JP7015510B2

JP7015510B2 - 老化度を評価する方法及び老化度の評価用キット

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Publication number: JP7015510B2
Application number: JP2017121317A
Authority: JP
Inventors: 美佳堀田; 靖伊達; 将大藤村; 貴亮山田; 悠井上; 靖司長谷川
Original assignee: Nippon Menard Cosmetic Co Ltd
Current assignee: Nippon Menard Cosmetic Co Ltd
Priority date: 2017-06-21
Filing date: 2017-06-21
Publication date: 2022-02-03
Anticipated expiration: 2037-06-21
Also published as: JP2019007759A

Description

本発明は、特定のタンパク質又はそれをコードする遺伝子の発現を指標として細胞及び／又は個体の老化度を評価する方法、ならびに老化度の評価用キットに関する。

老化により、人の身体は劇的に変化する。例えば、外見的な老化の徴候としては、シミ、しわ、たるみ、乾燥、白髪などがあげられる。また、骨、関節、筋肉は、加齢により様々な老化現象を引き起こし、筋力、持久力、平衡性、柔軟性、全身協調性といった運動機能の低下の原因となる。これまでの研究により、年老いた個体から得た細胞は若い個体由来の細胞より分裂寿命が短いことが知られており、個体の老化現象は細胞レベルで引き起こされていると考えられている（非特許文献１、非特許文献２）。近年、こうした個体や細胞の老化度を生化学的に評価できる指標（老化マーカー）の探索が進められている。このような生化学的な老化マーカーの利用方法として、個人の健康状態の評価や、培養細胞の品質評価、さらには新規老化防止剤の探索や効果の判定等への応用が考えられる。

例えば、これまでに老化度の評価方法として、血液や尿等の生体試料中のベータガラクトシダーゼ活性を指標とする方法（特許文献１）、８－ハイドロキシデオキシグアノシンを指標とする方法（特許文献２）などが報告されている。しかしながら、細胞レベルでも個体レベルでも老化度と客観的に関連づけられる指標としていまだ十分満足できるものはない。

特許第５０２１２７３号公報特許第２８５０１２８号公報

The serial cultivation of human diploid cell strains.HAYFLICK L, MOORHEAD PS.Exp Cell Res. 1961 Dec;25:585-621 J. Clinic. Invest., 114, 1299-1307, 2004

従って、本発明は、細胞レベルでも個体レベルでも老化度を客観的かつ正確に評価できる指標を用いた新たな老化度の評価方法を提供することを目的とする。

本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、ＧＲＥＭ１及び／又はＧＲＥＭ２の発現量が、若年群の検体よりも高齢群の検体のほうが有意に高く、ＧＲＥＭ１及び／又はＧＲＥＭ２の発現を指標とすれば、細胞及び／又は個体の老化度を評価できることを見出し、本発明を完成させるに至った。

すなわち、本発明は、以下の発明を包含する。
（１）生体試料におけるＧＲＥＭ１タンパク質及び／又はＧＲＥＭ２タンパク質、又は、ＧＲＥＭ１タンパク質をコードする遺伝子及び／又はＧＲＥＭ２タンパク質をコードする遺伝子の発現量を指標として、細胞及び／又は個体の老化度を評価する方法。
（２）前記生体試料が、被験体より採取した生体試料である、（１）に記載の方法。
（３）前記生体試料が、体液、細胞、又は組織である、（１）又は（２）に記載の方法。
（４）前記体液が、血液又は唾液である、（３）に記載の方法。
（５）前記細胞が、皮膚細胞である、（１）に記載の方法。
（６）ＧＲＥＭ１タンパク質及び／又はＧＲＥＭ２タンパク質、又は、ＧＲＥＭ１タンパク質をコードする遺伝子及び／又はＧＲＥＭ２タンパク質をコードする遺伝子に対して特異的親和性を有する物質を少なくとも１種含む、細胞及び/又は個体の老化度の評価用キット。
（７）前記特異的親和性を有する物質が、ＧＲＥＭ１タンパク質をコードする遺伝子及び／又はＧＲＥＭ２タンパク質をコードする遺伝子に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドである、（６）に記載のキット。
（８）前記特異的親和性を有する物質が、ＧＲＥＭ１タンパク質及び／又はＧＲＥＭ２タンパク質に対する抗体である、（６）に記載のキット。
（９）以下の工程を含む、抗老化物質のスクリーニング方法。
（ａ）被験物質を培養細胞に接触させる工程
（ｂ）（ａ）の培養細胞におけるＧＲＥＭ１タンパク質及び／又はＧＲＥＭ２タンパク質、又は、ＧＲＥＭ１タンパク質をコードする遺伝子及び／又はＧＲＥＭ２タンパク質をコードする遺伝子の発現量を測定する工程
（ｃ）被験物質を接触させない同培養細胞におけるＧＲＥＭ１タンパク質及び／又はＧＲＥＭ２タンパク質、又は、ＧＲＥＭ１タンパク質をコードする遺伝子及び／又はＧＲＥＭ２タンパク質をコードする遺伝子の発現量を測定する工程
（ｄ）上記工程（ｂ）で測定した発現量が、上記工程（ｃ）で測定した発現量よりも減少した被験物質を抗老化物質として選択する工程
（１０）前記培養細胞が、培養皮膚細胞である、（９）に記載の方法。

本発明の方法によれば、細胞及び／又は個体の老化度と相関する新規マーカーを指標とするため、細胞及び／又は個体の老化度を客観的かつ正確に評価することができる。本発明の方法は、検体として被験者から採取した血液や唾液などの体液を用いることができるため、被験者の負担もなく、迅速かつ簡便である。本発明の方法によって得られた細胞及び／又は生体の老化度の評価は、個人の健康状態の把握に役立ち、老化の改善や老化の予防を目的とした生活習慣の見直し、シミ、しわ、たるみなどの皮膚の老化に効果のある化粧品等を用いたスキンケアを行う意識を高めることができる。また、上記老化度の評価は、医療材料や美容材料として使用できる品質の高い細胞や組織の選択にも役立つ。さらに、本発明は、アンチエイジング志向の高まりから需要が伸びている抗老化のための医薬品、医薬部外品、化粧品、又は食品に用いる成分のスクリーニング手段としても有効である。

図１は、若年群と高齢群のヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）におけるＧＲＥＭ１及びＧＲＥＭ２遺伝子発現量の比較を示す（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１）。図２は、若年群と高齢群のヒト脂肪由来幹細胞（ＨＡＤＳＣ）におけるＧＲＥＭ１及びＧＲＥＭ２遺伝子発現量の比較を示す（＊＊Ｐ＜０．０１）。図３は、２０代と４０代の唾液中のＧＲＥＭ１及びＧＲＥＭ２タンパク質量の比較を示す（＊＊Ｐ＜０．０１）。図４は、２０代と４０代の血液中のＧＲＥＭ１及びＧＲＥＭ２タンパク質量の比較を示す（＊＊Ｐ＜０．０１）。

１．細胞及び／又は個体の老化度を評価する方法
本発明の細胞及び／又は個体の老化度を評価する方法は、生体試料におけるＧＲＥＭ１タンパク質及び／又はＧＲＥＭ２タンパク質、又は、ＧＲＥＭ１タンパク質をコードする遺伝子及び／又はＧＲＥＭ２タンパク質をコードする遺伝子の発現量を指標として用いる。

本発明において、「老化度の評価」とは、加齢に伴う身体的変化及び生理的変化の程度の判定をいう。加齢に伴う身体的変化及び生理的変化としては、シミ、しわ、たるみ、くすみなどの皮膚の変化、白髪、薄毛、脱毛などの毛髪の変化、筋肉量や骨量の減少、記憶力・認知機能の低下、血管の柔軟性の低下、体幹部脂肪の増加、視覚・聴覚機能の低下などが含まれるが、これらに限定はされない。

本発明において、生体試料は、ＧＲＥＭ１タンパク質及び／又はＧＲＥＭ２タンパク質、又は、ＧＲＥＭ１タンパク質をコードする遺伝子及び／又はＧＲＥＭ２タンパク質をコードする遺伝子の発現量の変動を測定及び／又は比較できる試料であれば、その種類は特に限定されるものではない。生体試料は、主として老化度の評価の対象となる被験体の生体から採取した試料であるが、培養細胞、パラフィン包埋組織等の生体由来の試料であってもよい。生体試料を採取する被験体としては、ヒトのほか、サル、チンパンジー、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ウサギ、マウス、ラット、モルモット等のヒト以外の哺乳動物であってもよい。

被験体から採取した生体試料の具体例としては、体液、非侵襲的に採取された細胞又は組織（血液細胞、皮膚細胞、脂肪細胞、筋細胞、神経細胞、骨髄細胞、線維芽細胞、毛髪、爪、毛根など）等が挙げられるが、体液が好ましい。非侵襲的に皮膚細胞（特には、角質細胞）を採取する方法としては、当該技術分野で使用されているテープストリッピングや擦過法などを挙げることができる。体液としては、例えば、血液（例えば、全血、白血球等の血球、血漿、血清等）、唾液、尿、喀痰、咽頭ぬぐい液、鼻腔ぬぐい液、口腔（内頬）粘膜ぬぐい液、涙腺分泌液、関節液、膣液、精液、子宮頸分泌液、及び汗などが挙げられるが、検査の簡便性と低侵襲性の点から、血液又は唾液が好ましい。

また、細胞には、幹細胞も含まれる。幹細胞としては、例えば胚性の幹細胞（ＥＳ細胞)；骨髄、血液、皮膚（表皮、真皮、皮下組織）、脂肪、毛包、脳、神経、肝臓、膵臓、腎臓、筋肉やその他の組織に存在する体性の幹細胞；遺伝子導入等により人工的に作製された幹細胞（人工多能性幹細胞：ｉＰＳ細胞）が挙げられるが、皮膚又は間葉系組織由来の幹細胞が好ましい。間葉系組織としては、代表的には脂肪組織のほか、筋肉、軟骨、骨等の組織が挙げられる。

本発明において細胞及び／又は個体の老化度の評価の指標として用いるＧＲＥＭ１（ｇｒｅｍｌｉｎ１）、ＧＲＥＭ２（ｇｒｅｍｌｉｎ２）は、Ｄａｎファミリーに属する分泌糖タンパク質で、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）であるＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ７の拮抗物質として、ＴＧＦβシグナル伝達経路に作用し、器官形成、組織分化の制御に関与すると考えられている。ヒトのＧＲＥＭ１遺伝子の塩基配列は配列表の配列番号１に示され（Ｇｅｎｂａｎｋｎｕｍｂｅｒ：ＮｕｃｌｅｏｔｉｄｅＮＭ＿０１３３７２．６）、ヒトのＧＲＥＭ２遺伝子の塩基配列は配列表の配列番号３にそれぞれ示される（Ｇｅｎｂａｎｋｎｕｍｂｅｒ：ＮｕｃｌｅｏｔｉｄｅＮＭ＿０２２４６９．３）。これらの遺伝子は、哺乳動物の種類等によってその塩基配列が異なる場合があり、本発明においては老化度の評価の指標として用いることができる限り、配列番号１、３の各塩基配列に対して８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の配列同一性を有する塩基配列からなる遺伝子であってもよく、そのようなホモログ遺伝子も、本発明にいうＧＲＥＭ１タンパク質をコードする遺伝子（以下、ＧＲＥＭ１遺伝子という）及びＧＲＥＭ２タンパク質をコードする遺伝子（以下、ＧＲＥＭ２遺伝子という）に包含されるものとする。ＧＲＥＭ１タンパク質のアミノ酸配列は配列表の配列番号２に示され（Ｇｅｎｂａｎｋｎｕｍｂｅｒ：ＰｒｏｔｅｉｎＮＰ＿０３７５０４．１）、ＧＲＥＭ２タンパク質のアミノ酸配列は配列表の配列番号４にそれぞれ示される（Ｇｅｎｂａｎｋｎｕｍｂｅｒ：ＰｒｏｔｅｉｎＮＰ＿０７１９１４．３）。これらのタンパク質もまた、本発明においては老化度の評価の指標として用いることができる限り、配列番号２、４の各アミノ酸配列に対して８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質であってもよく、そのようなホモログタンパク質も、本発明にいうＧＲＥＭ１タンパク質及びＧＲＥＭ２タンパク質に包含されるものとする。

本発明に係る細胞及び／又は個体の老化度の評価方法は、生体試料におけるＧＲＥＭ１遺伝子及び／又はＧＲＥＭ２遺伝子の発現量が、老化が進むと増加するという知見に基づき、細胞及び／又は個体の老化度を評価するものである。よって、評価にあたっては、老化度の評価に供する生体試料を用意し、該生体試料におけるＧＲＥＭ１及び／又はＧＲＥＭ２の発現量を測定し、該発現量に基づいて老化度を評価する。ここで、「ＧＲＥＭ１及び／又はＧＲＥＭ２の発現量」とは、ＧＲＥＭ１遺伝子及びＧＲＥＭ２遺伝子の少なくとも一方若しくは両方の発現量、又はＧＲＥＭ１タンパク質及びＧＲＥＭ２タンパク質の少なくとも一方若しくは両方の発現量をいう。生体試料におけるＧＲＥＭ１及び／又はＧＲＥＭ２の発現量は、絶対値又は相対値（比較対照又は基準発現量との比率や差など）として算出され、必ずしもＧＲＥＭ１及び／又はＧＲＥＭ２の絶対的な発現量を測定する必要はなく、対照のＧＲＥＭ１及び／又はＧＲＥＭ２の発現量との相対的な関係が明らかになればよい。また、ここでいう「評価」は、医師による診断を包含せず、加齢により発症する特定の疾患に対して医師による診断が介入する場合であっても、診断の補助を意味し、具体的には、診断のためのデータを取得することをいう。

本発明において、遺伝子の発現量は、当業者に公知の任意の方法により測定することができ、また、測定は、各方法の常法に従って実施すればよい。遺伝子の発現量とは、遺伝子の転写産物であるｍＲＮＡ量をいう。ｍＲＮＡ量の測定は、所望のｍＲＮＡ量を測定できる方法であれば特に限定されず、公知の方法から適宜選択して用いることができる。例えば、ＧＲＥＭ１遺伝子及び／又はＧＲＥＭ２遺伝子にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドをプライマーとした遺伝子増幅法、又は、ＧＲＥＭ１遺伝子及び／又はＧＲＥＭ２遺伝子にハイブリダイズするオリゴ（ポリ）ヌクレオチドをプローブとしたハイブリダイゼーション法を利用することができる。具体的には、ＲＴ－ＰＣＲ法、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ法、ＤＮＡマイクロアレイ法、セルアレイ法、組織アレイ法、ノーザンブロット法、ドットブロット法、ＲＮアーゼプロテクションアッセイ法などが挙げられる。上記の測定方法に用いるプライマーやプローブは、標識し、当該標識のシグナル強度を調べることによりｍＲＮＡ量を測定することができる。なかでも、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ法はＲＮＡを直接サンプルに使用でき、遺伝子増幅過程を光学的に測定することで増幅に必要な温度サイクルの回数から遺伝子定量が可能である上で好ましい。また、コントロールとして、ハウスキーピング遺伝子であるＧＡＰＤＨや、ベータアクチンなどのｍＲＮＡの発現量を用い、ＧＲＥＭ１遺伝子及びＧＲＥＭ２遺伝子の発現量を標準化することができる。なお、上記の測定方法に用いるプライマー及びプローブは前記のＧＲＥＭ１遺伝子の塩基配列（配列番号１）及びＧＲＥＭ２遺伝子の塩基配列（配列番号３）、ならびにＧｅｎｂａｎｋなどのデータベースよりそれらのアイソタイプ遺伝子のアクセッション番号により登録された１種以上の塩基配列に基づいて当業者であれば適宜設計し、調製することができる。上記の測定方法は、各方法について様々なプロトコルが報告されており、当業者であれば公知のプロトコルに従い、又は公知のプロトコルを適宜修正や変更を行い実施することができる。

タンパク質の発現量の測定は、例えば、ＧＲＥＭ１タンパク質及び／又はＧＲＥＭ２タンパク質に対する抗体又は抗体断片を用いて免疫学的に測定する方法を用いることができる。具体的には、ウエスタンブロッティング法、酵素免疫測定法(ＥＬIＳＡ）、放射線免疫測定法（ＲIＡ）、蛍光抗体法、セルアレイ法、組織アレイ法等を挙げることができる。その他、抗体を用いないタンパク質質量分析技術であるＬＣ－ＭＳ／ＭＳＭＲＭ等を用いることができる。これらの測定方法についても、常法のプロトコル、又は常法のプロトコルを適宜修正・変更したプロトコルによって実施することができる。

本発明において、細胞及び／又は個体の老化度の評価は、例えば、上記の方法で測定した生体試料におけるＧＲＥＭ１及び／又はＧＲＥＭ２の発現量と、予め定めた基準発現量とを比較することにより行うことができる。基準発現量としては、例えば、若年群、高齢群、あるいは年齢群別に平均値をとって定めたＧＲＥＭ１及び／又はＧＲＥＭ２の発現量を用いることができる。発現量の比較は、有意差の有無に基づいて行うことが好ましい。例えば、生体試料におけるＧＲＥＭ１及び／又はＧＲＥＭ２の発現量が、基準発現量と比べて、１０％、又は２０％、又は３０％、又は５０％、又は７０％、又は１００％高い、又は低い場合、有意に高い、又は、有意に低いとすることができる。生体試料におけるＧＲＥＭ１及び／又はＧＲＥＭ２と高齢群又は若年群の基準発現量とを比較し、該生体試料におけるＧＲＥＭ１及び／又はＧＲＥＭ２の発現量が高齢群の基準発現量と同等又は若年群の基準発現量よりも有意に高い場合には、該生体試料を採取した被験体（個体）の老化度が高いと評価でき、該生体試料におけるＧＲＥＭ１及び／又はＧＲＥＭ２の発現量が若年群の基準発現量と同等又は高齢群の基準発現量よりも有意に低い場合には、該生体試料を採取した被験体（個体）の老化度が低いと評価できる。あるいは、別の方法として、２０代、３０代、４０代、５０代、６０代、７０代といったように年代別に「基準発現量（平均値）＋２ＳＤ」をカットオフ値として規定し、被験体より採取した生体試料中のＧＲＥＭ１及び／又はＧＲＥＭ２の発現量が、該被験体の実年齢に相当する年代のカットオフ値より高い場合には、該被験体（個体）の老化度が高い、老化が進んでいると評価でき、カットオフ値より低い場合には、該被験体（個体）の老化度が低い、老化が進んでいないと評価することができる。

２．細胞及び／又は個体の老化度の評価用キット
本発明に係る細胞及び／又は個体の老化度の評価用キットは、前記のＧＲＥＭ１及び／又はＧＲＥＭ２の発現量を遺伝子レベル又はタンパク質レベルで測定するための試薬を含む。当該キットを構成する試薬としては、ＧＲＥＭ１遺伝子及び／又はＧＲＥＭ２遺伝子、又は、ＧＲＥＭ１タンパク質及び／又はＧＲＥＭ２タンパク質に対して特異的親和性を有する物質、具体的には、ＧＲＥＭ１遺伝子及び／又はＧＲＥＭ２遺伝子に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド、ＧＲＥＭ１タンパク質及び／又はＧＲＥＭ２タンパク質に対する抗体を用いることができる。

ＧＲＥＭ１遺伝子及び／又はＧＲＥＭ２遺伝子に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドとしては、例えば、配列番号１、３にそれぞれ示される塩基配列又はその相補配列において連続する少なくとも１５塩基以上のオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドが挙げられ、オリゴヌクレオチドはＧＲＥＭ１遺伝子及び／又はＧＲＥＭ２遺伝子増幅のためのプライマーとして、またポリヌクレオチドはＧＲＥＭ１遺伝子及び／又はＧＲＥＭ２遺伝子の検出のためのプローブとして用いることができる。プライマーの長さは、１５ｂｐ～５０ｂｐ、好ましくは１５ｂｐ～３５ｂｐ、より好ましくは２０ｂｐ～３０ｂｐが例示できる。またプローブの長さは、１５ｂｐ～全配列の塩基数、好ましくは５０ｂｐ～１０００ｂｐ、より好ましくは１００ｂｐ～５００ｂｐが例示できる。オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドは、測定方法に応じて標識物質をつけてもよい。標識物質としては、当該技術分野においてよく知られる蛍光物質、放射性同位体、化学発光物質、酵素、ビオチン等を用いることができる。

また、ＧＲＥＭ１タンパク質及び／又はＧＲＥＭ２タンパク質に対する抗体は、当該タンパク質と特異的に結合可能なものであれば特に限定されず、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれであってもよい。また抗体は、上記のタンパク質に特異的に結合し得る限り断片であってもよい。抗体の断片としては、例えば、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、単鎖抗体(ｓｃＦｖ)等が挙げられる。抗体の作成は、上記タンパク質を抗原として、常法により作製することができる。例えば、ポリクローナル抗体は、抗原を感作した哺乳動物（例えば、ウサギ、ラット、マウス等）から血液を採取し、この血液から公知の方法により血清を分離することによって得られる。また、モノクローナル抗体は、抗原を感作した哺乳動物から抗体産生細胞（脾臓細胞、リンパ節細胞等）を取り出して骨髄腫細胞と細胞融合させ、得られたハイブリドーマをクローニングして、その培養物から回収することによって得られる。また、市販品を用いることもできる。タンパク質の定量のために、これらの抗体を適宜標識してもよい。標識物質は、蛍光色素、放射性同位体、酵素等を使用することができる。

本発明のキットには、前記の測定方法においてプライマーやプローブとして用いるポリ（オリゴ）ヌクレオチド、又は抗体のいずれかを少なくとも含んでいればよいが、必要に応じて、ＲＮＡ抽出用試薬、ＰＣＲ用緩衝液やＤＮＡポリメラーゼ等のＰＣＲ用試薬、固定化担体、標識物質、標識の検出に用いられる基質化合物、陽性や陰性の標準試料、キットの使用方法を記載した指示書等を含めることもできる。なお、キット中の試薬は溶液でも凍結乾燥物でもよい。

３．抗老化物質のスクリーニング方法
ＧＲＥＭ１及び／又はＧＲＥＭ２は、抗老化物質のスクリーニング方法にも使用できる。本発明のスクリーニング方法によれば、ＧＲＥＭ１及び／又はＧＲＥＭ２の発現の減少を指標として、抗老化物質を正確かつ迅速にスクリーニングできる。ここで、「抗老化」には、あらゆる老化現象の改善、予防、及び進行の遅延が含まれるが、主には、皮膚の抗老化をいい、加齢等とともに増える、皮膚のシミ、しわ、たるみ、くすみ、弾力低下、乾燥などの改善、予防、進行の遅延をいう。

本発明のスクリーニング方法は、具体的には以下の工程を含む。
（ａ）被験物質を培養細胞に接触させる工程
（ｂ）被験物質を接触させた培養細胞におけるＧＲＥＭ１タンパク質及び／又はＧＲＥＭ２タンパク質、又は、ＧＲＥＭ１タンパク質をコードする遺伝子及び／又はＧＲＥＭ２タンパク質をコードする遺伝子の発現量を測定する工程
（ｃ）被験物質を接触させない同培養細胞におけるＧＲＥＭ１タンパク質及び／又はＧＲＥＭ２タンパク質、又は、ＧＲＥＭ１タンパク質をコードする遺伝子及び／又はＧＲＥＭ２タンパク質をコードする遺伝子の発現量を測定する工程
（ｄ）上記工程（ｂ）で測定した発現量が、上記工程（ｃ）で測定した発現量よりも減少した被験物質を抗老化物質として選択する工程

まず工程（ａ）では、被験物質を培養細胞に接触させる。接触は、被験物質を細胞の培地に添加し、一定時間培養することにより行なう。被験物質を接触させる細胞は、ＧＲＥＭ１遺伝子及び／又はＧＲＥＭ２遺伝子を発現する限り、天然の細胞であっても、遺伝子工学的に改変された細胞でもよい。培養細胞は、培養皮膚細胞が好ましい。皮膚細胞としては、表皮角化細胞、皮膚線維芽細胞、色素細胞（メラノサイト）などを挙げることができる。培養細胞は、細胞バンクから入手可能な培養細胞や市販されている培養細胞を入手して用いることができる。例えば、培養皮膚細胞であれば、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社、クラボウ社、ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ社から市販品を入手できる。

細胞の由来は哺乳動物であれば特に限定はされず、例えば、ヒト、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ウマ等が挙げられる。

スクリーニングに用いる被験物質は、主に化粧品、医薬品、医薬部外品、又は健康・機能性食品に利用できる成分を対象とし、例えば、動・植物組織の抽出物もしくは微生物培養物等の複数の化合物を含む混合物、またそれらから精製された標品；天然に生じる分子(例えば、アミノ酸、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、核酸、脂質、ステロイド、糖タンパク質、プロテオグリカンなど）；あるいは天然に生じる分子の合成アナログ又は誘導体(例えば、ペプチド擬態物など)；及び天然に生じない分子(例えば、コンビナトリアルケミストリー技術等を用いて作製した低分子有機化合物)；ならびにそれらの混合物などを挙げることができる。また、被験物質としては単一の被験物質を独立に試験しても、いくつかの候補となる被験物質の混合物（ライブラリーなどを含む）について試験をしてもよい。複数の被験物質を含むライブラリーとしては、合成化合物ライブラリー、ペプチドライブラリーなどが挙げられる。

工程（ｂ）及び（ｃ）のＧＲＥＭ１及び／又はＧＲＥＭ２発現量の測定、（ｄ）の発現量に基づく評価は、前項の方法と同様に行えばよい。

以下に本発明を実施例に基づいてさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。

（実施例１）若年群と高齢群の細胞におけるＧＲＥＭ１及びＧＲＥＭ２遺伝子発現量の比較
ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）とヒト脂肪由来幹細胞（ＨＡＤＳＣ）の２種類の細胞を用いてＧＲＥＭ１及びＧＲＥＭ２遺伝子発現量の測定を行った。ＮＨＤＦにおける同遺伝子発現解析には、若年群として１０歳から３０歳までのドナーから得られたＮＨＤＦ（ＫＵＲＡＢＯ社製）３検体と、高齢群として６０歳から８０歳までのドナーから得られたＮＨＤＦ（ＫＵＲＡＢＯ、Ｌｏｎｚａ社製）３検体の計６検体のＮＨＤＦを用いた。ＨＡＤＳＣにおける同遺伝子発現解析には、若年群として３０代のドナーから得られたＨＡＤＳＣ（Ｌｏｎｚａ社製）３検体と、高齢群として６０歳から９０歳までのドナーから得られたＨＡＤＳＣ（Ｌｏｎｚａ社製）３検体の計６検体のＨＡＤＳＣを用いた。

上記各検体のＮＨＤＦとＨＡＤＳＣを６０ｍｍｄｉｓｈに１×１０^５個播種し、１％ＦＢＳを含むαＤＭＥＭ培地にて、３７℃、５％ＣＯ_２条件下で培養した。細胞がコンフルエントな状態になったところで、ＰＢＳ（－）で洗浄し、総ＲＮＡの抽出を行った。細胞からの総ＲＮＡの抽出はＲＮＡｉｓｏｐｌｕｓ（ＴＡＫＡＲＡ社製）を用いて行い、総ＲＮＡ量は分光光度計（ＮａｎｏＤｒｏｐ）を用いて２６０ｎｍにおける吸光度により求めた。ｍＲＮＡ発現量の測定は、細胞から抽出した総ＲＮＡを基にしてリアルタイムＲＴ－ＰＣＲ法により行った。リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ法には、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＲＴＭａｓｔｅｒＭｉｘ（ＴＡＫＡＲＡ社製）及びＳＹＢＲＳｅｌｅｃｔＭａｓｔｅｒＭｉｘ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いた。すなわち、５００ｎｇの総ＲＮＡを逆転写反応後、ＰＣＲ反応（９５℃：１５秒間、６０℃：６０秒間、４０ｃｙｃｌｅｓ）を行った。その他の操作は定められた方法に従って実施した。尚、各遺伝子の発現量の測定に使用したプライマーは次の通りである。

ＧＲＥＭ１用のプライマーセット：
ＴＣＣＴＴＴＣＡＧＴＣＣＴＧＣＴＣＣＴＴＣＴ（配列番号５）
ＡＧＧＧＣＡＧＴＴＧＡＧＴＧＴＧＡＣＣＡＴ（配列番号６）
ＧＲＥＭ２用のプライマーセット：
ＡＡＧＧＣＡＧＡＧＧＧＡＧＡＧＧＧＡＧＡ（配列番号７）
ＣＡＣＣＡＧＧＡＡＣＡＡＧＧＡＣＡＧＧＧＡ（配列番号８）
ＧＡＰＤＨ用のプライマーセット：
ＴＧＣＡＣＣＡＣＣＡＡＣＴＧＣＴＴＡＧＣ（配列番号９）
ＴＣＴＴＣＴＧＧＧＴＧＧＣＡＧＴＧＡＴＧ（配列番号１０）

上記プライマーを用いて、各検体のＮＨＤＦとＨＡＤＳＣにおけるＧＲＥＭ１遺伝子及びＧＲＥＭ２遺伝子発現量を測定した。内部標準には、ＧＡＰＤＨ遺伝子を使用した。遺伝子発現量は、若年群の各検体のＮＨＤＦとＨＡＤＳＣにおけるＧＲＥＭ１遺伝子及びＧＲＥＭ２遺伝子発現量の内部標準であるＧＡＰＤＨ遺伝子の発現量に対する割合として算出したＧＲＥＭ１遺伝子及びＧＲＥＭ２遺伝子相対発現量（ＧＲＥＭ１遺伝子発現量／ＧＡＰＤＨ遺伝子発現量、ＧＲＥＭ２遺伝子発現量／ＧＡＰＤＨ遺伝子発現量）の平均値を１．０とし、これに対し、高齢群の各検体のＮＨＤＦとＨＡＤＳＣにおけるＧＲＥＭ１遺伝子及びＧＲＥＭ２遺伝子相対発現量の値を算出した。結果を図１及び図２に示す。ＮＨＤＦ（図１）とＨＡＤＳＣ（図２）のいずれにおいても、ＧＲＥＭ１遺伝子及びＧＲＥＭ２遺伝子の発現量は、若年群に比較して、高齢群において有意に高かった。

（実施例２）２０代と４０代の唾液中のＧＲＥＭ１及びＧＲＥＭ２タンパク質濃度の比較
（１）試料の調製
２０代男性４名及び４０代男性４名より唾液を採取した。唾液は、同時刻に、水で洗口した後、唾液採取用チューブに１ｍL程度を採取した。その後、１４０００ｒｐｍ、４℃、２０分間、遠心分離を行い上清を回収して試料とした。

（２）試料のタンパク質濃度の測定
各試料について、蒸留水にて１０倍希釈液、２０倍希釈液、５０倍希釈液を調製した。ＢＣＡＰｒｏｔｅｉｎＡｓｓａｙｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社製）を使用し、各試料のタンパク質濃度を求めた。全ての試料において、試料中の総タンパク質濃度は１．０～１．５μｇ／μＬであった。

（３）ドットプロットによるウエスタンブロッティング
メタノールで処理を行ったＰＶＤＦ製のウエスタンブロット用メンブレン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）上に、試料４μＬをプロットした。その後、一般的なウエスタンブロッティングの方法で、ブロッキング、抗原抗体反応を行った。なお、抗原抗体反応には、抗ＧＲＥＭ１ポリクローナル抗体（ＡｃｒｉｓＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ社製）、抗ＧＲＥＭ２ポリクローナル抗体（ＧｅｎｅＴｅｘ社製）を一次抗体に用いた。化学発光にて標的タンパク質を検出させ、化学発光撮影装置（Ｅｚ－ＣａｐｔｕｒｅＭＧ、アトー社製）で撮影を行った。

化学発光撮影装置にて撮影した画像について、画像解析ソフト（ＣＳＡｎａｌｙｚｅｒ）を用いて、バックグランドを差し引いたプロットエリアのＧＲＥＭ１及びＧＲＥＭ２の積算強度を求めた。ＧＲＥＭ１及びＧＲＥＭ２の積算強度を各試料のタンパク質量で補正（ＧＲＥＭ１及びＧＲＥＭ２の積算強度／プロットタンパク質量）することによって、各試料のタンパク質量当たりのＧＲＥＭ１及びＧＲＥＭ２の強度を求め、２０代の平均値を１．０とし、これに対し、４０代のＧＲＥＭ１及びＧＲＥＭ２の相対値を算出した。結果を図３に示す。図３に示されるように、唾液中のＧＲＥＭ１及びＧＲＥＭ２の検出量は、２０代に対して４０代において顕著に高かった（Ｐ＜０．０１）。

（実施例３）２０代と４０代の血液中のＧＲＥＭ１及びＧＲＥＭ２タンパク質濃度の比較
（１）試料の調製
２０代男性４名及び４０代男性４名より血液を採取した。血液は、手の指先を止血し、ポケットランセット（Ａｂｂｏｔｔ社製）を用いて１００μＬ程度を採取し、同量のＥＤＴＡ溶液（５ｍｇ／μＬ）と撹拌した。その後、１４０００ｒｐｍ、４℃、２０分間、遠心分離を行い上清を回収して試料とした。

（２）試料のタンパク質濃度の測定
各試料について、蒸留水にて１０倍希釈液、２０倍希釈液、５０倍希釈液を調製した。ＢＣＡＰｒｏｔｅｉｎＡｓｓａｙｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社製）を使用し、各試料のタンパク質濃度を求めた。全ての試料において、試料中の総タンパク質濃度は５５～７５μｇ／μＬであった。

（３）ドットプロットによるウエスタンブロッティング
メタノールで処理を行ったＰＶＤＦ製のウエスタンブロット用メンブレン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）上に、５μｇ相当量の試料をプロットした。その後、一般的なウエスタンブロッティングの方法で、ブロッキング、抗原抗体反応を行った。なお、抗原抗体反応には、抗ＧＲＥＭ１ポリクローナル抗体（ＡｃｒｉｓＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ社製）、抗ＧＲＥＭ２ポリクローナル抗体（ＧｅｎｅＴｅｘ社製）を一次抗体に用いた。化学発光にて標的タンパク質を検出させ、化学発光撮影装置（Ｅｚ－ＣａｐｔｕｒｅＭＧ、アトー社製）で撮影を行った。

化学発光装置にて撮影した画像について、画像解析ソフト（ＣＳＡｎａｌｙｚｅｒ）を用いて、バックグランドを差し引いたプロットエリアのＧＲＥＭ１及びＧＲＥＭ２の積算強度を求めた。ＧＲＥＭ１及びＧＲＥＭ２の積算強度をプロットした各試料のタンパク質量で補正（ＧＲＥＭ１及びＧＲＥＭ２の積算強度／プロットタンパク質量）することによって、各試料の同一タンパク質量当たりのＧＲＥＭ１及びＧＲＥＭ２の強度を求め、２０代の平均値を１．０とし、これに対し、４０代のＧＲＥＭ１及びＧＲＥＭ２の相対値を算出した。結果を図４に示す。図４に示されるように、血液中のＧＲＥＭ１及びＧＲＥＭ２の検出量は、２０代に対して４０代において顕著に高かった（Ｐ＜０．０１）。

本発明の方法によれば、細胞及び／又は個体の老化度を客観的かつ正確に、しかも迅速に評価することができる。よって、本発明は、抗老化剤のスクリーニング、再生医療や再生美容で利用する細胞や組織の品質評価、老化のメカニズムの基礎研究において利用できる。

Claims

体液、皮膚細胞（ただし、癌細胞を除く）、及び皮膚又は間葉系組織由来の幹細胞から選択される生体試料におけるＧＲＥＭ１タンパク質及び／又はＧＲＥＭ２タンパク質、又は、ＧＲＥＭ１タンパク質をコードする遺伝子及び／又はＧＲＥＭ２タンパク質をコードする遺伝子の発現量を指標とする、皮膚細胞（ただし、癌細胞を除く）及び／又は個体の老化度を評価するための測定方法。
前記体液が、血液又は唾液である、請求項１に記載の方法。
前記間葉系組織由来の幹細胞が、脂肪組織由来幹細胞である、請求項１に記載の方法。
ＧＲＥＭ１タンパク質及び／又はＧＲＥＭ２タンパク質、又は、ＧＲＥＭ１タンパク質をコードする遺伝子及び／又はＧＲＥＭ２タンパク質をコードする遺伝子に対して特異的親和性を有する物質を少なくとも１種含む、皮膚細胞及び/又は個体の老化度の評価用キット。
前記特異的親和性を有する物質が、ＧＲＥＭ１タンパク質をコードする遺伝子及び／又はＧＲＥＭ２タンパク質をコードする遺伝子に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドである、請求項４に記載のキット。
前記特異的親和性を有する物質が、ＧＲＥＭ１タンパク質及び／又はＧＲＥＭ２タンパク質に対する抗体である、請求項４に記載のキット。
以下の工程を含む、抗老化物質のスクリーニング方法。
（ａ）被験物質を培養皮膚細胞に接触させる工程
（ｂ）（ａ）の培養皮膚細胞におけるＧＲＥＭ１タンパク質及び／又はＧＲＥＭ２タンパク質、又は、ＧＲＥＭ１タンパク質をコードする遺伝子及び／又はＧＲＥＭ２タンパク質をコードする遺伝子の発現量を測定する工程
（ｃ）被験物質を接触させない同培養皮膚細胞におけるＧＲＥＭ１タンパク質及び／又はＧＲＥＭ２タンパク質、又は、ＧＲＥＭ１タンパク質をコードする遺伝子及び／又はＧＲＥＭ２タンパク質をコードする遺伝子の発現量を測定する工程
（ｄ）上記工程（ｂ）で測定した発現量が、上記工程（ｃ）で測定した発現量よりも減少した被験物質を抗老化物質として選択する工程
前記培養皮膚細胞が、培養表皮角化細胞又は皮膚線維芽細胞である、請求項７に記載の方法。