CN102844036B

CN102844036B - 用于体外和体内软骨发生的方法和组合物

Info

Publication number: CN102844036B
Application number: CN201080041322.0A
Authority: CN
Inventors: 迈克尔·D.·韦斯特; 哈尔·斯滕伯格; 克伦·B.·查普曼
Original assignee: Biotime Inc
Current assignee: Lineage Cell Therapeutics Inc
Priority date: 2009-07-16
Filing date: 2010-07-16
Publication date: 2016-01-20
Anticipated expiration: 2030-07-16
Also published as: US20120171171A1; CN102844036A; AU2018211308A1; CA2768376C; JP2018035175A; AU2016201700A1; JP6220367B2; JP2012533571A; JP6096509B2; CA2768376A1; EP2453905A4; IL217552A; SG177694A1; WO2011009106A3; EP2453905A2; EP2453905B1; WO2011009106A2; ES2778750T3; KR20120092558A; CN105796601A

Abstract

本发明的方面包括涉及能够进行软骨发生的胚胎祖细胞系的产生、识别和使用的方法和组合物。公开了来源于原始干细胞的许多示例性软骨形成细胞系。本文中公开的软骨形成细胞系是强健的，可扩增超过40代，并且具有位点特异性纯度，从而提供了用于产生用于研究和治疗的具有独特分子组成的不同软骨类型的组合物和方法。

Description

用于体外和体内软骨发生的方法和组合物

交叉引用

本申请根据35U.S.C.§119(e)要求下列临时专利申请的优先权：2009年7月16日提交的标题为“MethodsandCompositionsUsefulforInVitroandInVivoChondrogenesisUsingEmbryonicProgenitorCellLines”的第61/226,237号申请；2009年9月18日提交的标题为“ImprovedMethodsofScreeningEmbryonicProgenitorCellLines”的第61/243,939号申请；2010年5月27日提交的标题为“ImprovedMethodsofScreeningEmbryonicProgenitorCellLines”的第61/349,088申请；和2010年7月16日提交的标题为“MethodsandCompositionsforInVitroandInVivoChondrogenesis”的第61/365,308号申请。这些申请的每一个的全部内容通过引用并入本文。

发明背景

软骨的有限再生能力限制了身体的修复因创伤或退行性疾病引起的损伤的天然能力。例如，骨关节炎(OA)折磨高达70％的65岁以上的个体(2100万美国人)。对半月板或前交叉韧带的损伤通常让患者处于增加患关节炎的风险中。骨关节炎的特征在于关节表面上软骨的逐渐丢失，从而导致疼痛的软骨下骨暴露。在对关节软骨的该损伤后，人组织几乎不显示修复能力。作为固有修复反应的结果出现的新生软骨本质上通常是纤维状的，从而不适合用于修复。

已开发了多种治疗方案用于治疗患有软骨损伤的受试者。此类治疗的实例包括意欲使用机械手段(例如，摩擦和微小骨折手术例如钻孔、微小骨折手术、软骨成形术和海绵化(spongialization)；激光辅助治疗，其将患病软骨的去除与软骨矫形结合)触发受试者的软骨产生的治疗和依赖于组织至损伤部位的移植(或嫁接(grafting))(例如，骨膜移植、骨软骨移植(软骨镶嵌术)和关节软骨糊移植(articularcartilagepastegrafting))的治疗。此类治疗的成功率可变化并且某些治疗具有潜在的有害副作用，包括组织坏死、反应性滑膜炎(reactivesynovitis)、软骨溶解和关节软骨退变的加速。

称为自体软骨细胞治疗(ACT)的基于细胞的软骨治疗方案包括从软骨取出软骨细胞、体外扩增细胞和利用或不利用支持基质(或其它蛋白质或蛋白聚糖)将这些扩增的细胞施用至患者内。ACT治疗因人关节软骨细胞的去分化(当在体外培养时)以及再分化细胞(以便它们在移植位置产生丰富的软骨基质)的相对困难而变得复杂。此外，只有少量软骨可从人收集，从而只有少量软骨细胞可被用于起始培养。因此，实践中在将分离的人软骨细胞应用于移植治疗中一直存在困难。

另一个治疗策略是利用源自骨髓的间充质干细胞(hbmMSC)。利用单次剂量的hbmMSC(软骨素原(Chondrogen))的临床研究显示与透明质酸(HA)对照相比的疼痛的减轻。然而，间充质干细胞(MSC)在它们用于再生软骨的方面具有两个障碍。第一，因成体MSC的有限的增殖能力的原因导致细胞作为同种异体移植物的用途是有问题的，即使细胞能够进行一定量的扩增，它们通常也相对快速地失去它们形成软骨的能力。第二个障碍是MSC例如源自骨髓的MSC形成肥大软骨细胞，其特征在于高水平的COL10A1和IHH表达。这些软骨细胞在发育中的作用是补充血管和成骨细胞，然后死亡。在例如长骨的生长面区域观察到肥大软骨细胞。也在骨折位置观察到它们，在所述位置中它们类似地在骨形成中起着重要作用。因此，在软骨的创伤和退变疾病例如骨关节炎的治疗中使用MSC已产生混合结果。此外，在体内存在许多软骨类型。耳的弹性软骨具有与鼻、胸骨、气管和承重关节的分子组成不同的分子组成。

因此，再生医学领域，特别是在软骨再生和修复领域内，急需要产生商业量的多种类型的永久性软骨细胞(与肥大软骨细胞相反)的新型细胞制剂。

概要

本发明的方面包括与能够进行软骨发生的胚胎祖细胞系的产生、识别和使用相关的方法和组合物。公开了许多示例性源自已建立的hES细胞系的软骨形成细胞系。本文中描述的软骨形成细胞系是强健的，可扩增超过40代，并且具有位点特异性纯度(site-specificpurity)，从而提供了产生用于研究和治疗的具有独特分子组成的多种软骨类型的组合物和方法。

附图说明

图1：在软骨形成微团条件下的14天之前和之后通过qPCR测定的细胞系中COL2A1的诱导的水平。

图2：显示处于未分化和分化条件下的MSC对照连同本发明的细胞系中的软骨相关基因COL2A1、CRTAC1、CD74、(2A)LECT1、IHH和LHX8(2B)的相对表达。

图3：显示脂肪组织干细胞与第14代的细胞系4D20.8相比较，与第6代的MSC相比较的番红O染色(全部细胞系都处于以沉淀形式进行的分化的第21天)和第14天的细胞系4D20.8和MSC的沉淀的免疫染色(以同种型为对照)的实例。

图4：显示4D20.8RGD-藻酸盐(图4A)、E15RGD-藻酸盐和SM30RGD-藻酸盐(图4B)的体内植入的结果。

图5：显示示例性组织学图像，该图像显示4D20.8和E15的与透明软骨中的软骨细胞的外观相似的软骨细胞样外观。

缩写

AFP-甲胎蛋白

BMP-骨形态发生蛋白

BRL-水牛大鼠肝

BSA-牛血清白蛋白

CD-集群名称(ClusterDesignation)

cGMP-现行良好操作规范(CurrentGoodManufacturingProcesses)

CNS-中枢神经系统

DMEM-达尔伯克改良伊格尔培养基

DMSO-二甲基亚砜

DPBS-达尔伯克磷酸盐缓冲盐水(Dulbecco’sPhosphateBufferedSaline)

EC-胚胎性癌

EC细胞-胚胎性癌细胞；hEC细胞是人胚胎性癌细胞

ECM-细胞外基质

ED细胞-源自胚胎的细胞(Embryo-derivedcell)；hED细胞是人ED细胞

EDTA-乙二胺四乙酸

EG细胞-胚胎生殖细胞；hEG细胞是人EG细胞

EP细胞-胚胎祖细胞是来源于原始干细胞的细胞，其比原始干细胞更加分化，因为它们在人物种的情况下不再展现标志例如SSEA4、TRA1-60或TRA-1-81血清阳性，但仍未完全分化。胚胎祖细胞对应于胚胎期，与发育的出生后期相反。

ES细胞-胚胎干细胞；hES细胞是人ES细胞

FACS-荧光激活细胞分选术

FBS-胎牛血清

GMP-药品生产和质量管理

hED细胞-人胚胎来源的细胞

hEG细胞-人胚胎生殖细胞是源自胎儿组织的原始生殖细胞的干细胞。

hEP细胞-人胚胎祖细胞是来自人物种的胚胎祖细胞

hiPS细胞-人诱导多能干细胞是具有与在暴露于hES-特异性转录因子例如SOX2、KLF4、OCT4、MYC或NANOG、LIN28、OCT4和SOX2后获自体细胞的hES细胞相似的性质的细胞。

HSE-人皮肤等同物是细胞与被制造用于测试目的或用于促进创伤修复治疗性应用的生物或合成基质的混合物。

ICM-哺乳动物胚泡期胚胎的内细胞团。

iPS细胞-诱导多能干细胞是具有与在暴露于ES-特异性转录因子例如SOX2、KLF4、OCT4、MYC或NANOG、LIN28、OCT4和SOX2后获自体细胞的hES细胞相似的性质的细胞。

LOH-杂合性丢失

MEM-最低必需培养基

NT-核移植

PBS-磷酸盐缓冲盐水

PS成纤维细胞-瘢痕形成前(Pre-scarring)成纤维细胞是源自早期妊娠皮肤的皮肤或源自展示出生前基因表达模式的ED细胞的成纤维细胞，因为它们促进真皮创伤的快速愈合而无瘢痕形成。

RA-视黄酸

RFU-相对荧光单位

SCNT-体细胞核移植

SFM-无血清培养基

SPF-无特异病原体

SV40-猿猴病毒40

Tag-大T-抗原

T-EDTA-胰蛋白酶EDTA

定义

术语“分析重编程技术(analyticalreprogrammingtechnology)”是指将体细胞的基因表达模式重编程成更具多能性状态的细胞的基因表达模式，例如iPS、ES、ED、EC或EG细胞的基因表达模式的多种方法，其中重编程在多个分开的步骤中发生，并且不简单地依赖于体细胞至卵母细胞的转移和该卵母细胞的活化(参见2001年11月26日提交的第60/332,510号美国申请；2002年11月26日提交的第10/304,020号美国申请；2003年11月26日提交的第PCT/US02/37899号PCT申请；2005年8月3日提交的第60/705625号美国申请；2005年8月20日提交的第60/729173号美国申请；2006年7月5日提交的第60/818813号美国申请；2006年8月3日提交的第PCT/US06/30632号美国申请，将所述每一个申请的公开内容通过引用并入本文)。

术语“卵裂球/桑椹胚细胞”是指哺乳动物胚胎中的卵裂球或桑椹胚细胞或在另外的细胞(包括这些细胞的已分化的衍生物)存在或不存在的情况下体外培养的卵裂球或椹胚细胞。

术语“表达基因X的细胞”、“在细胞中表达基因X”(或细胞群)或其等同物意指使用专门的测定平台对细胞的分析提供了阳性结果。反之亦然(即，不表达基因X的细胞或等同物意指使用专门测定平台对细胞的分析提供了阴性结果)。因此，本文中描述的任何基因表达结果与测定平台中所用的对所指示基因特异的探针密切相关。

术语“细胞系”是指能够体外繁殖和扩增的一群非永生细胞或永生细胞。

术语“细胞重建”是指将一个细胞核的染色质转移至细胞的细胞质以获得功能细胞。

术语“克隆的”是指获自单一细胞至一群细胞(所有细胞全都来自该原始单一细胞并且不包含其它细胞)的扩增的一群细胞。

术语“集落原位分化(colonyinsitudifferentiation)”是指细胞(例如，hES、hEG、hiPS、hEC或hED)的集落原位分化而无需将集落从其培养容器取出或结集，在所述培养容器中集落被繁殖为未分化的干细胞系。集落原位分化不利用形成类胚体(embryoidbody)的中间步骤，虽然类胚体形成或其它聚集技术例如旋动培养的使用仍然可进行一段时间的集落原位分化。

术语“胞质泡(cytoplasmicbleb)”是指受完整无损的或经渗透化处理但仍完整的质膜限制但缺少细胞核的细胞的细胞质。

术语“分化细胞”，当用于指通过本发明的方法从多能干细胞产生的细胞时，是指当与亲代多能干细胞相比较具有减少的分化的潜能的细胞。本发明的分化细胞包括可进一步分化(即，它们可以是不是最终分化的)的细胞。

术语“直接分化”是指这样的分化过程：使卵裂球细胞、桑椹胚细胞、ICM细胞、ED细胞或体细胞直接重编程至未分化的状态(例如在使产生iPS细胞的过程中但在此类细胞以未分化状态被纯化出来之前)而无需将分离的未分化干细胞例如hES细胞繁殖为未分化细胞系的中间状态。直接分化的非限定性实例可以是将完整人胚泡培养成培养物以及衍生ED细胞而无需产生人ES细胞系，如所描述的(Bongso等人，1994.HumanReproduction9：2110)。

术语“胚胎干细胞”(ES细胞)是指源自胚泡、卵裂球或桑椹胚的内细胞团的细胞，其已被连续传代为细胞系同时维持未分化状态(例如，表达特异于该物种的ES细胞的TERT、OCT4以及SSEA和TRA抗原)。ES细胞可通过卵细胞与精子或DNA的受精、核转移、孤雌生殖，或通过在MHC区域中产生具有半合子性或纯合性的hES细胞来产生。虽然ES细胞在历史上已被定义为能够分化成所有体细胞类型以及生殖系(当被移植入植入前胚胎时)的细胞，但来自许多物种(包括人)的候选ES培养物在培养中具有更平整的外观，并且通常不引起生殖系分化，从而被称为“ES-样细胞”。通常认为人ES细胞实际上是“ES-样”的，然而，在本申请中，我们将使用术语ES细胞来指ES和ES-样细胞系。

术语“组织型培养”是指被聚集在一起产生具有组织样细胞密度的三维结构(例如在某些细胞于一层琼脂上的培养中发生的或例如当将细胞以三维形式在胶原凝胶、海绵或其它聚合物例如通常用于组织工程的聚合物中培养时发生的)的培养细胞。

术语“源自人胚胎的”(“hED”)细胞是指源自卵裂球的细胞、源自桑椹胚的干细胞(morula-derivedcell)、源自胚泡的细胞(blastocyst-derivedcell)(包括内细胞团、胚盾或上胚层的细胞)或早期胚胎的其它全能或多能干细胞(包括原始内胚层、外胚层、中胚层和神经嵴以及它们的达到与正常人发育的前8周等同物相关的分化的状态的衍生物)，但不包括来源于hES细胞的已被传代为细胞系的细胞(参见，例如，属于Thomson的第7,582,479号；第7,217,569号；第6,887,706号；第6,602,711号；第6,280,718号和第5,843,780号美国专利)。hED细胞可源自附植前胚胎(preimplantationembryo)，所述胚胎可通过卵细胞与精子或DNA的受精、核转移或染色质转移、通过孤雌生殖、分析重编程技术诱导卵细胞形成单性生殖生物，或通过在HLA区域产生具有半合子性或纯合性的hES细胞的方法来产生。术语“人胚胎生殖细胞”(hEG细胞)是指源自胎儿组织的原始生殖细胞或将要成熟或成熟的生殖细胞例如卵母细胞和精原细胞的多能干细胞，其可在体内分化成不同组织。hEG细胞也可源自通过产雌(gynogenetic)或产雄(androgenetic)方法(即其中多能细胞源自只包含雄性或雌性来源的DNA的卵母细胞从而将包含所有源自雌性的或源自雄性的DNA的方法)产生的多能干细胞(1999年10月28日提交的第60/161,987号美国申请；2000年10月27日提交的09/697,297；2001年11月29日提交的09/995,659；2003年2月27日提交的10/374,512；2000年10月27日提交的第PCT/US/00/29551号PCT申请；将所述申请的公开内容通过引用整体并入本文)。

术语“人胚胎干细胞”(hES细胞)是指人ES细胞。

术语“人iPS细胞”是指具有与hES细胞相似的性质的细胞，所述性质包括当在暴露于去分化因子例如hES细胞特异性转录因子组合：KLF4、SOX2、MYC和OCT4或SOX2、OCT4、NANOG和LIN28之后移植入免疫受损小鼠(其中所述iPS细胞来源于不同体细胞谱系的细胞)时，形成所有3个胚层的能力。去分化因子的任何方便组合可用于产生iPS细胞。所述iPS细胞可通过这些基因的表达(通过载体例如本领域内已知的逆转录病毒、慢病毒或腺病毒载体，或通过例如利用透化或其它技术引入因子如蛋白质)产生。关于此类示例性方法的描述参见：2006年8月3日提交的第PCT/US2006/030632号PCT申请；第11/989,988号美国申请；2000年6月30日提交的第PCT/US2000/018063号PCT申请；2000年12月15日提交的第09,736,268号美国申请；2004年4月23日提交的第10/831,599号美国申请；和第20020142397号美国专利公布(第10/015,824号申请，标题为“MethodsforAlteringCellFate”)；第20050014258号美国专利公布(第10/910,156号申请，标题为“MethodsforAlteringCellFate”)；第20030046722号美国专利公布(第10/032,191号申请，标题为“Methodsforcloningmammalsusingreprogrammeddonorchromatinordonorcells”)；和第20060212952号美国专利公布(第11/439,788号申请，标题为“Methodsforcloningmammalsusingreprogrammeddonorchromatinordonorcells”)，将所有所述专利申请通过引用整体并入本文。

术语“ICM细胞”是指哺乳动物胚胎的内细胞团的细胞或在存在或不存在周围滋养外胚层细胞的情况下体外培养的内细胞团的细胞。

术语“寡克隆(oligoclonal)”是指源自一小群细胞(通常2-1000个细胞)的一群细胞，所述细胞表现出共有相似特征例如形态或分化标志的存在或不存在，所述特征与相同培养物中其它细胞的特征不同。将寡克隆细胞与不共有这些共同特征的细胞分离，并且使其增殖，产生一群基本上完全源自相似细胞的原始群体的细胞。

术语“器官型培养”是指经聚集以产生具有组织样细胞密度的三维结构的培养的细胞，所述三维结构例如在某些细胞在一层琼脂上的培养中发生，在动物中被培养为畸胎瘤的培养细胞，或者生长在三维结构系统中的培养细胞，但其中所述聚集的细胞包含不同细胞谱系的细胞，例如，以非限定性实例为例，表皮角蛋白细胞与真皮成纤维细胞的组合，或主质细胞与它们对应的组织间质(tissuestroma)或者上皮细胞与间充质细胞的组合。

术语“多能性干细胞”与下文中定义的术语“原始干细胞(primordialstemcell)”同义地使用。

术语“混合克隆(pooledclonal)”是指通过将两个或更多个克隆群体组合以产生一群具有统一标志例如基因表达的标志的细胞来获得的一群细胞，该细胞群体与克隆群体相似，但并非其中所有细胞都来源于相同原始克隆的群体。所述混合克隆系可包括单一基因型或混合基因型的细胞。混合克隆系在其中克隆系相对早地分化或在它们的增殖寿命(proliferativelifespan)的早期以不期望的方式改变的情况下是特别有用的。

术语“原始干细胞”是指能够分化成超过一种已分化的细胞类型的动物细胞。此类细胞包括hES细胞、卵裂球/桑椹胚细胞和它们的衍生hED细胞、hiPS细胞、hEG细胞、hEC细胞和成体衍生细胞(adult-derivedcell)(包括间充质干细胞、神经元干细胞和源自骨髓的干细胞)。原始干细胞可来自非人动物。原始干细胞可进行遗传修饰或不进行遗传修饰。遗传修饰的细胞可包含标志例如荧光蛋白以有助于它们的体外或体内识别。

详述

如上文中概述的，本发明的方面包括与能够进行软骨发生的胚胎祖细胞的产生、识别和使用相关的方法和组合物。

在更详细地描述本发明的之前，应理解，本发明不限定于所描述的特定实施方案，这样其当然可以改变。还应理解，本文中使用的术语仅为了描述具体的实施方案，并且不旨在是限定性的，因为本发明的范围只受所附权利要求的限制。

当提供数值范围时，要理解的是，该范围的上限和下限之间的每个居间数值(至下限单位的十分之一，除非本文另外清楚地规定)以及所述范围内的任意其它所述或居间的数值都包括在本发明中。这些较小范围的上限和下限可独立地包括在该较小的范围内，并且也包括在本发明中，服从于所述范围内的任何特别排除的限值。当所述范围包括上下限值之一或两者时，排除那些所包括的界限之一或两者的范围也包括在本发明中。

本文中提供了某些在数值之前加有术语“约”的范围。术语“约”在本文中用于为其之后的确切数字以及与所述术语之后的数字接近或近似的数字提供文字支持。在确定数字是否与明确引用的数字接近或近似时，接近或近似的未引用的数字可以是在其出现的上下文中提供明确引用的数字的基本等同物的数字。

除非另外定义，否则本文中所使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域内的技术人员通常理解的意义相同的意义。虽然与本文中描述的方法和材料相似或等同的任何方法和材料可用于实施或测试本发明，但现在描述代表性举例说明的方法和材料。

本说明书中引用的所有公布和专利通过引用并入本文，就如同特定地及个别地表明各个公布或专利通过引用并入，并且通过引用并入本文以公开和描述与公布一起被引用的方法和/或材料。任何公布的引用是针对其提交日期之前的公开内容，并且不应当解释为本发明无权因先前发明而先于这些公布。此外，提供的公布的日期可能与实际公布日期不同，这可能需要独立确认。

应指出的是，如本文和所附权利要求中所使用的，除非上下文明确地另有说明，否则单数形式“一种”、“一个”和“该”包括复数指示物。还应指出，权利要求可以被撰写成排除任何可选元素。这样，该陈述意图用作与权利要求要素的描述联合使用此类排他性术语“单独地”、“仅仅”等或使用“否定(negative)”限定的在先基础。

在阅读本公开内容后对于本领域技术人员明显的是，本文中描述的和举例说明的单个实施方案的每一个具有分立的组分和特征，在不背离本发明的范围或精神的情况下可这些组分和特征可以容易地与其它若干实施方案的任一个的特征分开或组合。可以以所引用事件的顺序或以逻辑上可能的任何其它顺序实施任何引用的方法。

胚胎软骨形成祖细胞和使用方法

本发明的方面包括与能够进行软骨发生的胚胎祖细胞的产生、识别和使用相关的方法和组合物。已描述了与四肢和关节的细胞系例如表达MSX1、MSX2和SOX9的细胞系(具有表达高水平的关节特异性标志GDF5的细胞系的亚组)相关的多组表达间充质的中心调节因子的克隆细胞系(参见West等人，2008，RegenerativeMedicine第3卷(3)pp.287-308，其通过引用并入本文，包括补充信息；和2009年7月16日提交的并且标题为“MethodstoAcceleratetheIsolationofNovelCellStrainsfromPluripotentStemCellsandCellsObtainedThereby”的第12/504,630号美国专利申请，其通过引用整体并入本文)。这些克隆纯化的品系是强健的，能够扩增超过40代，同时保持它们的基因表达模式，未曾显示致肿瘤性，并且具有基因表达的胚胎模式。这些细胞系从而提供了用于产生多种用于研究和治疗的具有独特分子组成的软骨类型的组合物和方法。

在某些实施方案中，本发明的未分化胚胎软骨祖细胞或细胞系的基因表达模式未提供它们在适当的培养条件下具有成为软骨细胞的潜能的迹象。换句话说，细胞不具有显示软骨细胞发育潜能的基因表达模式。

本发明的某些软骨形成胚胎祖细胞系，当在软骨形成条件下诱导时，能够产生软骨而不表达COL10A1或IHH基因，这两种基因在这样的条件下于MSC中表达并且为肥大软骨细胞的标志。肥大软骨细胞提供了以后被成骨细胞侵入以产生骨的临时基质，从而不适合用于某些治疗目的(例如，当注射入关节中或移植入关节软骨中以试图再生该组织以治疗关节软骨创伤、关节炎或相关用途时)。因此，本发明的细胞系具有与其它发育成肥大软骨细胞的软骨细胞祖细胞(例如，源自骨髓的MSC)不同的重要治疗差异。

根据本发明的示例性胚胎软骨细胞祖细胞对于下列基因中的任合1个、2个、3个、4个或全部的表达是阴性的：CD74、CD90、CD166、ITGA2和KCNK2。这些基因中的每一个都是存在于间充质干细胞(MSC)中的标志，所述MSC目前用于软骨替代疗法(在下文中进一步描述)。因此，本发明的软骨形成胚胎祖细胞系具有与其它已知软骨形成祖细胞不同的基因表达模式。在某些实施方案中，软骨形成胚胎祖细胞还对HOX基因和PITX1的表达呈阴性。

下面是一组根据本发明的方面的示例性人胚胎软骨细胞祖细胞系和某些所关注的基因表达标志(阳性和阴性标志)。此类人胚胎软骨细胞祖细胞系，当它们在从人ES或源自相似的人原始干细胞的细胞分离后已经历18-21次倍增的克隆扩增时，能够分化成成软骨细胞，接着分化成与正常早期传代培养的人关节软骨细胞(NHAC)相比较表达更高水平的COL2A1的软骨细胞。

P22-28范围内的细胞系MEL2的基因表达标志可通过比较如表1中显示的处于未分化(对照或Ctrl))状态的细胞的基因表达模式来测定。由所述细胞系表达的特异性基因表达标志包括基因：PIP、ENPP2、DLX5、CXADR、NPTX2、CLDN23、SFRP2、HSPB3、HAND2、HSD17B2、RCAN2、EBF3、GPM6B、RNF175、PPARGC1A、RGS16、GPM6B、SOX17、EPHB6和BAPX1。在P22-28的范围内的细胞系MEL2中表达的这些标志中最特异的是：PIP(Illumina探针ID4010519)、SOX17(Illumina探针ID3610193)、DLX5(Illumina探针ID3370767)、GPM6B(Illumina探针ID2630279)、RGS16(Illumina探针ID1030102)、EPHB6(Illumina探针ID7400017)和HAND2(Illumina探针ID4640563)并且对于：TBX15(Illumina探针ID6060113)、HOXA2(Illumina探针ID2060471)、AJAP1(IlluminaID1300647)和HOXB2(Illumina探针ID3460097)的表达呈阴性。

P13-15的范围内的细胞系SM30的基因表达标志可通过比较如表1中显示的处于未分化(对照或Ctrl))状态的细胞的基因表达模式来测定。由所述细胞系表达的特异性基因表达标志包括基因：COL15A1、DYSF、FST、ITGB4、TMEM119、MSX1、NDST3、NTRK1和ZIC2。在P13-15的范围内的细胞系SM30中表达的这些基因表达标志中最特异的是：NTRK1(Illumina探针ID7050113)、NDST3(Illumina探针ID670537)、ZIC2(Illumina探针ID510368)、ITGB4(Illumina探针ID3940132)，并且对于PIP(Illumina探针ID4010519)、NNAT(Illumina探针ID4010709)、HOXA2(Illumina探针ID2060471)、TBX15(Illumina探针ID6060113)和HAND2(Illumina探针ID4640563)的表达呈阴性。

P11-18的范围内的细胞系7SMOO32的基因表达标志可通过比较如表1中显示的处于未分化(对照或Ctrl))状态的细胞的基因表达模式来测定。由所述细胞系表达的特异性基因表达标志包括基因：EGFL6、FGF13、BEX2、CHRNA3、NCAM2、BBOX1和DLK1。在7SMOO32中表达的这些基因表达标志中最特异的是：EGFL6(Illumina探针ID6330079)、FGF13(Illumina探针ID7380239)、CHRNA3(Illumina探针ID4280180)、BBOX1(Illumina探针ID3400386)，并且对于基因：TBX15(Illumina探针ID6060113)、NNAT(Illumina探针ID4010709)、NTRK1(Illumina探针ID7050113)、HAND2(Illumina探针ID4640563)和HOXA2(Illumina探针ID2060471)的表达呈阴性。

P12-17范围内的细胞系SK11的基因表达标志可通过比较表1中显示的处于未分化(对照或Ctrrl))状态中的细胞的基因表达模式来确定。由所述细胞系表达的特异性基因表达标志包括基因：PITX1、TBX15、NCAM1、COL21A1、CYYR1、LAMI3、MEGF10、RNF165和GDF10。在SK11中表达的这些基因表达标志中最特异的是：TBX15(Illumina探针ID6060113)、COL21A1(Illumina探针ID3440747)、GDF10(Illumina探针ID5690095)、PITX1(Illumina探针ID2000373)，并且对基因：NNAT(Illumina探针ID4010709)、HAND2(Illumina探针ID4640563)、FOXF2(Illumina探针ID1660470)、FOXG1(Illumina探针ID4200458)、HOXA2(Illumina探针ID2060471)HOXB2(Illumina探针ID3460097)和AJAP1(IlluminaID1300647)的表达呈阴性。

P15-26范围内的细胞系7PEND24的基因表达标志可通过比较表1中显示的处于未分化(对照或Ctrl))状态中的细胞的基因表达模式来确定。由所述细胞系表达的特异性基因表达标志包括基因：TBX15、CA9、SPAG16、SUSD2、TBXAS1、AIF1、SLITRK5、FOXF2、AADAC和FOXG1。在7PEND24中表达的这些基因表达标志中最特异的是：AADAC(Illumina探针ID6200619)、TBX15(Illumina探针ID6060113)、SPAG16(Illumina探针ID4390537)、AIF1(Illumina探针ID3800047)，并且对基因：NNAT(Illumina探针ID4010709)、PITX1(Illumina探针ID2000373)、SOX17(Illumina探针ID3610193)和AJAP1(IlluminaID1300647)的表达呈阴性。

P14-15范围内的细胞系E15的基因表达标志可通过比较表1中显示的处于未分化(对照或Ctrl))状态中的细胞的基因表达模式来确定。由所述细胞系表达的特异性基因表达标志包括基因：ENPP2、ABCA6、TBX15、BAI3、CNTN3、TSPYL5、GAP43、AJAP1、CYFIP2、HOXA2(Illumina探针ID2060471)HOXB2(Illumina探针ID3460097)和NNAT。在E15中表达的这些基因表达标志中最特异的是：AJAP1(Illumina探针ID1300647)、BAI3(Illumina探针ID5690301)、NNAT(Illumina探针ID4010709)、ABCA6(Illumina探针ID5810209)，并且对于基因：PITX1(Illumina探针ID2000373)的表达呈阴性，以及对于基因表达标志：HAND2(Illumina探针ID4640563)和SOX17(Illumina探针ID3610193)呈阴性。

P12-17范围内的细胞系4D20.8的基因表达标志可通过比较表1中显示的处于未分化(对照或Ctrl))状态中的细胞的基因表达模式来确定。由所述细胞系表达的特异性基因表达标志包括基因：LHX8、HAPLN1、LINGO2、FGF18、GPR126、BBOX1、ITGA4、SHISA3和BARX1并且对于基因表达标志：NNAT和HAND2呈阴性。在4D20.8中表达的这些基因表达标志中最特异的是：SHISA3(Illumina探针ID5670286)、LHX8(Illumina探针ID2900343)、BARX1(Illumina探针ID6450040)、LINGO2(Illumina探针ID1110291)，并且对于基因：PITX1(Illumina探针ID2000373)、SOX17(Illumina探针ID3610193)和AJAP1(IlluminaID1300647)的表达呈阴性。

如上所指出的，本发明的胚胎软骨祖细胞用于体外或体内产生软骨的方法(有时在本文中称为软骨细胞诱导方法)。可使用任何方便的软骨细胞诱导方法，包括适合用于治疗用途的那些方法(许多示例性软骨诱导/软骨产生方法描述于下文中和实施例部分中)。

因此，通过例如在治疗可接受的载体中给受试者施用，本发明的胚胎软骨祖细胞可用于修复软骨组织的治疗性应用。施用所述祖细胞的受试者可具有软骨置换/再生可为其提供治疗益处的任何病症、损伤或疾病。例如，如果受试者在特定的位置具有软骨损伤，例如关节软骨损伤，那么可对软骨损伤的位置施用胚胎祖细胞系。用于此类治疗的药学上可接受的载体包括众多种用作用于细胞移植的治疗性载体的支架、基质等中的任一种。非限定性实例包括包含下列成分的任一种或其组合的载体：人造血浆溶液(Hextend)；透明质酸(hyaluronan)和其聚合物；硫酸软骨素；I型胶原；II型胶原；III型胶原、聚酸酐、聚原酸酯、聚乙醇酸及其共聚物；藻酸盐；琼脂糖；泊洛沙姆(polaxomer)；纤维蛋白；壳多糖和壳聚糖。示例性支架/基质和它们在软骨细胞分化和治疗中的用途更详细地描述于下文中。

在某些治疗性应用中，可在将所使用的软骨细胞胚胎祖细胞系给受试者施用之前，在软骨细胞诱导条件下培养所述细胞，例如以在移植前诱导软骨产生。例如，可将包含从本发明的细胞系产生的软骨的形式或其它结构(例如，模制结构)移植至受试者的例如在软骨丧失、损伤或退变的位置。可在此类实施方案中使用任何方便的软骨产生条件，包括如下条件中任一种或其组合：软骨细胞培养条件；将胚胎祖细胞系浸入合成基质或生物可吸收的固定媒介物；和将胚胎祖细胞系置于模制结构中。

根据本发明的治疗方法还可包括在移植后在一个或多个时间点上在期望的位置测量软骨的产生速度(例如，测量受损软骨的修复或替换)以及获得关于在受试者中最新形成的软骨的性能的信息。测量的参数可包括存在于患者的移植位置上的施用的细胞的存活、定位和数量。可使用多种扫描技术的任一种测定细胞移植物植入或重建的程度，所述扫描技术是例如计算机轴向体层摄影术(computerizedaxialtomography)(CAT或CT)扫描、磁共振成像(MRI)或正电子成象术(PET)扫描。根据本发明的移植的细胞至受试者的功能性整合可通过检查被损伤或患病的功能的恢复例如关节的恢复或功能的增强来评估。细胞移植的移植物植入、定位和存活可通过取出目标组织，并且目视或经显微镜对其检查(例如，在死后分析中)来进行。

组织工程软骨

3种类型的软骨存在于哺乳动物中，包括：透明软骨；纤维软骨和弹性软骨。透明软骨由具有坚硬、弹性稠度的软骨质团块组成，其为透明的并且颜色呈珍珠蓝。透明软骨主要发现于关节接合(articulatingjoint)的关节表面。它也在骨骺板、肋软骨、气管软骨、支气管软骨和鼻软骨中被发现。纤维软骨基本上与透明软骨相同，除了其包含为软骨增加拉伸强度的I型胶原的纤维外。胶原纤维成束排列，软骨细胞位于束之间。纤维软骨通常发现于无脊椎椎间盘(invertebraldisc)的纤维环、腱附着端(tendonousinsertion)和韧带附着端(ligamentousinsertion)、半月板、耻骨联合(symphysispubis)和关节囊的附着端中。弹性软骨也与透明软骨相似，除了其包含弹性蛋白的纤维外。其不如透明软骨透明，并且更柔软和更易弯曲。这些特征部分由植入软骨基质的弹性纤维限定。通常，弹性软骨存在于耳的耳郭、会厌和喉中。

在某些实施方案中，本发明的软骨产生性细胞被用于修复、替换或增强受试者(例如，哺乳动物，例如人患者)的软骨组织的治疗性应用。可在体外产生软骨，然后将其移植至患病位置或，在某些实施方案中，可将软骨细胞移植(例如，在基质或支架中)以在受试者的期望的位置上产生软骨。已描述了使用软骨产生性细胞(或软骨细胞)的许多疗法，在下文中概述了其中的少数几个疗法。

在某些实施方案中，可用本发明的软骨产生性细胞浸渍合成基质或生物可吸收固定媒介物(有时称为“支架”或“基质”)。迄今为止，已使用许多种合成载体基质，其包括：三维胶原凝胶(美国专利第4,846,835号；Nishimoto(1990)Med.J.KinkiUniversity15；75-86；Nixon等人(1993)Am.J.Vet.Res.54：349-356；Wakitani等人(1989)J.BoneJointSurg.71B：74-80；Yasui(1989)J.Jpn.Ortho.Assoc.63：529-538)；重建的纤维蛋白-凝血酶凝胶(reconstitutedfibrin-thrombingel)(美国专利第4,642,120号；第5,053,050和4,904,259号)；含聚酸酐、聚原酸酯、聚乙醇酸及其共聚物的合成聚合物基质(美国专利第5,041,138号)；和基于透明质酸的聚合物(Robinson等人.(1990)Calcif.TissueInt.46：246-253)。此类支架和基质中的某些被用于治疗性软骨修复(或针对该修复正接受测试)，包括I型胶原基质(例如，来自KokenCoLtd，TokyoJapan的端胶原(Atelocollagen))；I型和III型胶双层支架(例如，来自Verigen，Leverkusen，Germany)；胶原支架(例如，来自Matricel，Hezoenrath，Germany的隐蔽自体软骨细胞植入(coveredAutologousChondrocyteImplantation)(CACI)和基质诱导的自体软骨细胞植入(matrix-inducedautologouschondrocyteimplantation)(MACI)系统(ACI-Maix^TM))；猪I型/III型胶原双层(例如，(GeistlichBiomaterials，Wolhusen，Switzerland)；3D-胶原-凝胶-基质(例如，用于来自BioRegioSTERN，Friedrichstraβe，StuttgartandArthroKineticsInc，Boston，MA的)；透明质酸(hyaluruanan)支架，例如，基于透明质酸的生物可降解聚合物的酯化(苄酯)衍生物(例如，来自FidaAdvancedBiopolymersLaboratories，AbanoTerme，Italy的-11)；PGA/PLA共聚物和聚二噁烷酮支架，例如，凝胶-装载的多孔生物可降解羊毛(gel-loadedporousbiodegradablefleece)(例如，如在来自BiotissueTechnologies，Freiburg，Germany的Bio-Seed-C中所使用的)；具有琼脂糖-藻酸盐基质的固体支架(例如，来自TBFTissueEngineering，MIONS，FRANCE的)；二相性三维胶原-硫酸软骨素支架(例如，来自TETEC，Reutlingen，Germany的NOVOCART^TM3D)。

本发明的软骨产生性细胞可用于软骨重建，如由AnthonyAtala和RobertP.Lanza编著并且由AcademicPress(London)出版的MethodsofTissueEngineering(2002)中所描述的，其通过引用将该著作中关于软骨重建的描述(参见例如，第1027至1039页)并入本文。如其中所描述的，可将软骨产生性细胞置于模制结构中(例如，通过注射成型)，然后移植入动物。随着时间过去，由软骨产生性细胞产生的软骨将替代模制结构，从而产生成形的软骨结构(即，以初始模制结构的形状)。用于模制结构的示例性制模材料包括水凝胶(例如，藻酸盐、琼脂糖、泊洛沙姆(Pluronics))和天然材料(例如，I型胶原、II型胶原和纤维蛋白)。

在某些实施方案中，可在体外培养本发明的软骨产生性细胞以形成合成软骨(或软骨样)材料。随后可将所得的软骨在软骨缺损位置植入受试者。该种方法的优点在于：可在植入之前监控合成软骨材料的发育。此外，可在植入之前在生物化学和形态学上表征所得的软骨。已开发了两种通用方法以用于体外生长合成软骨。这些方法包括以依赖贴壁或不依赖贴壁的方式生长软骨产生性细胞。

在依赖贴壁的方式中，可将软骨产生性细胞在琼脂糖内培养为集落。参见例如：Benya等人(1982)Cell30：215-224；Aydlotte等人(1990)inMethodsandCartilageResearchChapter23：pp.90-92；Aulthouse等人(1989)InVitroCellularandDevelopmentalBiology25：659-668；Delbruck等人(1986)ConnectiveTissueRes.15：1550-172和Bohme等人(1992)J.CellBiol.116：1035-1042。可选择地，在另一个依赖贴壁的方法中，可在悬浮培养中将软骨产生性细胞培养为集落。参见，例如，Franchimont等人.(1989)J.Rheumatol.16：5-9和Bassleer等人.(1990)in“MethodsandCartilageResearch”，AcademicPressLtd.，第24章。

在依赖贴壁的方法中，可将软骨产生性细胞的原代培养物生长为粘附至细胞培养瓶表面的单层。参见例如：Yoshihashi(1983)J.Jpn.Ortho.Assoc.58：629-641；和美国专利第4,356,261号，将所述文献和专利通过引用整体并入本文。

在某些实施方案中，本发明的软骨疗法包括美国专利第5,723,331和5,786,217(标题为“Methodsandcompositionsfortherepairofarticularcartilagedefectsinmammals”，将这两个专利通过引用整体并入本文)中描述的那些方法。这些专利描述了用于体外制备用于软骨缺损修复的合成软骨贴剂的方法。当使用本发明的软骨产生性细胞时，所述方法包括如下步骤：(1)将本发明的软骨产生性细胞接种至具有细胞接触、细胞粘着表面的预成形的孔中；和(2)将本发明的软骨产生性细胞在孔中培养足够的时间以允许细胞分泌细胞外基质，从而形成合成软骨的三维多细胞层贴剂。所得的合成软骨(例如，合成关节软骨)，包含分散在内源产生和分泌的细胞外基质内的本发明的软骨产生性细胞。随后可将所得的合成软骨贴剂用于修复(或替换)受试者(例如，哺乳动物)的软骨缺损。

作为另一个实例，可将本发明的软骨形成细胞封装在三维基质例如水凝胶中。示例性水凝胶封装法可见于“DirectedDifferentiationofEmbryonicStemCellsinThree-DimensionalHydrogelCulture”，NathanielS.Hwang，ShyniVarghese和JennifcrElisseeff，MethodsinMolecularBiology，第407卷：p351StemCellAssays中，其通过引用并入本文。本文中描述的示例性方法概述于下文中。

A.将软骨细胞祖细胞光封装(Photo-Encapsulation)在PEGDA或RGD-修饰的PEGDA水凝胶中

1.通过将大分子单体以10％(w/v)混合在无菌PBS中来制备PEGDA聚合物聚(乙二醇)-二丙烯酸酯(PEGDA；目录号01010F12，Nektar，Huntsville，AL，USA)溶液或RGD-修饰的PEGDA聚合物溶液。保护聚合物溶液免受光照并且可将其在-20℃下贮存3个月。

2.将100mg光引发剂Igracure2959(产品编号1706673，CibaSpecialtyChemicals，Tarrytown，NY，USA)溶解在1ml70％过滤灭菌的乙醇中。

3.将PEGDA溶液和光敏引发剂溶液置于碎冰上方直至使用它们。

5.将光引发剂加入PEGDA溶液，然后充分混合以产生0.05％(w/v)的终浓度。确保引发剂与大分子单体溶液充分混合(5ul光引发剂溶液/ml聚合物溶液)。

6.通过将含光引发剂的PEGDA溶液加入到细胞颗粒沉淀中并且使用移液器充分混合(但不产生气泡)来将细胞(2000万-3000万个/ml)悬浮在前体(具有光引发剂的聚合物)溶液中。

7.将100_l祖细胞-聚合物溶液转移至圆柱形模具中，使其在4.4mW/cm²的长波长365nm的光(GlowmarkSystem，UpperSaddleRiver，NJ，USA)下暴露5分钟以完成凝胶形成。

8.将负载“固化的”软骨细胞祖细胞的水凝胶从它们的模具中取出，并将它们转移至装有含10ng/mlTGF-β1的软骨形成培养基的12孔板，在37℃和5％CO₂下温育，每隔2-3天更换培养基。

B.将软骨细胞祖细胞封装在藻酸盐水凝胶中

1.将软骨形成细胞收集在50-ml锥形管中，以145g离心5分钟。除去上清液，加入藻酸盐聚合物或RGD-修饰的藻酸盐聚合物溶液，使用(P-1000)Pipetteman轻轻悬浮细胞。避免在液体中产生气泡。

2.取出Transwell组织培养插入皿之一，用1ml氯化钙溶液充满孔。

3.使用Pipctteman，将100ul细胞悬浮液加入组织培养插入皿。在充满所有插入皿后，使用无菌摄子将插入皿转移至装有氯化钙溶液的孔中。将它们在37℃下于5％CO₂中温育20分钟。

4.使用薄而弯曲的刮铲(spatula)利用轻轻的撬开动作从插入皿取出构建体。在每一个孔中放置一个构建体，在37℃、5％CO₂下温育。

可体外培养水凝胶封装的软骨细胞祖细胞，或将其体内移植至期望产生软骨例如以替换受损软骨或正在丢失的软骨的位置。

GlycosanBiosystems也提供了用于三维细胞培养的水凝胶，其可用于培养、组织工程支架和细胞治疗。该公司提供了例如用于体外和体内细胞生长和分化的基于透明质酸的、基于PEG的和基于胶原的水凝胶。

来自GlycosanBiosystems的一个示例性水凝胶系统是HyStem-CSS^TM，其允许在3-D培养物中温和且快速地回收被封装的细胞。HyStem-CSS使用新型交联剂PEGSSDA，其允许只使用少量还原剂液化HyStem-C水凝胶。重建的HyStem-CSS^TM组分在15至37℃下保持液体状态。当将交联剂PEGSSDA加入Glycosil^TM(硫氢基修饰的透明质酸)和Gelin-S^TM(硫氢基修饰的明胶)的混合物时，水凝胶形成。胶凝作用在所有3种成分混合后约20分钟发生。所有步骤都不依赖低温或低pH。用磷酸缓冲盐溶液(PBS)或细胞培养基稀释组分可增加胶凝时间。所得的水凝胶可以在2小时内于37℃下溶解于40ml乙酰-L-半胱氨酸(还原剂)中。

根据制造方案，如下制备HyStem-CSS水凝胶(3×2.5ml＝7.5mL)：

使HyStem、Gelin-S、PEGSSDA和DG水小瓶回至室温。

在无菌条件下，使用注射器和针头，将1.0mLDG水加入HyStem小瓶。对于Gelin-S小瓶，重复操作。

将两个小瓶都水平地放置在振荡器或摇床上。将在30分钟内完全溶解所述固体。加温至不超过37℃和/或轻轻涡旋将加速溶解，溶液将是澄清的并且具有微弱粘性的。

在无菌条件下，使用注射器和针头，将0.5mLDG水加入PEGSSDA小瓶。颠倒数次以进行溶解。

尽可能快地(但在制备溶液的2小时内)无菌地混合等体积的HyStem和Gelin-S^TM。为了混合，缓慢地来回用移液器抽吸以避免捕获气泡。

将细胞颗粒沉淀重悬浮于2.0mLHyStem+Gelin-S中。用移液器来回抽吸以混合。

为了形成水凝胶，以1∶4的体积比(0.5mLPEGSSDA^TM对2.0mLHyStem+Gelin-S)将PEGSSDA加入HyStem+Gelin-S混合物，然后利用移液器混合。

使溶液反应10分钟，随后再次通过移液器抽吸混合以确保细胞均匀分布。胶凝作用将在约10至20分钟内发生。

用于软骨发生应用的另一种示例性支架是脱细胞的组织(例如来自尸体来源，例如尸体组织)(参见，例如，Minehara等人，“Anewtechniqueforseedingchondrocytesontosolvent-preservedhumanmeniscususingthechemokineticeffectofrecombinanthumanbonemorphogeneticprotein-2.”CellTissueBank.2010年6月17日.[印刷前的电子版(Epubaheadofprint)]；Yang等人“AcartilageECM-derived3-DporousacellularmatrixscaffoldforinvivocartilagetissueengineeringwithPKH26-labeledchondrogenicbonemarrow-derivedmesenchymalstemcells.”Biomaterials.2008年5月；29(15)：2378-87；和Stapleton等人，“Developmentandcharacterizationofanacellularporcinemedialmeniscusforuseintissueengineering.”TissueEngPartA.2008Apr；14(4)：505-18；将所述文献的每一个通过引用并入本文)。

例如，Minehara等人描述了使用溶剂保存(solvent-preserved)的来自尸体的人半月板和软骨细胞趋化药剂的趋化性细胞接种技术。Minehara证明rhBMP-2(以10ng/ml)能够诱导软骨细胞迁移至脱细胞的人半月板中。Minehara等人显示在3周温育后，新形成的软骨细胞外基质由遍布半月板(下至3mm的深度)的迁移的软骨细胞合成。

直接注射细胞以赋予原位软骨发生

细胞例如细胞系4D20.8、MEL2、7SMOO32、SM30、SK11、7PEND24或E15或具有相同或类似标志的人或动物细胞或本发明的其它细胞的直接注射也具有与先前对于成体源自骨髓的MSC(软骨素原)报导的治疗效用相似的治疗效用。患者经历半月板切除术，然后单次注射透明质酸(HA)或低剂量(5000万个细胞)或高剂量(1亿5000万个细胞)的MSC。针对安全性和另外的初步功效例如疼痛、软骨损伤和组织修复对患者进行监控2年。将非侵入性MRI(Non-invasiveMRI)用于检查半月板和软骨状态。在进行手术的骨关节炎(OA)患者中，在一年时，在接受MSC的单次注射的患者中相对于接受对照HA的注射的患者观察到统计上显著的20mm的疼痛的减轻(如通过视觉模拟评分法(VAS)测量的)(MSC48mmvs.对照28mm，p＝0.05)。对于患者关节的更严重的骨关节炎变化，疼痛的减轻甚至进一步增加至37mm(p＝0.004，MSC56mmvs.对照19mm)。为作比较，目前可获得的OA的治疗例如HA基于超过安慰剂9-23mm的改善而获得食品和药物管理局(FDA)批准。MRI体积分析法因读数之间看到的高水平变化性而被认为不适合于计算分析。因此，不能产生有意义的半月板再生的评估。在关节状态的身体计量中也看到成体MSC的有益效应。在21％的接受对照的患者中，但仅在6％的MSC治疗的患者中报导了与骨关节炎相关的骨质改变例如软骨下硬化和骨赘形成。也存在阳性剂量-响应效应。在一年时，在进行手术以除去受损的半月板之前，疼痛相对于基线的改善为56mm(对于高剂量MSC)、26mm(对于低剂量)和19mm(对于对照)。关节的细胞疗法可从产生关节特异性和患者特异性干细胞、具有改善的再生关节组织的能力的细胞、具有改善的用于放大和低温保存的能力的细胞的技术中受益。本发明提供了表达适合用于工业放大的表达SOX9、MSX1和MSX2的细胞系。

用于产生胚胎祖细胞系的方法

除了下文中描述的方法外，用于产生和使用本文中描述的细胞系的方法可见于下列专利申请中：第20080070303号美国专利公布，标题为“Methodstoacceleratetheisolationofnovelcellstrainsfrompluripotentstemcellsandcellsobtainedthereby”；2009年7月16日提交的第12/504,630号美国专利申请，标题为“MethodstoAcceleratetheIsolationofNovelCellStrainsfromPluripotentStemCellsandCellsObtainedThereby”；2009年7月16日提交的第61/226,237号美国临时专利申请，标题为“MethodsandCompositionsUsefulforInVitroandInVivoChondrogenesisUsingEmbryonicProgenitorCellLines”；和2006年4月11日提交的第PCT/US2006/013519号PCT申请，标题为“NOVELUSESOFCELLSWITHPRENATALPATTERNSOFGENEEXPRESSION”，将所述每一个专利申请通过引用整体并入本文。

本发明的胚胎祖细胞系衍生自已建立的hES细胞系，没有使用或破坏人类胚胎。

hES细胞培养和候选培养物的产生

先前描述了所使用的hES细胞系H9(国立卫生研究院-登记为WA09)和从AdvancedCellTechnology获得的细胞系(MA03)(West等人，2008，RegenerativeMedicine第3卷(3)pp.287-308)。将hES细胞常规地培养在hES培养基(KO-DMEM(Invitrogen，Carlsbad，CA)、1X非必需氨基酸(Invitrogen，Carlsbad，CA)、1XGlutamax-1(Invitrogen，Carlsbad，CA)、55uMβ-巯基乙醇(Invitrogen，Carlsbad，CA)、8％敲除血清替代物(Knock-OutSerumReplacement)(Invitrogen，Carlsbad，CA)、8％人血浆Plasmanate、10ng/mlLIF(Millipore，Billerica，MA)、4ng/mlbFGF(Millipore，Billerica，MA)、50个单位/ml青霉素-50个单位/ml链霉素(Invitrogen，Carlsbad，CA))中。在丝裂霉素-C处理的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)上将hES细胞系在10％CO₂和5％O₂的气氛中维持在37℃，通过胰蛋白酶消化或定期人工选择集落传代。为了产生克隆胚胎祖细胞，将hES细胞以500-10,000个细胞/15cm培养皿涂板，随后在两步骤方案下分化，第一步骤是在一系列条件下分化hES细胞以产生称为“候选培养物”的不同细胞异质培养物。利用生长在MEF上的粘附hES细胞(集落原位分化)或利用源自hES的类胚体(EB)进行候选培养物的产生。为了进行集落原位分化实验，将hES细胞生长至汇合并且通过多种方法(如来自West等人，2008，RegenerativeMedicine第3卷(3)pp.287-308(其通过引用整体并入本文)的补充表I中所描述的)使细胞分化。以非限定性实例为例，在于含有10％FCS的DMEM中集落原位分化的情况下，从小鼠饲养细胞(mousefeeder)上的hES细胞集落的培养物抽吸培养基，将培养基替换为含有10％FBS的DMEM培养基以进行分化，进行不同的时间段(1、2、3、4、5、7和9天，于分化培养基中)。随后用0.25％胰蛋白酶(Invitrogen，Carlsbad，CA)分离细胞，将其涂板在150cm²瓶中以进行扩增。如下所述将150cm²瓶中来自各时间点的候选细胞取出涂板(platedout)以进行克隆和扩增。为了进行EB分化实验，用1mg/ml胶原酶IV(于DMEM中，Invitrogen，Carlsbad，CA)在37℃下处理汇合的hES培养物15分钟以释放集落。刮取所分离的完整的集落，通过离心(150xg，进行5分钟)收集集落，将其重悬浮于补充表I(来自West等人，2008，RegenerativeMedicine第3卷(3)pp.287-308，将其通过引用整体并入本文)中描述的分化培养基中，然后转移至装有相同分化培养基的6-孔Ultra-LowBinding板(Corning，由FisherScientific，Pittsburgh，PA分配的)的单个孔中。根据实验的不同，将EB分化4-7天，用0.25％胰蛋白酶分离分化的EB，将其涂板在含有不同扩增培养基的6孔板中。将6孔板中的候选培养物生长至汇合，然后如下所述，将其取出涂板以进行克隆和扩增。

克隆细胞系的分离和扩增

用0.25％胰蛋白酶将上述部分分化的候选细胞培养物分离成单细胞，将其以约500和/或1,000和/或2,000和/或5,000个细胞/板的克隆密度一式两份地涂板在15cm明胶包覆的平板上，以在补充表I(来自West等人，2008，RegenerativeMedicine第3卷(3)pp.287-308，将其通过引用整体并入本文)中显示的多种生长培养基中进行进一步分化和扩增。将克隆密度细胞不受扰动地生长10-14天，使用标准技术利用克隆柱(cloningcylinder)和胰蛋白酶识别和收集产生的集落。将克隆的集落转移至明胶包覆的24孔板中以进行扩增。当克隆在24孔板中汇合(但不将细胞保持汇合超过2天)时，顺序地将它们扩增至12孔、6孔、T-25瓶、T-75瓶、T-150或T-225瓶，最后，扩增至转瓶。扩增至转瓶阶段的克隆细胞系被赋予唯一的ACTC识别号码、拍照并以等分冷冻保存以待以后使用。一旦细胞达到汇合的6孔皿，将它们传代至T-25瓶，取出一部分细胞(5×10⁵)以涂板在凝胶化的6cm培养皿中，进行基因表达特征谱分析。可选择地，首先将某些细胞传代至T-225瓶，然后取出一部分细胞(5×10⁵)用于涂板在凝胶化的6cm培养皿中以进行基因表达特征谱分析。从而将细胞已经历的群体倍增数测定为18-21PD。在从克隆板取出细胞克隆后，按照制造商的说明书，通过100％乙醇中的结晶紫染色(SigmaHT9132-1L)来使剩余集落可见。实验中使用的细胞培养基包括：平滑肌细胞基础培养基(Cat#C-22062B)和生长补充剂(Cat#C-39267)、骨骼肌基础培养基(Cat#C-22060B)和生长补充剂(Cat#C-39365)、内皮细胞基础培养基(Cat#C-22221)和生长补充剂(Cat#C-39221)、黑素细胞基础培养基(Cat#C-24010B)和生长补充剂(Cat#C-39415)获自PromoCellGmbH(Heidelberg，Germany)。Epi-Life，无钙/无酚红培养基(Cat#M-EPIcf/PRF-500)和低血清生长补充剂(Cat#S-003-10)购自CascadeBiologics(Portland，Oregon)。Mesencult基础培养基(Cat#05041)和补充剂(Cat#5402)获自StemCellTechnologies(Vancouver，BC)。达尔伯克改良伊格尔培养基(Cat#11960-069)和胎牛血清(Cat#SH30070-03)分别购自Invitrogen(Carlsbad，CA)和Hyclone(Logan，UT)。按照制造商的说明书对培养基和补充剂进行组合。

克隆胚胎祖细胞系命名法：

本发明的细胞系以及它们的可选择的名称列于表4中，包括代表因由生物信息学分析而引起的名称的篡改而导致的较小改动的异名，所述改动包括用“-”替换“.”和用“.”替换“-”、在始于阿拉伯数字的细胞系名称前加“x”，以及后缀例如“bio1”或“bio2”和“Rep1”或“Rep2”，“bio1”或“bio2”表示相同细胞系的生物复制物，其冷冻安瓿的相同细胞系被解冻、繁殖并且用于平行研究的情况的实例，“Rep1”或“Rep2”表示技术重复，其中第二次使用分离自给定细胞系的RNA进行重复分析而不解冻或始于新的细胞培养。细胞系的传代数(其为细胞已经历胰蛋白酶作用和再涂板的次数)通常利用字母“P”后跟阿拉伯数字来标明，相比而言，群体倍增数(其是指在从一个细胞的克隆扩增中细胞已经历的估算倍增数)通过字母“PD”后跟阿拉伯数字来标明。传代的PD数视实验而变化，但通常每一次胰蛋白酶化和再涂板为处于1∶3至1∶4的比率(分别对应于为1.5和2的PD的增加)。在克隆的扩增中，如上所述，用克隆柱从组织培养板中取出原始集落，然后转移至24孔板，然后12孔，然后6孔。第一个汇合24孔命名为P1，第一个汇合12孔培养物为P2，第一个6孔培养物为P3，随后将6孔培养物分成第二6孔板(P4)和T25(P4)。将P4时的第二6孔用于RNA提取(参见2009年7月16日提交第12/504,630号美国专利申请，名称为“MethodstoAcceleratetheIsolationofNovelCellStrainsfromPluripotentStemCellsandCellsObtainedThereby”，其通过引用整体并入本文)并且代表约18-21PD的克隆扩增。通常估计的随后的代和PD是随后分至T75瓶(19.5-22.5PD)，P6代的细胞分至T225瓶(21-24PD)，随后P7为细胞至转瓶(850cm²，23-26PD)的转移，P8为分入4个转瓶(25-28PD)。括弧中上面显示的范围代表因细胞大小、附着效率和计数误差而引起的细胞计数的估计范围。

克隆、混合克隆、寡克隆和混合寡克隆细胞系的扩增

本发明的方面提供了用于识别和区分来源于单个细胞(克隆)或细胞系(其为“混合克隆”，意指克隆的细胞系具有不能区别的标志例如基因表达标志并且通常为了在培养中增加细胞的数量而被组合以产生单细胞培养物，或为寡克隆，其中细胞系产生自少量(通常2-1,000个相似的细胞并且作为细胞系来进行扩增，或为“混合寡克隆”细胞系，其为通过组合两个或更多个具有不能区别的标志例如基因表达模式的寡克隆细胞系产生的细胞系)的胚胎祖细胞系的方法。所述克隆、混合克隆、寡克隆或混合寡克隆细胞系随后通过从它们所附着的基质取出细胞，将所述细胞以通常为细胞的原始数量的1/3至1/4的减小的密度再涂板(以有利于进一步增殖)来进行体外扩增。所述细胞系和它们的相关细胞培养基的实例公开于2009年7月16提交的名称为“MethodstoAcceleratetheIsolationofNovelCellStrainsfromPluripotentStemCellsandCellsObtainedThereby”的第12/504,630号美国专利申请；和West等人，2008，RegenerativeMedicine第3卷(3)pp.287-308中，将两者(包括补充信息)通过引用并入本文。本发明的组合物和方法涉及按所描述方式培养的但超过21次倍增的克隆扩增的所述细胞系。

基因表达分析

为了减小因细胞周期假像(cellcycleartifact)引起的基因表达的变异，和为了捕获细胞的早期基因表达特征谱，在扩增至6孔板时，在细胞达到汇合的当天，将细胞置于血清减少至0.5％(在原始血清浓度超过5％的情况下)的培养基中。在所有其它情况下，将血清和/或其它生长因子减少至它们的原始值的10％。将这些静止条件强制进行5天，在收获前再给所有培养物给料2天以减小给料差异假象。因此，通过举例说明，如果原始培养基为含有10％FCS的DMEM培养基，那么静止同步培养基为含有0.5％FCS的DMEM。按照制造商的说明书，使用QiagenRNeasy小试剂盒直接从生长在6孔或6cm组织培养板中的细胞提取总RNA。使用BeckmanDU530或Nanodrop分光光度计测量RNA浓度，利用变性琼脂糖凝胶电泳或Agilent2100生物分析仪测定RNA质量。使用AffymetrixHumanGenomeU133Plus2.0系统、IlluminaHuman-6v1和HumanRef-8v1Beadchips(Illumina1)以及IlluminaHuman-6v2Beadchips(Illumina2)进行全基因组表达分析，并且通过定量PCR确认某些基因的RNA水平。对于IlluminaBeadArrays，使用IlluminaTotalPrep试剂盒(Ambion)线性扩增并生物素标记总RNA，使用Agilent2100生物分析仪对cDNA进行质量控制。将cRNA与IlluminaBeadChips杂交，处理，然后按照制造商的说明书(Illumina)使用BeadStation阵列读数器读数。将使用共同探针组的所有细胞系的相对荧光单位(RFU)值进行分位数归一化。

上述基因表达分析的数据可见于West等人，2008，RegenerativeMedicine第3卷(3)pp.287-308的补充表中，将其(包括所有补充表)通过引用整体并入本文。在补充表II-IV中，按(对于整个组的细胞系的基因观察到的最高RFU值-平均RFU值)/AveRFU值的比率的等级次序(最高至最低)显示基因。在补充表V中，针对(对于单个细胞系的基因观察到的最高RFU值)/所有细胞系的AveRFU值的比率对前45个差异表达的基因按等级次序(最高至最低)排列。在补充表VI中，分别按(对于整个组的细胞系中的基因观察到的最高RFU值)/AveRFU值和(对于整个组的细胞系中的基因观察到的最低RFU值)/AveRFU值的比率的等级次序((最高至最低)以及(最低至最高))显示对应于被识别的CD抗原的基因。在补充表VII中，按(对于整个组的细胞系中的基因观察到的最高RFU值)/AveRFU值的比率的等级次序(最高至最低)显示对应于分泌的蛋白质的基因。

用于诱导软骨细胞分化的示例性条件

注意，使用本文中描述祖细胞系的诱导软骨发生(或软骨产生)的任何方便方法可用于(体内或体外)研究或治疗目，这样，预期在这方面不存在限制。因此下文中描述的测定法代表了用于软骨发生的条件的示例性非限定性实例。

微团分化方案1

下列分化方案简称为“d14MM”(例如，在本文中描述的微阵列表中)。

1.将细胞培养在明胶(0.1％)包覆的Corning组织培养物处理的细胞培养皿(cultureware)中，用PBS(Gibco，不含Ca、Mg)以1∶3稀释的.25％胰蛋白酶/EDTA(Gibco)分离细胞。在分离和加入生长培养基后，使用库尔特计数器计数细胞，将进行实验所需的适当数量的细胞(例如，10×10⁶或更多个)以20×10⁶个细胞/ml的细胞密度重悬浮于生长培养基中。

2.将10ul等分以堆积物(mound)或“微团”形式接种在Corning组织培养物处理的聚苯乙烯板或培养皿上。接种25个或更多个微团等分(200,000个细胞/10ul等分)。

3.将接种的微团在37℃以及5％O₂和10％CO₂下在湿润的培养箱中放置90分钟至2小时，以进行附着。

4.加入生长培养基，第二天早上在抽吸和用PBS(不含Ca、Mg)洗涤后，用完全软骨形成培养基(按照下文中对于颗粒微团所描述的方式制备)替换所述生长培养基。例如加入6ml完全软骨形成培养基/10cm培养皿。将细胞在37℃以及5％O₂、10％CO₂下维持在湿润的培养箱中，每2-3天用新鲜配制的培养基更换软骨形成培养基。

5.在于软骨形成培养基中进行不同的时期后，按Qiagen手册中所述的方式使用QiagenRNeasy试剂盒(Qiagen目录号74104)提取RNA。在RNA提取之前，通过在用RLT缓冲液(其由RNeasy小试剂盒提供)裂解微团后使用Qiagen’sQiaShredder(Cat.#79654)匀浆化样品来使RNA收率最大化。

对Lonza软骨形成培养基的替代选择是来自MediaTech的CellGro(目录号15-013-CV)。向每一个500ml中加入下列补充剂：5.0ml青霉素/链霉素(Gibco目录号15140)、5.0mlGlutamax(Gibco目录号35050)、地塞米松(Sigma，St.Louis，MO，Cat.No.D1756-100)-500ul0.1mM(终浓度0.1uM)；L-脯氨酸(Sigma目录号D49752)-500ul0.35M(终浓度0.35mM)；抗坏血酸-2-磷酸盐(Sigma，目录号49792，Fluka)-500ul0.17M(终浓度0.17mM)；ITSPremix(BD，FranklinLakes，NJ，无菌目录号47743-628)-500ul1000×浓缩物(终浓度6.25ug/ml胰岛素、6.25ug/ml转铁蛋白、6.25ng/ml硒酸、血清白蛋白1.25mg/ml、5.35ug/ml亚油酸)。

在加入上述成分后，通过500mlCorning0.2微米过滤器单元过滤培养基。

微团分化方案2

下列分化方案在本文中描述的微阵列表中简称为“d14MM”。

作为对上述LonzaTGFβ3的替代选择，我们使用TGFβ3(R&D系统，MinneapolisMN，目录号243-B3-010)。其制备、等分以及贮存和使用与购自Lonza的系统类的方式相似。

微团分化方案3

下列分化方案在本文中描述的微阵列表中简称为“d14CS”。

作为对微团方案1的另外的选择，可将细胞直接涂板在完全软骨形成培养基中而非在含有血清的培养基存在的情况下使微团附着。所述分化的微团在本发明中命名为“软骨-接种的(Chondro-seeded)”或“CS”。

颗粒分化方案

下列分化方案在本文中描述的微阵列表中简称为“d14Pel”。

1.将细胞培养在明胶(0.1％)包覆的Corning组织培养物的处理细胞培养皿(cultureware)中，然后用PBS(不含Ca、Mg)以1∶3稀释的.25％的胰蛋白酶/EDTA(Invitrogen，Carlsbad，CA，Gibco)分离。在分离和加入生长培养基后，使用库尔特计数器计数细胞，将实验所需的适当数量的细胞(例如，10×10⁶或更多个)转移至无菌聚丙烯管中，然后在室温下以150g离心5分钟。

2.吸出上清液并弃去。通过加入已向其中加入了补充剂(Lonza，Basel，Switzerland，PoieticsSingle-Quots，Cat.#PT-4121)的不完全软骨形成培养基(由hMSCChondroBullet试剂盒(PT-3925)组成)来洗涤细胞。为制备完全软骨形成培养基而添加的补充剂是：地塞米松(PT-4130G)、抗坏血酸盐(PT-4131G)、ITS+补充剂(4113G)、丙酮酸盐(4114G)、脯氨酸(4115G)、庆大霉素(4505G)、谷氨酰胺(PT-4140G)。

3.在室温下以150g离心细胞，吸出上清液，以1.0ml不完全软骨形成培养基/7.5×105个细胞重悬浮(再一次)细胞颗粒，以150×g离心5分钟。吸出上清液并弃去。然后对由Lonza描述的软骨发生培养方案进行某些改变(如下文中描写的)。

4.将细胞颗粒重悬浮于完全软骨发生培养基至5.0×105个/ml的浓度。完全软骨形成培养基由Lonza不完全培养基+TGFb3(Lonza，PT-4124)组成。通过加入含1mg/mlBSA的无菌4mMHCl至20ug/ml的浓度而重建无菌冷冻的TGFb3，在等分后将其于-80℃下贮存。在即将使用前通过对每份2ml的不完全软骨形成培养基加入1ulTGFb3来制备完全软骨形成培养基(终TGFb3浓度为10ng/ml)。

5.将0.5ml(2.5×10⁵个细胞)细胞悬浮液的等分置于无菌15ml聚丙烯培养管中。在室温下以150×g离心细胞5分钟。

6.离心后，拧松管盖半圈以允许气体交换。将管在37℃、10％CO₂和5％O₂的潮湿气氛下置于培养箱中。使颗粒静置24小时。

7.通过每2-3天完全更换每个管中的培养基(通过用无菌1-200ul移液管尖头吸出旧培养基，然后向每个管中加入0.5ml新配制的完全软骨形成培养基)来给细胞颗粒给料。

8.在更换培养基和确保颗粒自由漂浮后，拧松盖子，将管放回培养箱。

9.在于软骨形成培养基中进行不同的时间点后收获颗粒，通过用中性缓冲福尔马林固定将其制备用于组织学，和/或将颗粒组合，并制备用于利用RNeasy小试剂盒(Qiagen，Germantown，MD，目录号74104)提取RNA。

按照Qiagen手册所描述的方式进行RNA提取的方案。通过在RNA提取之前，在用RLT缓冲液(RNeasy小试剂盒中提供的)裂解细胞颗粒后，利用Qiagen’sQiaShredder(Cat.#79654)匀浆化样品来使RNA收率最大化。

藻酸盐珠粒分化方案

下列分化方案在本文中描述的微阵列表中简称为“d14藻酸盐”。

通过低速离心使本发明的细胞形成颗粒，用NaCl(155mM)洗涤，再离心，然后将颗粒以20×10⁶重悬浮于1.2％藻酸盐(Lonza)中。将细胞悬浮液抽入1ml注射器中，通过22g针逐滴分配至CaCl₂浴液(102mM)中。胶凝化立即发生。用NaCl(155mM)洗涤珠泣3-5次，在浸入软骨形成培养基后，然后用软骨形成培养基(不含TGF)再洗涤一次。将珠粒置于6孔板的多个孔中，一周给料3天，进行14天。随后用NaCl洗涤珠粒多次，然后通过暴露于柠檬酸钠(55mM)20分钟进行解聚。离心后，用RLT(Qiagen)裂解细胞颗粒，在使用QiaShredder的破碎步骤(shreddingstep)后利用Rneasy微试剂盒(Qiagen)提取总RNA以提高收率。如上所述利用qPCR测定COL2A1表达。

软骨细胞分化的基因表达标志

可利用本文中描述的微阵列分析或利用qPCR测定软骨细胞基因表达。可利用本领域内已知的方法选择qPCR引物序列，其非限定性实例可以是：

COMP	f2	CCGACAGCAACGTGGTCTT
			COMP	r2	CAGGTTGGCCCAGATGATG
CRTL1	f1	TGCTCAGATTGCAAAAGTGG
			CRTL1	r1	TATCTGGGAAACCCACGAAG
CILP	f1	CCTGGTCCTGGAAGTCACAT
			CILP	r1	CCATGTTGTCCACTCACCAG
CEP68	f1	ATCCGTAGAGAG CACG GAGA
			CEP68	r1	GGACTCTCCATGGGACAAGA
COL2A1	f3	GGCAATAGCAGGTTCACGTACA
			COL2A1	r3	CGATAACAGTCTTGCCCCACTT
COL2A1	f4	TGGCCTGAGACAGCATGA
			COL2A1	r4	AGTGTTGGGAGCCAGATTG
CEP68	f1	ATCCGTAGAGAGCACG GAGA
			CEP68	r1	GGACTCTCCATGGGACAAGA
SOX9	f1	TACGACTACACCGACCACCA
			SOX9	r1	TCAAGGTCGAGTGAGCTGTG
SCXA	f1	TCCAGCTACATCTCGCACCT
			SCXA	r1	CGGTCCTTGCTCAACTTTCT
BARX2	f1	GGACTTGGCTCAGTCTCTGG
			BARX2	r1	TGGGGATGGAGTTCTTCTTG

GAPDH	f2	GGCCTCCAAGGAGTAAGACC
			GAPDH	r2	AGGGGTCTACATGGCAACTG
RPS10	f1	ATTTG GTCGTGGACGTGGT
			RPS10	r1	TTTGGCTGTAAGTTTATTCAATGC
GUSB	f1	AAACGATTGCAGGGTTTCAC
			GUSB	r1	CTCTCGTCGGTGACTGTTCA

用于软骨发生的其它引物组：

COL2A1	f1	TCTACCCCAATCCAGCAAAC
			COL2A1	r1	GTTGGGAGCCAGATTGTCAT
COL2A1	f2	CACACTGGTAAGTGGGGCAAGACCG
			COL2A1	r2	ACGAGGTCCTCACTGGTGAA
ACAN	f1	TGAGTCCTCAAGCCTCCTGT
			ACAN	r1	TGGTCTGCAGCAGTTGATTC
ACAN	f2	ACAGCTGGGGACATTAGTGG
			ACAN	r2	GTGGAATGCAGAGGTGGTTT
COL10A1	f1	GCTAAGGGTGAAAGGGGTTC
			COL10A1	r1	CTCCAGGATCACCTTTTGGA
BGN	f1	GGACTCTGTCACACCCACCT
			BGN	r1	AGCTCGGAGATGTCGTTGTT
COL9A2	f1	AGCATCATTCGGCTGTTACC
			COL9A2	r1	CTGAGGGGTGGAACTGTAGC
CDMP1	f1	CCCATCAGCATCCTCTTCAT
			CDMP1	r1	TGTAGATGCTCCTGCCACAG
VERSICAN	f1	ACCACGCTTCCTATGTGACC
			VERSICAN	r1	TGTTGTAACTGGGTGGCAAA
COL11A1	f1	TCGAGGGTTTGATGGACTTC
			COL11A1	r1	CATCTTCTCCCCTCATTCCA
DCN	f1	TGGCAACAAAATCAGCAGAG
			DCN	r1	GCCATTGTCAACAGCAGAGA
FMOD	f1	CCTCCAAGGCAATAGGATCA

FMOD	r1	GCTGCGCTTGATCTCGTTC
			LUM	f1	TGATCTGCAGTGGCTCATTC
LUM	r1	AAAAGAGCCCAGCTTTGTGA

COL1A1	f1	GTGCTAAAGGTGCCAATGGT
			COL1A1	r1	ACCAGGTTCACCGCTGTTAC
COL1A1	f2	GTGCTAAAGGTGCCAATGGT
			COL1A1	r2	CTCCTCGCTTTCCTTCCTCT
PRELP	f1	TCCCAATCTTGCCTTCATTC
			PRELP	r1	GTCATGGAACGCCACTAGGT
ACAN	f3	TCGAGGACAGCGAGGCC
			ACAN	r3	TCGAGGGTGTAGCGTGTAGAGA
COL10A1	f2	CAAGGCACCATCTCCAGGAA
			COL10A1	r2	AAAGGGTATTTGTGGCAGCATATT
CRTL1	f2	TTCCACAAGCACAAACTTTACACAT
			CRTL1	r2	GTGAAACTGAGTTTTGTATAACCTCTCAGT
LUM	f2	ACCAGATTGACCATATTGATGA
			LUM	r2	GGACAGATCCAGCTCAACC
SOX9	f2	AGGCAAGCAAAGGAGATGAA
			SOX9	r2	TGGTGTTCTGAGAGGCACAG
SOX9	f3	ACTGAGTCATTTGCAGTGTTTTCTGCC
			SOX9	r3	GTGGGCTGATCCCCTCCAGGT
SOX5	f1	TGGCACTGCACTGGGTAGGA
			SOX5	r1	AAGGCTGGGAGCCCGTCACT
AGC1/ACAN	f4	TGAGTCCTCAAGCCTCCTGT
			AGC1/ACAN	r4	CCTCTGTCTCCTTGCAGGTC
IHH	f1	GGCCGGGAGACCGTGTGTTG
			IHH	r1	TGGGGCTCGCGGTCCAGTAA
IHH	f2	TACGCCTGGAGAGTGGGGCG
			IHH	r2	TGGGGCTCGCGGTCCAGTAA
COL2A1	f5	TCGTGGGTCCCAGGGGTGAA
			COL2A1	r5	GACCTGGAGGGCCCTGTGCG
COL2A1	f6	TGCTGCCCCATCTGCCCAAC
			COL2A1	r6	CCTGCAGGTCCCTGAGGCCC
COL2A1	f7	AGGGCCAGGATGTCCGGCAA
			COL2A1	r7	TCTGCCACGAGGTCCAGGGG

CRTAC1(CEP-68)	f2	CGGGGCGATGGCACCTTTGT
			CRTAC1(CEP-68)	r2	GATAGAGGCGGTGGGGGCCA
COMP	f1	ACAATGACGGAGTCCCTGAC
			COMP	r1	TCTGCATCAAAGTCGTCCTG
BARX2	f2	GAGTCAGAGACGGAACAGCC
			BARX2	r2	AGTCCCAGAGACTGAGCCAA
CHM1(LECT1)	f1	GCGCAAGTGAAGGCTCGTAT
			CHM1(LECT1)	r1	GTTTGGAGGAGATGCTCTGTTTG

qPCR方案可改变并且在本领域是公知的。以非限定性实例为例，在标准光学96孔反应板(AppliedBiosystemsCarlsbad，CA，PN4306737)中制备用于测试的样品，所述样品由30ng的cDNA的RNA等同物、0.4uM/引物、超纯蒸馏水(Invitrogen)组成，用12.5ul包含AmpliTaqGoldDNA聚合酶的PowerSYBRGreenPCRMasterMix(AppliedBiosystemsCarlsbad，CA，Cat#4367659)将其以1∶1稀释于25ul的总反应体积中。利用SDSv1.2软件，使用AppliedBiosystems7500实时PCR系统运行实时qPCR。扩增条件设置为在50℃下进行2分钟(阶段1)，在95℃下进行10分钟(阶段2)，在95℃下进行15秒然后在60℃进行1分钟的40个循环(阶段3)，离解阶段为在95℃下进行15秒在60℃下进行1分钟以及在95℃下进行15秒(阶段4)。针对3个管家基因(GAPD、RPS10和GUSB)的平均Ct值归一化目的基因的扩增产物的Ct值。

番红O染色测定

用番红O染色福尔马林固定的、石蜡包埋的组织切片的公知技术通常用于检测软骨相关蛋白聚糖，然而，所述测定对于软骨不是绝对特异的，因为其还染色粘蛋白、肥大细胞颗粒以及可能还染色其它细胞类型中的其它物质。其中软骨和粘蛋白将被染成橙色至红色，并且细胞核将被染成黑色以及背景染成绿色的方案的非限定性实例使用福尔马林固定的细胞的微团、颗粒(pellet)或相似聚集体。所使用的试剂包括Weigert’s铁苏木精溶液：其中原液A由1克苏木精在100ml的95％酒精中的溶液组成；原液B由在95ml蒸馏水中稀释的4ml29％的氯化铁水溶液和1.0ml浓盐酸组成；Weigert’s铁苏术精工作溶液由等份的原液A和B组成并且在4周内使用；0.001％固绿(FCF)溶液由0.01克的1000ml蒸馏水中的固绿，FCF，C.I.42053组成；1％醋酸溶液由1.0ml的冰醋酸在99ml蒸馏水中的溶液组成；以及0.1％番红O溶液由0.1克的番红O，C.I.50240，在100ml蒸馏水中的溶液组成。使样品脱蜡，用蒸馏水水化。用Weigert’s铁苏木精工作溶液将它们染色10分钟，随后在流动自来水中洗涤10分钟，用固绿(FCF)溶液染色5分钟，用1％醋酸溶液快速漂洗不超过10-15秒，在0.1％番红O溶液中染色5分钟，使用95％乙醇、无水乙醇和二甲苯进行脱水和清洁，每种使用2次变化，每次2分钟，使用树脂介质封片，然后照相，如上所述分析染色。软骨相关蛋白聚糖染成暗红-橙色。

低通量筛选和qPCR

在1、2、3、4、5或优选10个或更多个不同分化条件中同时筛选本发明的克隆、寡克隆或混合克隆或混合寡克隆胚胎祖细胞系，所述胚胎祖细胞系处于少于21次或优选超过21次倍增的克隆或寡克隆扩增阶段，最优选处于29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69或70次倍增的克隆扩增阶断(因为在29次倍增的克隆扩增阶段之前，只能获得数量有限的细胞，并且在超过70次倍增后，细胞通常接近衰老)。分化条件可包括上文中描述为“微团分化”、“颗粒分化”和“藻酸盐珠粒分化”的分化条件。

测定的读出可以是软骨细胞分化的mRNA标志，包括但不限于上文中描述为“软骨细胞分化的基因表达标志”的那些mRNA标志，并且可通过与排成阵列的靶序列(包括但不限于微阵列)杂交或通过qPCR来测量。检测也可在肽或蛋白质的水平上，所述肽或蛋白质可通过使用特异性抗体，通过使用酶测定法、质谱法或本领域内公知的其它类似方法来检测。

克隆或寡克隆胚胎祖细胞的命运空间(FateSpace)的中等通量筛选

在10、20、30、40、50或优选100个或更多个不同分化条件(参见，例如，2006年11月21日提交的标题为“MethodstoAcceleratetheIsolationofNovelCellStrainsfromPluripotentStemCellsandCellsObtainedThereby”的第11/604,047号美国专利申请；和2009年7月16日提交的标题为“MethodstoAcceleratetheIsolationofNovelCellStrainsfromPluripotentStemCellsandCellsObtainedThereby”的第12/504,630美国专利申请(将所述每一个专利申请通过引用并入本文)中描述的分化条件)中同时筛选本发明的克隆、寡克隆或混合克隆或混合寡克隆胚胎祖细胞系，所述胚胎祖细胞系处于少于21次或优选超过21次倍增的克隆或寡克隆扩增阶段，最优选处于29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69或70次倍增的克隆扩增阶断(因为在29次倍增的克隆扩增阶段之前，只能获得数量有限的细胞，并且在超过70次倍增后，细胞通常接近衰老)。将细胞在所述分化条件下培养1-6周，最优选4周。

测定的读出可以是分化的mRNA标志，例如上文中描述为“软骨细胞分化的基因表达标志”的那些mRNA标志，并且可通过与排成阵列的靶序列(包括但不限于微阵列)杂交或通过PCR来测量。检测也可在肽或蛋白质的水平上，所述肽或蛋白质可通过使用特异性抗体，通过使用酶测定法、质谱法或本领域内公知的其它类似方法来检测。

hEP细胞分化的中等通量qPCR筛选

将本发明的克隆、寡克隆或混合克隆或混合寡克隆胚胎祖细胞系(包括但不限于上文中描述的处于少于21次或优选超过21次倍增的克隆或寡克隆扩增阶段，最优选处于29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69或70次倍增的克隆扩增阶断的所述细胞系)涂板在12孔培养板中，每孔具有10个250,000个细胞的微团(即250万个细胞/孔)。可选择地，利用其它培养条件(例如，2006年11月21日提交的标题为“MethodstoAcceleratetheIsolationofNovelCellStrainsfromPluripotentStemCellsandCellsObtainedThereby”的第11/604,047号美国专利申请；和2009年7月16日提交的标题为“MethodstoAcceleratetheIsolationofNovelCellStrainsfromPluripotentStemCellsandCellsObtainedThereby”的第12/504,630号美国专利申请(将所述每一个专利申请并入本文)中描述的培养条件；参见表II，使用相同数量的细胞，暴露于表III所列的培养基与这些申请的表IV所列的补充因子的任何组合)处理细胞。将细胞在所述分化条件中培养1-6周，最优选4周。

按照制造商的说明书，使用RNeasy小试剂盒(Qiagen)从细胞裂解物制备RNA。简而言之，在PBS中漂洗细胞培养物(微团)，随后裂解于最小体积的RLN裂解缓冲液中。在于冰上温育后，通过离心除去细胞碎片，将裂解物与RLT缓冲液混合，然后向混合物中加入乙醇。随后将组合的混合物加载至RNeasy旋转柱上，然后离心。随后洗涤已加载的柱子，用最小体积的DEPC-处理的水(通常30ul或更少)将纯化的RNA从柱子释放出来。利用260nm处的吸光度测定终洗脱物中RNA的浓度。

使用SuperScriptFirstStrandcDNA试剂盒(InVitrogen；Carlsbad，CA)进行cDNA合成。简而言之，在无规六聚物存在的情况下使2.5ug纯化的RNA加热变性。冷却后，使用试剂盒的SuperSript逆转录酶和相关试剂完成第一链反应。按照制造商的说明书，使用QIAquickPCRPurification试剂盒(Qiagen)进一步纯化所得的产物。简而言之，将PB缓冲液加入第一链cDNA反应产物，随后将混合物加载至QIAquick旋转柱并离心。用PE缓冲液洗涤柱子，使用最小体积的水(20ul)从柱子洗脱纯化的cDNA。

合成用于各靶基因的qPCR引物对。简而言之，用于靶基因的引物对经设计只扩增靶mRNA序列，并且最优地具有在65-80℃的范围内的针对它们的靶序列的退火温度和大小在100-500bp范围内的唯一扩增产物。将引物对以工作浓度(10uM)提供给BioTrove，Inc.(Woburn，MA)以产生定制的qPCROpenArray板。OpenArray板经设计可容纳56-336个引物对并且将最终制备的具有干燥的下游引物对的板提供给服务提供商。使用OpenArray自动装载设备(BioTrove)将纯化的cDNA反应产物(2.)和Syber绿色主混合物加入OpenArray板的单个孔中。将板密封，进行qPCR，将其加入NTImager/Cycler设备(BioTrove)以进行扩增。使用OpenArray应用软件计算每一个样品的Ct值。

应用

用于动物细胞和组织的培养的公开的方法在哺乳动物和人细胞治疗中产生细胞或其后代是有用的，例如但不限于产生用于在治疗矫形外科状态(包括但不限关节炎例如骨关节炎、椎间组织的退变、颞下颌关节病、鼻、外耳、下颌关节、气管、环状软骨(crichoid)、胸骨或其它滑膜关节(例如肩、肘、腕、佛和承重关节例如髋、膝和足趾的滑膜关节)的软骨组织的创伤或手术修复)中是有用的人细胞和细胞来源的制剂。

在本发明的某些实施方案中，将通过本发明的方法产生的源自单细胞的和源自寡克隆细胞的细胞用于与细胞生物相关的障碍的研究和治疗、基于细胞的药物发现和用于细胞疗法。使用本发明的方法产生的源自单细胞的细胞群体可容易地接收指向分化途径下游的必需信号。

在本发明的某些实施方案中，将源自单细胞的和源自寡克隆细胞的细胞引入它们通常存在的组织中从而展现治疗效用。在本发明的某些实施方案中，将通过本发明的方法产生的源自单细胞的和源自寡克隆细胞的细胞用于诱导其它多能干细胞的分化。能够在体外增殖同时维持基因表达的胚胎模式的源自单细胞的细胞群体的产生在诱导其它多能干细胞的分化中是有用的。细胞-细胞诱导是在早期胚胎中指导分化的常见方式。许多潜在医学上有用的细胞类型在正常胚胎发育过程中受诱导信号影响，包括脊髓神经元、心脏细胞胰腺β细胞和定型造血细胞(definitivehematopoieticcell)。可在多种体外、离体或体内培养条件下培养能够在体外增殖同时维持基因表达的胚胎模式的源自单细胞的细胞群体以诱导其它多能干细胞分化变成期望的细胞或组织类型。可以以将诱导细胞与靶细胞并置的多种方法进行诱导。以非限定性实例为例，可将诱导细胞涂板在组织培养物中，用丝裂霉素C或辐射处理以阻止细胞进一步复制。随后将靶细胞涂板在有丝分裂失活的诱导细胞的上面。可选择地，可将源自单细胞的诱导细胞培养在来自更大的细胞培养物或来自原始源自单细胞的集落的可抽取的膜上，并且可将靶细胞涂板在诱导细胞的上面或可将靶细胞覆盖的分离膜并置以直接接触的方式层叠两个细胞层。可将所得的双层细胞在体外培养、移植至SPF鸟蛋中或在允许于三维结构中生长同时获得血管支持的条件下培养(参见，例如，2005年7月28日公布的第WO2005068610号国际专利公布，将其公开内容通过引用并入本文)。诱导细胞也可来自多能干细胞的来源，包括hES或hED细胞，其中已引入自杀构建体以便随意除去诱导细胞。在源自单细胞的和源自寡克隆细胞的诱导中有用的细胞类型可包括本领域公知的在正常胚胎发育中天然发生的诱导的情况。在本发明的某些实施方案中，通过本发明的方法产生的源自单细胞的细胞和源自寡克隆细胞的细胞用作“饲养细胞”以支持其它细胞类型(包括多能干细胞)的生长。使用本发明的源自单细胞的细胞和源自寡克隆细胞的细胞作为饲养细胞降低了将来自源自其它哺乳动物来源的饲养细胞的病原体传递给靶细胞的潜在风险。可以例如通过γ射线辐照或通过用丝裂霉素C处理来使饲养细胞失活以限制复制，然后与多能干细胞共培养。

在本发明的某些实施方案中，可将通过本发明的方法产生的源自单细胞的和源自寡克隆细胞的细胞的细胞外基质(ECM)用于支持较低分化的细胞(参见Stojkovic等人，StemCells(2005)23(3)：306-14)。可在基质上以无饲养细胞培养方式支持通常需要饲养层的某些细胞类型(Rosler等人，DevDyn.(2004)229(2)：259-74)。可通过预培养和裂解形成基质的细胞系(参见WO99/20741)例如STO小鼠成纤维细胞系(ATCC登录号CRL-1503)或人胎盘成纤维细胞来沉积基质。

在本发明的某些实施方案中，可收集、混合、过滤源自单细胞的和源自寡克隆细胞的细胞培养物的条件化培养基，将其作为条件化培养基贮存。可将该条件化培养基制剂化，并用于研究和治疗。此类条件化培养基可有助于维持较少的分化状态并且允许细胞例如多能干细胞增殖。在本发明的某些实施方案中，可将通过本发明的方法产生的源自单细胞的和源自寡克隆细胞的细胞培养物的条件化培养基用于诱导其它细胞类型(包括多能干细胞)的分化。源自单细胞的和源自寡克隆细胞的细胞培养物的条件化培养基的使用在降低使培养的细胞暴露于来源于其它哺乳动物来源的非人动物病原体(即无异种基因)的潜在风险中是有利的。

在本发明的另一个实施方案中，可按照本发明的方法，通过克服细胞周期的抑制的因子的受调节的表达(例如SV40病毒大T抗原(Tag)的受调节的表达，或受调节的E1a和/或E1b，或乳头瘤病毒E6和/或E7或CDK4)诱导在任何已知的细胞培养条件下不能良好增殖的细胞类型增殖，以便可克隆性地或寡克隆性地分离它们(参见，例如，2006年11月21日提交的标题为“MethodstoAcceleratetheIsolationofNovelCellStrainsfromPluripotentStemCellsandCellsObtainedThereby”的第11/604,047号美国专利申请，其通过引用并入本文)。

在本发明的另一个实施方案中，可将克服细胞周期停滞的因子与另外的蛋白质或蛋白质结构域融合并且将其递送至细胞。例如，可将克服细胞周期停滞的因子与蛋白质转导结构域(PTD)连接。共价或非共价地连接至克服细胞周期停滞的因子的蛋白质转导结构域允许所述因子易位穿过细胞膜，因此所述蛋白质可最终到达细胞的细胞核区室(nuclearcompartments)。可与克服细胞周期停滞的因子融合的PTD包括HIV反式激活(TAT)(Tat47-57)蛋白的PTD(Schwarze和Dowdy2000TrendsPharmacol.Sci.21：45-48；Krosl等人.2003NatureMedicine(9)：1428-1432)。对于HIVTAT蛋白，赋予膜转位活性的氨基酸序列对应于残基47-57(Ho等人，2001，CancerResearch61：473-477；Vives等人，1997，J.Biol.Chem.272：16010-16017)。这些残基单独可赋予蛋白质易位活性。

在本发明的另一个实施方案中，可通过连接子将PTD与细胞周期停滞因子缀合。连接子的确切长度和序列以及其相对于连接的序列的取向可变化。连接子可包含例如2、10、20、30或更多个氨基酸，并且可基于期望的性质例如溶解性、长度、空间分离(stericseparation)等来进行选择。在具体的实施方案中，连接子可包含对于例如融合蛋白的纯化、检测或修饰是有用的功能序列。

在本发明的另一个实施方案中，可通过新型重编程技术，如2005年8月3日提交的第60/705,625号美国申请、2005年10月20日提交的第60/729,173号美国申请；2006年7月5日提交的第60/818,813号美国申请(将所述申请的公开内容通过引用并入本文)中描述的技术，将本发明的源自单细胞的或源自寡克隆细胞的细胞重编程为未分化的状态。简而言之，可使用至少两个，优选三个步骤过程使细胞重编程为未分化的状态，所述三步骤过程包括第一核重塑步骤、第二细胞重建步骤和最后第三步骤，在所述第三步骤中从重编程的程度以及核型的正常性和质量方面对所得的通过步骤2产生的细胞的集落进行表征。在某些实施方案中，可在重编程过程的第一核重塑步骤中，通过将分化细胞的核被膜和染色质重塑为与未分化细胞或生殖细胞的分子组成更密切相似，来使本发明的源自单细胞的或源自寡克隆细胞的细胞重编程。在重编程过程的第二细胞重建步骤中，接着将包含步骤1的重塑核被膜的细胞核与包含必要的有丝分裂器的细胞质突融合，所述细胞质突与转移的细胞核一起能够产生一群能够增殖的未分化的干细胞例如ES或ED-样细胞。在重程过程的第三步骤中，从重编程的程度以及核型的正常性方面表征由通过步骤2产生的一个或多个细胞产生的细胞的集落，选择具有高质量的集落。虽然该第三步骤不是成功重编程细胞所必需的和在某些应用中不是必需的，但当将重编程的细胞用于某些应用例如人移植时包括第三质量控制步骤是优选的。最后，具有正常核型但重编程的程度不足的重编程的细胞的集落可通过重复步骤1和2或步骤1至3来进行再循环。

在本发明的另一个实施方案中，可使用噬菌体展示技术(参见，2005年5月27日提交的第60/685,758号美国申请和2006年5月26日提交的PCTUS2006/020552(将所述申请的公开内容通过引用并入本文))将源自单细胞的和源自寡克隆细胞的细胞用于产生配体。

基因表达水平的测量可用本领域的任何已知方法来进行，包括但不限于微阵列基因表达分析、珠粒阵列基因表达分析和Northern分析。基因表达水平可表示为针对ADPRT(登录号NM_001618.2)、GAPD(登录号NM_002046.2)或本领域已知的其它管家基因归一化的相对表达。基因表达数据也可用中值法的中位值来进行归一化。在该方法中，每一个阵列产生不同的总强度。使用中位值是比较实验中的细胞系(阵列)的强有力方法。例如，找出每一个细胞系的中位值，随后这些中位值的中位值成为用于归一化的值。相对于其它细胞系的每一个细胞系产生来自各细胞系的信号。

在本发明的另一个实施方案中，本发明的源自单细胞的或源自寡克隆细胞的细胞可表达独特模式的CD抗原基因表达，所述抗原是细胞表面抗原。细胞表面上的CD抗原的差异表达可用作工具，例如用于根据哪些CD抗原被细胞表达来使用商购可得的抗体分选细胞。本发明的某些细胞的CD抗原的表达谱示于West等人，2008，RegenerativeMedicine第3卷(3)pp.287-308(其(包括补充信息)通过引用并入本文)中。例如，存在在ES细胞中表达但在本发明的相对更加分化的细胞系中不表达(或在某些情况下，以降低的水平表达)的CD抗原。这可以是非常有用的用于选择、分选、纯化和/或表征ES细胞的工具。由于CD抗原在细胞表面上表达并且针对它们的抗体通常来说是商购可得的，因此抗体(或它们的特异性结合)可用于将ES细胞或本发明的细胞的纯群体从细胞的异质混合物纯化出来。这在用于生长ES细胞或本发明的细胞或者制备此类用于不同商业目的细胞的不同策略中是有用的。

在本发明的另一个实施方案中，可将通过本发明的方法产生的源自单细胞的和源自寡克隆细胞的细胞注射入小鼠以产生针对分化抗原的抗体。针对分化抗原的抗体可用于识别细胞以证明用于细胞疗法的群体的纯度，用于细胞分化研究，以及用于证明移植后细胞的存在和命运。通常，用于产生抗体的技术在本领域是公知的。

可对由本发明的方法产生的细胞进行遗传修饰以产生大量BMP3b或BMP家族的其它成员，该细胞从而可用于在骨骼损耗疾病中诱导骨。在本发明的命名为4D20.8的具有下颌骨间充质的标志的细胞系的情况下，因子例如BMP3b或BMP家族的其它成员的过表达在治疗骨坏死或骨折例如下颌骨的骨坏死或骨折中是有用的。

在本发明的另一个实施方案中，能够进行软骨发生的源自单细胞的和源自寡克隆细胞的细胞通常可从非人动物物种产生并且用于治疗兽医疾病。

在本发明的另一个实施方案中，能够进行软骨发生的源自单细胞的和源自寡克隆细胞的细胞可在实验上用于进行关于软骨细胞分化(包括在人或非人体内导致不同软骨类型的转录调控网络)的研究。

组合

应理解，也可在单个实施方案中组合地提供本发明的某些特征，所述特征，为清楚起见，描述于分开的实施方案的上下文中。相反地，还可分开地或以任何适当的亚组合(sub-combination)方式提供本发明的不同特征，所述特征，为简便起见，描述于单个实施方案的上下文。关于本发明的胚胎软骨祖细胞的基因表达模式的实施方案的所有组合明确地包括在本发明中并且公开于本文中，就如同各个和每一个组合被个别地且明确地公开一样。因此，本文中提供了展示描述的标志的胚胎软骨细胞祖细胞。

系统和试剂盒

本发明还提供了经设计用于本文中描述的各种应用的系统和试剂盒。

例如，根据本发明的方面的系统和试剂盒(在下文中统称为“试剂盒”)包括一个或多个本发明的胚胎软骨祖细胞系。试剂盒还可包括用于增殖和使用用于研究和/或治疗性应用的细胞的试剂和材料，以及使用说明书。试剂盒还可包含本文中所使用的诱导细胞分化为软骨细胞的试剂，例如上文中命名的方案：微团分化方案1、微团分化方案2、微团分化方案3、颗粒分化方案和藻酸盐珠粒分化方案中描述的材料。

在某些实施方案中，试剂盒经设计用于软骨产生并且包括本文中描述的一个或多个胚胎软骨细胞祖细胞系和用于增殖细胞和/或诱导软骨发生的一种或多种另外的组分。此类试剂盒中提供的胚胎软骨细胞祖细胞系展示本发明的胚胎祖细胞系的基因表达标志，例如细胞系：SM30、E15、4D20.8、7SMOO32、MEL2、SK11和7PEND24的基因表达标志。用于增殖和/或软骨细胞分化的组分可包括本文中描述的用于此类目的的任何组分，包括基质或支架(或用于产生基质/支架，例如用于产生水凝胶的试剂)、保湿剂(hydratingagent)(例如，生理上相容的盐水溶液、制备型细胞培养基)、细胞培养衬底(例如，培养皿、平板、小瓶等)、细胞培养基(无论是液体还是粉末形式的)、抗生素化合物、激素、添加剂等。

在某些实施方案中，试剂盒还可包括经设计有利于将细胞群体递送至例如至实验动物或至有此需要的患者例如需要软骨修复/替换治疗的患者的组分。在此类较后的实施方案中，可以以适合于治疗用途的形式(例如，以无菌/医药级成分提供的)提供试剂盒的组分。递送组分可包括经设计用于封装或固定细胞群体(例如，支架或基质)以及用于直接地或与其它成分(例如，支架或基质)结合地递送细胞(包括将分离的细胞注射入缺损位置，用适当的支架或基质温育和/或培养胚胎祖细胞以及植入、用生物可吸收的支架温育等)的成分。可使用任何方便的支架或基质，例如上文中详细描述的生物可吸收的、生物相容性支架，其中许多已被用于治疗性软骨修复/替换，或在治疗性软骨修复/替换中的用途方面正在接受测试。

在某些实施方案中，试剂盒包括用于确定递送的/移植的细胞群体定位至至少一个期望的位置例如软骨损伤的位置的组分。此类组分可允许递送至受试者的细胞的定位的确定和甚至定量。

在某些实施方案中，对试剂盒中的胚胎软骨细胞祖细胞系进行遗传修饰。例如，可对胚胎软骨细胞祖细胞系工程改造以表达外源基因，例如可用于随后识别源自所述细胞系的细胞的标志基因(例如，本领域内公知的报告基因)。报告基因包括可直接或间接检测的报告基因，例如，荧光蛋白、发光蛋白、酶、细胞表面标志等。在某些实施方案中，将不同细胞系进行工程改造以表达可与彼此可区别的外源报告基因，例如，具有不同激发和/或发射特征的荧光蛋白。

在某些实施方案中，试剂盒可包括其期望的用途所必需的任何或所有组分。例如根据本发明的试剂盒可包括许多其它适当的制品或组分例如人工关节、导管、缝线、解剖刀、针头、注射器、用于手术位置的准备的抗菌药、矫形外科装置等。

本发明的方面还提供了其它类型的试剂盒。

例如，提供了用于识别和/或分离根据本发明的软骨细胞祖细胞的试剂盒。此类试剂盒可包括经设计用于检测细胞标志(包括本文中描述的任何基因表达标志)的表达的试剂。可将此类检测试剂制剂化为在蛋白质或核酸(例如，mRNA)水平上检测此类基因的表达产物。这样，试剂可包括：抗体或其特异性结合部分(例如，可检测地标记的抗体)、其它特异性蛋白质结合试剂(例如，配体或可溶性受体)、用于杂交分析例如northern印迹分析、微阵列分析等的核酸探针；用于PCR测定，例如上述定量PCR测定的引物对等。

如上文中所指出的，本发明的试剂盒通常还包括使用试剂盒的组分实施本发明的方法(例如制备用于进行根据本发明的方法的方面的突变方法的核酸样品)的说明书。用于实施本发明的方法的说明书通常记录在适当的记录介质上。例如，可将说明书打印在基片例如纸或塑料等上。这样，说明书可以以包装说明书的形式存在于试剂盒中，存在于试剂盒的容器或其组分等(即，与包装或分包装结合)的标签中。在其它实施方案中，说明书以存在于适当的计算机可读存储媒介例如CD-ROM、软盘等上的电子存储数据文件的形式提供。在其它实施方案中，实际说明书不存在于试剂盒中，但提供用于例如通过互联网从远程来源获得说明书的方法。本实施方案的实例是包括其中可察看说明书和/或可从其下载说明书的网址。与说明书一样，用于获得说明书的该方法记录在适当的基片上。

除了上述组分外，试剂盒还可包括一种或多种对照样品和试剂，例如，两种或更多种对照样品。此类对照样品可采取任何形式，例如具有已知的标志谱的另外的细胞系、用于分析基因表达数据的阴性和阳性对照样品等。任何方便的对照样品可用于本发明的试剂盒。

生物保藏

本申请中描述的细胞系已在布达佩斯协议下保藏在美国典型培养物保藏中心(“ATCC”；P.O.Box1549，Manassas，VA20108，USA)。细胞系4D20.8(也称为ACTC84)于2009年7月23日以第11代保藏在ATCC，并且具有ATCC登录号PTA-10230。细胞系SM30(也称为ACTC256)于2009年7月23日以第12代保藏在ATCC，并且具有ATCC登录号PTA-10232。细胞系7SMOO32(也称为ACTC278)于2009年7月23日以第12代保藏在ATCC，并且具有ATCC登录号PTA-10231。细胞系E15(也称为ACTC98)于2009年9月15日以第20代保藏在ATCC，并且具有ATCC登录号PTA-10341。细胞系MEL2(也称为ACTC268)于2010年7月1日以第22代保藏在ATCC，并且具有ATCC登录号PTA-11150。细胞系SK11(也称为ACTC250)于2010年7月1日以第13代保藏在ATCC，并且具有ATCC登录号PTA-11152。细胞系7PEND24(也称为ACTC283)于2010年7月1日以第11代保藏在ATCC，并且具有ATCC登录号PTA-11149。

提供下列实施例为本领域技术人员提供如何产生和使用本发明的完整公开内容和说明，并且无意限制本发明者视为它们的发明的范围，它们也无意表示下面的实验是全部实验或所实施的唯一实验。已努力确保关于使用的数字(例如量、温度等)的准确性，但应当解释一些实验误差和偏差。除非另外指出，否则部分是按重量计的部分，分子量是重均分子量，温度以摄氏度数表示，压力是大气压或接近大气压。

实施例1.在软骨形成分化条件的低通量筛选中进行的克隆人胚胎祖细胞系的微阵列分析

如上文中对于“微团分化方案1”所描述的，筛选细胞系10RPE8、4D20.8、4D20.9、4SKEL20、7PEND12、7PEND24、7PEND30、7PEND9、7SKEL4、7SKEL7、7SMOO25、7SMOO32、7SMOO7、7SMOO9、B16、C4.4、C4ELS5.1、C4ELS5.6、C4ELSR10、C4ELSR2、CMO2、E109、E111、E120、E15、E164、E33、E44、E68、E69、E85、EN1、EN13、EN16、EN18、EN2、EN22、EN23、EN26、EN27、EN31、EN4、EN42、EN47、EN5、EN51、EN55、EN7、EN8、F15、J16、MEL2、MEL2、MW1、RAD20.16、RAD20.19、RAD20.4、RAD20.5、RAD20.6、RAPEND10、RAPEND15、RAPEND18、RASKEL8、RASMO12、RASMO19、SK11、SK17、SK18、SK25、SK31、SK35、SK43、SK44、SK46、SK47、SK49、SK50、SK52、SM17、SM2、SM22、SM28、SM28、SM30、SM33、SM8、T14、T20、T36、T42、T43、T44、T7、U31、W10、W11、W8、Z1、Z11、Z2和Z3，亚组也区分为“沉淀分化”和“藻酸盐珠粒分化”。简而言之，筛选可包括对照细胞类型，包括：人骨髓间充质干细胞第3代(Lonza)、脂肪干细胞(ASC)、牙髓干细胞(DPSC)、包皮真皮成纤维细胞(XgeneFB)和正常人关节软骨细胞(NHAC)。在具有5％环境氧的培养箱中，使待筛选的细胞以及上述对照细胞类型在生长停止或微团和颗粒软骨形成条件下同步化，如本文中以及2006年11月21日提交的标题为“MethodstoAcceleratetheIsolationofNovelCellStrainsfromPluripotentStemCellsandCellsObtainedThereby”的第11/604,047号美国专利申请；和2009年7月16日提交的标题为“MethodstoAcceleratetheIsolationofNovelCellStrainsfromPluripotentStemCellsandCellsObtainedThereby”的第12/504,630号美国专利申请(将所述各文献和申请通过引用并入本文)中描述的。例如，对于诱导静止的同步化的条件，将细胞系7PEND24(ACTC283)培养在具有通常由制造商推荐的浓度的补充剂并且作为完整的试剂盒(Cat#C-22022)销售的Promocell内皮MV2培养基中直至细胞达到汇合。在达到汇合时，除去培养基并且将其替换为相同的但具有10％的原始补充剂混合物的Promocell培养基。3天后，吸出培养基，用相同培养基(即10％的常用补充剂)更换，进行另外两天(即，总共5天的静止条件)。在细胞系4D20.8(ACTC84)的情况下，将细胞培养在补充有20％FCS的DMEM培养基中直至细胞达到汇合。在达到汇合时，除去培养基，用相同的但含有10％的原始浓度(即2％FCS)的DMEM培养基替换。3天后，吸出培养基，用相同的培养基(即具有2％FCS的DMEM)更换，进行另外2天(即总共5天的静止条件)或在软骨形成条件(如沉淀或微团)中进行分化，进行1、2或14天。按本文中所描述的方式收获RNA，利用qPCR进行测定，将其与Illumina微阵列杂交以进行本文中描述的基因表达分析。骨髓间充质干细胞对沉淀和微团软骨形成条件起反应，软骨细胞基因表达被显著上调。软骨细胞分化标志的实例包括MGP和PENK(所述标志虽然不特异于软骨，但在软骨发生中被上调)，以及相对特异于发育软骨的COL2A1、MATN4、EPYC、COL9A2和LECT1。细胞系4D20.8的未分化细胞相对微团条件中的14天的细胞的基因表达的比较显示了＞479倍的MGP表达的上调、＞10倍的MATN4表达的上调、＞369倍的PENK表达的上调、＞60倍的COL2A1表达的上调、＞42倍的EPYC表达的上调、＞25倍的COL9A2表达的上调、＞24倍的LECT1表达的上调，以及类似地，对于MSC，分化显示5倍的MGP表达的上调(虽然与4D20.8不同，未分化的MSC表达相对高的基线水平的表达)、20倍的MATN4表达的上调、6倍的PENK表达的上调(再次地，相对于未分化的4D20.8中的无表达在未分化的MSC中的相对高的水平)、613倍的COL2A1表达的上调、48倍的EPYC表达的上调、117倍的COL9A2表达的上调、34倍的LECT1表达的上调。相反地，真皮成纤维细胞显示37倍的MGP表达的上调、369倍的PENK，但在实验处理之前或之后无COL2A1、EPYC、LECT1或COL9A2的表达。因此，与真皮成纤维细胞不同，4D20.8表达众多种软骨特异性基因(与MS相似但不完全相同)。在被评估的24,526个基因中，265个基因在MSC分化过程中显示增加的表达，191个在D20.8分化过程中增加，只有47个基因是共同的。因此，细胞系4D20.8代表与MSC不同的细胞系，其在上腭和下颌骨具有位点特异性LHX8同源框基因表达并且无HOX或PITX1表达，与未MSC不同，MSC显示LHX8表达但相反在下肢显示HOX基因表达例如HOXA10、HOXB7、HOXC8和HOXD13表达，和PITX1表达的特征。细胞系7PEND24也以显示低水平的软骨形成诱导。

通过微阵列测定的14天的软骨形成条件之前和之后的细胞系以及MSC和正常人关节软骨细胞(NHAC)对照中的COL2A1的诱导水平示于图2的标题为“COL2A1”的图中。如也可在图2中看到的，LECT1(软骨的共同成分)的基因在细胞系中也被诱导，然而在细胞系中差异表达。CRTAC1，最初被表征为永久性软骨(与肥大软骨细胞相反)的标志的基因，确实在NHAC中表达，但不在MSC中表达，但其在本发明的细胞系中以不同程度表达。在肥大软骨细胞中表达的标志IHH不在NHAC中表达，在MSC中表达，但不在本发明的细胞中表达，这与它们不同于MSC并且潜在地为稳定的软骨的祖细胞一致。CD74，最初被表征为MSC的标志但非成纤维细胞的标志的基因，在脂肪干细胞(ASC)、MSC中表达，但不在NHAC或本发明的细胞系中表达。最后，LHX8，下颌骨间充质的标志，不在NHACS、ACS中表达，但在牙髓干细胞(DPSC)中表达，与它们起源于下颌骨神经嵴一致并且在细胞系4D20.8中表达。

在14天的微团后和在如所描述的这些细胞系沉淀软骨形成条件的亚组中，细胞系7PEND24、4D20.8、7SMOO32、MEL2、SK11、SM30和E15在分化诱导时表达显著升高的COL2A1表达，4D20.8、7SMOO32、MEL2、E15和SM30与正常人关节软骨细胞相比较表达更高的相对水平的转录物。令人惊讶地，细胞系SM30表达＞1,000COL2A1转录物。第3代骨髓间充质干细胞表达极少的(如果有的话)转录物，虽然观察到这随所使用的细胞的批次和代数而变化极大，这在本领域是公知的。在ASC、DPSC或XgeneFB中未观察到COL2A1表达。细胞系表达标志的不同标志组合例如TBX5和HAND2(中胚层和神经嵴的标志)，从而在建立不同类型的软骨发生模型中和临床基于细胞的疗法中是有用的。此外，它们展示不同的位点特异性同源框基因，所述基因产生体内软骨的位点特异性独特机械性能。以非限定性实例为例，细胞系4D20.8强劲地表达标志基因LHX8(口周间充质的标志)，以便产生继发腭，重建下颌骨或神经嵴下颌骨间充质的其它衍生物，包括但不限于：腭裂、牙周病的修复，通过贡献能够形成牙齿的神经嵴成分、下颌骨区域的真皮、下颌骨区域的周围神经或黑素细胞的细胞重建牙蕾，或者修复牙龈萎缩。

实施例2

如对于hMSC先前已证明的，可在内侧半月板切除术或外侧半月板切除术或ACL切除术后，测定施用外源细胞的绵羊的关节软骨和半月板的损伤和修复(Ghosh，等人，Clin.Orthop.，第252卷，第101-113页，1990；Little，等人，J.Rheumatol.，第11卷，第2199-2209页，1997；将两篇文献都通过引用整体并入本文)。通过出生前移植源自hES的细胞获得绵羊对源自hES的细胞的耐受性。将升高剂量的源自hES-iPS的胚胎祖细胞例如7PEND24、7SMOO32、SM30、E15、4D20.8以及hMSC和HA对照与一种或多种药物载体(包括人造血浆溶液、透明质酸、硫酸软骨素、壳多糖、壳聚糖或其它支架/基质(例如脱细胞的半月板))一起注射入产生耐受性的绵羊的受损关节。随时间测量响应于升高的剂量的损伤的修复速度。针对排斥、畸胎瘤形成和与人成体MSC和媒介物对照相比较的功效在组织学上评估移植的细胞。

实施例3测定随着传代延续胚胎软骨祖细胞的稳定性

虽然我们不能使成体骨髓MSC传代＞30次倍增，但我们培养本发明的命名为4D20.8的细胞系超过33代。我们比较第12和33代细胞诱导软骨的能力，其通过COL2A1表达测定的以及通过本文中描述的qPCR测定。处于延长代的细胞产生可比较水平的COL2A1，与在平行实验中MSC的情况不同。从第12代的工作细胞库放大细胞进行另外21代或更多代的能力(其中每一代是1.5次倍增)对应于为工作细胞库的细胞数的约52次倍增或2⁵⁰倍。所述细胞从而在它们被商业放大用于许多患者的同种异体移植的潜力上是独特的。

实施例4.筛选识别选择的本发明的软骨形成细胞系上的CD抗原的抗体

以中等通量方式针对CD抗原的抗体库测定本发明的软骨形成细胞系，并且阳性细胞％示于下面(表2)，显示了2006年11月21日提交的标题为“MethodstoAcceleratetheIsolationofNovelCellStrainsfromPluripotentStemCellsandCellsObtainedThereby”的第11/604,047美国专利申请；和2009年7月16日提交的标题为“MethodstoAcceleratetheIsolationofNovelCellStrainsfromPluripotentStemCellsandCellsObtainedThereby”的第12/504,630美国专利申请(将各专利申请通过引用并入本文)中描述的预测的抗原的一般效用。然而，也可识别例外。具体地，针对抗原CD56的抗体(NCAM1)结合细胞系4D20.8中的80％的细胞同时其结合少量其它测试的细胞系。这与微阵列数据中相对高水平的NCAM1(Illumina探针ID4040725)一致。针对CD56的抗体从而在具有本文中描述的细胞系4D20.8的基因表达标志的细胞的亲和纯化中是有用的。

表2

阳性细胞％(扣除了同种型对照)

实施例5.NNAT阳性软骨形成祖细胞系的发现

通过在补充有20％血清的DMEM培养基中连续传代来扩增第17代的细胞系E15(也称为ACTC98)，所述培养基是与最初在其中克隆性扩增所述细胞系的培养基相同的培养基(参见补充表I，West等人，2008，RegenerativeMedicine第3卷(3)pp.287-308，其通过引用并入本文)。在第14和17代，通过在细胞已达到汇合时除去培养基并且将所述培养基替换成补充有1/10的血清(2％)的新鲜DMEM来使细胞同步化进入静止期。3天后，吸出培养基，替换为补充有2％FCS的DMEM，进行另外2天。将相同代的细胞按本文所述的方式以微团和颗粒条件涂板以诱导软骨发生。在14天的微团培养后，利用qPCR测定在相同培养条件下培养的细胞系E15和正常人关节软骨细胞(NHAC)对照的表达特异性标志(参见下文中的实施例6)。观察到E15比NHAC对照多表达＞10,000个COL2A1mRNA。固定第14天的微团，按如下所述的方式用番红O染色。样品的软骨蛋白聚糖被强烈染色。为了进一步表征细胞，按本文中所描述的方式，将RNA与Illumina微阵列杂交。

实施例6.通过qPCR进行的软骨形成祖细胞评分的低通量筛选

将本发明的命名为10RPE8、4D20.8、4D20.9、4SKEL20、7PEND12、7PEND24、7PEND30、7PEND9、7SKEL4、7SKEL7、7SMOO25、7SMOO32、7SMOO7、7SMOO9、B16、C4.4、C4ELS5.1、C4ELS5.6、C4ELSR10、C4ELSR2、CMO2、E109、E111、E120、E15、E164、E33、E44、E68、E69、E85、EN1、EN13、EN16、EN18、EN2、EN22、EN23、EN26、EN27、EN31、EN4、EN42、EN47、EN5、EN51、EN55、EN7、EN8、F15、J16、MEL2、MEL2、MW1、RAD20.16、RAD20.19、RAD20.4、RAD20.5、RAD20.6、RAPEND10、RAPEND15、RAPEND18、RASKEL8、RASMO12、RASMO19、SK11、SK17、SK18、SK25、SK31、SK35、SK43、SK44、SK46、SK47、SK49、SK50、SK52、SM17、SM2、SM22、SM28、SM28、SM30、SM33、SM8、T14、T20、T36、T42、T43、T44、T7、U31、W10、W11、W8、Z1、Z11、Z2和Z3的细胞系自它们从hES-来源的细胞分离后体外扩增＞21次倍增的克隆扩增，通过将所述细胞生长至汇合并且将培养基替换成补充有1/10血清或本文中描述的其他有丝分裂原的培养基来使它们同步化在静止期。从这些细胞提取RNA作为对照。在能够体外软骨发生的细胞的低通量筛选中，按本文中所述的方式，将细胞在微团条件下培养以诱导软骨发生，进行14天。将来自这两种条件的每一种的RNA转化成cDNA，随后检查通常与软骨发生相关的基因(即COL2A1、COMP、CILP、SCX、CRTL1、SOX9、BARX2)的表达。基因特异性引物对探针获自Invitrogen。在标准光学96孔反应板(AppliedBiosystemsCarlsbad，CA，PN4306737)中制备用于测试的样品，其由30ng的cDNA的RNA等同物、0.4uM/引物、超纯蒸馏水(Invitrogen)组成，用12.5ul的包含AmpliTaqGoldDNA聚合酶的PowerSYBRGreenPCRMasterMix(AppliedBiosystemsCarlsbad，CA，Cat#4367659)将其以1∶1稀释于25ul的总反应体积中。利用SDSv1.2软件，使用AppliedBiosystems7500原位PCR系统运行原位qPCR。扩增条件设置为在50℃下进行2分钟(阶段1)，在95℃下进行10分钟(阶段2)，40个循环：在95℃下进行15秒然后在60℃进行1分钟(阶段3)，离解阶段为在95℃下进行15秒，在60℃下进行1分钟，以及在95℃下进行15秒(阶段4)。针对3个管家基因(GAPD、RPS10和GUSB)的平均Ct值归一化目的基因的扩增产物的Ct值，并且相对于早期代的膝-正常人关节软骨细胞(Lonza)和培养的人骨髓间充质干细胞的基因表达进行基因表达分析。

用于检测软骨形成基因的引物组是上述引物组：以与培养的早期代的正常人关节软骨细胞相比较的倍数表达的方式表示的被筛选的细胞系的Col2A1表达示于图1中。早期代的正常人关节软骨细胞(NHAC)在值上设为1.0。定量为与NHAC相比的倍数诱导的COL2A1的表达水平在大部分细胞系中未显著升高，但在一小亚组的细胞系，即，7SMOO32技术重复2(154×NHAC表达)、7SMOO32生物重复2(137×NHAC表达)、4D20.8生物重复2(130×NHAC表达)、SM30(1287×NHAC表达)、SM30生物重复2(13,494×NHAC表达)、SM30技术重复2(1168×NHAC表达)、E15(10,809×NHAC表达)、E15技术重复2(9810×NHAC表达)、MEL2(22×NHAC表达)和SK11(4×NHAC表达)中令人惊讶地升高。

令人惊讶地，COL2A1的诱导与通常使用的软骨形成间充质的标志例如SOX9之间几乎不存在任何相关性。类似地，推测为软骨形成间充质细胞的标志的标志例如AQP1以在微团软骨形成条件下不诱导COL2A1的包皮真皮成纤维细胞的RFU值存在，并且在分化之前和之后不存在于本发明的细胞系中。例如，在分化之前，在18-21次倍增的克隆扩增时，AQP1的表达不存在于(为本底的RFU135)细胞系SM30中，不存在于(RFU为126)SK11中以及不存在于(RFU139)细胞系E15中(参见West等人，2008，RegenerativeMedicine第3卷(3)pp.287-308，补充表II)。本发明的未分化细胞系中SOX9的表达水平都不是预测本发明的细胞系是否能够软骨发生的预测值。实际上，在分化前在未分化的细胞系中未发现与这些细胞系成为软骨细胞的潜力相关足以预测这样的结果的基因。SK11、7SMOO32、4D20.8、MEL2、SM30和E15的组内的基因表达标志的多样性(包括位点特异性同源框基因表达)表明各细胞系代表软骨祖细胞的独特且可区分的类型。还令人惊讶的是通常用作体外软骨发生的标志的许多基因例如COMP和CILP在培养条件下在实际上任何细胞类型包括培养的真皮成纤维细胞中以非特异性方式被诱导，而与所述真皮成纤维细胞例如是否能够在COL2A1的表达证实的并显示软骨形成的组织学证据的相同的条件下进行真实的软骨发生无关。此外，细胞系SK11、7SMOO32、4D20.8、MEL2、SM30和E15在分化前和分化后在基因表达标志方面可与培养的骨髓MSC明显区别。虽然骨髓MSC通常被描述为ALCAM(CD166)阳性，但处于未分化状态的本发明的细胞系例如SK11、7SMOO32、4D20.8、MEL2、SM30和E15显示CD166表达不存在于(为本底的RFU125)细胞系SM30中，不存在于(RFU为164)SK11中(参见West等人，2008，RegenerativeMedicine第3卷(3)pp.287-308，补充表II)。当与MSC比较时本发明的细胞系的其他差异，以非限定性例子为例，是CD74的表达，CD74的表达已被证明是MSC的比许多通常使用的但实际上是非特异性的标志更准确的标志(Ishii等人，2005BBRC332：297-303)。如表3中显示的，未分化的MSC实际上表达非高水平的CD74转录物，脂肪细胞干细胞也以更低水平表达CD74，牙髓干细胞以检测限表达CD74，但在本发明的能够诱导COL2A1的未分化细胞(包括SK11、7SMOO32、4D20.8、MEL2、SM30和E15)中以及在培养的真皮成纤维细胞中或非软骨胚胎祖细胞系7SMOO7中都根本未检测到该转录物。显示细胞系的多样性和与本文中研究的成体干细胞类型的惊人差异的另外的非限定性实例是发育基因NNAT(NM_181689.1)的表达，该基因以高水平在细胞系E15中表达但不在成体干细胞例如MSC、脂肪细胞干细胞、牙髓干细胞或真皮成纤维细胞中表达。本发明的能够诱导COL2A1表达的细胞系与本领域的干细胞类型的显著差异的另一个非限定性实例可通过测量已知为MSC的标志的基因KCNK2(NM_001017425.2)的表达看出。如表3中显示的，KCNK2在MSC、脂肪细胞干细胞和牙髓干细胞中以高水平表达，但在本发明的能够诱导COL2A1表达的几个细胞系例如SM30、E15、4D20.8、MEL2和SK11中未能检测到。本发明的细胞系与源自骨髓的MSC的显著差异也在表示细胞类型的重要治疗性差异的基因中看到。当MSC在体外分化时，它们遭受经历至肥大软骨细胞的转化。肥大软骨细胞表达在诱导血管生成中有用的基因并且提供以后被成骨细胞侵入以产生骨的临时基质。因此，当被注射进关节或被移植进关节软骨时，MSC不能很好地表现出试图再生该组织以治疗关节软骨创伤、关节炎或相关用途。当以本文中的软骨形成条件诱导时，本发明的细胞系几乎不诱导IHH(肥大软骨细胞的标志)的表达，然而MSC表达极高水平的IHH转录物。类似地，细胞系4D20.8不表达可检测水平的COL10A1(肥大软骨细胞的另一个标志)，然而MSC表达极高水平的该转录物。因此，本发明的细胞系例如7SMOO32、4D20.8、SM30和E15显示这样的标志：它们在它们的分化成永久性软骨以修复关节关节软骨病状的能力上优于MSC。与培养的人骨髓MSC、脂肪细胞干细胞和成体牙髓干细胞相比较，细胞系SK11、7SMOO32、4D20.8、MEL2、SM30和E15的差异的其他非限定性实例示于表3中，或可通过将所述细胞的基因表达标志与本文中例如表3中描述的基因表达标志相比较而看出。因此，这些结果表明本筛选中识别的细胞系是新型的，通常用于识别MSC的标志不预测人胚胎祖细胞系的软骨形成能力，以及目前不存在这样的标志，所述标志可预测所述细胞系为一小亚组可在表达软骨发生的真正标志中对软骨形成刺激作出反应的细胞系。证据提供于软骨形成的组织学证据的实施例7中。

表3

人脂肪细胞干细胞(ACS)、人骨髓间充质干细胞(MSC)、人成体牙髓干细胞(DPSC)、培养的人包皮成纤维细胞(Fibro)、不能诱导COL2A1的克隆hEP细胞系(7SMOO7)和各自能够诱导COL2A1表达的人胚胎祖细胞SM30、E15、4D20.8、7SMOO32、MEL2和SK11的基因表达标志的比较。数字是RFU值。阴性表达由阴影框显示。(ND意指无数据)。

实施例7.软骨形成的组织学和免疫化学确认

将本发明的细胞系例如在上述实施例6的低通量筛选中发现的显示中等至强劲的COL2A1诱导的细胞系例如7PEND24、7SMOO32、MEL2、SM30、E15、SK11和4D20.8以及对照例如MSC、脂肪细胞干细胞和其他细胞系例如包皮真皮成纤维细胞、Z11、牙髓干细胞、7SMOO7、E44和其他细胞暴露于本文中描述的微团和颗粒软骨形成条件，进行不同的时间(包括1、8、14和21天)，所述颗粒的一个亚组，当转移进SCID小鼠的肾包膜时，促进延长的分化。将所述微团和沉淀于福尔马林中固定，并按以上所述的方式利用H&E染色、蛋白聚糖的番红O染色以及对于免疫反应性COL2A1，使用特异性抗体并且以非特异性抗体作为对照来进行组织学分析。在第14和21天的细胞系4D20.8的颗粒中观察到对番红O的强反应性和/或COL2A1免疫反应性，在第14天的细胞系E15的微团中观察到强番红O染色。令人惊讶地，细胞系RAD20.6在第14天的颗粒中显示对COL2A1的免疫反应性和番红O染色。图2显示脂肪组织干细胞与第14代的细胞系4D20.8相比较，与第6代的MSC相比较的番红O染色(全部细胞系都处于以颗粒形式进行的分化的第21天)和第14天的细胞系4D20.8和MSC的颗粒的免疫染色(以同种型为对照)的实例。

实施例8.

如下测试本发明的能够进行软骨发生的细胞系的修复关节软骨的能力：外植捐献的人关节组织。将细胞系SM30、E15和4D20.8的5×10⁵个细胞在15ml锥形管中于10％FBS/DMEM/F12中以400×g离心5分钟，然后温育过夜以产生细胞团块。利用ArthrexSingleUseOATS系统(Naples，Fl)从关节外植体钻出6mm直径的圆柱塞。使用手术刮匙(surgicalcurette)在关节表面产生尺寸约2mm的部分厚度缺损。用SM30、E15和4D20.8的细胞团块或由原代人关节软骨细胞、源自hES的软骨细胞或源自成体脂肪的干细胞(hASC)的大量培养物组成的对照填充缺损。将软骨外植体在TGFβ3存在或不存在的情况下于10％FBS/DMEM/F12中温育。4周后，固定外植体，进行石蜡包埋、切片，然后用番红O染色以进行评分。使用克隆祖细胞系SM30、E15和4D20.8的所选择的克隆细胞系的基因表达水平和基质染色比异质的hESC和ASC中的更高，并且接近在hAC中看到的水平。在软骨外植体中，修复组织与关节软骨相似并且与周围宿主组织充分整合。

实施例9

测试本发明的能够进行软骨发生的细胞系在人造基质中进行软骨发生的能力。扩增来自细胞系4D20.8和7PEND24的细胞，通过低速离心形成颗粒，用NaCl(155mM)洗涤，然后再离心，将颗粒以20×10⁶重悬浮于1.2％藻酸盐(Lonza)中。将细胞悬浮液抽入1ml注射器中，通过22g针头逐滴分配入CaCl₂浴液(102mM)中。胶凝化立即发生。用NaCl(155mM)洗涤珠粒3-5次，随后在浸入软骨形成培养基后用软骨形成培养基(不含TGF)洗涤一次。将珠粒置于6孔板的多个孔中，每周给料3天，进行14天。随后用NaCl洗涤珠粒多次，然后通过暴露于柠檬酸钠(55mM)20分钟来进行解聚。离心后，用RLT(Qiagen)裂解细胞颗粒，在使用QiaShredder的破碎步骤后使用RNeasy微试剂盒(Qiagen)提取总RNA以提高收率。按以上方式利用qPCR测定COL2A1表达。在细胞系4D20.8的情况下，COL2A1表达为正常微团条件的51倍。在细胞系7SMOO32中，使用RGD-藻酸盐进行的COL2A1表达为正常微团条件的2.88倍。在细胞系SK11的情况下，使用藻酸盐进行的COL2A1表达为正常微团条件的179倍。除了Lonza藻酸盐外，也可制备RGD-连接的藻酸盐(NovaMatrix)珠粒。在7PEND24的情况下，虽然其在微团条件下只微弱地诱导COL2A1，但在藻酸盐珠粒中，其显示为微团条件下的45倍。封装在RGD-藻酸盐复合物中的7PEND24未显示高于微团条件的增强的COL2A1表达，但确实显示了为正常人关节软骨细胞(NHAC)的17倍的COL2A1的表达。类似地，在微团条件下只微弱地形成软骨的7SMOO32在RGD-藻酸盐珠粒中强劲地表达COL2A1。

通过使用Illumina平台，RGD藻酸盐显示细胞系4D20.8中令人惊讶的449倍的COL2A1的上调。

实施例10.

为了测定在连续体外传代过程中细胞系的稳定性，将细胞系4D20.8、E15、SM30和hbmMSC连续传代，按上述方式(实施例9)定期分离未分化状以及14个微团和藻酸盐珠粒的RNA。藻酸盐珠粒中的第33代细胞系4D20.8与P12相比较显示大致相同水平的COL2A1，然而hbmMSC因衰老的原因而在相当的代上不能进行比较。

实施例11.封装在藻酸盐中的软骨形成hEP的体内皮下植入

刮取、分离、颗粒化hES细胞祖细胞系4D20.8、E15、SM30、7PEND24、MEL2和对照人骨髓和x-Gene皮肤成纤维细胞，并以20×10⁶个细胞/ml重悬浮于藻酸盐制剂(Lonza1.2％或NovaMatrix1.5％和RGD肽连接的藻酸盐)中。对于凝胶化和细胞封装，使用1ml无菌注射器，在加入注射器后将藻酸盐悬浮液通过22G针头逐滴排入CaCl₂(102mM)溶液中，或置于预先用CaCl₂浸润的塑造股骨形状的硅酮模具中，随后用102mMCaCl₂覆盖以进行完全快速胶凝化。

从模具中取出股骨形状构建体，用NaCl(155mM)洗涤，与对于藻酸盐珠粒(直径约1-2mm)一样，然后将其浸入含有地塞米松0.1uM和人重组TGFβ3(10ng/ml)的软骨细胞分化培养基中。星期一、星期三和星期五给构建体和珠粒给料。12天后，将构建体皮下植入NOD-SCID小鼠的肩膀，在第14天类似地植入珠粒。

植入后6周，切取组织，用4％多聚甲醛固定24小时，随后浸入70％酒精。

肉眼观察显示某些hEPC构建体和珠粒可容易地与获得带白色外观的皮肤下方的正常筋膜区别。4D20.8藻酸盐外植体的示例性外植体(图4A)。

为了进行组织学评估，将样品进行石蜡包埋，以约100um的间隔将其切成4um切片，将切片置于载玻片上，随后用苏木精和伊红染色。

图5显示示例性组织学图象，该图象显示细胞系4D20.8和E15的与透明软骨中的软骨细胞外观相似的软骨细胞样外观。

表4

虽然为了清楚地理解，已通过举例说明和实例稍许详细地描述了上述发明，但根据本发明的教导，对于本领域技术人员来说很显然的是，在不背离所附权利要求的精神和范围下可对本发明进行某些改变和更改。

因此，上述内容仅用于举例说明本发明的原理。应当理解，本领域技术人员能够设计不同的安排，所述安排，尽管未在本文中明确地描述或显示，但体现了本发明的原理并且包括在其精神和范围内。此外，本文中引用的所有实例和条件语言主要旨在帮助读者理解本发明的原理和由本发明者提供以推进现有技术的概念，而不被解释为限定于这些明确引述的实例和条件。此外，本文中引用本发明的原理、方面和实施方案以及其具体的实施例的所有声明意欲包括其结构和功能等同物。此外，期望此类等同物包括目前已知的等同物和未来开发的等同物，即无论结构如何，进行相同功能的开发的任何元件。因而，本发明的范围无意限定于本文中显示和描述的示例性实施方案。相反，本发明的范围和精神由所附权利要求体现。

Claims

1.有效量的胚胎祖细胞系组合物在制备用于在受试者中产生软骨的药物中的应用，所述胚胎祖细胞系组合物包括：

(a)胚胎祖细胞系，所述胚胎祖细胞系衍生自已建立的hES细胞系并且选自由SM30、E15、4D20.8、7SMOO32、MEL2、SK11和7PEND24及其组合组成的组，其中所述胚胎祖细胞系对于选自由CD74、CD90、CD166、ITGA2、KCNK2及其组合组成的组中的一个或多个基因的表达呈阴性；和

(b)药学上可接受的载体，

其中，细胞系SM30于2009年7月23日保藏，具有ATCC保藏编号PTA-10232；

细胞系E15于2009年9月15日保藏，具有ATCC保藏编号PTA-10341；

细胞系4D20.8于2009年7月23日保藏，具有ATCC保藏编号PTA-10230；

细胞系7SMOO32于2009年7月23日保藏，具有ATCC保藏编号PTA-10231；

细胞系MEL2于2010年7月1日保藏，具有ATCC保藏编号PTA-11150；

细胞系SK11于2010年7月1日保藏，具有ATCC保藏编号PTA-11152；

细胞系7PEND24于2010年7月1日保藏，具有ATCC保藏编号PTA-11149。

2.权利要求1所述的应用，其中所述胚胎祖细胞系对于CD74的表达呈阴性。

3.权利要求2所述的应用，其中所述胚胎祖细胞系还对于选自由HOX基因和PITX1组成的组中的一个或多个基因的表达呈阴性。

4.权利要求1所述的应用，其中所述胚胎祖细胞系在不表达COL10A1标志的情况下产生软骨。

5.权利要求1所述的应用，其中所述受试者具有软骨损伤。

6.权利要求5所述的应用，其中所述软骨损伤是关节软骨损伤。

7.权利要求1所述的应用，其中所述药学上可接受的载体包括选自由羟乙基淀粉；透明质酸及其聚合物；硫酸软骨素；I型胶原；II型胶原；III型胶原；聚酸酐、聚原酸酯、聚乙醇酸及其共聚物；藻酸盐；琼脂糖；泊洛沙姆；纤维蛋白；壳多糖和壳聚糖及其组合组成的组的组合物。

8.权利要求1所述的应用，其中在给所述受试者施用之前在软骨细胞诱导条件下培养所述胚胎祖细胞系。

9.衍生自已建立的hES细胞系的一种克隆纯化的胚胎祖细胞系在制备产生软骨的药物中的应用，包括在软骨产生性条件下，培养克隆纯化的胚胎祖细胞系，所述克隆纯化的胚胎祖细胞系选自由SM30、E15、4D20.8、7SMOO32、MEL2、SK11和7PEND24及其组合组成的组；其中所述克隆纯化的胚胎祖细胞系对于选自由CD74、CD90、CD166、ITGA2和KCNK2组成的组中的一个或多个基因的表达呈阴性，

细胞系E15于2009年9月15日保藏，具有ATCC保藏编号PTA-10341；

细胞系4D20.8于2009年7月23日保藏，具有ATCC保藏编号PTA-10230；

细胞系7SMOO32于2009年7月23日保藏，具有ATCC保藏编号PTA-10231；

细胞系MEL2于2010年7月1日保藏，具有ATCC保藏编号PTA-11150；

细胞系SK11于2010年7月1日保藏，具有ATCC保藏编号PTA-11152；

细胞系7PEND24于2010年7月1日保藏，具有ATCC保藏编号PTA-11149。

10.权利要求9所述的应用，其中所述克隆纯化的胚胎祖细胞系对于CD74的表达呈阴性。

11.权利要求10所述的应用，其中所述克隆纯化的胚胎祖细胞系还对选自由HOX基因和PITX1组成的组中的一个或多个基因的表达呈阴性。

12.权利要求11所述的应用，其中所述克隆纯化的胚胎祖细胞系在不表达COL10A1标志的情况下产生软骨。

13.权利要求9所述的应用，其中所述软骨产生性条件选自由软骨细胞培养条件；将胚胎祖细胞系浸入合成基质或生物可吸收的固定媒介物；和将胚胎祖细胞系置于模制结构组成的组中的一个或多个条件。

14.一种试剂盒，其包括：

(a)胚胎祖细胞系，所述胚胎祖细胞系衍生自已建立的hES细胞系并且选自由SM30、E15、4D20.8、7SMOO32、MEL2、SK11和7PEND24及其组合组成的组，其中所述胚胎祖细胞系对于选自由CD74、CD90、CD166、ITGA2和KCNK2组成的组中的一个或多个基因的表达呈阴性；和

(b)用于由所述细胞系诱导软骨产生的试剂，

细胞系E15于2009年9月15日保藏，具有ATCC保藏编号PTA-10341；

细胞系4D20.8于2009年7月23日保藏，具有ATCC保藏编号PTA-10230；

细胞系7SMOO32于2009年7月23日保藏，具有ATCC保藏编号PTA-10231；

细胞系MEL2于2010年7月1日保藏，具有ATCC保藏编号PTA-11150；

细胞系SK11于2010年7月1日保藏，具有ATCC保藏编号PTA-11152；

细胞系7PEND24于2010年7月1日保藏，具有ATCC保藏编号PTA-11149。

15.权利要求14所述的试剂盒，其中所述用于诱导软骨产生的试剂包含软骨细胞培养试剂。

16.一种组合物，其包含：

软骨细胞祖细胞系，所述软骨细胞祖细胞系衍生自已建立的hES细胞系并且选自由SM30、E15、4D20.8、7SMOO32、MEL2、SK11和7PEND24及其组合组成的组，其中所述软骨细胞祖细胞系对于选自由CD74、CD90、CD166、ITGA2和KCNK2组成的组中的一个或多个基因的表达呈阴性；和

药学上可接受的载体，

细胞系E15于2009年9月15日保藏，具有ATCC保藏编号PTA-10341；

细胞系4D20.8于2009年7月23日保藏，具有ATCC保藏编号PTA-10230；

细胞系7SMOO32于2009年7月23日保藏，具有ATCC保藏编号PTA-10231；

细胞系MEL2于2010年7月1日保藏，具有ATCC保藏编号PTA-11150；

细胞系SK11于2010年7月1日保藏，具有ATCC保藏编号PTA-11152；

细胞系7PEND24于2010年7月1日保藏，具有ATCC保藏编号PTA-11149。

17.权利要求16所述的组合物，其中所述软骨细胞祖细胞系对于CD74的表达呈阴性。

18.权利要求16所述的组合物，其中所述软骨细胞祖细胞系还对选自由HOX基因和PITX1组成的组中的一个或多个基因的表达呈阴性。

19.权利要求16所述的组合物，其中所述软骨细胞祖细胞系在不表达COL10A1标志的情况下产生软骨。

20.一种软骨细胞祖细胞系，衍生自已建立的hES细胞系并且选自由SM30、E15、4D20.8、7SMOO32、MEL2、SK11和7PEND24及其组合组成的组，其中所述软骨细胞祖细胞系对于选自CD74、CD90、CD166、ITGA2和KCNK2中的一个或多个基因的表达呈阴性，

细胞系E15于2009年9月15日保藏，具有ATCC保藏编号PTA-10341；

细胞系4D20.8于2009年7月23日保藏，具有ATCC保藏编号PTA-10230；

细胞系7SMOO32于2009年7月23日保藏，具有ATCC保藏编号PTA-10231；

细胞系MEL2于2010年7月1日保藏，具有ATCC保藏编号PTA-11150；

细胞系SK11于2010年7月1日保藏，具有ATCC保藏编号PTA-11152；

细胞系7PEND24于2010年7月1日保藏，具有ATCC保藏编号PTA-11149。

21.权利要求20所述的细胞系，其中所述软骨细胞祖细胞系对于CD74的表达呈阴性。

22.权利要求20所述的细胞系，其中所述软骨细胞祖细胞系还对选自由HOX基因和PITX1组成的组中的一个或多个基因的表达呈阴性。

23.权利要求20所述的细胞系，其中所述软骨细胞祖细胞系在不表达COL10A1标志的情况下产生软骨。