60％以上，说明了载体具有良好的细胞相容性。与此同时，载体与pDNA复合后的细胞存活率与纯载体相比有了明显的上升，说明负载基因减少了表面正电荷，减少了细胞毒性。
(6)绿色荧光蛋白表达试验结果
EGFP-pDNA基因转染实验用于研究P-G2.5/PAMAM-G3和G3-CD/Ad-G3负载EGFP-pDNA后对HeLa细胞的转染能力。
以宫颈癌细胞(HeLa)为模型细胞，选有带有增强型绿色荧光蛋白基因的质粒作为pDNA，来检验P-G2.5/PAMAM-G3和G3-CD/Ad-G3在不同的N/P比条件下(20，30，40和50)的基因转染效率。以5×104/孔的密度将HeLa种于24孔板中，所用培养基为添加了100U/mL青霉素、100U/mL链霉素和10％FBS的DMEM培养基，37℃、5％CO2条件下培养过夜。随后更换成含有1μg pDNA的载体/pDNA复合物(N/P比为20、30、40和50)的新鲜培养基，孵育4h。PBS缓冲溶液清洗细胞，添加500μL新鲜培养液，37℃、5％CO2条件下培养24h。利用荧光显微镜检测EGFP的表达情况。
纳米载体与pDNA复合物在HeLa细胞中的基因转染效率荧光显微镜结果如图8所示，在不同N/P比条件下，P-G2.5/PAMAM-G3和G3-CD/Ad-G3都显示出了良好的基因转染效率，并且两种载体在N/P比为40的条件下，绿色荧光信号最强，其转染效率最佳，且在各个N/P比条件下，P-G2.5/PAMAM-G3的基因转染效率要优于G3-CD/Ad-G3，证明具有刚性内核的载体能够增强基因传递的效率，这也说明了材料的刚性会影响基因传递的效率。
另外，采用相同的方法培养细胞24h后，使用PBS缓冲溶液清洗细胞，按每孔200μL的胰酶消化细胞2min，1000rpm离心5min，最后用1mL PBS将获得的细胞重新分散。制备好细胞悬液后用流式细胞仪检测细胞释放的绿色荧光，每个材料的不同N/P比样品采样1×104，重复三次。
用流式细胞仪对绿色荧光蛋白表达试验进行了定量分析，结果如图9所示。各材料与pDNA复合物在HeLa细胞中的基因转染效率流式结果显示，在实验设计的N/P比条件下，P-G2.5/PAMAM-G3和G3-CD/Ad-G3都显示出了良好的基因转染效率，并且在N/P为40的条件下转染效率最佳。同时，在各个N/P比下，P-G2.5/PAMAM-G3的基因转染效率要高于G3-CD/Ad-G3，其结果与荧光显微镜检测的绿色荧光蛋白表达结果一致。
另外，在试验设计的各个N/P比条件下，P-G2.5/PAMAM-G3的绿色荧光信号明显强于G3-CD/Ad-G3，并且在N/P比为40的时候，荧光信号最高，进一步证明具有刚性内核的载体能够增强基因传递的效率。
(7)荧光素酶表达试验结果
使用编码Luc的pDNA作为报告基因，定量评价P-G2.5/PAMAM-G3和G3-CD/Ad-G3的基因转染效率。
以HeLa细胞作为模型细胞，选用带有荧光素酶基因的质粒作为pDNA，以此作为模型评价P-G2.5/PAMAM-G3和G3-CD/Ad-G3在不同的N/P比条件下(20，30，40和50)的基因转染效率。以5×104/孔的密度将HeLa种于24孔板中，所用培养基为添加了100U/mL青霉素、100U/mL链霉素和10％FBS的DMEM培养基，于37℃及5％CO2条件下培养过夜。随后更换成新鲜培养液，按照每孔1μgpDNA，N/P比20、30、40和50制备载体/pDNA复合物加入细胞中吞噬4h。使用PBS缓冲溶液清洗细胞，添加500μL新鲜培养液，于37℃及5％CO2条件下培养24h。转染结束后，将细胞裂解，使用荧光素酶检测试剂盒来检测荧光素酶的荧光值。蛋白定量试剂盒测定每一个样品中的蛋白含量。最后用每毫克蛋白的荧光单位数(RLU/mg)来表示载体的基因转染效率。结果如图10所示，不同N/P比条件下，P-G2.5/PAMAM-G3的基因转染效率明显高于G3-CD/Ad-G；在N/P比为40的时候，P-G2.5/PAMAM-G3的基因转染效率是G3-CD/Ad-G3的4.1倍。
由此可知，各个N/P比条件下，P-G2.5/PAMAM-G3和G3-CD/Ad-G3都显示出了良好的基因转染效率，但是P-G2.5/PAMAM-G3的转染效率远远高于G3-CD/Ad-G3，充分说明基因传递载体的刚性越强，基因传递效率越好，这与绿色荧光蛋白基因表达的结果一致。
(8)胞内定位实验结果
采用带有Cy3标记的EGFP-pDNA(Cy3-EGFP-pDNA)作为报告基因以研究P-G2.5/PAMAM-G3和G3-CD/Ad-G3负载基因后在HeLa细胞内的分布情况。
以HeLa细胞作为模型细胞，选用带有Cy3标记的pDNA，以此为模型评价P-G2.5/PAMAM-G3和G3-CD/Ad-G3作为基因载体时被细胞吞噬的效率。以1×105/孔的密度将HeLa细胞种于12孔板中，所用培养基为添加了100U/mL青霉素、100U/mL链霉素和10％FBS的DMEM培养基，于37℃及5％CO2条件下培养过夜。随后更换成新鲜培养液，按照每孔1μg pDNA，N/P比20、30、40和50制备载体/pDNA复合物加入细胞中吞噬4h。使用PBS缓冲溶液清洗细胞，按每孔200μL的胰酶消化细胞2min，1000rpm离心5min，最后用1mL PBS将获得的细胞重新分散。制备好细胞悬液后用流式细胞仪检测细胞释放的红色荧光，每个材料的不同N/P比样品采样1×104，重复三次。
载体与pDNA复合物在HeLa细胞中的吞噬效率流式结果如图11所示。结果表明，对照组和未加载体的裸pDNA组都未检测到明显的红色荧光。材料组中出现明显的红色荧光，这说明制备的P-G2.5/PAMAM-G3/pDNA复合物和G3-CD/Ad-G3/pDNA复合物能够被细胞吞噬。各个N/P比条件下，P-G2.5/PAMAM-G3的吞噬效率明显高于G3-CD/Ad-G3，这也是P-G2.5/PAMAM-G3具有更高转染效率的原因。
另外，以HeLa细胞作为模型细胞，选用带有Cy3标记的pDNA，以此为模型评价P-G2.5/PAMAM-G3和G3-CD/Ad-G3作为基因载体时被细胞吞噬后的胞内定位。以2×105/孔的密度将HeLa细胞种于confocal皿中，所用培养基为添加了100U/mL青霉素、100U/mL链霉素和10％FBS的DMEM培养基，于37℃及5％CO2条件下培养过夜。随后更换成新鲜培养液，按照每孔1μg pDNA，按照最佳N/P比40制备载体/pDNA复合物，与细胞中共孵育4h。采用激光共聚焦显微镜对结果进行观察。结果如图12所示，对照组未见明显荧光，对于材料组，可看出明显的红色荧光，这说明制备的P-G2.5/PAMAM-G3/pDNA复合物和G3-CD/Ad-G3/pDNA复合物能被细胞吞噬，并且与G3-CD/Ad-G3/pDNA复合物相比，P-G2.5/PAMAM-G3/pDNA复合物具有更强的荧光信号，说明P-G2.5/PAMAM-G3/pDNA复合物具有更高的细胞内吞效率。
实施例2：
一种具有刚性内核的核-壳结构树状大分子的制备方法，该方法为：以第2.5代含磷树状大分子作为内核，以第3代聚酰胺-胺树状大分子作为外壳，通过化学键合制备得到P-G2.5/PAMAM-G3核-壳结构树状大分子，即为具有刚性内核的核-壳结构树状大分子。
其中，第2.5代含磷树状大分子的表面含有-CHO，第3代聚酰胺-胺树状大分子的表面含有-NH2。
具体包括以下步骤：
1)将无水硫酸钠加入至PAMAM-G3的DMSO溶液中，之后滴加P-G2.5的DMSO溶液，并在冰浴条件下进行反应；
2)反应结束后，进行后处理，得到P-G2.5/PAMAM-G3核-壳结构树状大分子。
步骤1)中，P-G2.5与PAMAM-G3的摩尔比为1:18。PAMAM-G3的DMSO溶液中，PAMAM-G3的质量浓度为10mg/ml；P-G2.5的DMSO溶液中，P-G2.5的质量浓度为0.4mg/ml。无水硫酸钠与PAMAM-G3的质量比为45:1。
冰浴温度为4℃，反应时间为28h。
步骤2)中，后处理依次包括透析及冻干。透析过程中，透析袋的截留分子量为450Da。
实施例3：
一种具有刚性内核的核-壳结构树状大分子的制备方法，该方法为：以第2.5代含磷树状大分子作为内核，以第3代聚酰胺-胺树状大分子作为外壳，通过化学键合制备得到P-G2.5/PAMAM-G3核-壳结构树状大分子，即为具有刚性内核的核-壳结构树状大分子。
其中，第2.5代含磷树状大分子的表面含有-CHO，第3代聚酰胺-胺树状大分子的表面含有-NH2。
具体包括以下步骤：
1)将无水硫酸钠加入至PAMAM-G3的DMSO溶液中，之后滴加P-G2.5的DMSO溶液，并在冰浴条件下进行反应；
2)反应结束后，进行后处理，得到P-G2.5/PAMAM-G3核-壳结构树状大分子。
步骤1)中，P-G2.5与PAMAM-G3的摩尔比为1:22。PAMAM-G3的DMSO溶液中，PAMAM-G3的质量浓度为9mg/ml；P-G2.5的DMSO溶液中，P-G2.5的质量浓度为0.5mg/ml。无水硫酸钠与PAMAM-G3的质量比为40:1。
冰浴温度为9℃，反应时间为20h。
步骤2)中，后处理依次包括透析及冻干。透析过程中，透析袋的截留分子量为550Da。
实施例4：
一种具有刚性内核的核-壳结构树状大分子的制备方法，该方法为：以第2.5代含磷树状大分子作为内核，以第3代聚酰胺-胺树状大分子作为外壳，通过化学键合制备得到P-G2.5/PAMAM-G3核-壳结构树状大分子，即为具有刚性内核的核-壳结构树状大分子。
其中，第2.5代含磷树状大分子的表面含有-CHO，第3代聚酰胺-胺树状大分子的表面含有-NH2。
具体包括以下步骤：
1)将无水硫酸钠加入至PAMAM-G3的DMSO溶液中，之后滴加P-G2.5的DMSO溶液，并在冰浴条件下进行反应；
2)反应结束后，进行后处理，得到P-G2.5/PAMAM-G3核-壳结构树状大分子。
步骤1)中，P-G2.5与PAMAM-G3的摩尔比为1:20。PAMAM-G3的DMSO溶液中，PAMAM-G3的质量浓度为9.5mg/ml；P-G2.5的DMSO溶液中，P-G2.5的质量浓度为0.45mg/ml。无水硫酸钠与PAMAM-G3的质量比为42:1。
冰浴温度为6℃，反应时间为24h。
步骤2)中，后处理依次包括透析及冻干。透析过程中，透析袋的截留分子量为500Da。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种具有刚性内核的核-壳结构树状大分子的制备方法，其特征在于，该方法为：以第2.5代含磷树状大分子作为内核，以第3代聚酰胺-胺树状大分子作为外壳，通过化学键合制备得到P-G2.5/PAMAM-G3核-壳结构树状大分子，即为所述的具有刚性内核的核-壳结构树状大分子；
所述的第2.5代含磷树状大分子的表面含有-CHO，所述的第3代聚酰胺-胺树状大分子的表面含有-NH2。
2.根据权利要求1所述的一种具有刚性内核的核-壳结构树状大分子的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
1)将无水硫酸钠加入至PAMAM-G3的DMSO溶液中，之后滴加P-G2.5的DMSO溶液，并在冰浴条件下进行反应；
2)反应结束后，进行后处理，得到P-G2.5/PAMAM-G3核-壳结构树状大分子。
3.根据权利要求2所述的一种具有刚性内核的核-壳结构树状大分子的制备方法，其特征在于，步骤1)中，所述的P-G2.5与PAMAM-G3的摩尔比为1:(18-22)。
4.根据权利要求2所述的一种具有刚性内核的核-壳结构树状大分子的制备方法，其特征在于，步骤1)中，所述的PAMAM-G3的DMSO溶液中，PAMAM-G3的质量浓度为9-10mg/ml；所述的P-G2.5的DMSO溶液中，P-G2.5的质量浓度为0.4-0.5mg/ml。
5.根据权利要求2所述的一种具有刚性内核的核-壳结构树状大分子的制备方法，其特征在于，步骤1)中，所述的无水硫酸钠与PAMAM-G3的质量比为(40-45):1。
6.根据权利要求2所述的一种具有刚性内核的核-壳结构树状大分子的制备方法，其特征在于，步骤1)中，冰浴温度为4-9℃，反应时间为20-28h。
7.根据权利要求2所述的一种具有刚性内核的核-壳结构树状大分子的制备方法，其特征在于，步骤2)中，所述的后处理依次包括透析及冻干。
8.根据权利要求7所述的一种具有刚性内核的核-壳结构树状大分子的制备方法，其特征在于，透析过程中，透析袋的截留分子量为450-550Da。
9.一种具有刚性内核的核-壳结构树状大分子，其特征在于，该树状大分子采用如权利要求1至8任一项所述的方法制备而成。
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