KR102232283B1 - 연골세포 분화 마커 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 연골세포 분화 탐지 마커에 관한 발명으로, 더욱 상세하게는 JAM2, AQP1, ASTN2, FAM27B, 및 FLJ31855로 이루어진 군으로부터 선택된 줄기세포로부터 연골세포로의 분화 여부를 탐지하기 위한 마커 검출용 조성물에 관한 것이다.
본 발명을 통해 줄기세포의 연골세포로의 분화에 특이적으로 발현이 증가하는 유전자들을 이용하여 연골세포로의 분화 여부를 간편하고 정확하게 탐지할 수 있다.
본 발명을 통해 줄기세포의 연골세포로의 분화에 특이적으로 발현이 증가하는 유전자들을 이용하여 연골세포로의 분화 여부를 간편하고 정확하게 탐지할 수 있다.
Description
본 발명은 연골세포 분화 마커에 관한 발명으로, 더욱 상세하게는 JAM2(junctional adhesion molecule B precursor), AQP1(aquaporin 1), ASTN2(astrotactin 2), FAM27B(family with sequence similarity 27 member B), 및 FLJ31855로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질 또는 이를 암호화하는 mRNA의 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는 줄기세포로부터 연골세포로의 분화 여부를 탐지하기 위한 마커 조성물에 관한 것이다.
인간 중간엽줄기세포(human mesenchymal stem cell)는 성체줄기세포로, 배아줄기세포에 일반적으로 문제가 되는 암 (cancer)화나 윤리적인 문제에서 자유로울 뿐 아니라 지방세포, 조골세포, 연골세포, 심장세포, 근육세포 및 신경세포 등 다양한 세포로의 분화가 가능하다고 보고되고 있다. 또한, 중간엽줄기세포는 이식 시에도 면역반응을 유발시키지 않기 때문에 세포치료의 효과적인 수단으로써 각광받고 있는 줄기세포이다.
또한, 재생 의료 분야에서는, 줄기세포를 목적으로 하는 세포로 분화시키고 나서 이식을 실시하지만, 그 이식시키는 세포에 미분화 세포가 혼입되어 있는 경우에는, 여러 가지 위험을 초래할 수 있다. 아울러, 분화가 완료된 세포에 대해서도 추가적으로 분화 신호를 받는 경우 세포의 특성이 과분화되어 변해 버리는 경우가 있다. 그래서, 분화 유도 처리한 줄기세포가 어느 정도로 분화되어 있는지 판정하는 기술은 중요하다.
그러나, 세포의 분화 상태를 세포의 외관으로부터 판단하는 것은 어려우며, 그래서, 줄기세포의 분화 상태를 판정하는 방법으로서, 분화 상태의 지표가 되는 마커를 검출하는 방법이 실시되고 있다. 예를 들어, 마커로서, SOX9, COL2, ACAN 등이 알려져 있다. 그러나 기존에는 이들 마커에 대해서 분화가 완료된 시점, 즉 연골세포로의 분화가 충분히 이루어진 시점에 확인한 것으로 분화 상태를 확인한 적은 없었다. 따라서, 분화를 유도한 이후에 분화가 개시된 세포가 어느 정도로 분화가 이루어졌는지 확인하려는 목적으로 사용은 곤란하였다.
이에, 본 발명자들은 중간엽 줄기세포로부터 연골세포로의 분화 과정을 살펴볼 수 있는 마커를 개발하고자 노력한 결과, 중간엽 줄기세포로부터 연골세포로의 분화과정에 있어서 특정 유전자의 발현이 시간이 지남에 따라서 점차적으로 증가한다는 것을 확인하였고, 따라서 이러한 유전자를 연골세포로의 분화 정도를 확인하는 마커로서 사용할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 JAM2(junctional adhesion molecule B precursor), AQP1(aquaporin 1), ASTN2(astrotactin 2), FAM27B(family with sequence similarity 27 member B), 및 FLJ31855로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질 또는 이를 암호화하는 mRNA의 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는 줄기세포로부터 연골세포로의 분화 여부를 탐지하기 위한 마커 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는, 줄기세포로부터 연골세포로의 분화 검출용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 JAM2, AQP1, ASTN2, FAM27B, 및 FLJ31855로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질 또는 이를 암호화하는 mRNA의 발현수준을 확인하여 줄기세포로부터 연골세포로의 분화여부를 탐지하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 JAM2(junctional adhesion molecule B precursor), AQP1(aquaporin 1), ASTN2(astrotactin 2), FAM27B(family with sequence similarity 27 member B), 및 FLJ31855로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질 또는 이를 암호화하는 mRNA의 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는 줄기세포로부터 연골세포로의 분화 여부를 탐지하기 위한 마커 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는, 줄기세포로부터 연골세포로의 분화 검출용 키트를 제공한다.
본 발명의 또다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 JAM2, AQP1, ASTN2, FAM27B, 및 FLJ31855로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질 또는 이를 암호화하는 mRNA의 발현 수준을 확인하여 줄기세포로부터 연골세포로의 분화여부를 탐지하는 방법을 제공한다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 JAM2(junctional adhesion molecule B precursor), AQP1(aquaporin 1), ASTN2(astrotactin 2), FAM27B(family with sequence similarity 27 member B), 및 FLJ31855 (FLJ12825와 동일 유전자로 알려져 있으며, uncharacterized homo sapiens gene) 로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질 또는 이를 암호화하는 mRNA의 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는 줄기세포로부터 연골세포로의 분화 여부를 탐지하기 위한 마커 조성물을 제공한다. 바람직하게는 상기 분화는 무혈청 배지에서 수행될 수 있다.
본 발명의 “JAM2”는 ’junctional adhesion molecule 2'으로 인간 JAM2 유전자의 mRNA와 단백질의 서열정보는 GenBank database에 XM_024452124.1의 accession number로 공지되어 있다.
본 발명의 “AQP1”는 'aquaporin 1'으로, 내재성 막 단백질이며, 인간 적혈구로부터 구저적으로 및 기능적으로 특징이 규명된 첫번째 것이다. 사량체 구조를 가지며, 각 서브유닛은 그 자체의 관능성을 가진다. 인간 AQP1 유전자의 mRNA와 단백질 서열정보는 GenBank database에 NM_198098.3의 accession number로 공지되어 있다.
본 발명의 “ASTN2”는 ‘astrotactin 2’로 뇌에서 발현되고, 뉴런 이동에 기능하는 것으로 알려져 있다. 인간 ASTN2 유전자의 mRNA와 단백질 서열정보는 GenBank database에 NM_014010.4의 accession number로 공지되어 있다.
본 발명의 “FAM27B”는 'family with sequence similarity 27 member B'으로, GenBank database에 NR_027422.1의 accession number로 공지되어 있다.
본 발명의 “FLJ31855”는 FLJ12825와 동일한 유전자로 알려져 있다. GenBank database에 AK056417.1의 accession number로 공지되어 있다.
본 발명의 "무혈청배지"는 혈청이 포함되지 않은 배지를 의미한다. 본 발명에 따른 무혈청배지의 조성은 그 조성비가 제한되지 않으나, 기본배지는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)로 하며 bFGF 와 EGF를 포함하며, TGF-β1 또는 TGF-β3을 포함하는 것일 수 있다.
상기 배지에 사용되는 EGF의 농도는 0.1ng/ml~20ng/ml, 바람직하게는 1ng/ml~15ng/ml이며, 보다 바람직하게는 5ng/ml~15ng/ml이며, 가장 바람직하게는 10ng/ml이다.
또한, bFGF의 농도는 0.1ng/ml~20ng/ml, 바람직하게는 1ng/ml~15ng/ml 이며, 보다 바람직하게는 5ng/ml~15ng/ml이며, 가장 바람직하게는 10ng/ml 일 수 있다.
TGF-β1 또는 TGF-β3의 농도는 0.1ng/ml~20ng/ml, 바람직하게는 1ng/ml~15ng/ml 이며, 보다 바람직하게는 5ng/ml~15ng/ml이며, 가장 바람직하게는 10ng/ml 이다.
본 발명에서 사용된 용어, "줄기세포"는 미분화 상태에서 무한 증식능력(self-renewal capacity)과 더불어 특정한 분화유도자극에 의해 다양한 조직의 세포로 분화될 수 있는 능력(multi-differentiation potency)을 가진 세포를 말하며, 바람직하게는 중간엽줄기세포일 수 있다.
본 발명에서 용어, "중간엽줄기세포"는 미분화 상태에서 무한 증식능력(self-renewal capacity)과 더불어 특정한 분화유도자극에 의해 다양한 조직의 세포로 분화될 수 있는 능력(multi-differentiation potency)을 가진 세포를 말한다. 본 발명의 중간엽줄기세포는 분화능 및 증식능을 갖는 모든 세포일 수 있으며, 인간(human), 원숭이(monkeys), 돼지(pigs), 말(horses), 소(cows), 양(sheeps), 개(dogs), 고양이(cats), 생쥐(mice), 토끼(rabbits) 등의 모든 동물로부터 유래할 수 있으며, 바람직하게는 인간 유래이며, 더욱 바람직하게는 인간의 지방조직, 골수, 말초혈액, 또는 제대혈 등에서 분리된 것일 수 있다.
용어 "연골 세포"는 줄기세포로부터 분화 유도된 연골세포 또는 연골세포로의 분화 과정에 있는 세포를 모두 포함한다.
본 발명에서 사용된 용어, "줄기세포로부터 연골세포로의 분화 여부를 탐지하기 위한 마커"란 연골세포로 분화를 유도시키지 않은 대조군과 비교하였을 때 분화를 유도시킨 실험군에서 그 발현량이 유의하게 증가하는 유전자를 의미한다.
용어 "분화(differentiation)"는 세포가 분열 증식하여 성장하는 동안에 서로 구조나 기능이 특수화하는 현상, 즉 생물의 세포, 조직 등이 각각에게 주어진 일을 수행하기 위하여 형태나 기능이 변해가는 것을 말한다. 본 발명의 분화는 줄기세포에서 연골세포로의 분화를 의미하는 것이다.
본 발명의 마커 조성물은 상기 유전자의 단백질 발현수준을 측정하기 위한 것일 때에는, 상기 제제는 상기 유전자의 단백질에 특이적으로 결합하는 항체일 수 있다.
"항체(antibody)"는 항원성 부위에 특이적으로 결합하는 면역글로불린(immunoglobulin)을 의미한다. 항체는 상기 유전자를 발현벡터에 클로닝하여 상기 유전자에 의해 암호화되는 단백질을 수득하고, 수득한 단백질로부터 당해 기술분야의 통상적인 방법에 따라 제조할 수 있다. 항원성 부위를 포함하는 상기 유전자 단백질의 단편을 이용하여 단백질 특이적인 항체를 제조할 수도 있다. 본 발명의 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며, 다클론항체(polyclonal antibody) 또는 단일클론항체(monoclonal antibody)를 포함한다. 또한 항원-항체 결합성을 갖는 것이면 전체 항체의 일부도 본 발명의 항체에 포함되며, 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 모든 종류의 면역글로불린 항체가 포함된다. 예를 들어 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 갖는 완전한 형태의 항체 뿐 아니라 항체 분자의 기능적인 단편, 즉 항원 결합 기능을 갖는 Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등을 포함한다. 나아가 본 발명의 항체에는 CHI3L1 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 것이라면 인간화 항체, 키메릭 항체 등의 특수 항체와 재조합 항체도 포함된다.
상기 유전자 단백질에 특이적인 항체를 발현 수준을 측정하는 제제로 포함하는 본 발명의 마커 조성물은 공지된 단백질을 감지하는 방법에 필요한 제제를 추가적으로 포함할 수 있으며, 본 조성물을 이용하여 공지된 단백질을 감지하는 방법을 제한없이 사용하여 피검체에서 유전자의 단백질 수준을 측정할 수 있다.
한편, 본 발명의 진단용 조성물이 상기 유전자(mRNA)의 발현 수준을 측정하기 위한 것일 때에는, 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프로브 또는 프라이머 세트일 수 있다.
상기 유전자를 암호화하는 mRNA는 인간을 포함하는 포유류에서 유래한 것일 수 있다. 상기 유전자를 암호화는 mRNA 특이적인 프로브 또는 프라이머 세트를 포함하는 본 발명의 진단용 조성물은 공지된 RNA를 감지하는 방법에 필요한 제제를 추가로 포함할 수 있다. 본 조성물을 이용하여 공지된 RNA를 감지하는 방법을 제한없이 사용하여 상기 유전자들의 mRNA의 수준을 측정할 수 있다.
본 발명에서 상기"프라이머(primer)"는 DNA 합성의 개시점(starting point)으로 작용하는 짧은 단일가닥 올리고뉴클레오티드(single strand oligonucleotide)이다. 프라이머는 적합한 완충액(buffer)와 온도 조건에서 주형(template)인 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 결합하고, DNA 중합효소가 프라이머에 주형 DNA에 상보적인 염기를 갖는 뉴클레오사이드 트리포스페이트를 추가하여 연결함으로써 DNA가 합성된다. 프라이머는 일반적으로 15 내지 30개의 염기서열로 이루어져 있으며, 염기 구성과 길이에 따라 주형 가닥에 결합하는 온도(melting temperature, Tm)가 달라진다.
프라이머의 서열은 주형의 일부 염기 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 주형과 혼성화되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 범위 내에서의 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 따라서 본 발명에서 mRNA의 발현 수준을 측정하기 위한 프라이머는 유전자 서열에 완벽하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, DNA 합성을 통해 mRNA 또는 cDNA의 특정 구간을 증폭하여 mRNA의 양을 측정하려는 목적에 맞는 길이와 상보성을 갖는 것이면 충분하다. 상기 증폭 반응을 위한 프라이머는 증폭하고자 하는 mRNA의 특정 구간의 양쪽 끝부분의 주형(또는 센스, sense)과 반대편(안티센스, antisense)에 각각 상보적으로 결합하는 한 세트(쌍)으로 구성된다. 프라이머는 당업자라면 mRNA 또는 cDNA 염기서열을 참조하여 용이하게 디자인할 수 있다.
'프로브(probe)'는 특정 유전자의 mRNA나 cDNA(complementary DNA)에 특이적으로 결합할 수 있는 짧게는 수개 내지 길게는 수백 개의 염기(base pair) 길이의 RNA 또는 DNA 등 폴리뉴클레오티드의 단편을 의미하며, 표지(labeling)되어 있어서 결합하는 대상 mRNA나 cDNA의 존재 유무, 발현양 등을 확인할 수 있다. 본 발명의 목적을 위해서는 mRNA에 상보적인 프로브를 피검체의 시료와 혼성화 반응(hybridization)을 수행하여 mRNA의 발현양을 측정함으로써 연골세포로 분화 여부검출에 이용할 수 있다. 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당업계에 공지된 기술에 따라 적절하게 선택할 수 있다.
본 발명의 프라이머 또는 프로브는 포스포아미다이트(phosphoramidite) 고체지지체 합성법이나 기타 널리 공지 된 방법을 이용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 또한 프라이머 또는 프로브는 mRNA와의 혼성화를 방해하지 않는 범위에서 당해 기술분야에 공지된 방법에 따라 다양하게 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오티드 하나 이상의 동족체로의 치환 및 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등), 그리고 형광 또는 효소를 이용한 표지물질(labeling material)의 결합 등이 있다.
본 발명은 상기 조성물을 포함하는, 줄기세포로부터 연골세포로의 분화 검출용 키트를 제공한다.
본 발명의 키트에는 상기 유전자들의 발현 수준을 측정하기 위하여 선택적으로 유전자의 단백질을 마커로 인식하는 항체 또는 유전자의 mRNA를 마커로 인식하는 프라이머, 프로브 뿐만 아니라 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수 있다.
구체적인 양태로서 상기 진단 키트는 역전사 중합효소반응을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 진단용 키트일 수 있다. 역전사 중합효소반응 키트는 마커 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍을 포함한다. 프라이머는 각 마커 유전자의 핵산서열에 특이적인 서열을 가지는 뉴클레오타이드로서, 약 7bp 내지 50bp의 길이, 보다 바람직하게는 약 10bp 내지 30bp의 길이이다. 또한 대조군 유전자의 핵산 서열에 특이적인 프라이머를 포함할 수 있다. 그 외 역전사 중합효소반응 키트는 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNAse, RNAse 억제제 DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다.
또 다른 양태로는 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 진단 키트일 수 있다. DNA 칩 키트는 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)가 부착되어 있는 기판, 및 형광표식 프로브를 제작하기 위한 시약, 제제, 효소 등을 포함할 수 있다. 또한 기판은 대조군 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
또 다른 양태로는 ELISA를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 진단 키트일 수 있다. ELISA 키트는 마커 단백질에 대한 특이적인 항체를 포함한다. 항체는 각 마커 단백질에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 단클론 항체, 다클론 항체 또는 재조합 항체이다. 또한 ELISA 키트는 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 ELISA 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단(chromophores), 효소(항체와 컨주게이트된 형태로서) 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 효소와 발색 반응할 기질 및 결합되지 않은 단백질 등은 제거하고 결합된 단백질 마커 만을 보유할 수 있는 세척액 또는 용리액을 포함할 수 있다.
본 발명은 JAM2, AQP1, ASTN2, FAM27B, 및 FLJ31855로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질 또는 이를 암호화하는 mRNA의 발현 수준을 확인하여 줄기세포로부터 연골세포로의 분화여부를 탐지하는 방법을 제공한다.
상기 방법은 다음의 단계를 포함하는 것일 수 있다.
이하 단계에 따라 본 발명의 방법을 설명한다.
(a) 줄기세포로부터 시료를 얻는 단계;
(b) JAM2, AQP1, ASTN2, FAM27B, 및 FLJ31855로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질 또는 이를 암호화하는 mRNA의 발현수준을 측정하는 단계; 및
(c) 상기 단계 (b)의 JAM2, AQP1, ASTN2, FAM27B, 및 FLJ31855로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질 또는 이를 암호화하는 mRNA의 발현수준이 증가되었을 때, 줄기세포가 연골세포로 분화된 것으로 판정하는 단계를 포함하는 방법.
본 발명의 “시료”는 이에 제한되지는 않으나 단백질의 발현 수준 또는 이를 암호화하는 mRNA의 발현수준을 측정할 수 있는 핵산 시료 또는 단백질 시료를 의미한다.
mRNA의 발현 수준은 mRNA에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트나 프로브를 이용하여 피검체의 시료로부터 mRNA나 cDNA를 증폭하거나, 프로브와의 혼성화(hybridization) 반응을 이용하여 mRNA의 존재와 발현량을 측정할 수 있다. 상기 프라이머와 프로브는 본 발명의 조성물에서 기재한 바와 같다.
mRNA 발현 수준의 측정은 당업계에서 통상적인 발현 수준 확인 방법을 제한 없이 사용할 수 있으며, 분석 방법의 예로 역전사중합체연쇄반응(reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR), 경쟁적 RT-PCR(competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA:RNase protection assay), 노던 블랏팅(northern blotting), DNA 마이크로어레이 칩(microarray chip), RNA 염기서열분석(RNA sequencing), 나노스트링(nanostring)을 이용한 혼성화 방법, 조직 절편의 인시투 혼성화 방법(in situ hybridization) 등이 있으나, 이들에 한정되는 것은 아니다.
단백질의 발현 수준은 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 검출하거나 측정할 수 있다. 상기 항체는 본 발명의 진단용 조성물에서 기재한 바와 같다.
단백질의 발현 수준 측정 방법은 당업계에서 공지되어 있는 방법은 제한 없이 사용할 수 있으며, 그 예로 웨스턴 블랏팅(western blotting), 닷 블랏팅(dot blotting), 효소면역분석법(enzyme-linked immunosorbent assay), 방사능 면역분석법(RIA), 방사면역확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역 전기영동, 면역조직화학염색, 면역침전법(immunoprecipitation), 보체 고정 분석법, 유세포 분석법(FACS) 또는 단백질 칩(chip) 방법 등이 있으나, 이들에 한정되는 것은 아니다.
상술한 (b) 단계의 방법으로 측정한 단백질 또는 유전자(mRNA)의 발현 수준을, 동일한 방법으로 측정한 초기 줄기세포의 단백질 또는 유전자 발현수준과 비교한다. 발현 수준이 증가한 세포는 연골세포로 분화한 것으로 판정한다.
본 발명의 일 실시예에서, 본 발명자들은 줄기세포에서 연골세포로 분화되면서, 본 발명의 유전자의 3주 후 발현 수준이 초기 줄기세포와 비교하여 현저히 증가한 것을 밝힌 바 있다.
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명을 통해 줄기세포의 연골세포로의 분화에 특이적으로 발현이 증가하는 유전자들을 이용하여 연골세포로의 분화 여부를 간편하고 정확하게 탐지할 수 있다.
도 1은 RT-qPCR 결과 각각의 유전자의 Ct값에서 표준발현 유전자 (GAPDH)의 Ct값의 차이 (ΔCT mean = Ct유전자 - CtGADPH)을 배지별로 도시한 것이다. 총 3주간 1주 간격으로 즉정하였으며, 도 1a는 JAM2, 도 1b는 AQP1, 도 1c는 ASTN2, 도 1d는 FAM27B, 도 1e는 FLJ31855의 발현량을 각각 도시하고 있다. CtGADPH는 비교적 일정하므로 각 유전자 발현이 많이 될수록 Ct유전자값은 감소하므로 ΔCT mean 역시 각 유전자 발현이 많이 될수록 감소하게 된다.
도 2는 RT-qPCR 재현한 결과 각각의 유전자의 Ct값에서 표준발현 유전자 (GAPDH)의 Ct값의 차이를 배지별로 도시한 것이다. 총 3주간 1주 간격으로 즉정하였으며, 도 2a는 JAM2, 도 2b는 AQP1, 도 2c는 ASTN2, 도 2d는 FAM27B, 도 2e는 FLJ31855의 발현량을 각각 도시하고 있다.
도 3은 종래의 마커에 대해서 RT-qPCR 결과, 각각의 유전자의 Ct값에서 표준발현 유전자 (GAPDH)의 Ct값의 차이 배지별로 도시한 것이다. 총 3주간 1주 간격으로 즉정하였으며, 도 3a는 SOX9, 도 3b는 COL2, 도 3c는 ACAN의 발현량을 각각 도시하고 있다.
도 2는 RT-qPCR 재현한 결과 각각의 유전자의 Ct값에서 표준발현 유전자 (GAPDH)의 Ct값의 차이를 배지별로 도시한 것이다. 총 3주간 1주 간격으로 즉정하였으며, 도 2a는 JAM2, 도 2b는 AQP1, 도 2c는 ASTN2, 도 2d는 FAM27B, 도 2e는 FLJ31855의 발현량을 각각 도시하고 있다.
도 3은 종래의 마커에 대해서 RT-qPCR 결과, 각각의 유전자의 Ct값에서 표준발현 유전자 (GAPDH)의 Ct값의 차이 배지별로 도시한 것이다. 총 3주간 1주 간격으로 즉정하였으며, 도 3a는 SOX9, 도 3b는 COL2, 도 3c는 ACAN의 발현량을 각각 도시하고 있다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1>
줄기세포 준비
본 발명자들은 지방내 존재하는 중간엽줄기세포(mesenchymal stem cell, MSC)의 빠르고 효율적인 연구를 위해 정상인의 지방(lipoaspirate)조직에서 채취하여 일차 배양된 중간엽 줄기세포주(ThermoFisher scientific, 미국)를 구입하여 이용하였다. 중간엽 줄기세포의 일정기간 계대배양을 위하여 자사의 무혈청 줄기세포 배양배지를 이용하여 배양하였다. 배양조건은 5% 이산화탄소 배양기에 온도 37℃, 습도 95% 이상을 유지하였으며, 3일 배양후 세포들이 80% 교회하면(confluent), Accutase (1x accutase enzyme) 처리하여 계대배양(subcultivation)을 시행하였다.
<실시예 2>
연골세포로의 분화 (differentiation of chondrocyte)
배양된 세포들을 연골세포 유도배지에 세포수 2 ×105/well의 농도로 15ml tube에 분주하여 1000 rpm, 3분간 원심분리 한 후, 5% 이산화탄소, 37℃ 조건으로 연골세포 유도 배지로 2일마다 배양액을 교환하여 동일한 조건으로 3주간 배양 하였다.
본 발명에서 사용된 연골세포 유도배지는 총 4가지로 하기 표 1(연골세포 유도배지)에 기재된 바와 같다.
자사배지 | CD03 |
2 | DMEM_FBS |
3 | Irvine Scientific (#9113-PRIME-XV Chondrogenic Differentiation) |
4 | Chondro Life (LM-0022,ChondroLife Complete Chondrogenesis Medium) |
자사의 연골세포 분화 배지의 조성은 분화배지(기본배지는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)로 하며, bFGF와 EGF를 포함한다. 또한, TGF-β1 또는 TGF-β3를 포함한다.)를 3 일 간격으로 21 일간 번갈아 처리하였다.
연골세포로의 분화를 관찰하기 위하여 분화 2주 후 지질 특이 염색법인 Alcian blue(Sigma, B8438) 시행하였다. 구체적으로 세포를 10% 포르말린으로 30분간 고정시킨 후 Alcian blue용액으로 30시간 반응시켰다. 다시 증류수로 2회 세척 후 현미경상으로 연골분화정도를 관측하였다(도 1).
<실시예 3>
정량적 실시간 중합효소 연쇄반응 (Real-Time qPCR)
마이크로어레이 프로파일링에 의해 생성된 바이오마커 후보 물질을 마이크로어레이 분석을 위해 실시간의 정량적 RT-PCR(qPCR)에 의해 스크리닝하였다.
이를 완수하기 위해, 역전사 효소 및 유전자 특이 프라이머를 사용하고, 60℃에서 1 min, 50℃에서 30 min, 95℃에서 2 min, 이어서, 95℃에서 15 s, 50℃에서 30 s, 72℃에서 10 s로 15회 사이클인 열 사이클 조건을 이용함으로써 전체 RNA를 역전사시켰다. 이 단계를 수행한 후, 72℃에서 5 min인 최종의 신장 단계를 수행하고, 이어서, 4℃로 냉각시켰다.
이를 물 중에 1/40으로 희석시켰다. qPCR을 위해 2 ㎕의 cDNA를 사용하였다. 최초 변성을 위해 QuantStudio 3 고속 실시간 PCR 시스템(QunatStudio 3)(미국 캘리포니아주 포스터 시티 소재의 Applied Biosystems)에서 50℃에서 2 min 동안, 이어서, 95℃에서 10 min 동안, 이어서, 95℃에서 15 s 및 60℃에서 30 s로 40회 사이클을 수행함으로써 파워 SYBR -그린 마스터 믹스(SYBR -Green Master Mix)(미국 매사추세츠 주 월섬 시티 소재의 Thermo Fisher Scientific)를 이용하여 20 ㎕의 반응 부피로 96 웰 플레이트 중에서 qPCR을 수행하였다. 모든 qPCR은 모든 후보 mRNA에 대해 이중으로 수행하였다. 각 유전자의 용융 곡선에 따라 PCR의 특이성을 확인하고, 평균 역치 사이클(Ct: threshold cycle)을 조사하였다.
사전 증폭에 사용된 외부 프라이머 쌍에 대한 앰플리콘 길이는 약 100-130 bp이고, qPCR에 사용된 내부 프라이머 쌍에 대한 앰플리콘 길이는 약 60-80 bp였다. 프라이머 익스프레스 3.0 소프트웨어(Primer Express 3.0 software)(미국 캘리포니아주 포스터 시티 소재의 Applied Biosystems)를 이용하여 RT-qPCR 프라이머를 디자인하였다. 모든 프라이머는 코스모진텍(한국 서울시 소재의 코스모진텍)이 합성한 것이었고, 앰플리콘은 가능할 때마다 인트론에 걸쳐져 있었다.
증폭된 DNA의 양에 비례하는 형광을 530㎚에서 각 연장시기(elongation phase)의 끝에서 측정하였다. 일련의 희석된 표적 유전자들로부터 얻어진 CT(형광이 발단을 가로지르는 시점) 값의 표준 그래프를 모든 반응에 대해 구성하여 이들이 증폭되고 주형에 비례하게 기록하였다. CT 값은 방정식 2△△CT를 이용하여 주형 cDNA의 유전자 복사 수로 전환하였다. △CT는 각 시점에서 GAPDH에 표준화된 각 유전자의 전사를 위한 다량의 mRNA이다.
유전자 | 프라이머 |
JAM2 | (서열번호 1)AAT GAG ACG AAA AAG CTC AGT ATG AC |
(서열번호 2)TGT GCC CAC TGT GTT TCA AGA | |
AQP1 | (서열번호 3)GGA CCG GCA GAG CTC TAC AG |
(서열번호 4)ACG TCT TCT GGA CCC ATG CT | |
ASTN2 | (서열번호 5)ACT CCA AAT TCA ATG ATA CCC TCT TT |
(서열번호 6)CAT GCT GGG TCC GGT TGT | |
FAM27B | (서열번호 7)TGA AGC CAC ACC ACG ATA CAG |
(서열번호 8)CTG TTG CCA TCT CCC ATT CC | |
FLJ31855 | (서열번호 9)TCC ACC CCC TCC TGT GTG T |
(서열번호 10)ACG AGG AAA CAG GTT CAA GGA A | |
SOX9 | (서열번호 11)CCC CAA CAG ATC GCC TAC AG |
(서열번호 12)GAG TTC TGG TCG GTG TAG TC | |
COL2 | (서열번호 13)ACT GGA TTG ACC CCA ACC AA |
(서열번호 14)TCC ATG TTG CAG AAA ACC TTC A | |
ACAN | (서열번호 15)GCC TGC GCT CCA ATG ACT |
(서열번호 16)ATG GAA CAC GAT GCC TTT CAC |
qPCR 결과는 도 1내지 3에 도시되어 있다.
그 결과, 배지에 상관없이 시간이 지날수록 JAM2, AQP1, ASTN2, FAM27B, 및 FLJ31855는 중간엽 줄기세포로부터 연골세포로 분화됨에 따라 그 발현량이 단계별로 증가하는 것을 확인하였다. 하지만, 무혈청 연골분화배지에서는 분화시기와 비례하여 후보마커의 지속적인 증가를 확인하였으나, 혈청을 포함하는 분화배지에서는 분화를 유도하는 초기단계에서는 후보마커의 발현이 증가하지만 분화 후기단계에서는 후보마커의 발현 증가량이 소폭 감소하는 것을 확인하였다. (도 1 및 2 참조)
반면, 일반적으로 대표적인 연골 분화마커로 널리 알려진 SOX9, COL2, 및 ACAN를 이용하여 각 분화 단계별로 발형량을 확인하였다. 그 결과 중간엽 줄기세포로부터 연골분화유도를 통해 분화됨을 확인하였으나 배지 종류 및 분화유도 시기에 따라 그 발현량의 증가 또는 감소 경향이 일정하지 않았다. 따라서 대표적인 연골 분화마커로 널리 알려진 SOX9, COL2, 및 ACAN을 이용하여 분화 단계를 판별하기에는 한계를 지니고 있음을 확인하였다.(도 3 참조)
따라서, 본 발명자들은 무혈청의 연골분화배지를 이용한 연골분화 단계의 정도를 판별하기 위한 마커로 JAM2, AQP1, ASTN2, FAM27B, 및 FLJ31855를 사용할 수 있음을 검증하였다.
본 발명의 줄기세포의 연골세포로의 분화에 특이적으로 발현이 증가하는 유전자들을 이용하여 연골세포로의 분화 여부를 간편하게 탐지할 수 있어, 연골세포 분화 검출용 마커로서 유용하게 사용될 수 있다는 점에서 산업상 이용가능성이 높다.
<110> ABION Inc.
<120> Markers of differentiation potency of chondrocyte
<130> NP18-0019
<160> 16
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> JAM2 forward primer
<400> 1
aatgagacga aaaagctcag tatgac 26
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> JAM2 reverse primer
<400> 2
tgtgcccact gtgtttcaag a 21
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AQP1 forward primer
<400> 3
ggaccggcag agctctacag 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AQP1 reverse primer
<400> 4
acgtcttctg gacccatgct 20
<210> 5
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ASTN2 forward primer
<400> 5
actccaaatt caatgatacc ctcttt 26
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ASTN2 reverse primer
<400> 6
catgctgggt ccggttgt 18
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FAM27B forward primer
<400> 7
tgaagccaca ccacgataca g 21
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FAM27B reverse primer
<400> 8
ctgttgccat ctcccattcc 20
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FLJ31855 forward primer
<400> 9
tccaccccct cctgtgtgt 19
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FLJ31855 reverse primer
<400> 10
acgaggaaac aggttcaagg aa 22
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SOX9 forward primer
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ccccaacaga tcgcctacag 20
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SOX9 reverse primer
<400> 12
gagttctggt cggtgtagtc 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> COL2 forward primer
<400> 13
actggattga ccccaaccaa 20
<210> 14
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> COL2 reverse primer
<400> 14
tccatgttgc agaaaacctt ca 22
<210> 15
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 15
gcctgcgctc caatgact 18
<210> 16
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ACAN reverse primer
<400> 16
atggaacacg atgcctttca c 21
Claims (8)
- JAM2(junctional adhesion molecule B precursor) 단백질 또는 이를 암호화하는 mRNA의 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는 줄기세포로부터 연골세포로의 분화 탐지용 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 줄기세포는 조혈모 줄기세포 또는 중간엽줄기세포인 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 줄기세포는 인간 유래인 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 제제가 항체인 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 제제가 프라이머 또는 프로브인 조성물.
- 제1항의 조성물을 포함하는, 줄기세포로부터 연골세포로의 분화 검출용 키트.
- JAM2 단백질 또는 이를 암호화하는 mRNA의 발현 수준을 확인하여 줄기세포로부터 연골세포로의 분화여부를 탐지하는 방법.
- 제7항에 있어서,
(a) 줄기세포로부터 시료를 얻는 단계;
(b) JAM2 단백질 또는 이를 암호화하는 mRNA의 발현수준을 측정하는 단계; 및
(c) 상기 단계 (b)의 JAM2 단백질 또는 이를 암호화하는 mRNA의 발현수준이 증가되었을 때, 줄기세포가 연골세포로 분화된 것으로 판정하는 단계를 포함하는 방법.
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J Cell Physiol. 2018;233:2279-2291.* |
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