JP7015510B2 - 老化度を評価する方法及び老化度の評価用キット - Google Patents
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- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
(1)生体試料におけるGREM1タンパク質及び/又はGREM2タンパク質、又は、GREM1タンパク質をコードする遺伝子及び/又はGREM2タンパク質をコードする遺伝子の発現量を指標として、細胞及び/又は個体の老化度を評価する方法。
(2)前記生体試料が、被験体より採取した生体試料である、(1)に記載の方法。
(3)前記生体試料が、体液、細胞、又は組織である、(1)又は(2)に記載の方法。
(4)前記体液が、血液又は唾液である、(3)に記載の方法。
(5)前記細胞が、皮膚細胞である、(1)に記載の方法。
(6)GREM1タンパク質及び/又はGREM2タンパク質、又は、GREM1タンパク質をコードする遺伝子及び/又はGREM2タンパク質をコードする遺伝子に対して特異的親和性を有する物質を少なくとも1種含む、細胞及び/又は個体の老化度の評価用キット。
(7)前記特異的親和性を有する物質が、GREM1タンパク質をコードする遺伝子及び/又はGREM2タンパク質をコードする遺伝子に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドである、(6)に記載のキット。
(8)前記特異的親和性を有する物質が、GREM1タンパク質及び/又はGREM2タンパク質に対する抗体である、(6)に記載のキット。
(9)以下の工程を含む、抗老化物質のスクリーニング方法。
(a)被験物質を培養細胞に接触させる工程
(b)(a)の培養細胞におけるGREM1タンパク質及び/又はGREM2タンパク質、又は、GREM1タンパク質をコードする遺伝子及び/又はGREM2タンパク質をコードする遺伝子の発現量を測定する工程
(c)被験物質を接触させない同培養細胞におけるGREM1タンパク質及び/又はGREM2タンパク質、又は、GREM1タンパク質をコードする遺伝子及び/又はGREM2タンパク質をコードする遺伝子の発現量を測定する工程
(d)上記工程(b)で測定した発現量が、上記工程(c)で測定した発現量よりも減少した被験物質を抗老化物質として選択する工程
(10)前記培養細胞が、培養皮膚細胞である、(9)に記載の方法。
本発明の細胞及び/又は個体の老化度を評価する方法は、生体試料におけるGREM1タンパク質及び/又はGREM2タンパク質、又は、GREM1タンパク質をコードする遺伝子及び/又はGREM2タンパク質をコードする遺伝子の発現量を指標として用いる。
本発明に係る細胞及び/又は個体の老化度の評価用キットは、前記のGREM1及び/又はGREM2の発現量を遺伝子レベル又はタンパク質レベルで測定するための試薬を含む。当該キットを構成する試薬としては、GREM1遺伝子及び/又はGREM2遺伝子、又は、GREM1タンパク質及び/又はGREM2タンパク質に対して特異的親和性を有する物質、具体的には、GREM1遺伝子及び/又はGREM2遺伝子に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド、GREM1タンパク質及び/又はGREM2タンパク質に対する抗体を用いることができる。
GREM1及び/又はGREM2は、抗老化物質のスクリーニング方法にも使用できる。本発明のスクリーニング方法によれば、GREM1及び/又はGREM2の発現の減少を指標として、抗老化物質を正確かつ迅速にスクリーニングできる。ここで、「抗老化」には、あらゆる老化現象の改善、予防、及び進行の遅延が含まれるが、主には、皮膚の抗老化をいい、加齢等とともに増える、皮膚のシミ、しわ、たるみ、くすみ、弾力低下、乾燥などの改善、予防、進行の遅延をいう。
(a)被験物質を培養細胞に接触させる工程
(b)被験物質を接触させた培養細胞におけるGREM1タンパク質及び/又はGREM2タンパク質、又は、GREM1タンパク質をコードする遺伝子及び/又はGREM2タンパク質をコードする遺伝子の発現量を測定する工程
(c)被験物質を接触させない同培養細胞におけるGREM1タンパク質及び/又はGREM2タンパク質、又は、GREM1タンパク質をコードする遺伝子及び/又はGREM2タンパク質をコードする遺伝子の発現量を測定する工程
(d)上記工程(b)で測定した発現量が、上記工程(c)で測定した発現量よりも減少した被験物質を抗老化物質として選択する工程
ヒト皮膚線維芽細胞(NHDF)とヒト脂肪由来幹細胞(HADSC)の2種類の細胞を用いてGREM1及びGREM2遺伝子発現量の測定を行った。NHDFにおける同遺伝子発現解析には、若年群として10歳から30歳までのドナーから得られたNHDF(KURABO社製)3検体と、高齢群として60歳から80歳までのドナーから得られたNHDF(KURABO、Lonza社製)3検体の計6検体のNHDFを用いた。HADSCにおける同遺伝子発現解析には、若年群として30代のドナーから得られたHADSC(Lonza社製)3検体と、高齢群として60歳から90歳までのドナーから得られたHADSC(Lonza社製)3検体の計6検体のHADSCを用いた。
TCCTTTCAGTCCTGCTCCTTCT(配列番号5)
AGGGCAGTTGAGTGTGACCAT(配列番号6)
GREM2用のプライマーセット:
AAGGCAGAGGGAGAGGGAGA(配列番号7)
CACCAGGAACAAGGACAGGGA(配列番号8)
GAPDH用のプライマーセット:
TGCACCACCAACTGCTTAGC(配列番号9)
TCTTCTGGGTGGCAGTGATG(配列番号10)
(1)試料の調製
20代男性4名及び40代男性4名より唾液を採取した。唾液は、同時刻に、水で洗口した後、唾液採取用チューブに1mL程度を採取した。その後、14000rpm、4℃、20分間、遠心分離を行い上清を回収して試料とした。
各試料について、蒸留水にて10倍希釈液、20倍希釈液、50倍希釈液を調製した。BCA Protein Assay kit(ThermoFisher社製)を使用し、各試料のタンパク質濃度を求めた。全ての試料において、試料中の総タンパク質濃度は1.0~1.5μg/μLであった。
メタノールで処理を行ったPVDF製のウエスタンブロット用メンブレン(Millipore社製)上に、試料4μLをプロットした。その後、一般的なウエスタンブロッティングの方法で、ブロッキング、抗原抗体反応を行った。なお、抗原抗体反応には、抗GREM1ポリクローナル抗体(Acris Antibodies社製)、抗GREM2ポリクローナル抗体(GeneTex社製)を一次抗体に用いた。化学発光にて標的タンパク質を検出させ、化学発光撮影装置(Ez-Capture MG、アトー社製)で撮影を行った。
(1)試料の調製
20代男性4名及び40代男性4名より血液を採取した。血液は、手の指先を止血し、ポケットランセット(Abbott社製)を用いて100μL程度を採取し、同量のEDTA溶液(5mg/μL)と撹拌した。その後、14000rpm、4℃、20分間、遠心分離を行い上清を回収して試料とした。
各試料について、蒸留水にて10倍希釈液、20倍希釈液、50倍希釈液を調製した。BCA Protein Assay kit(ThermoFisher社製)を使用し、各試料のタンパク質濃度を求めた。全ての試料において、試料中の総タンパク質濃度は55~75μg/μLであった。
メタノールで処理を行ったPVDF製のウエスタンブロット用メンブレン(Millipore社製)上に、5μg相当量の試料をプロットした。その後、一般的なウエスタンブロッティングの方法で、ブロッキング、抗原抗体反応を行った。なお、抗原抗体反応には、抗GREM1ポリクローナル抗体(Acris Antibodies社製)、抗GREM2ポリクローナル抗体(GeneTex社製)を一次抗体に用いた。化学発光にて標的タンパク質を検出させ、化学発光撮影装置(Ez-Capture MG、アトー社製)で撮影を行った。
Claims (8)
- 体液、皮膚細胞(ただし、癌細胞を除く)、及び皮膚又は間葉系組織由来の幹細胞から選択される生体試料におけるGREM1タンパク質及び/又はGREM2タンパク質、又は、GREM1タンパク質をコードする遺伝子及び/又はGREM2タンパク質をコードする遺伝子の発現量を指標とする、皮膚細胞(ただし、癌細胞を除く)及び/又は個体の老化度を評価するための測定方法。
- 前記体液が、血液又は唾液である、請求項1に記載の方法。
- 前記間葉系組織由来の幹細胞が、脂肪組織由来幹細胞である、請求項1に記載の方法。
- GREM1タンパク質及び/又はGREM2タンパク質、又は、GREM1タンパク質をコードする遺伝子及び/又はGREM2タンパク質をコードする遺伝子に対して特異的親和性を有する物質を少なくとも1種含む、皮膚細胞及び/又は個体の老化度の評価用キット。
- 前記特異的親和性を有する物質が、GREM1タンパク質をコードする遺伝子及び/又はGREM2タンパク質をコードする遺伝子に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドである、請求項4に記載のキット。
- 前記特異的親和性を有する物質が、GREM1タンパク質及び/又はGREM2タンパク質に対する抗体である、請求項4に記載のキット。
- 以下の工程を含む、抗老化物質のスクリーニング方法。
(a)被験物質を培養皮膚細胞に接触させる工程
(b)(a)の培養皮膚細胞におけるGREM1タンパク質及び/又はGREM2タンパク質、又は、GREM1タンパク質をコードする遺伝子及び/又はGREM2タンパク質をコードする遺伝子の発現量を測定する工程
(c)被験物質を接触させない同培養皮膚細胞におけるGREM1タンパク質及び/又はGREM2タンパク質、又は、GREM1タンパク質をコードする遺伝子及び/又はGREM2タンパク質をコードする遺伝子の発現量を測定する工程
(d)上記工程(b)で測定した発現量が、上記工程(c)で測定した発現量よりも減少した被験物質を抗老化物質として選択する工程 - 前記培養皮膚細胞が、培養表皮角化細胞又は皮膚線維芽細胞である、請求項7に記載の方法。
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