CN107501562A - 一种质子化吗啡啉修饰的含磷树状大分子及其制备和应用 - Google Patents

一种质子化吗啡啉修饰的含磷树状大分子及其制备和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种质子化吗啡啉修饰的含磷树状大分子及其制备和应用，将吗啡啉接枝到含磷树状大分子表面，然后质子化，得到质子化吗啡啉修饰的含磷树状大分子。本发明制备的吗啡啉修饰的含磷树状大分子是一种良好的促进间充质干细胞成骨诱导分化的试剂，在骨组织修复和重建等方面具有良好的应用前景。

Description

一种质子化吗啡啉修饰的含磷树状大分子及其制备和应用
技术领域
本发明属于功能性树状大分子复合物及其制备和应用领域，特别涉及一种质子化吗啡啉修饰的含磷树状大分子及其制备和应用。
背景技术
骨损伤等疾病已经成为严重的全球性公共健康问题，根据骨损伤的程度不同分为轻度骨损伤和大块骨缺损。对于大块骨损伤的修复，骨组织工程方法应运而生。近年来，干细胞逐渐成为骨组织工程研究的热点。干细胞是一类可以自我更新并具有多向分化潜能的细胞。根据发育时间的不同，干细胞可分为胚胎干细胞和成体干细胞，成体干细胞又包括间充质干细胞(MSCs，mesenchymal stem cells)等多种干细胞。间充质干细胞是研究干细胞定向分化中最常用的细胞。一方面，间充质干细胞具有多向分化潜能，可以分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞和神经细胞等；另一方面，间充质干细胞的来源广泛，分离和提取的方法简单快捷。
在MSCs的培养体系中添加一定浓度的地塞米松、β-甘油磷酸钠和抗坏血酸可以使得鼠MSCs向成骨细胞方向(Liao et al.,J.Clin.Rehabil.Tissue Eng.Res.2009,13,88-91)。MSCs分化为成骨细胞主要需经历四个阶段，即：未成熟的骨祖细胞、成熟的骨祖细胞、前成骨细胞、成熟的成骨细胞。在此分化过程中，细胞的碱性磷酸酶(ALP)、I型胶原、骨桥蛋白和骨钙素蛋白的表达都随之增强，同时可观察到细胞外基质中发生钙盐沉积、骨结节形成等现象。这一分化过程中多个因子起到了调控作用。骨形态发生蛋白(BMPs，bonemorphpgenetic proteins)是成骨细胞发育过程中非常重要的调节因子，它们可以促进较成熟的成骨细胞的分化和骨基质的形成(Schmidt-Bleek et al.,Cytokine GrowthFactor Rev.2016,27,141-148)。目前临床上应用于促进骨形成的骨形成剂主要包括两类，氟化物和甲状旁腺激素。然而，氟化物的毒性虽小，但长期大量使用可导致骨硬化，骨强度下降(Kassem et al.,Eur.J.Endocrinol.1994,130,381-386)；甲状旁腺激素小剂量间歇给药是能促进骨形成，但大剂量持续给药则抑制成骨细胞活性(Seebach et al.,J.Orthop.Res.2004,22,472-478)。这些问题使其临床应用受到限制。
近年来，寻求高效、无毒，无副作用，具有生物相容性的促进骨形成的药物，是干细胞应用于骨组织工程治疗骨疾病的一大关键。其中纳米药物基于其优越性能：小尺寸效应，可实现高效的细胞吸收性；大比表面积，可载多个功能基团或活性中心；便于生物降解或吸收等，纳米药物在医药领域得到了广泛的关注和高度重视。
本文使用的第二代树状大分子，内部含有很多含磷单元，表面拥有的活泼的基团可进行多功能化修饰，单分散性的结构使其容易进入细胞。磷是组成遗传物质核酸的基本成分之一，而核苷酸是生命中传递信息和调控细胞代谢的重要物质——核糖核酸(RNA)和脱氧核糖核酸(DNA)的基本组成单位。磷存在于人体所有细胞中，是维持骨骼和牙齿的必要物质，几乎参与所有生理上的化学反应。磷还是使心脏有规律地跳动、维持肾脏正常机能和传达神经刺激的重要元素。含磷树状大分子独特的元素组成和结构在生物活性方面具有更多的优势。至今未发现有关含磷树状大分子用于促进间充质干细胞成骨分化的报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种质子化吗啡啉修饰的含磷树状大分子及其制备和应用，本发明的材料具有制备过程简单，实验条件温和，易操作，在骨组织的修复和重建中有良好的应用前景。
本发明的一种质子化吗啡啉修饰的含磷树状大分子，将吗啡啉接枝到含磷树状大分子表面，然后质子化。
所述含磷树状大分子为第二代含磷树状大分子G2-P(S)Cl2(购买自法国Biodendrimers公司)。
本发明的一种质子化吗啡啉修饰的含磷树状大分子的制备方法，包括：
(1)将含磷树状大分子溶解在溶剂中，在氮气保护的冰浴条件下依次滴加入N，N-二异丙基乙胺和4-(2-氨乙基)吗啉，滴加完毕3-8min后撤去冰浴，然后在室温条件下继续搅拌2-4h，纯化，得到吗啡啉修饰的含磷树状大分子G2-Mor，并于4℃保存；
(2)将上述吗啡啉修饰的含磷树状大分子G2-Mor溶于溶剂中，滴加盐酸溶液直至不再产生沉淀为止，过滤得到的沉淀进行洗涤，烘干，得到纯化的质子化吗啡啉修饰的含磷树状大分子G2-Mor+。
所述步骤(1)、(2)中溶剂为无水四氢呋喃。
所述步骤(1)中含磷树状大分子、N，N-二异丙基乙胺、4-(2-氨乙基)吗啉的摩尔比为1:60:30。
所述步骤(1)中纯化为：用旋转蒸发仪旋干反应液，残余物质加二甲基亚砜DMSO溶解后用可再生透析袋透析，冻干。
所述透析为透析袋截留分子量为1000；用去离子水透析3d，每天3次，每次2L去离子水。
所述步骤(2)中盐酸溶液为盐酸的乙醚溶液，浓度为0.1M。
所述步骤(2)洗涤为用乙醚洗涤除去过量的盐酸；烘干为：真空干燥箱中烘干。
本发明的一种质子化吗啡啉修饰的含磷树状大分子的应用，质子化吗啡啉修饰的含磷树状大分子在促进间充质干细胞(BMSCs)成骨分化中的应用。
所述质子化的吗啡啉修饰的含磷树状大分子促进间充质干细胞成骨分化的浓度为12-36μg/mL。
所述质子化吗啡啉修饰的含磷树状大分子为活性成分，具有促进间充质干细胞成骨分化的作用。
成骨促进作用是促进骨髓间充质干细胞早期的碱性磷酸酶表达，促进骨髓间充质干细胞向成骨方向分化。
成骨促进作用是促进骨髓间充质干细胞后期的钙离子分泌，促进骨髓间充质干细胞向成骨方向分化。
本发明中将吗啡啉接枝到第二代含磷树状大分子表面，可以通过质子化以达到溶于水的目的。
本发明通过吗啡啉修饰的含磷树状大分子诱导间充质干细胞分化成成骨细胞。本发明通过CCK-8法测试材料对细胞的毒性；通过定量的碱性磷酸酶(ALP)活性、钙离子分泌和定性的ALP染色、冯库萨染色对BMSCs分化成成骨细胞的能力进行分析。
细胞毒性试验、ALP活性、钙离子分泌和定性的ALP染色、冯库萨染色结果分别如下：
(1)细胞毒性试验测试结果：
细胞毒性试验用于表征吗啡啉修饰的含磷树状大分子对细胞的毒性，参见说明书附图2。CCK-8试验结果表明，所合成的纳米材料在给定浓度范围内对细胞基本无毒性，说明所合成的纳米材料有良好的生物相容性。
(2)ALP活性结果：
ALP活性结果用于定量的研究吗啡啉修饰的含磷树状大分子诱导BMSCs分化成成骨细胞的能力，参见说明书附图3。结果表明：ALP活性随着时间的延长而增加，添加吗啡啉修饰的含磷树状大分子的细胞较之未添加该材料和添加了乙酰化的第五代聚酰胺-胺树状大分子的细胞，ALP表达水平明显得到提升。
(3)钙离子沉积结果：
钙离子沉积结果用于定量的研究吗啡啉修饰的含磷树状大分子诱导BMSCs分化成成骨细胞的能力，参见说明书附图4。结果显示：添加吗啡啉修饰的含磷树状大分子的细胞中的钙离子含量随着时间的延长而增加，相比于未添加该纳米材料和添加乙酰化的第五代聚酰胺-胺树状大分子的细胞，添加吗啡啉修饰的含磷树状大分子的细胞中钙离子含量明显提升。
(4)ALP染色结果：
ALP染色结果用于定性的研究吗啡啉修饰的含磷树状大分子诱导BMSCs分化成成骨细胞的能力。参见说明书附图5。结果显示：添加吗啡啉修饰的含磷树状大分子的细胞，它们的颜色和形态都发生了些许的改变，说明干细胞正分化成成骨细胞。这与ALP活性和钙离子沉积结果都一致，体现了吗啡啉修饰的含磷树状大分子可以促进对BMSCs向成骨细胞的诱导分化。
(5)冯库萨染色结果：
冯库萨染色结果用于定性研究吗啡啉修饰的含磷树状大分子诱导BMSCs分化成成骨细胞的能力。参见说明书附图6。结果显示：添加吗啡啉修饰的含磷树状大分子的细胞，它们的颜色和形态都发生了明显的改变，说明干细胞已成功分化成成骨细胞。这与ALP活性、钙离子沉积结果都一致，体现了吗啡啉修饰的含磷树状大分子可以促进对BMSCs向成骨细胞的诱导分化。
有益效果
(1)本发明提供吗啡啉修饰的含磷树状大分子在促进间充质干细胞成骨分化中的应用。
(2)本发明的材料具有制备过程简单，实验条件温和，易操作，在骨组织的修复和重建中有良好的应用前景。
附图说明
图1为本发明中4-(2-氨乙基)吗啉(a)和吗啡啉修饰的含磷树状大分子G2-Mor(b)的核磁共振氢谱图；
图2为本发明制备的纳米材料对BMSCs的细胞毒性结果；
图3为本发明制备的纳米材料对BMSCs的ALP活性影响结果图；None代表未处理的BMSCs的ALP活性，OI代表含地塞米松的骨诱导培养基处理的BMSCs的ALP活性，为阳性对照，OC代表无地塞米松的骨引导培养基处理的BMSCs的ALP活性，G5-NHAc+OC代表含G5-NHAc的骨引导培养基处理的BMSCs的ALP活性，G2-Mor++OC代表含G2-Mor+的骨引导培养基处理的BMSCs的ALP活性；
图4为本发明制备的纳米材料对BMSCs的钙离子分泌影响结果图；None代表未处理的BMSCs的钙离子分泌量，OI代表含地塞米松的骨诱导培养基处理的BMSCs的钙离子分泌量，为阳性对照，OC代表无地塞米松的骨引导培养基处理的BMSCs的钙离子分泌量，G5-NHAc+OC代表含G5-NHAc的骨引导培养基处理的BMSCs的钙离子分泌量，G2-Mor++OC代表含G2-Mor+的骨引导培养基处理的BMSCs的钙离子分泌量；
图5为本发明制备的纳米材料对BMSCs的ALP染色结果图；(a)代表未处理的BMSCs的ALP染色图，(b)代表含地塞米松的骨诱导培养基处理的BMSCs的ALP染色图，为阳性对照，(c)代表无地塞米松的骨引导培养基处理的BMSCs的ALP染色图，(d)代表含G5-NHAc的骨引导培养基处理的BMSCs的ALP染色图，(e)代表含G2-Mor+的骨引导培养基处理的BMSCs的ALP染色图；
图6为本发明制备的纳米材料对BMSCs的冯库萨染色结果图；(a)代表未处理的BMSCs的冯库萨染色图，(b)代表含地塞米松的骨诱导培养基处理的BMSCs的冯库萨染色图，为阳性对照，(c)代表无地塞米松的骨引导培养基处理的BMSCs的冯库萨染色图，(d)代表含G5-NHAc的骨引导培养基处理的BMSCs的冯库萨染色图，(e)代表含G2-Mor+的骨引导培养基处理的BMSCs的冯库萨染色图；
图7为本发明中乙酰化的聚酰胺-胺型树状大分子G5-NHAc的核磁共振氢谱图；
图8为吗啡啉修饰的含磷树状大分子的制备示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
称取第二代含磷树状大分子G2-P(S)Cl2 20mg(4.19μmol),溶于1mL无水四氢呋喃(THF)中，在氮气保护的冰浴条件下加入43.85μL(251.73μmol)的N，N-二异丙基乙胺(DIPEA),然后缓慢滴加16.51μL(125.86μmol)的4-(2-氨乙基)吗啉。滴加完毕5min后撤去冰浴，在室温下继续搅拌3小时。用旋转蒸发仪旋干反应液，残余物质加1～2mL DMSO溶解，得到含有G2-Mor的粗品溶液。将上述液体转移至截留分子量为1000的可再生透析袋中，在磷酸缓冲溶液(pH＝7.4)中透析一天(2L×3)，在蒸馏水中透析两天(2L×6)，然后进行冷冻干燥处理得到纯化样品，并于4℃保存。
参见说明书附图1(a)，图为4-(2-氨乙基)吗啉在氘代二甲基亚砜中的核磁氢谱。其中3.32、2.6、2.3和2.26ppm是4-(2-氨乙基)吗啉上亚甲基的特征质子峰，1.28ppm处是4-(2-氨乙基)吗啉上氨基的特征峰。
参见说明书附图1(b)，图为吗啡啉修饰的含磷树状大分子在氘代二甲基亚砜中的核磁氢谱图。其中3.32、3.02和2.32ppm是吗啡啉上亚甲基的特征质子峰，7～8ppm处是含磷树状大分子结构单元的苯环(图中g、h处)和碳氮双键氢(图中i处)的特征质子峰，4.6ppm处是新生成的仲氨(图中f处)的特征峰。根据它们积分面积之比，计算出每个第二代含磷树状大分子上连接了22个吗啡啉分子(其投料摩尔比为G2:Mor＝1:30)。
实施例2
将上述制备得到的吗啡啉修饰的含磷树状大分子(G2-Mor)溶于无水四氢呋喃中，滴加盐酸的乙醚溶液(0.1M)直至不再产生沉淀为止。通过过滤得到沉淀并用乙醚洗涤除去过量的盐酸，在真空干燥箱中烘干得到纯化的质子化的产物G2-Mor+。
实施例3
以骨髓间充质干细胞BMSCs为模型细胞来检验实施例2制备的材料的细胞毒性。以1.5×104/孔的密度将BMSCs种于96孔板中，培养于添加100U/mL青霉素，100U/mL链霉素和10％FBS的100μL DMEM(L)培养液中，在37℃、5％二氧化碳浓度下培养24h。然后将培养基换成G2-Mor+浓度分别为0nM、50nM、100nM、500nM、1000nM、2000nM和3000nM的无血清培养基与细胞共培养24h，然后用PBS冲洗，随后加入10μL CCK-8溶液和90μL完全培养基，继续培养2h。最后用多功能酶标仪测试吸光值，测试波长450nm，结果如说明书附图2所示。结果表明，随着材料浓度的增加，材料几乎对细胞的存活率没有影响，表明制备的G2-Mor+材料具有较好的细胞相容性。
实施例4
以ALP活性结果来检验G5-NHAc(对照材料)和实施例2制备的材料诱导BMSCs分化成成骨细胞的能力。ALP是干细胞成骨分化的早期标记物。以骨引导(Osteoconductive(OC))和骨诱导(Osteoinductive(OI))培养基作为对照。骨引导培养基OC的成分为DMEM(L)+10％FBS+1％双抗+10mmol/Lβ-甘油磷酸钠+50mg/L抗坏血酸细胞，骨诱导培养基OI的成分为DMEM(L)+10％FBS+1％双抗+0.1μmol/L地塞米松+10mmol/Lβ-甘油磷酸钠+50mg/L抗坏血酸。细胞的培养方法如实施例3所示，间充质干细胞(BMSCs，5×103细胞每孔)分别接种于24孔组织培养板中，置于5％CO2、37℃培养箱培养1天。将基础培养基除去，换成含有骨诱导培养基OC的引导液(即骨引导培养基OC，DMEM(L)+10％FBS+1％双抗+10mmol/Lβ-甘油磷酸钠+50mg/L抗坏血酸)，并分别加入实施例2制备的质子化吗啡啉修饰的含磷树状大分子(最终浓度为24μg/mL)或G5-NHAc(最终浓度为24μg/mL)，培养7、14和21天。培养7、14和21天后，分别收集处理后的细胞，将细胞裂解，采用细胞比色分析方法对细胞的ALP活性进行检测。通过说明书附图3可知，ALP活性随着时间的延长而增加，但在第14天到第21天的时候，ALP活性的增加速度有所降低。这可能是由于随着干细胞分化成成骨细胞，ALP表达水平随之上升，但随着成骨细胞的逐渐形成，ALP表达水平有所降低。从图中亦可看出，在三个时间点，G2-Mor+处理的细胞较之未处理的、G5-NHAc处理的细胞，ALP表达水平明显得到提升，和含地塞米松的骨引导培养基处理的细胞相比，ALP表达水平相当接近。
实施例5
以钙离子沉积结果来检验G5-NHAc(对照材料)和实施例2制备的材料诱导BMSCs分化成成骨细胞的能力。钙离子沉积也是一种成骨细胞分化的重要指标之一，钙离子是干细胞成骨分化的后期标记物。细胞的培养方法如实施例3所示，以骨引导(Osteoconductive(OC))和骨诱导(Osteoinductive(OI))培养基作为对照。骨引导培养基OC的成分为DMEM(L)+10％FBS+1％双抗+10mmol/Lβ-甘油磷酸钠+50mg/L抗坏血酸细胞，骨诱导培养基OI的成分为DMEM(L)+10％FBS+1％双抗+0.1μmol/L地塞米松+10mmol/Lβ-甘油磷酸钠+50mg/L抗坏血酸。细胞的培养方法如实施例3所示，间充质干细胞(BMSCs，5×103细胞每孔)分别接种于24孔组织培养板中，置于5％CO2、37℃培养箱培养2天。将基础培养基除去，换成含有骨引导培养基OC的引导液(即骨引导培养基OC，DMEM(L)+10％FBS+1％双抗+10mmol/Lβ-甘油磷酸钠+50mg/L抗坏血酸)，并分别加入实施例1制备的质子化吗啡啉修饰的含磷树状大分子(最终浓度为24μg/mL)或G5-NHAc(最终浓度为24μg/mL)，培养14和21天。培养14和21天后，收集14天和21天的细胞，将细胞裂解，通过钙离子测定试剂盒来检测细胞中钙离子的含量，结果见说明书附图4。测试结果显示，随着时间的延长，细胞中的钙离子含量明显的增加。在14天和21天的时候，G2-Mor+处理的细胞较之未处理的、G5-NHAc处理的细胞具有更高的钙离子浓度，和含有地塞米松的骨引导培养基处理的细胞相比，钙离子浓度非常接近。
实施例6
以ALP染色结果定性的检验G5-NHAc(对照材料)和实施例2制备的材料诱导BMSCs分化成成骨细胞的能力。ALP是干细胞成骨分化的早期标记物。ALP染色是能通过染色的方法将碱性磷酸酶染成黄棕色，从而定性的验证细胞成骨分化的过程。细胞的培养方法和实验处理方法如实施例4所示。根据实施例4和5的结果，干细胞在21天的时候已成功的分化成成骨细胞，因此，我们对21天的细胞进行冯库萨染色，结果见说明书附图5。测试结果显示：经染色后，对于未处理的细胞，从细胞的颜色和形态明显看出细胞依旧是干细胞；而对于处理的细胞，细胞的颜色和形态都发生了一些改变，说明干细胞正逐步分化成成骨细胞。G2-Mor+处理的细胞较之未处理的、G5-NHAc处理的细胞相比，细胞被染成黄棕色的密度是较大的；与骨引导培养基处理的细胞相比，细胞被染成黄棕色的密度是相当的。本结果与ALP活性，钙离子沉积结果都一致。
实施例7
以冯库萨染色结果定性的检验G5-NHAc(对照材料)和实施例2制备的材料诱导BMSCs分化成成骨细胞的能力。冯库萨染色即硝酸银法，其原理在于该法是一种金属置换法，干细胞成骨分化后期所分泌的钙盐被置换成银盐，银盐在光的作用下被还原成黑色金属银，从而定性的验证成骨细胞的形成。细胞的培养方法和实验处理方法如实施例4所示。根据实施例4和5的结果，干细胞在21天的时候已成功的分化成成骨细胞，因此，我们对21天的细胞进行冯库萨染色，结果见说明书附图6。测试结果显示：经染色后，对于未处理的细胞，从细胞的颜色和形态明显看出细胞依旧是干细胞；而对于处理的细胞，细胞的颜色和形态都发生显著性的改变，说明干细胞已成功分化成成骨细胞。G2-Mor+处理的细胞较之未处理的、G5-NHAc处理的细胞相比，细胞被染成黑色的密度是较大的；与骨引导培养基处理的细胞相比，细胞被染成黑色的密度是相当的。这一结果与ALP活性，钙离子沉积和ALP染色结果都一致。均表明G2-Mor+对干细胞诱导成骨分化具有促进作用。
对比例1
将20mg聚酰胺-胺型树状大分子G5.NH2溶于2mL DMSO中，逐滴加入60μL三乙胺，磁力搅拌反应30min，再向反应液中加入50μL乙酸酐，继续室温搅拌反应24h，随后将反应产物用可再生透析袋(截留分子量5000)透析三天，经冻干得到纯化样品乙酰化的树状大分子材料G5.NHAc。
参见说明书附图7，图为聚酰胺-胺型树状大分子在氘代水中的核磁氢谱图。聚酰胺胺树状大分子的亚甲基质子峰位于2.2-3.4ppm之间(图中2，3，4，5处),1.86ppm处为乙酰基的甲基质子峰(图中1处)。根据它们积分面积之比，计算出每个聚酰胺-胺型树状大分子表面修饰了108个乙酰基，表明聚酰胺-胺型树状大分子表面氨基(伯胺)基本被全部乙酰化(聚酰胺-胺型树状大分子表面氨基个数约为110个)。

Claims (10)

1.一种质子化吗啡啉修饰的含磷树状大分子，其特征在于：将吗啡啉接枝到含磷树状大分子表面，然后质子化。
2.根据权利要求1所述的一种质子化吗啡啉修饰的含磷树状大分子，其特征在于：所述含磷树状大分子为第二代含磷树状大分子G2-P(S)Cl2。
3.一种如权利要求1-2任一所述的质子化吗啡啉修饰的含磷树状大分子的制备方法，包括：
(1)将含磷树状大分子溶解在溶剂中，在氮气保护的冰浴条件下依次滴加入N，N-二异丙基乙胺和4-(2-氨乙基)吗啉，滴加完毕3-8min后撤去冰浴，然后在室温条件下继续搅拌2-4h，纯化，得到吗啡啉修饰的含磷树状大分子G2-Mor；
(2)将上述吗啡啉修饰的含磷树状大分子G2-Mor溶于溶剂中，滴加盐酸溶液直至不再产生沉淀为止，过滤得到的沉淀进行洗涤，烘干，得到质子化吗啡啉修饰的含磷树状大分子G2-Mor+。
4.根据权利要求3所述的一种质子化吗啡啉修饰的含磷树状大分子的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)、(2)中溶剂为无水四氢呋喃。
5.根据权利要求3所述的一种质子化吗啡啉修饰的含磷树状大分子的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中含磷树状大分子、N，N-二异丙基乙胺、4-(2-氨乙基)吗啉的摩尔比为1:60:30。
6.根据权利要求3所述的一种质子化吗啡啉修饰的含磷树状大分子的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中纯化为：用旋转蒸发仪旋干反应液，残余物质加二甲基亚砜DMSO溶解后用可再生透析袋透析，冻干。
7.根据权利要求6所述的一种质子化吗啡啉修饰的含磷树状大分子的制备方法，其特征在于：所述透析为透析袋截留分子量为1000；用去离子水透析3d，每天3次，每次2L去离子水。
8.根据权利要求3所述的一种质子化吗啡啉修饰的含磷树状大分子的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中盐酸溶液为盐酸的乙醚溶液，浓度为0.1M。
9.一种如权利要求1-2任一所述的质子化吗啡啉修饰的含磷树状大分子的应用，其特征在于：质子化吗啡啉修饰的含磷树状大分子在促进间充质干细胞成骨分化中的应用。
10.根据权利要求9所述的一种质子化吗啡啉修饰的含磷树状大分子的应用，其特征在于：所述质子化的吗啡啉修饰的含磷树状大分子促进间充质干细胞成骨分化的浓度为12-36μg/mL。
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