JP4476488B2 - 表皮中の生物学的因子の検出法 - Google Patents
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Description
【０００１】
発明の分野
本発明は表皮中の生物学的因子の検出法に関し、その生物学的因子はポリヌクレオチドもしくはそのポリヌクレオチドでコードされるポリペプチドまたは脂質であり得る。
【０００２】
発明の背景
細胞および組織は内因性および外因性の作用物質によって影響を受け、ある作用物質に対しての応答をメディエートする生物学的活性のカスケードで応答する。例えば、皮膚は外因性作用物質への暴露の結果生ずる多数の皮膚反応の部位である。また、皮膚は身体で最もアクセスしやすい器官である。このように、皮膚は、ある特定の反応に伴って生ずる、またはその反応を引き起こすような遺伝子および遺伝子産物ならびにタンパク質反応の決定に役に立つものである。
【０００３】
表皮は、皮膚の最外層である。この層は4つの主要な細胞型を含んでいる。表皮で最も多数を占める細胞は分化の種々のステージにあるケラチノサイトである。表皮は、表皮の最下層である基底細胞層にあるこれらの細胞の有糸分裂によってケラチノサイトのプールを維持している。これに対して、表皮の最上層を覆っている層は角質層で、これは正常な皮膚では、有核細胞を含んでいない。ケラチノサイトは、インターロイキン(IL)-1、IL-3、IL-4、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)を含む多数のサイトカインを産生する(Kupper, M., 1993, Am. J. Dermatopathol. 11:69-73)。基底細胞層の上部にはランゲルハンス細胞があり、これは骨髄由来の免疫応答能のある細胞である。ランゲルハンス細胞はマクロファージとT細胞の特徴を有し、接触皮膚炎などの皮膚における免疫応答に至る一連のイベントを開始させると考えられる。メラノサイトは皮膚における色素産生細胞である。この細胞はまた、通常は表皮のより深い位置に常在している。表皮の第4の細胞はメルケル細胞である。
【０００４】
表皮の直下には、主として線維芽細胞、リンパ球、肥満細胞、内皮細胞、および神経終末を含んでいる皮膚層がある。線維芽細胞は、皮膚の細胞外マトリックス物質および構造タンパク質、例えばコラーゲンなどを貯えている主要な細胞型である。内皮細胞は皮膚の毛細血管の内腔をコートしており、肥満細胞は皮膚の炎症反応で遊離されるヒスタミンを含んでいる。
【０００５】
皮膚の炎症は広範な外因性作用物質が皮膚に適用されることによって引き起こされ得る。接触皮膚炎のクラスとしては、刺激性、アレルギー性、光アレルギー性および光毒性、ならびに不顕性の機作によるものが挙げられる。臨床的には、反応は実質的に同一で、紅斑、浮腫、および小胞形成を特徴とする湿疹過程の外観を呈する(Hoefakkerら, 1995, Contact Dermat. 33:258-266; Krasteva, M., 1993, Int. J. Dermatol. 32:547-560)。接触じんま疹は種々の作用物質の皮膚への適用に対するものとして起こりうる別の反応で、それは皮膚との接触に対して直ちに膨疹が出現することが異なっている。接触反応の機作を分類することは患者にとって重要である。この分類は、感作後の再暴露にともなって徐々に重篤な皮膚の炎症に至るアレルギー性または免疫応答の免疫学的な帰結に由来している。例えば、ある作用物質の暴露に対する炎症反応の型を特徴づけることによって、患者および医薬品製造者に、以降の炎症反応を避けるための製品の購入および製品を再デザインする能力を与えることとなる。
【０００６】
接触皮膚炎が過去に頻繁に生じていることから、全ての新規局所用医薬品またはコスメシューティカル(機能性化粧品)についてヒト皮膚での試験の実施を促している。現在では、皮膚への接触が行われるいかなる製品についても、的確に行われた皮膚安全性試験の蓄積を市場に出す前に行うことが多くの国々で要求されている。製品およびその構成成分を用いての皮膚パッチテストによる予測はこのような皮膚安全性試験法の柱として行われてきた。この予測的皮膚パッチテストの開始以来の主な欠陥は刺激性接触皮膚炎(ICD)とアレルギー性接触皮膚炎(ACD)とを明確には識別し得ないことである。さらに、パッチテストは紅斑、浮腫、および小胞形成の定性的可視的スコアに依存しており、反応の重症度を定量的に測定するには不十分である。
【０００７】
概要
上述の限界を克服することが本発明の1つの目的である。本発明は角質層の下にある皮膚細胞中の生物学的因子を非侵襲的に検出するための方法を提供する。生物学的因子の特徴を調べることは、全身的な反応、ならびに接触皮膚炎などの局所反応を識別するために有用であり、より特定して述べれば、刺激性接触皮膚炎(ICD)とアレルギー性皮膚炎(ACD)とを識別するために有用である。
【０００８】
また別の1実施形態においては、本発明はポリヌクレオチドのサンプルを得るための非侵襲的方法を提供し、そのサンプルはその後に行う接触皮膚炎の試験に用いられる。好ましい1実施形態においては、皮膚の表皮の角質層は硬質表面でこすり取ることなどによって取り除く。別の好ましい1実施形態においては、表皮は接着性表面と1回以上接触させる。
【０００９】
別の1実施形態においては、本発明は被験体から得た角質層の下にある細胞におけるIL-8をコードするポリヌクレオチドを定量することによって、その被験体がICDであるかを診断する方法を提供するが、ここでIL-13に対してIL-4が相対的に存在していない状態においてIL-8 mRNAが存在することが、ICDの指標となる。
【００１０】
別の1実施形態においては、本発明は被験体から得た角質層の下にある細胞におけるIL-4をコードするポリヌクレオチドを定量することによって、その被験体のACDを診断する方法を提供するが、ここでIL-4 mRNAが存在することがACDの指標となる。
【００１１】
さらに、本発明は被験体の皮膚の角質層の下にある細胞からポリヌクレオチドを得るための方法であって、角質層を除去して生きた表面を露出させ、その露出された表面からポリヌクレオチドを採取することを含む方法を提供する。
【００１２】
別の1実施形態において、本発明は、被験体の皮膚細胞におけるIL-13をコードするポリヌクレオチドを定量することを含む、被験体のIL-13の発現を検出することによるACDの診断法であって、IL-13ポリヌクレオチドの量が増大していることがACDの指標となる方法を提供する。
【００１３】
別の1実施形態においては、本発明は硬質表面および接着テープなどの細胞採取装置、接着テープ、ならびに皮膚サンプル中の核酸の保存に適した細胞溶解バッファーまたはコンピューターチップを含む、皮膚からサンプルを非侵襲的に得るためのキットを提供する。
【００１４】
別の1実施形態においては、本発明は細胞採取装置、細胞溶解バッファー、およびハイブリダイゼーション試薬などの検出試薬を含むキットを提供する。
【００１５】
さらなる1実施形態においては、本発明は皮膚の1区画を被験化合物と接触させ、その後にサイトカインまたはサイトカインポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの存在を検出することによって皮膚炎の原因となる化合物を同定する方法を提供し、その方法では該ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの存在が皮膚炎の指標となる。この実施形態の方法は、in vivoまたはin vitroで行うことができ、そのようなものとしては3次元の器官型皮膚構築物を用いるものを含んでいる。
【００１６】
本発明の1つ以上の実施形態の詳細は付属の図面および下記の説明に示している。本発明のその他の特徴、目的、および利点についてはそれらの説明および図面から、ならびに特許請求の範囲から明らかであろう。
【００１７】
図面の説明
図1はある同一の被験体の上腕の3カ所の異なる領域をテープで剥ぎ取ることによって得られたRNAでRNaseプロテクションアッセイ(RPA)を行った結果を示すゲルの像を示している。その3カ所のテープ引き剥がしはそれぞれ12回行った。4種類の異なるRNAプローブ(IL-4、IL-8、L32、GAPDH)を被験体から得たRNAサンプルにハイブリダイズさせるために用いた。レーン1は皮膚の紅斑の領域から単離されたRNAを示しており、その紅斑はスクアレート(squarate)で誘発させたもの(ACD)で臨床的には2＋の紅斑と判定されるものである。レーン3に示したものは0.5%のラウリル硫酸ナトリウム(SLS)で誘発させたICD紅斑部位(2＋のスコアのもの)から単離されたRNAである。2つのレーンの双方ともIL-8のバンドを示している。レーン2は、同じ被験体の非炎症性の正常な外観の皮膚から得たサンプルを示している。アレルギー反応から誘導されたサイトカインIL-4の1本のバンドが、レーン1に認められる。
【００１８】
図2はさらに4名の上腕の3カ所の異なる領域のテープによる剥ぎ取りによって得られたRNAを用いて行ったRPAの結果である。このゲル中には6種の異なるRNA (IL-4、IL-8、IL-9、IL-13、IL-14、および酸化窒素合成酵素のアイソフォーム(iNOS))と、さらに2つのハウスキーピング遺伝子のためのリボプローブを含有させた。「＋」は被験体から集めた皮膚をSLS(図の下部の第2列)またはスクアレート (図の下部の第3列)のいずれかで処理したことを示すものである。
【００１９】
発明の説明
本発明は角質層の下の皮膚細胞から、ポリヌクレオチドなどの生物学的因子を採取するための非侵襲的方法を提供する。これらの生物学的因子の特徴を調べて被験体中における局所または全身の反応の存在を示すことができる。さらに、本発明は不顕性のものを含む全ての型の接触皮膚炎を識別する方法を提供する。好ましい1実施形態においては、本発明は、皮膚から得られた例えばサイトカインをコードするポリヌクレオチドなどの生物学的因子を検出することによって、刺激性反応とアレルギー反応とを識別するための方法に関する。1実施形態においては、核酸を含んでいるサンプルは非侵襲的に得られる。
【００２０】
炎症反応はその臨床的症状発現がしばしば類似している。炎症反応を示している患者を適正に治療するためにはその反応の適正な同定がなされねばならない。「類似の臨床的症状発現」とは2つ以上の反応が全体的に類似の臨床的および/または組織学的な外観を有していることを意味する。例えば、皮膚の接触皮膚炎は、皮膚と接触した広範な外因性作用物質からもたらされる可能性のあるものである。接触皮膚炎のクラスとしては、刺激性、アレルギー性、光アレルギー性および光毒性、ならびに不顕性の機作によるものが挙げられる。臨床的には、反応は実質的に同一で、紅斑、浮腫、および小胞形成を特徴とする湿疹過程の外観を呈する。ICDとACDの紅斑、浮腫、および小胞形成は見分けることができない。組織所見ですら、これら2つの過程は非常に小さな相異を示すのみで、しかも反応の最初の24時間の間にのみ認められる。
【００２１】
本明細書で用いている「核酸」、「ポリヌクレオチド」、または「核酸配列」という用語は、分離した断片の形またはより大きな構築物の構成成分としてのデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドのポリマーを意味する。本発明のポリヌクレオチドまたは核酸配列としては、mRNAおよびcDNA配列を含むDNA、RNAが挙げられる。
【００２２】
本明細書で用いている「ポリペプチド」という用語は、分離した断片の形またはより大きな構築物の構成成分としてのアミノ酸残基のポリマーを意味する。ポリペプチドの1例としてはサイトカインまたはその断片をコードするアミノ酸配列が挙げられる。ポリペプチドは、機能性のタンパク質またはタンパク質の断片をコードしうる。例えば、IL-4ポリペプチドには、アミノ酸のポリマーからなるIL-4のタンパク質の完全長の配列ならびにその断片が含まれる。
【００２３】
本明細書で用いている「サイトカイン」とは、細胞性の調節または分化において役割を果たしているいかなる因子をも意味する。例えば、サイトカインとしては、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-9、IL-13、IL-14を含むインターロイキン(IL)のファミリーならびにトランスフォーミング増殖因子β(TGF-β)スーパーファミリーに属する因子、GM-CSF、およびインターフェロンが挙げられる。
【００２４】
本明細書で用いている「生物学的因子」という用語は、生物活性を有する、または生物学的な役割を果たす多数の因子を意味する。例えば、生物学的因子としては、DNA、RNA、mRNA、およびcDNAなどのポリヌクレオチド、IL-4、IL-8、およびIL-13タンパク質およびそれらの断片などのポリペプチド、ならびにコレステロールなどの脂質、脂肪酸、およびロイコトリエンなどの炎症メディエーター、プロスタグランディン、およびその他のものが挙げられる。
【００２５】
「皮膚」という用語は、1または数層の厚さの、基底層の上に構築された、しばしば機械的防護または能動輸送に特化される細胞のシートを含んでなる組織である。好ましい1実施形態においては、皮膚は哺乳動物の皮膚である。より好ましい1実施形態においては、皮膚はヒトの皮膚である。ヒトの皮膚の表皮は数種の異なる皮膚組織層を含む。最も深い層は基底層で、それは柱状細胞からなる。その上の層は有棘層で、それは多面体細胞からなる。有棘層から押し上げられている細胞は平らになっており、ケラトヒアリン顆粒を合成して顆粒層を形成する。これらの細胞は外部へと移動するにつれて核を失い、ケラトヒアリン顆粒は張原線維と融合し一緒になる。このことによって淡明層と呼ばれる透明な層が形成される。淡明層の細胞は密に詰め込まれている。淡明層から細胞が上昇して行くにつれて、多層状の不透明な鱗屑へと圧縮されるようになる。これらの細胞は全て平らな細胞残遺物であり、それはケラチンで完全に充填され、核を含む他の内部構造を全て失っている。これらの鱗屑は表皮の外層である角質層を構成する。角質層の底部では、細胞は密に詰め込まれており、お互いが強く接着されているが、その層の上部へ行くほど粗く詰め込まれるようになり、やがては表面で薄片となってはげ落ちる。
【００２６】
「サンプル」という用語は被験体の皮膚に由来するいかなる標品をも意味する。例えば、上述の非侵襲的方法を用いて得られた細胞のサンプルは、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、または脂質を単離するために用いることができる。さらに、本発明の方法はin vitroで、例えば、固形または半固形の支持体、および器官型の皮膚構築物上で培養した皮膚細胞を用いることができる。そのような場合には、皮膚細胞はどのようなソースからのものでもよい。任意のin vitroまたはin vivoの検体から得られた精製または非精製形態の生物学的因子を、その生物学的因子が目的の因子を含むことを条件として、皮膚炎などの生物活性の検出用の出発材料として用いることができる。例えば、サンプルは、それが皮膚炎の指標となるサイトカインなどのポリペプチドをコードする特異的なポリヌクレオチド配列を含有しているか、または含有していることが疑われるものであれば、ポリヌクレオチドを検出することによって皮膚炎を検出するために用いることができる。
【００２７】
組織からのサンプルは当業界でよく知られている多数の方法のいかなるものによっても単離することができる。サンプルを単離するための侵襲的方法には、注射針を例えば血液サンプリングの際に使用すること、ならびに種々の組織の生検が挙げられる。これらの方法は侵襲的であるので、死亡率および罹患率が上昇する危険性がある。本発明は種々の疾患、障害、または炎症反応の検出、診断、または予後において生物学的因子を得るためのソースとして用いることのできるサンプルを非侵襲的に得るために有用な方法およびキットを提供する。好ましい1実施形態においては、本発明は皮膚炎反応を検出するために、生物学的因子例えば核酸および/またはポリペプチドなどの単離に用いる皮膚サンプルを得るための非侵襲的方法を提供する。この実施形態においては、皮膚の表皮細胞は硬い器具、例えば滅菌済の#15メスでこすり取られるが、皮膚の表面の層(すなわち角質層)のみを取り除くことのできる硬い器具であればいずれも用いることができることは理解されるであろう。あるいはまた、皮膚をこすり取る代わりに、皮膚の表皮層を接着テープ、例えばDuctテープ(333 Duct tape, Nashua tape products)またはScotch(登録商標)テープ(3M Scotch 810, St Paul, 米国ミネソタ州)を用いて除去することができる。しかし好ましい方法は、皮膚細胞層を引き剥がすためにD-SQUAME(登録商標)(CuDerm, Dallas, 米国テキサス州)を用いることである。この実施形態においては、皮膚をテープで引き剥がし、次いでその引き剥がされた細胞および細胞性物質を次いでメス、テープまたはその他のものから回収する。例えば、皮膚細胞および細胞性物質を得るために用いたテープを、溶解バッファーを入れた滅菌マイクロ分離管(microfuge tube)に入れて遠心分離することができる。メスの場合には、細胞および細胞性物質を滅菌ペトリ皿に移し、そこにある細胞を全て溶解バッファーで溶解させる。同じ溶解バッファーを、単一の皮膚部位で用いられたテープの各ピースまたはメスに再使用することができる。特定の適用法では、皮膚から細胞および細胞性物質を取り除くためにテープ引き剥がし法はこすり取り法と組み合わせることができる。次いで、得られたサンプルをさらに例えば、核酸、ポリペプチド、または脂質を単離するために処理することができる。好ましくは、用いられる方法は、測定しようとするポリヌクレオチド、ポリペプチド、または脂質レベルに悪影響を及ぼさないものである。本発明は、迅速で非侵襲的な、mRNAなどのポリヌクレオチドを得るための方法を提供し、それは皮膚細胞の合成パターンにおける変化を立証するための助けとなるものである。テープによる剥ぎ取り工程それ自体はその工程の実施後最初の2-3時間は皮膚のサイトカインのプロフィールに影響しないことが示されている。本発明のこすり取りおよび剥ぎ取り法を用いて、遺伝性疾患を含む局所または全身の疾患、障害、または炎症反応の存在を同定、識別、または診断することができる。本発明においては、転写およびポリペプチド合成の誘導に対応する反応、疾患、または障害のいかなるものも本発明の方法によって検出することができる。
【００２８】
ポリヌクレオチドは、溶解した細胞及び細胞性物質から、当業者に周知のいくつもの手段によって単離できる。例えば、限定はされないが、TriReagent（Molecular Research Center, Inc社製、オハイオ州シンシナティー）を含む多数の商業的製品がポリヌクレオチドの単離に利用できる。次いで、単離されたポリヌクレオチドは、サイトカインをコードするポリヌクレオチドを含む特定の核酸配列に対して試験又はアッセイできる。
【００２９】
別の実施態様では、ポリペプチドは、当業者に公知の方法によってサンプルから得られる。例えば、本発明の非侵襲的（non-invasive）な方法を用いて得られた全細胞調製物は、ポリペプチドを含む。あるいは、ポリペプチドを、予備的なクロマトグラフィー及びモノクローナル抗体又はポロクローナル抗体を用いることを含む免疫学的分離を含む従来の手段を用いてさらに単離又は精製することができる。次いで、ポリヌクレオチドを特徴解析し、皮膚反応（dermatatic reaction）の存在を呈示することができる。
【００３０】
ある実施態様では、本発明は、サイトカインをコードするポリヌクレオチドを検出することによって皮膚サンプル中の刺激反応とアレルギー反応とを識別する方法を提供する。正常又は標準的な組織サンプルに関するある種のサイトカインの相対量で、反応タイプ及び／又は反応の重篤度を識別する。
【００３１】
現在の臨床試験は、組織中の刺激反応とアレルギー反応を識別することはできないこともあるが、本発明の非侵襲的方法は、それらの相対的サイトカイン発現プロフィールによってその二つの反応を識別できる。刺激性接触皮膚炎（irritant contact dermatitis）は、サイトカインをコードするポリヌクレオチド又はサイトカインポリペプチドの存否によってアレルギー性接触皮膚炎と区別できる。例えば、本発明では、ICD由来の細胞は、用いた方法によるACD障害を有する細胞由来のポリヌクレオチドと比べて、検出不可能な濃度のIL-4をコードするポリヌクレオチドを有する。それ故、その方法（process）は、例えば、組織から単離された、DNA、又はメッセンジャーRNA（mRNA）を含むRNAを利用できる。DNA又はRNAは、1本鎖又は2本鎖であり得る。RNAが得られると、当業界で周知のDNAに対する鋳型を逆転写するのに最適な酵素及び条件を用いることができる。あるいは、RNAをRNAseプロテクションアッセイにかけることができる。それぞれの1本の鎖を含むDNA−RNAハイブリッドを用いることもできる。ポリヌクレオチドの混合物を利用することもでき、あるいは同一又は異なるプライマーを用いる予備増幅反応で生成したポリヌクレオチドを用いることもできる。ポリヌクレオチド配列を増幅すべき場合には、ポリヌクレオチド配列を、より大きな分子の画分とすることもでき、又は分離した分子として最初に存在させて、特定配列が完全な核酸であるようにすることができる。増幅されるべき配列は純粋な形態で最初に存在する必要はなく；ヒトの全DNA中に含まれているような、複合混合物の微量画分であってもよい。
【００３２】
さらに、RNAがサンプルから得られるポリヌクレオチドであれば、RNAseプロテクションアッセイが使用できる。この方法では、標識アンチセンスRNAプローブが、サンプル中の相補的なポリヌクレオチドにハイブリダイズする。残ったハイブリダイズしない1本鎖プローブは、リボヌクレアーゼ処理によって分解される。ハイブリダイズした2本鎖プローブはRNAse消化から保護される。適当な時間の後、消化反応の生成物を回収し、ゲル上で分析する（例えば、Ausubelら, 分子生物学の最新プロトコール（CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY）, 4.7.1節(1987)を参照されたい）。本明細書中で用いる「RNAプローブ」とは、対象となるサンプル中のRNAにハイブリダイズできるリボヌクレオチドをいう。当業者であれば、測定すべきポリヌクレオチドに特異的なRNAseプロテクションアッセイを特定し、そして、例えば、プローブ特異性、ハイブリダイゼーション温度、核酸の量などについて改変できるであろう。さらに、多数の市販キット（例えば、RiboQuantTM Multi-Probe RNAse Protection Assay System（Pharmingen, Inc.社製、カリフォルニア州サンディエゴ））を用いることができる。
【００３３】
別の実施態様では、サンプル中のポリヌクレオチドをノーザンブロット又はサザンブロットによって分析することができる。この技術では、ポリヌクレオチドをゲル上で分離し、次いで、目的の配列に相補的ポリヌクレオチドをプローブにして探索する。例えば、RNAをゲル上で分離し、ニトロセルロースに転写し、目的の配列に相補的なDNAをプローブにして探索する。相補的プローブは、放射性標識、科学標識等されている場合もある。プローブのハイブリダイゼーションは、目的のポリヌクレオチドの存在を示す。
【００３４】
サイトカインをコードするポリヌクレオチドの検出は、核酸のサイズ分画などの標準的方法によって行うことができる。DNA及びRNAのサイズ分画法は、当業者に周知であり、例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）を含むゲル電気泳動などである。例えば、ゲルは変性7 M又は8 M尿素−ポリアクリルアミド−ホルムアミドゲルであってもよい。核酸のサイズ分画は、当業者に周知のクロマトグラフィー方法によって達成されてもよい。
【００３５】
ポリヌクレオチドの検出は、任意に放射性標識プローブによって行うことができる。適当なシグナルを与える任意の放射性標識を用いることができる。他の標識は、リガンド、着色染料、及び蛍光分子を含み、標識リガンドなどの特異的結合対のメンバーとして作用ことができる。標識調製物は、サザンハイブリダイゼーション法又はノーザンハイブリダイゼーション法（例えば、サンプルから得られたヌクレオチドをポリヌクレオチドが結合するフィルターに転写する）によるポリヌクレオチドへのプロービングに用いられる。標識ポリヌクレオチドプローブへの暴露によって、標識ポリヌクレオチドプローブは、標的核酸配列を含むヌクレオチド断片にハイブリダイズし、放射性プローブの標的核酸断片への結合は、オートラジオグラフィーによって同定される（遺伝子工学（Genetic Engineering）, 1, Robert Williamson編, Academic Press社 (1981), 72-81頁を参照されたい）。特定のハイブリダイゼーション法は本発明に必須ではない。ハイブリダイゼーション法は、周知であるか、又は当業者には容易に確かめられる。ハイブリダイゼーション法は改良を施されるが、それらは本発明の方法に容易に適用できる。
【００３６】
所望のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを増幅してから検出することができる。語句「増幅」とは、たった１つのポリヌクレオチド分子から複数の核酸のコピーを作成する過程をいう。ポリヌクレオチドの増幅は、当業者に公知の生化学的工程によってin vitroで行うことができる。増幅試薬は、酵素を含むプライマー伸長産物の合成を達成するために機能するあらゆる化合物又はシステムであってよい。この目的に適した酵素としては、例えば、大腸菌DNAポリメラーゼI、Taqポリメラーゼ、大腸菌DNAポリメラーゼIのクレノウフラグメント、T4 DNAポリメラーゼ、他の利用可能なDNAポリメラーゼ、ポリメラーゼムテイン、逆転写酵素、リガーゼ、及び熱安定性酵素（すなわち、変性を起こさせるのに十分高い温度に付した後にプライマー伸長を行う酵素）が挙げられる。好適な酵素は、それぞれの突然変異ヌクレオチド鎖に相補的なプライマー伸長産物を形成するのに適切な方法でヌクレオチドの結合を促進するだろう。一般に、合成は各プライマーの3'末端で開始され、合成が終結するまで鋳型鎖に沿って5'方向に進行し、異なる長さの分子を生成する。それらは、5'末端で合成を開始し、上記と同じ工程を用いて反対の方向に進行する増幅試薬が存在しうる。いずれの場合も、本発明の方法は、本明細書中に記載した増幅の態様に限定されない。
【００３７】
本発明に用いることができるin vitro増幅の１つの方法は、米国特許第4,683,202号及び第4,683,195号に記載したポリメラーゼ連鎖反応（PCR）である。語句「ポリメラーゼ連鎖反応」とは、熱安定性DNAポリメラーゼ及び2つのオリゴヌクレオチドプライマー（一方は増幅されるべき配列の一方の末端で(+)鎖に相補的であり、他方は他方の末端で(-)鎖に相補的である）を用いるDNA塩基配列の増幅方法をいう。新たに合成されたDNA鎖は、続いて、同じプライマー配列のさらなる鋳型となり、プライマーのアニーリング、鎖伸長、及び解離からなる連続的な繰り返しで、所望の配列の迅速で特異性の高い増幅が得られる。ポリメラーゼ連鎖反応は、サンプル中のサイトカインをコードするポリヌクレオチドの存在を検出するのに用いられる。多くのポリメラーゼ連鎖方法は当業者に公知であり、本発明の方法で用いることができる。例えば、DNAを、以下のようにサーマルサイクラー中で30〜35サイクルの増幅にかけることができる：95℃30秒、52℃〜60℃1分、及び72℃1分、最終伸長ステップでは72℃5分。別の例としては、DNAを、95℃の変性温度で30秒、次いで、54〜58℃の範囲の可変のアニーリング温度で1分、伸長ステップ7として0℃1分及び最終伸長ステップとして70℃でのサーマルサイクラー中で35サイクルのポリメラーゼ連鎖反応に付すことができる。
【００３８】
本発明のポリヌクレオチドを増幅するのに用いるプライマーは、目的のポリヌクレオチドにハイブリダイズできさえすれば、従来のリン酸トリエステル法及びリン酸ジエステル法又はその自動化態様などの任意の好適な方法を用いて調製できる。改良された固相支持体上でオリゴヌクレオチドを合成する１つの方法は、米国特許第4,458,066号明細書に記載されている。プライマーの的確な長さは、温度、バッファー、及びヌクレオチド組成を含む多くの因子に依存するだろう。プライマーは、増幅を誘導する試薬の存在下で伸長産物の合成を開始させなければならない。
【００３９】
本発明の方法に従って用いられるプライマーは、増幅されるべきヌクレオチド配列のそれぞれの鎖に相補的である。語句「相補的」は、プライマーが、重合のための試薬が機能する条件下でそれらのそれぞれの鎖にハイブリダイズしなければならないことを意味する。言い換えれば、隣接する配列に相補的なプライマーは、その隣接する配列とハイブリダイズし、ヌクレオチド配列を増幅させる。伸長されるプライマーの3'末端は、相補的な隣接する鎖と完全に塩基対形成する相補性を有することが好ましい。
【００４０】
当業者であれば、標的核酸のコピー数を増加させるのにも利用できる種々の増幅方法論を知っているであろう。本発明の方法で検出されるポリヌクレオチドは、別のポリメラーゼ連鎖反応、オリゴマー制限（oligomer restriction）（Saikiら, Bio/Technology 3:1008-1012 (1985)）、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ASO）プローブ分析（Connerら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:278 (1983)）、オリゴヌクレオチド連結アッセイ（OLA）（Landegrenら, Science 241:1077 (1988)）、RNAseプロテクションアッセイなどの特定核酸配列の検出に通常適用される任意の方法によって、溶液中又は固体支持体に結合してのいずれかで、さらに評価、検出、クローニング、配列決定等され得る。DNA分析のための分子技術は、総説されている（Landegrenら, Science, 242:229-237(1988)）。DNA増幅に続いて、反応生成物は、放射性プローブを用いることなく、サザンブロット分析によって検出できる。この方法では、例えば、組織又は被験体（subject）から得たポリヌクレオチドを含むDNAの少量のサンプルを増幅し、サザンブロット法によって分析する。非放射性プローブ又は標識の使用は、高レベルに増幅されたシグナルによって促進される。本発明のある実施態様では、１つのヌクレオチド三リン酸を放射性標識し、それによってオートラジオグラフィーで増幅産物の直接視覚的認識を可能にする。別の実施態様では、増幅プライマーは蛍光標識され、電気泳動システムにかけられる。増幅産物の視覚化は、放射性シグナルを用いずに、レーザー検知され、次いでコンピューターを使って図示される。
【００４１】
分離された生成物を含むゲルの簡単な視覚化を利用して、皮膚炎反応の存在又は重篤度を測定できる。例えば、分離されたポリヌクレオチドを視覚化するためのゲルの染色法として、多数の染色が当業者に周知である。しかしながら、当業者に公知の他の方法（例えば、スキャニング・デンシトメトリー、コンピューターを使ったスキャニング及び定量など）も用いることができる。
【００４２】
すなわち、上記の方法は、刺激性反応又はアレルギー反応などの皮膚炎を有すると疑われる被験体から非侵襲的に組織サンプルを得るため及びそのサンプルからポリヌクレオチドを単離するのに用いることができる。次いで、ポリヌクレオチドは、以下に限定されないが、上記の方法などの方法を用いて分析できる。幾つものサイトカインのレベルは、得られたサンプル中のそれらの相対的な発現を測定し、それらの濃度を正常な標準サンプルと比較することによって定量できる。例えば、皮膚中のタンパク質の製造が増加又は低減されると、細胞中のmRNA濃度が変化する。従って、RNA、特にmRNAの測定は、皮膚中で、又は局所性又は全身性応答の結果として起きる炎症反応などのイベントのモニターを提供する。この非侵襲的方法が、生物学的因子が皮膚中、より特定的には皮膚の角質層の下に存在しさえすれば、任意の反応、障害、又は疾病を検出できることが認識できるだろう。例えば、本発明者らは、サイトカインIL-4をコードするポリヌクレオチドは、正常皮膚又はICD障害を受けた皮膚よりもアレルギー性接触皮膚炎（ACD）障害でより高いレベルで検出できることを発見したが、これに限定するわけではない。さらに、本発明者らは、IL-13をコードするポリヌクレオチドが、正常又はICDの皮膚よりもACDの皮膚でより高濃度であることを発見した。これに対し、IL-8をコードするポリヌクレオチドは、正常皮膚と比べてACD及びICDの両者でより高レベルである。つまり、IL-8ポリヌクレオチドの高いレベルは、一般的な接触皮膚炎を検出することにより診断的に用いることができる。本発明の方法を用いることによって、サイトカインをコードするポリヌクレオチドのレベルを測定し、正常−標準サンプルと比較して反応の重篤度を決定することができる。
【００４３】
皮膚炎反応を識別するためのサイトカインの検出方法は、代わりに、サイトカインポリペプチドの検出を用いることができる。細胞中のサイトカインポリペプチドの検出方法は、皮膚炎反応を有すると疑われる被験体から得た細胞中の特定のサイトカイン（例えば、IL-4、IL-8及び／又はIL-13）のレベルを測定することによる反応の識別に有用である。そのようなサイトカインのレベルは、同種組織の正常又は標準サイトカインポリペプチドプロフィールと比較することによって、反応の指標となる。従って、サイトカインポリペプチドの発現パターンは、皮膚炎反応のタイプ及び程度に依存して変動するだろう。これについては、本明細書中に記載のように、得られたサンプルはポリペプチドを単離するための供給源として用いることができる。特定のポリペプチド（例えば、IL-4）の測定は、ACDを同定する方法として役立てることができる。例えば、皮膚のこすり取り（scraping）又は皮膚の剥ぎ取り（stripping）の後、上記方法を用いて、角質層から単離した細胞を何らかの手段によって溶解し、細胞からポリペプチドを得ることができる。次いで、これらのポリペプチドは、当業者に公知の方法（例えば、ELISAによって）を用いて定量できる。
【００４４】
特定のポリペプチド（例えば、IL-4、IL-8、IL-13など）に対するモノクローナル抗体は、皮膚炎などの障害と関係するポリペプチドを検出するための、液相中又は固相担体に結合した形でイムノアッセイに用いることができる。さらに、これらのイムノアッセイ中では、モノクローナル抗体は、種々の方法で検出可能な標識を付すことができる。本発明のモノクローナル抗体を利用できるイムノアッセイのタイプの例にはは、直接的又は間接的方法のいずれかの競合及び非競合イムノアッセイがある。そのようなイムノアッセイの例は、ラジオイムノアッセイ（RIA）及びサンドイッチ（免疫学的）アッセイである。本発明のモノクローナル抗体を用いるポリペプチド抗原の検出は、順方向（forward）、逆方向（reverse）、又は同時様式のいずれかで行われる、生理学的サンプルに関する免疫組織化学アッセイを含むイムノアッセイを用いて行うことができる。当業者であれば、他のイムノアッセイ方法を知っているか、又は過度の実験をすることなく他のイムノアッセイ方法を容易に認識できる。さらに、目的のサイトカインに対する多数の市販の抗体がある。
【００４５】
語句「免疫学的（immunometric）アッセイ」又は「サンドイッチイムノアッセイ」は、同時サンドイッチ、順方向サンドイッチ及び逆方向サンドイッチイムノアッセイを含む。これらの語句は、当業者であれば十分理解している。当業者であれば、本発明による抗体が、現在知られているか又は将来開発されうるアッセイの他の変法及び形態においても有用であろうことも十分理解しているだろう。これらは本発明の範囲内に含まれることを意図する。
【００４６】
モノクローナル抗体は、多くの異なる担体に結合でき、サイトカインポリペプチドの存在を検出するのに用いることができる。周知の担体の例としては、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然及び改変セルロース、ポリアクリルアミド、アガロース並びに磁鉄鉱が挙げられる。担体の性質は、本発明の目的のためには、可溶性又は不溶性のいずれであってもよい。当業者であれば、モノクローナル抗体が結合するための他の適当な担体を知っているか、又はそれを日常的な実験を用いて確かめることができるであろう。
【００４７】
サイトカインポリペプチドは、生物学的液体及び組織中に存在するときは、モノクローナル抗体によって検出できる。検出可能な量のサイトカインを含む任意のサンプルを用いることができる。サンプルは、血液、血清等などの液体、又は組織、皮膚サンプルなどの固体若しくは半固体、あるいは、組織学的診断で一般に用いられるような固体組織であり得る。
【００４８】
アッセイを実行するには、（通常、標識した可溶性抗体が添加されている）インキュベーション媒体中に、ある種の「ブロッカー」を含ませることが望ましい。「ブロッカー」は、非特異的タンパク質、プロテアーゼ、又は実験サンプル中に存在する抗サイトカイン免疫グロブリンに対する抗異種免疫グロブリンは、交差反応しないか、又は固相支持体上の抗体、若しくは放射性標識指示抗体を破壊して偽陽性又は偽陰性結果を与えないために添加される。それ故、「ブロッカー」の選択は、実質的にアッセイの特異性を増加させうる。
【００４９】
アッセイで用いられる抗体と同じクラス又はサブクラス（アイソタイプ）（例えば、IgG1、IgG2a、IgM等）の不適切な（すなわち、非特異的な）抗体を、「ブロッカー」として用いることができることは周知である。適切な感受性を維持するが、試料中に相互に生じる交差反応性タンパク質による任意の好ましくない干渉を抑制するために、「ブロッカー」の濃度（通常1〜100μg/μl）は重要であるだろう。
【００５０】
別の実施態様では、本発明は、堅い表面、粘着テープ、又はその両方からなる群から選択される細胞採集デバイス及び皮膚サンプル中の核酸を保護するのに好適な細胞溶解用バッファーを含む、非侵襲的に皮膚からサンプルを得るためのキットを提供する。別の実施態様では、本発明は、細胞採集デバイス、細胞溶解用バッファー及び組織中の刺激性反応とアレルギー反応を識別するmRNA検出試薬を含むキットを提供する。このキットは、ポリヌクレオチド検出試薬（例えば、IL-4などのサイトカインをコードするポリヌクレオチド配列に相補的なオリゴヌクレオチドプライマー）を含む。このようなキットは、バイアル、チューブなどの厳重に密封できる1以上の容器中に入れて区分した運搬手段を含んでいてもよく、その各容器は、この方法で用いられる個々の要素のうちの１つを含む。第２の容器が存在するならば、それに溶解用バッファーを入れることができる。あるいは、該キットは、その上で電流を用いて細胞を溶解できるコンピュータータイプのチップを含むことができる。
【００５１】
キットは、標的核酸配列の増幅又はそれへのハイブリダイゼーションのためのヌクレオチド(標識されていても標識されていなくてもよい)を含む容器、又はリポーター分子（例えば、酵素、蛍光、又は放射性核種で標識した分子など）に結合するビオチン結合性タンパク質（例えば、アビジン又はストレプトアビジンなど）などのリポーターを含む容器を含んでもよい。語句「検出可能なように標識したデオキシリボヌクレオチド」とは、デオキシリボヌクレオチドを同定するための手段を指す。例えば、検出可能な標識は、放射性標識ヌクレオチドか、又は十分に特性のわかっている大きな分子によって認識される小さな分子であって、ヌクレオチドに共有結合したものであり得る。これらの小さな分子の例は、アビチンが結合するビオチン、及び抗チロキシン抗体が結合するチロキシン（甲状腺ホルモン）である。酵素、蛍光化合物、化学発光化合物、燐光性化合物、及び生物発光化合物を含む他の標識方法は、当業者に公知である。
【００５２】
別の実施態様では、本発明は、皮膚炎の原因となる化合物をスクリーニング又は同定する方法を提供する。この方法では、皮膚の細胞（例えば、角質細胞及びメラノサイトを含む表皮細胞、又は線維芽細胞などの真皮細胞など）に、皮膚炎反応を誘導する条件下で被験化合物を接触させる。接触させる条件は可変的であり、化合物のタイプ、試験する皮膚中の細胞のタイプ及び量、試験するサンプル中の化合物の濃度、並びにその化合物への暴露時間に依存するだろう。ある化合物が皮膚炎を引き起こす適当な条件を決定する当業界の技術は公知であり、たとえ必要であるとしても、日常的な実験だけであろう。皮膚細胞は、上記の技術（例えば、こすり取り又はテープによる剥ぎ取り）を用いて単離でき、次いで、細胞をin vitroで被験化合物に暴露することができる。あるいは、培養された皮膚細胞又は皮膚構築物を用いることもできる。例えば、皮膚細胞を任意の供給源から得て、十分にコンフルエントになるまで標準的な細胞培養条件下にて固体又は半固体支持体上で培養してもよい。コンフルエント又はサブコンフルエントになると、細胞を被験化合物に暴露する。次いで、化合物に暴露した細胞からポリヌクレオチドを単離して、上記のように定量する。例えば、限定するものではないが、上記のテープによって、又はこすり取り方法によって、細胞を単離して、mRNAを単離することができる。次いでこのmRNAを特定のサイトカインに対するプローブを用いて定量する。あるいは、mRNAをポリヌクレオチドの検出の前にRT-PCRに供することができる。上記のように、サイトカインをコードするポリヌクレオチドの定量は、皮膚炎の指標となり、例えば、標準サンプルと比較してIL-4が増加していることはACDを示し、IL-4又はIL-13の増加を伴わないIL-8の増加はICDを示す。
【００５３】
本発明は以下に提示する具体的実施例によって範囲を限定されることはなく、実施例は本発明の個別の態様の１つの例示として意図されており、機能的に同等な方法及び構成成分は本発明の範囲内に含まれる。
【００５４】
実施例１
下層角質細胞（ sub-stratum corneum cell ）の非侵襲的回収
A. 硬質表面を用いた回収
皮膚細胞は、滅菌したNo. 15外科用メスによって皮膚から削り取ることによって非侵襲的に回収できる。外科用メスは、水平から約15度の角度で持ち、繰り返し、しかし優しく約1×1 cmのサイズの皮膚の区域を横切って削り取る。滅菌組織培養ウエルの内壁で刃を擦ることによって表皮細胞をウエルに移す。きらきら輝く表皮層に達したとき、出血を引き起こす前に削り取りを止め、削り取ったものが血液によって汚染されるのを避ける。細胞を滅菌された1 cmのペトリ皿に載せ、約300 mlの溶解用バッファーを培養用ウェルに添加する。表皮細胞が完全に溶解するまで、溶解用バッファーをピペットで吸ったり出したりする。
【００５５】
削り取りの開始から10分以内にRNA溶解用バッファーを添加する。滅菌組織培養ウエルをドライアイス上に置いておく。細胞をRNA溶解用バッファー中で溶解し、RNAseを含まない遠心チューブに移し、全RNAを抽出する。
【００５６】
B. 粘着性表面を用いた回収
皮膚細胞は、Ductテープ（333 Duct テープ、Nashua tape products社製）、Scotch（登録商標）テープ（3M Scotch（登録商標）810、ミネソタ州セントポール）、又はD-SQUAME（登録商標）（CuDerm社製、テキサス州ダラス）を用いて非侵襲的に回収できる。皮膚を最高25回まで剥ぎ取る。さらに、テープの粘着性が高ければ高いほど、必要な剥ぎ取りが少ないことが認識されるだろう。皮膚細胞は、攪拌（vortexing）、及び、続いて溶解用バッファーを含むRNAse不含のエッペンドルフチューブ中でテープを遠心分離することによって回収した。同じ溶解用バッファーを単一の皮膚部位で用いた各テープ片に再度使用した。全工程は90分未満で行った。テープ剥ぎ取りプロセス自体は、その工程がなされた後最初の数時間は皮膚サイトカインプロフィールに影響しない。さらに、剥ぎ取り後早期の数時間の間、炎症性細胞は血液循環から真皮又は表皮に移動しない。
【００５７】
直ちに0.5 mlのTriReagent（Molecular Research Center, Inc.製、オハイオ州シンシナティー）中でテープを激しく攪拌することによってストリップに付着した細胞からRNAを抽出した。次いで、担体RNAとして酵母トランスファーRNA（4μg）を添加した後、全RNAを単離し、製造業者用指示書に従って精製した。各サンプルから単離された全RNAを、前もって光学濃度（OD）測定によるRNA量測定を行わずにRNAseプロテクションアッセイ（RiboQuant（登録商標）Multiprobe RNAse Protection Assay System、PharMingen, Inc.製、カリフォルニア州サンディエゴ）に用いた。アッセイは、標準アクリルアミドシーケンシングゲル上でサンプルを用いて行い、消化されたサイトカインのメッセージを同定するために用いた。消化されたRNAバンドを含むゲルを、最初にPhosphor Screen（Molecular Dynamics, Inc.社製、カリフォルニア州サニーベール）に暴露した。次いで、暴露したスクリーンを燐光体イメージャーStorm 860（Molecular Dynamics, Inc.製）でスキャンした。各サンプル中のバンド強度をソフトウエアImageQuantTM（Molecular Dynamics, Inc.製）によって分析した。
【００５８】
皮膚は損傷された表皮細胞から遊離されるRNAを素早く分解できるRNAseの豊富な供給源なので、サンプルのRNAse汚染を避けるために適切な注意が払われるべきである。本明細書中に記載されたサンプル採集及び抽出技術は、RPAによるmRNAの検出能力によって示されるような顕著な分解を伴わずに、皮膚RNAが確かに得られることを示している。
【００５９】
実施例２
テープ剥ぎ取りによって得られた細胞の分析
蒸留水中の0.5％ラウリル硫酸ナトリウム（SLS）を72時間、上腕に適用することによって、刺激性接触皮膚炎（ICD）を誘導した。この暴露の後、紅斑標準スコアリングスケール（フィッシャーの接触皮膚炎（Fisher's Contact Dermatitis）, 第4版, Rietschel, R.L.及びFowler, J.F. Jr.編、Williams & Wilkins社、ボルティモア1995, 29頁）に従ってランク付けした。アセトン中のジブチルスクワレートを同じ被験体の上腕に48時間閉塞（occlurion）して適用することによってアレルギー性接触皮膚炎（ACD）を誘導した。同じ個体（被験体No. 1）の上腕を12回テープ剥ぎ取りし、上記実施例2で記載したように処理した。
【００６０】
図1のレーン1は、スクワレートによって誘導された臨床的に3+紅斑と読める皮膚のACD紅斑区域から単離されたRNAを示す。レーン3は、0.5％SLSに暴露することによって誘導された臨床的に2+紅斑と判定されるICD紅斑皮膚由来のRNAである。Ｘ線フィルムの暴露後、サイトカインIL-4のバンドは、レーン1では明瞭に見られるが、ICD細胞由来のRNAを含むレーン3には見られない。このように、ACD反応におけるサイトカインパターンは、ICD反応及びレーン2で見られる正常皮膚とは異なっていた。
【００６１】
その後の実験で、皮膚炎を有する全ての被験体がACD反応を示した区域の皮膚由来の細胞中のサイトカインIL-4をコードするmRNAを有していた（図2中のレーン8、11、13）。それに対して、IL-4は、任意のICD処理された皮膚区域又は同じ被験体から得られた正常皮膚サンプル中には見られなかった。さらに、5人の被験体のうちの4人（図2中の被験体2、3、4及び5）で、紅斑が刺激性反応又はアレルギー反応によって誘導された皮膚の紅斑区域中にIL-8が存在したが、正常皮膚から得られたRNA中には存在しなかった。すなわち、IL-8のmRNAは、皮膚炎の一般的な指標であった。
【００６２】
活性化されたT細胞によって分泌されるサイトカインであるIL-3をコードするmRNAは、アレルギー性炎症がスクワレートによって誘導された皮膚の4つの紅斑区域のうちの3つ（図2中のレーン5、8、11、13）に存在した。γインターフェロン（IFN-γ）に関連する分子量を有するmRNAを含有していると思われる近傍の位置に、かすかなバンドが見られた（図2中のレーン8及び11）。これらのバンドは、スクワレート（ACD）処理した5つの皮膚サンプルのうちの2つから抽出されたmRNA中に存在した。IL-13の場合のように、IL-4のmRNAを有する同じレーンでも、IFN-γのmRNAと思われるバンドが見られた。
【００６３】
B細胞成長因子であるIL-14は、スクワレート処理した皮膚サンプルの幾つか並びにSLS処理した皮膚サンプルの幾つかに存在した（図2）。この実験で視覚化できた全13サンプルで、多機能性サイトカインであるIL-9が検出された。さらに、明瞭に視覚化できた全てのレーン（15サンプル中13サンプル）で、一酸化窒素合成酵素の誘導性アイソフォーム（iNOS）及びIL-9のmRNAが見られた（図2）。
【００６４】
IL-13と同じレーンのIL-4の存在は、これら2つのサイトカインマーカーがサンプルを得た皮膚中のアレルギー反応によって誘導されることを強く示唆している。
【００６５】
種々の皮膚反応で見られる紅斑の臨床的定量化は、表1及び表2に記されている。
【００６６】
【表１】
ACD反応
ND；検出されず
＊；ゲルの解読不可能であった。
NT；試験せず
2+；中程度の紅斑（赤）
【００６７】
【表２】
ICD反応
ND；検出されず
＊；ゲルの解読不可能であった。
NT；試験せず
1+；軽度の紅斑（淡いピンク）
2+；中程度の紅斑（赤）
3+；重度の紅斑（濃い赤）
【００６８】
実施例３
被験体No. 3〜5でのサイトカインと炎症の程度との間の関係をさらに試験するために、IL-4、IL-8及びIL-13のRNAレベルを、対応するハウスキーピング遺伝子濃度に対して基準化した（表3）。分析した3つの被験体で、RNAレベルと反応の重篤度の間に相関関係が存在する。表2は、最も強い皮膚反応由来のサンプルも、ACD反応を有し、IL-8の最大の相対量を示すものであることを示している。例えば、ACD部位で2+の反応及びICD部位でわずかな（低い+1）反応のみを有する被験体No. 4は、上記のRPA法を用いてICDとACDとを比較したとき、IL-8／GAPDH比において約2倍の差を示した。さらに、もしゲル上にIL-4のバンドが存在し、IL-4／GAPDHの値が約0.001以上であるなら、ACD反応が想定される。また、約0.13以上のIL-13／GAPDH値を有してIL-13バンドが存在する場合には、ACD反応が確実視される（表3）。
【００６９】
【表３】
NC；計算せず
本発明の多数の実施態様を記載した。しかしながら、本発明の精神及び範囲から離れることなく種々の改変がなされ得ることは理解されるであろう。従って、他の実施態様は、以下の特許請求の範囲内である。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図1はある同一の被験体の上腕の3カ所の異なる領域をテープで剥ぎ取ることによって得られたRNAでRNaseプロテクションアッセイ(RPA)を行った結果を示すゲルの像を示している。
【図２】 図2はさらに4名の上腕の3カ所の異なる領域のテープによる剥ぎ取りによって得られたRNAを用いて行ったRPAの結果である。
発明の分野
本発明は表皮中の生物学的因子の検出法に関し、その生物学的因子はポリヌクレオチドもしくはそのポリヌクレオチドでコードされるポリペプチドまたは脂質であり得る。
【０００２】
発明の背景
細胞および組織は内因性および外因性の作用物質によって影響を受け、ある作用物質に対しての応答をメディエートする生物学的活性のカスケードで応答する。例えば、皮膚は外因性作用物質への暴露の結果生ずる多数の皮膚反応の部位である。また、皮膚は身体で最もアクセスしやすい器官である。このように、皮膚は、ある特定の反応に伴って生ずる、またはその反応を引き起こすような遺伝子および遺伝子産物ならびにタンパク質反応の決定に役に立つものである。
【０００３】
表皮は、皮膚の最外層である。この層は4つの主要な細胞型を含んでいる。表皮で最も多数を占める細胞は分化の種々のステージにあるケラチノサイトである。表皮は、表皮の最下層である基底細胞層にあるこれらの細胞の有糸分裂によってケラチノサイトのプールを維持している。これに対して、表皮の最上層を覆っている層は角質層で、これは正常な皮膚では、有核細胞を含んでいない。ケラチノサイトは、インターロイキン(IL)-1、IL-3、IL-4、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)を含む多数のサイトカインを産生する(Kupper, M., 1993, Am. J. Dermatopathol. 11:69-73)。基底細胞層の上部にはランゲルハンス細胞があり、これは骨髄由来の免疫応答能のある細胞である。ランゲルハンス細胞はマクロファージとT細胞の特徴を有し、接触皮膚炎などの皮膚における免疫応答に至る一連のイベントを開始させると考えられる。メラノサイトは皮膚における色素産生細胞である。この細胞はまた、通常は表皮のより深い位置に常在している。表皮の第4の細胞はメルケル細胞である。
【０００４】
表皮の直下には、主として線維芽細胞、リンパ球、肥満細胞、内皮細胞、および神経終末を含んでいる皮膚層がある。線維芽細胞は、皮膚の細胞外マトリックス物質および構造タンパク質、例えばコラーゲンなどを貯えている主要な細胞型である。内皮細胞は皮膚の毛細血管の内腔をコートしており、肥満細胞は皮膚の炎症反応で遊離されるヒスタミンを含んでいる。
【０００５】
皮膚の炎症は広範な外因性作用物質が皮膚に適用されることによって引き起こされ得る。接触皮膚炎のクラスとしては、刺激性、アレルギー性、光アレルギー性および光毒性、ならびに不顕性の機作によるものが挙げられる。臨床的には、反応は実質的に同一で、紅斑、浮腫、および小胞形成を特徴とする湿疹過程の外観を呈する(Hoefakkerら, 1995, Contact Dermat. 33:258-266; Krasteva, M., 1993, Int. J. Dermatol. 32:547-560)。接触じんま疹は種々の作用物質の皮膚への適用に対するものとして起こりうる別の反応で、それは皮膚との接触に対して直ちに膨疹が出現することが異なっている。接触反応の機作を分類することは患者にとって重要である。この分類は、感作後の再暴露にともなって徐々に重篤な皮膚の炎症に至るアレルギー性または免疫応答の免疫学的な帰結に由来している。例えば、ある作用物質の暴露に対する炎症反応の型を特徴づけることによって、患者および医薬品製造者に、以降の炎症反応を避けるための製品の購入および製品を再デザインする能力を与えることとなる。
【０００６】
接触皮膚炎が過去に頻繁に生じていることから、全ての新規局所用医薬品またはコスメシューティカル(機能性化粧品)についてヒト皮膚での試験の実施を促している。現在では、皮膚への接触が行われるいかなる製品についても、的確に行われた皮膚安全性試験の蓄積を市場に出す前に行うことが多くの国々で要求されている。製品およびその構成成分を用いての皮膚パッチテストによる予測はこのような皮膚安全性試験法の柱として行われてきた。この予測的皮膚パッチテストの開始以来の主な欠陥は刺激性接触皮膚炎(ICD)とアレルギー性接触皮膚炎(ACD)とを明確には識別し得ないことである。さらに、パッチテストは紅斑、浮腫、および小胞形成の定性的可視的スコアに依存しており、反応の重症度を定量的に測定するには不十分である。
【０００７】
概要
上述の限界を克服することが本発明の1つの目的である。本発明は角質層の下にある皮膚細胞中の生物学的因子を非侵襲的に検出するための方法を提供する。生物学的因子の特徴を調べることは、全身的な反応、ならびに接触皮膚炎などの局所反応を識別するために有用であり、より特定して述べれば、刺激性接触皮膚炎(ICD)とアレルギー性皮膚炎(ACD)とを識別するために有用である。
【０００８】
また別の1実施形態においては、本発明はポリヌクレオチドのサンプルを得るための非侵襲的方法を提供し、そのサンプルはその後に行う接触皮膚炎の試験に用いられる。好ましい1実施形態においては、皮膚の表皮の角質層は硬質表面でこすり取ることなどによって取り除く。別の好ましい1実施形態においては、表皮は接着性表面と1回以上接触させる。
【０００９】
別の1実施形態においては、本発明は被験体から得た角質層の下にある細胞におけるIL-8をコードするポリヌクレオチドを定量することによって、その被験体がICDであるかを診断する方法を提供するが、ここでIL-13に対してIL-4が相対的に存在していない状態においてIL-8 mRNAが存在することが、ICDの指標となる。
【００１０】
別の1実施形態においては、本発明は被験体から得た角質層の下にある細胞におけるIL-4をコードするポリヌクレオチドを定量することによって、その被験体のACDを診断する方法を提供するが、ここでIL-4 mRNAが存在することがACDの指標となる。
【００１１】
さらに、本発明は被験体の皮膚の角質層の下にある細胞からポリヌクレオチドを得るための方法であって、角質層を除去して生きた表面を露出させ、その露出された表面からポリヌクレオチドを採取することを含む方法を提供する。
【００１２】
別の1実施形態において、本発明は、被験体の皮膚細胞におけるIL-13をコードするポリヌクレオチドを定量することを含む、被験体のIL-13の発現を検出することによるACDの診断法であって、IL-13ポリヌクレオチドの量が増大していることがACDの指標となる方法を提供する。
【００１３】
別の1実施形態においては、本発明は硬質表面および接着テープなどの細胞採取装置、接着テープ、ならびに皮膚サンプル中の核酸の保存に適した細胞溶解バッファーまたはコンピューターチップを含む、皮膚からサンプルを非侵襲的に得るためのキットを提供する。
【００１４】
別の1実施形態においては、本発明は細胞採取装置、細胞溶解バッファー、およびハイブリダイゼーション試薬などの検出試薬を含むキットを提供する。
【００１５】
さらなる1実施形態においては、本発明は皮膚の1区画を被験化合物と接触させ、その後にサイトカインまたはサイトカインポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの存在を検出することによって皮膚炎の原因となる化合物を同定する方法を提供し、その方法では該ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの存在が皮膚炎の指標となる。この実施形態の方法は、in vivoまたはin vitroで行うことができ、そのようなものとしては3次元の器官型皮膚構築物を用いるものを含んでいる。
【００１６】
本発明の1つ以上の実施形態の詳細は付属の図面および下記の説明に示している。本発明のその他の特徴、目的、および利点についてはそれらの説明および図面から、ならびに特許請求の範囲から明らかであろう。
【００１７】
図面の説明
図1はある同一の被験体の上腕の3カ所の異なる領域をテープで剥ぎ取ることによって得られたRNAでRNaseプロテクションアッセイ(RPA)を行った結果を示すゲルの像を示している。その3カ所のテープ引き剥がしはそれぞれ12回行った。4種類の異なるRNAプローブ(IL-4、IL-8、L32、GAPDH)を被験体から得たRNAサンプルにハイブリダイズさせるために用いた。レーン1は皮膚の紅斑の領域から単離されたRNAを示しており、その紅斑はスクアレート(squarate)で誘発させたもの(ACD)で臨床的には2＋の紅斑と判定されるものである。レーン3に示したものは0.5%のラウリル硫酸ナトリウム(SLS)で誘発させたICD紅斑部位(2＋のスコアのもの)から単離されたRNAである。2つのレーンの双方ともIL-8のバンドを示している。レーン2は、同じ被験体の非炎症性の正常な外観の皮膚から得たサンプルを示している。アレルギー反応から誘導されたサイトカインIL-4の1本のバンドが、レーン1に認められる。
【００１８】
図2はさらに4名の上腕の3カ所の異なる領域のテープによる剥ぎ取りによって得られたRNAを用いて行ったRPAの結果である。このゲル中には6種の異なるRNA (IL-4、IL-8、IL-9、IL-13、IL-14、および酸化窒素合成酵素のアイソフォーム(iNOS))と、さらに2つのハウスキーピング遺伝子のためのリボプローブを含有させた。「＋」は被験体から集めた皮膚をSLS(図の下部の第2列)またはスクアレート (図の下部の第3列)のいずれかで処理したことを示すものである。
【００１９】
発明の説明
本発明は角質層の下の皮膚細胞から、ポリヌクレオチドなどの生物学的因子を採取するための非侵襲的方法を提供する。これらの生物学的因子の特徴を調べて被験体中における局所または全身の反応の存在を示すことができる。さらに、本発明は不顕性のものを含む全ての型の接触皮膚炎を識別する方法を提供する。好ましい1実施形態においては、本発明は、皮膚から得られた例えばサイトカインをコードするポリヌクレオチドなどの生物学的因子を検出することによって、刺激性反応とアレルギー反応とを識別するための方法に関する。1実施形態においては、核酸を含んでいるサンプルは非侵襲的に得られる。
【００２０】
炎症反応はその臨床的症状発現がしばしば類似している。炎症反応を示している患者を適正に治療するためにはその反応の適正な同定がなされねばならない。「類似の臨床的症状発現」とは2つ以上の反応が全体的に類似の臨床的および/または組織学的な外観を有していることを意味する。例えば、皮膚の接触皮膚炎は、皮膚と接触した広範な外因性作用物質からもたらされる可能性のあるものである。接触皮膚炎のクラスとしては、刺激性、アレルギー性、光アレルギー性および光毒性、ならびに不顕性の機作によるものが挙げられる。臨床的には、反応は実質的に同一で、紅斑、浮腫、および小胞形成を特徴とする湿疹過程の外観を呈する。ICDとACDの紅斑、浮腫、および小胞形成は見分けることができない。組織所見ですら、これら2つの過程は非常に小さな相異を示すのみで、しかも反応の最初の24時間の間にのみ認められる。
【００２１】
本明細書で用いている「核酸」、「ポリヌクレオチド」、または「核酸配列」という用語は、分離した断片の形またはより大きな構築物の構成成分としてのデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドのポリマーを意味する。本発明のポリヌクレオチドまたは核酸配列としては、mRNAおよびcDNA配列を含むDNA、RNAが挙げられる。
【００２２】
本明細書で用いている「ポリペプチド」という用語は、分離した断片の形またはより大きな構築物の構成成分としてのアミノ酸残基のポリマーを意味する。ポリペプチドの1例としてはサイトカインまたはその断片をコードするアミノ酸配列が挙げられる。ポリペプチドは、機能性のタンパク質またはタンパク質の断片をコードしうる。例えば、IL-4ポリペプチドには、アミノ酸のポリマーからなるIL-4のタンパク質の完全長の配列ならびにその断片が含まれる。
【００２３】
本明細書で用いている「サイトカイン」とは、細胞性の調節または分化において役割を果たしているいかなる因子をも意味する。例えば、サイトカインとしては、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-9、IL-13、IL-14を含むインターロイキン(IL)のファミリーならびにトランスフォーミング増殖因子β(TGF-β)スーパーファミリーに属する因子、GM-CSF、およびインターフェロンが挙げられる。
【００２４】
本明細書で用いている「生物学的因子」という用語は、生物活性を有する、または生物学的な役割を果たす多数の因子を意味する。例えば、生物学的因子としては、DNA、RNA、mRNA、およびcDNAなどのポリヌクレオチド、IL-4、IL-8、およびIL-13タンパク質およびそれらの断片などのポリペプチド、ならびにコレステロールなどの脂質、脂肪酸、およびロイコトリエンなどの炎症メディエーター、プロスタグランディン、およびその他のものが挙げられる。
【００２５】
「皮膚」という用語は、1または数層の厚さの、基底層の上に構築された、しばしば機械的防護または能動輸送に特化される細胞のシートを含んでなる組織である。好ましい1実施形態においては、皮膚は哺乳動物の皮膚である。より好ましい1実施形態においては、皮膚はヒトの皮膚である。ヒトの皮膚の表皮は数種の異なる皮膚組織層を含む。最も深い層は基底層で、それは柱状細胞からなる。その上の層は有棘層で、それは多面体細胞からなる。有棘層から押し上げられている細胞は平らになっており、ケラトヒアリン顆粒を合成して顆粒層を形成する。これらの細胞は外部へと移動するにつれて核を失い、ケラトヒアリン顆粒は張原線維と融合し一緒になる。このことによって淡明層と呼ばれる透明な層が形成される。淡明層の細胞は密に詰め込まれている。淡明層から細胞が上昇して行くにつれて、多層状の不透明な鱗屑へと圧縮されるようになる。これらの細胞は全て平らな細胞残遺物であり、それはケラチンで完全に充填され、核を含む他の内部構造を全て失っている。これらの鱗屑は表皮の外層である角質層を構成する。角質層の底部では、細胞は密に詰め込まれており、お互いが強く接着されているが、その層の上部へ行くほど粗く詰め込まれるようになり、やがては表面で薄片となってはげ落ちる。
【００２６】
「サンプル」という用語は被験体の皮膚に由来するいかなる標品をも意味する。例えば、上述の非侵襲的方法を用いて得られた細胞のサンプルは、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、または脂質を単離するために用いることができる。さらに、本発明の方法はin vitroで、例えば、固形または半固形の支持体、および器官型の皮膚構築物上で培養した皮膚細胞を用いることができる。そのような場合には、皮膚細胞はどのようなソースからのものでもよい。任意のin vitroまたはin vivoの検体から得られた精製または非精製形態の生物学的因子を、その生物学的因子が目的の因子を含むことを条件として、皮膚炎などの生物活性の検出用の出発材料として用いることができる。例えば、サンプルは、それが皮膚炎の指標となるサイトカインなどのポリペプチドをコードする特異的なポリヌクレオチド配列を含有しているか、または含有していることが疑われるものであれば、ポリヌクレオチドを検出することによって皮膚炎を検出するために用いることができる。
【００２７】
組織からのサンプルは当業界でよく知られている多数の方法のいかなるものによっても単離することができる。サンプルを単離するための侵襲的方法には、注射針を例えば血液サンプリングの際に使用すること、ならびに種々の組織の生検が挙げられる。これらの方法は侵襲的であるので、死亡率および罹患率が上昇する危険性がある。本発明は種々の疾患、障害、または炎症反応の検出、診断、または予後において生物学的因子を得るためのソースとして用いることのできるサンプルを非侵襲的に得るために有用な方法およびキットを提供する。好ましい1実施形態においては、本発明は皮膚炎反応を検出するために、生物学的因子例えば核酸および/またはポリペプチドなどの単離に用いる皮膚サンプルを得るための非侵襲的方法を提供する。この実施形態においては、皮膚の表皮細胞は硬い器具、例えば滅菌済の#15メスでこすり取られるが、皮膚の表面の層(すなわち角質層)のみを取り除くことのできる硬い器具であればいずれも用いることができることは理解されるであろう。あるいはまた、皮膚をこすり取る代わりに、皮膚の表皮層を接着テープ、例えばDuctテープ(333 Duct tape, Nashua tape products)またはScotch(登録商標)テープ(3M Scotch 810, St Paul, 米国ミネソタ州)を用いて除去することができる。しかし好ましい方法は、皮膚細胞層を引き剥がすためにD-SQUAME(登録商標)(CuDerm, Dallas, 米国テキサス州)を用いることである。この実施形態においては、皮膚をテープで引き剥がし、次いでその引き剥がされた細胞および細胞性物質を次いでメス、テープまたはその他のものから回収する。例えば、皮膚細胞および細胞性物質を得るために用いたテープを、溶解バッファーを入れた滅菌マイクロ分離管(microfuge tube)に入れて遠心分離することができる。メスの場合には、細胞および細胞性物質を滅菌ペトリ皿に移し、そこにある細胞を全て溶解バッファーで溶解させる。同じ溶解バッファーを、単一の皮膚部位で用いられたテープの各ピースまたはメスに再使用することができる。特定の適用法では、皮膚から細胞および細胞性物質を取り除くためにテープ引き剥がし法はこすり取り法と組み合わせることができる。次いで、得られたサンプルをさらに例えば、核酸、ポリペプチド、または脂質を単離するために処理することができる。好ましくは、用いられる方法は、測定しようとするポリヌクレオチド、ポリペプチド、または脂質レベルに悪影響を及ぼさないものである。本発明は、迅速で非侵襲的な、mRNAなどのポリヌクレオチドを得るための方法を提供し、それは皮膚細胞の合成パターンにおける変化を立証するための助けとなるものである。テープによる剥ぎ取り工程それ自体はその工程の実施後最初の2-3時間は皮膚のサイトカインのプロフィールに影響しないことが示されている。本発明のこすり取りおよび剥ぎ取り法を用いて、遺伝性疾患を含む局所または全身の疾患、障害、または炎症反応の存在を同定、識別、または診断することができる。本発明においては、転写およびポリペプチド合成の誘導に対応する反応、疾患、または障害のいかなるものも本発明の方法によって検出することができる。
【００２８】
ポリヌクレオチドは、溶解した細胞及び細胞性物質から、当業者に周知のいくつもの手段によって単離できる。例えば、限定はされないが、TriReagent（Molecular Research Center, Inc社製、オハイオ州シンシナティー）を含む多数の商業的製品がポリヌクレオチドの単離に利用できる。次いで、単離されたポリヌクレオチドは、サイトカインをコードするポリヌクレオチドを含む特定の核酸配列に対して試験又はアッセイできる。
【００２９】
別の実施態様では、ポリペプチドは、当業者に公知の方法によってサンプルから得られる。例えば、本発明の非侵襲的（non-invasive）な方法を用いて得られた全細胞調製物は、ポリペプチドを含む。あるいは、ポリペプチドを、予備的なクロマトグラフィー及びモノクローナル抗体又はポロクローナル抗体を用いることを含む免疫学的分離を含む従来の手段を用いてさらに単離又は精製することができる。次いで、ポリヌクレオチドを特徴解析し、皮膚反応（dermatatic reaction）の存在を呈示することができる。
【００３０】
ある実施態様では、本発明は、サイトカインをコードするポリヌクレオチドを検出することによって皮膚サンプル中の刺激反応とアレルギー反応とを識別する方法を提供する。正常又は標準的な組織サンプルに関するある種のサイトカインの相対量で、反応タイプ及び／又は反応の重篤度を識別する。
【００３１】
現在の臨床試験は、組織中の刺激反応とアレルギー反応を識別することはできないこともあるが、本発明の非侵襲的方法は、それらの相対的サイトカイン発現プロフィールによってその二つの反応を識別できる。刺激性接触皮膚炎（irritant contact dermatitis）は、サイトカインをコードするポリヌクレオチド又はサイトカインポリペプチドの存否によってアレルギー性接触皮膚炎と区別できる。例えば、本発明では、ICD由来の細胞は、用いた方法によるACD障害を有する細胞由来のポリヌクレオチドと比べて、検出不可能な濃度のIL-4をコードするポリヌクレオチドを有する。それ故、その方法（process）は、例えば、組織から単離された、DNA、又はメッセンジャーRNA（mRNA）を含むRNAを利用できる。DNA又はRNAは、1本鎖又は2本鎖であり得る。RNAが得られると、当業界で周知のDNAに対する鋳型を逆転写するのに最適な酵素及び条件を用いることができる。あるいは、RNAをRNAseプロテクションアッセイにかけることができる。それぞれの1本の鎖を含むDNA−RNAハイブリッドを用いることもできる。ポリヌクレオチドの混合物を利用することもでき、あるいは同一又は異なるプライマーを用いる予備増幅反応で生成したポリヌクレオチドを用いることもできる。ポリヌクレオチド配列を増幅すべき場合には、ポリヌクレオチド配列を、より大きな分子の画分とすることもでき、又は分離した分子として最初に存在させて、特定配列が完全な核酸であるようにすることができる。増幅されるべき配列は純粋な形態で最初に存在する必要はなく；ヒトの全DNA中に含まれているような、複合混合物の微量画分であってもよい。
【００３２】
さらに、RNAがサンプルから得られるポリヌクレオチドであれば、RNAseプロテクションアッセイが使用できる。この方法では、標識アンチセンスRNAプローブが、サンプル中の相補的なポリヌクレオチドにハイブリダイズする。残ったハイブリダイズしない1本鎖プローブは、リボヌクレアーゼ処理によって分解される。ハイブリダイズした2本鎖プローブはRNAse消化から保護される。適当な時間の後、消化反応の生成物を回収し、ゲル上で分析する（例えば、Ausubelら, 分子生物学の最新プロトコール（CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY）, 4.7.1節(1987)を参照されたい）。本明細書中で用いる「RNAプローブ」とは、対象となるサンプル中のRNAにハイブリダイズできるリボヌクレオチドをいう。当業者であれば、測定すべきポリヌクレオチドに特異的なRNAseプロテクションアッセイを特定し、そして、例えば、プローブ特異性、ハイブリダイゼーション温度、核酸の量などについて改変できるであろう。さらに、多数の市販キット（例えば、RiboQuantTM Multi-Probe RNAse Protection Assay System（Pharmingen, Inc.社製、カリフォルニア州サンディエゴ））を用いることができる。
【００３３】
別の実施態様では、サンプル中のポリヌクレオチドをノーザンブロット又はサザンブロットによって分析することができる。この技術では、ポリヌクレオチドをゲル上で分離し、次いで、目的の配列に相補的ポリヌクレオチドをプローブにして探索する。例えば、RNAをゲル上で分離し、ニトロセルロースに転写し、目的の配列に相補的なDNAをプローブにして探索する。相補的プローブは、放射性標識、科学標識等されている場合もある。プローブのハイブリダイゼーションは、目的のポリヌクレオチドの存在を示す。
【００３４】
サイトカインをコードするポリヌクレオチドの検出は、核酸のサイズ分画などの標準的方法によって行うことができる。DNA及びRNAのサイズ分画法は、当業者に周知であり、例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）を含むゲル電気泳動などである。例えば、ゲルは変性7 M又は8 M尿素−ポリアクリルアミド−ホルムアミドゲルであってもよい。核酸のサイズ分画は、当業者に周知のクロマトグラフィー方法によって達成されてもよい。
【００３５】
ポリヌクレオチドの検出は、任意に放射性標識プローブによって行うことができる。適当なシグナルを与える任意の放射性標識を用いることができる。他の標識は、リガンド、着色染料、及び蛍光分子を含み、標識リガンドなどの特異的結合対のメンバーとして作用ことができる。標識調製物は、サザンハイブリダイゼーション法又はノーザンハイブリダイゼーション法（例えば、サンプルから得られたヌクレオチドをポリヌクレオチドが結合するフィルターに転写する）によるポリヌクレオチドへのプロービングに用いられる。標識ポリヌクレオチドプローブへの暴露によって、標識ポリヌクレオチドプローブは、標的核酸配列を含むヌクレオチド断片にハイブリダイズし、放射性プローブの標的核酸断片への結合は、オートラジオグラフィーによって同定される（遺伝子工学（Genetic Engineering）, 1, Robert Williamson編, Academic Press社 (1981), 72-81頁を参照されたい）。特定のハイブリダイゼーション法は本発明に必須ではない。ハイブリダイゼーション法は、周知であるか、又は当業者には容易に確かめられる。ハイブリダイゼーション法は改良を施されるが、それらは本発明の方法に容易に適用できる。
【００３６】
所望のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを増幅してから検出することができる。語句「増幅」とは、たった１つのポリヌクレオチド分子から複数の核酸のコピーを作成する過程をいう。ポリヌクレオチドの増幅は、当業者に公知の生化学的工程によってin vitroで行うことができる。増幅試薬は、酵素を含むプライマー伸長産物の合成を達成するために機能するあらゆる化合物又はシステムであってよい。この目的に適した酵素としては、例えば、大腸菌DNAポリメラーゼI、Taqポリメラーゼ、大腸菌DNAポリメラーゼIのクレノウフラグメント、T4 DNAポリメラーゼ、他の利用可能なDNAポリメラーゼ、ポリメラーゼムテイン、逆転写酵素、リガーゼ、及び熱安定性酵素（すなわち、変性を起こさせるのに十分高い温度に付した後にプライマー伸長を行う酵素）が挙げられる。好適な酵素は、それぞれの突然変異ヌクレオチド鎖に相補的なプライマー伸長産物を形成するのに適切な方法でヌクレオチドの結合を促進するだろう。一般に、合成は各プライマーの3'末端で開始され、合成が終結するまで鋳型鎖に沿って5'方向に進行し、異なる長さの分子を生成する。それらは、5'末端で合成を開始し、上記と同じ工程を用いて反対の方向に進行する増幅試薬が存在しうる。いずれの場合も、本発明の方法は、本明細書中に記載した増幅の態様に限定されない。
【００３７】
本発明に用いることができるin vitro増幅の１つの方法は、米国特許第4,683,202号及び第4,683,195号に記載したポリメラーゼ連鎖反応（PCR）である。語句「ポリメラーゼ連鎖反応」とは、熱安定性DNAポリメラーゼ及び2つのオリゴヌクレオチドプライマー（一方は増幅されるべき配列の一方の末端で(+)鎖に相補的であり、他方は他方の末端で(-)鎖に相補的である）を用いるDNA塩基配列の増幅方法をいう。新たに合成されたDNA鎖は、続いて、同じプライマー配列のさらなる鋳型となり、プライマーのアニーリング、鎖伸長、及び解離からなる連続的な繰り返しで、所望の配列の迅速で特異性の高い増幅が得られる。ポリメラーゼ連鎖反応は、サンプル中のサイトカインをコードするポリヌクレオチドの存在を検出するのに用いられる。多くのポリメラーゼ連鎖方法は当業者に公知であり、本発明の方法で用いることができる。例えば、DNAを、以下のようにサーマルサイクラー中で30〜35サイクルの増幅にかけることができる：95℃30秒、52℃〜60℃1分、及び72℃1分、最終伸長ステップでは72℃5分。別の例としては、DNAを、95℃の変性温度で30秒、次いで、54〜58℃の範囲の可変のアニーリング温度で1分、伸長ステップ7として0℃1分及び最終伸長ステップとして70℃でのサーマルサイクラー中で35サイクルのポリメラーゼ連鎖反応に付すことができる。
【００３８】
本発明のポリヌクレオチドを増幅するのに用いるプライマーは、目的のポリヌクレオチドにハイブリダイズできさえすれば、従来のリン酸トリエステル法及びリン酸ジエステル法又はその自動化態様などの任意の好適な方法を用いて調製できる。改良された固相支持体上でオリゴヌクレオチドを合成する１つの方法は、米国特許第4,458,066号明細書に記載されている。プライマーの的確な長さは、温度、バッファー、及びヌクレオチド組成を含む多くの因子に依存するだろう。プライマーは、増幅を誘導する試薬の存在下で伸長産物の合成を開始させなければならない。
【００３９】
本発明の方法に従って用いられるプライマーは、増幅されるべきヌクレオチド配列のそれぞれの鎖に相補的である。語句「相補的」は、プライマーが、重合のための試薬が機能する条件下でそれらのそれぞれの鎖にハイブリダイズしなければならないことを意味する。言い換えれば、隣接する配列に相補的なプライマーは、その隣接する配列とハイブリダイズし、ヌクレオチド配列を増幅させる。伸長されるプライマーの3'末端は、相補的な隣接する鎖と完全に塩基対形成する相補性を有することが好ましい。
【００４０】
当業者であれば、標的核酸のコピー数を増加させるのにも利用できる種々の増幅方法論を知っているであろう。本発明の方法で検出されるポリヌクレオチドは、別のポリメラーゼ連鎖反応、オリゴマー制限（oligomer restriction）（Saikiら, Bio/Technology 3:1008-1012 (1985)）、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ASO）プローブ分析（Connerら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:278 (1983)）、オリゴヌクレオチド連結アッセイ（OLA）（Landegrenら, Science 241:1077 (1988)）、RNAseプロテクションアッセイなどの特定核酸配列の検出に通常適用される任意の方法によって、溶液中又は固体支持体に結合してのいずれかで、さらに評価、検出、クローニング、配列決定等され得る。DNA分析のための分子技術は、総説されている（Landegrenら, Science, 242:229-237(1988)）。DNA増幅に続いて、反応生成物は、放射性プローブを用いることなく、サザンブロット分析によって検出できる。この方法では、例えば、組織又は被験体（subject）から得たポリヌクレオチドを含むDNAの少量のサンプルを増幅し、サザンブロット法によって分析する。非放射性プローブ又は標識の使用は、高レベルに増幅されたシグナルによって促進される。本発明のある実施態様では、１つのヌクレオチド三リン酸を放射性標識し、それによってオートラジオグラフィーで増幅産物の直接視覚的認識を可能にする。別の実施態様では、増幅プライマーは蛍光標識され、電気泳動システムにかけられる。増幅産物の視覚化は、放射性シグナルを用いずに、レーザー検知され、次いでコンピューターを使って図示される。
【００４１】
分離された生成物を含むゲルの簡単な視覚化を利用して、皮膚炎反応の存在又は重篤度を測定できる。例えば、分離されたポリヌクレオチドを視覚化するためのゲルの染色法として、多数の染色が当業者に周知である。しかしながら、当業者に公知の他の方法（例えば、スキャニング・デンシトメトリー、コンピューターを使ったスキャニング及び定量など）も用いることができる。
【００４２】
すなわち、上記の方法は、刺激性反応又はアレルギー反応などの皮膚炎を有すると疑われる被験体から非侵襲的に組織サンプルを得るため及びそのサンプルからポリヌクレオチドを単離するのに用いることができる。次いで、ポリヌクレオチドは、以下に限定されないが、上記の方法などの方法を用いて分析できる。幾つものサイトカインのレベルは、得られたサンプル中のそれらの相対的な発現を測定し、それらの濃度を正常な標準サンプルと比較することによって定量できる。例えば、皮膚中のタンパク質の製造が増加又は低減されると、細胞中のmRNA濃度が変化する。従って、RNA、特にmRNAの測定は、皮膚中で、又は局所性又は全身性応答の結果として起きる炎症反応などのイベントのモニターを提供する。この非侵襲的方法が、生物学的因子が皮膚中、より特定的には皮膚の角質層の下に存在しさえすれば、任意の反応、障害、又は疾病を検出できることが認識できるだろう。例えば、本発明者らは、サイトカインIL-4をコードするポリヌクレオチドは、正常皮膚又はICD障害を受けた皮膚よりもアレルギー性接触皮膚炎（ACD）障害でより高いレベルで検出できることを発見したが、これに限定するわけではない。さらに、本発明者らは、IL-13をコードするポリヌクレオチドが、正常又はICDの皮膚よりもACDの皮膚でより高濃度であることを発見した。これに対し、IL-8をコードするポリヌクレオチドは、正常皮膚と比べてACD及びICDの両者でより高レベルである。つまり、IL-8ポリヌクレオチドの高いレベルは、一般的な接触皮膚炎を検出することにより診断的に用いることができる。本発明の方法を用いることによって、サイトカインをコードするポリヌクレオチドのレベルを測定し、正常−標準サンプルと比較して反応の重篤度を決定することができる。
【００４３】
皮膚炎反応を識別するためのサイトカインの検出方法は、代わりに、サイトカインポリペプチドの検出を用いることができる。細胞中のサイトカインポリペプチドの検出方法は、皮膚炎反応を有すると疑われる被験体から得た細胞中の特定のサイトカイン（例えば、IL-4、IL-8及び／又はIL-13）のレベルを測定することによる反応の識別に有用である。そのようなサイトカインのレベルは、同種組織の正常又は標準サイトカインポリペプチドプロフィールと比較することによって、反応の指標となる。従って、サイトカインポリペプチドの発現パターンは、皮膚炎反応のタイプ及び程度に依存して変動するだろう。これについては、本明細書中に記載のように、得られたサンプルはポリペプチドを単離するための供給源として用いることができる。特定のポリペプチド（例えば、IL-4）の測定は、ACDを同定する方法として役立てることができる。例えば、皮膚のこすり取り（scraping）又は皮膚の剥ぎ取り（stripping）の後、上記方法を用いて、角質層から単離した細胞を何らかの手段によって溶解し、細胞からポリペプチドを得ることができる。次いで、これらのポリペプチドは、当業者に公知の方法（例えば、ELISAによって）を用いて定量できる。
【００４４】
特定のポリペプチド（例えば、IL-4、IL-8、IL-13など）に対するモノクローナル抗体は、皮膚炎などの障害と関係するポリペプチドを検出するための、液相中又は固相担体に結合した形でイムノアッセイに用いることができる。さらに、これらのイムノアッセイ中では、モノクローナル抗体は、種々の方法で検出可能な標識を付すことができる。本発明のモノクローナル抗体を利用できるイムノアッセイのタイプの例にはは、直接的又は間接的方法のいずれかの競合及び非競合イムノアッセイがある。そのようなイムノアッセイの例は、ラジオイムノアッセイ（RIA）及びサンドイッチ（免疫学的）アッセイである。本発明のモノクローナル抗体を用いるポリペプチド抗原の検出は、順方向（forward）、逆方向（reverse）、又は同時様式のいずれかで行われる、生理学的サンプルに関する免疫組織化学アッセイを含むイムノアッセイを用いて行うことができる。当業者であれば、他のイムノアッセイ方法を知っているか、又は過度の実験をすることなく他のイムノアッセイ方法を容易に認識できる。さらに、目的のサイトカインに対する多数の市販の抗体がある。
【００４５】
語句「免疫学的（immunometric）アッセイ」又は「サンドイッチイムノアッセイ」は、同時サンドイッチ、順方向サンドイッチ及び逆方向サンドイッチイムノアッセイを含む。これらの語句は、当業者であれば十分理解している。当業者であれば、本発明による抗体が、現在知られているか又は将来開発されうるアッセイの他の変法及び形態においても有用であろうことも十分理解しているだろう。これらは本発明の範囲内に含まれることを意図する。
【００４６】
モノクローナル抗体は、多くの異なる担体に結合でき、サイトカインポリペプチドの存在を検出するのに用いることができる。周知の担体の例としては、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然及び改変セルロース、ポリアクリルアミド、アガロース並びに磁鉄鉱が挙げられる。担体の性質は、本発明の目的のためには、可溶性又は不溶性のいずれであってもよい。当業者であれば、モノクローナル抗体が結合するための他の適当な担体を知っているか、又はそれを日常的な実験を用いて確かめることができるであろう。
【００４７】
サイトカインポリペプチドは、生物学的液体及び組織中に存在するときは、モノクローナル抗体によって検出できる。検出可能な量のサイトカインを含む任意のサンプルを用いることができる。サンプルは、血液、血清等などの液体、又は組織、皮膚サンプルなどの固体若しくは半固体、あるいは、組織学的診断で一般に用いられるような固体組織であり得る。
【００４８】
アッセイを実行するには、（通常、標識した可溶性抗体が添加されている）インキュベーション媒体中に、ある種の「ブロッカー」を含ませることが望ましい。「ブロッカー」は、非特異的タンパク質、プロテアーゼ、又は実験サンプル中に存在する抗サイトカイン免疫グロブリンに対する抗異種免疫グロブリンは、交差反応しないか、又は固相支持体上の抗体、若しくは放射性標識指示抗体を破壊して偽陽性又は偽陰性結果を与えないために添加される。それ故、「ブロッカー」の選択は、実質的にアッセイの特異性を増加させうる。
【００４９】
アッセイで用いられる抗体と同じクラス又はサブクラス（アイソタイプ）（例えば、IgG1、IgG2a、IgM等）の不適切な（すなわち、非特異的な）抗体を、「ブロッカー」として用いることができることは周知である。適切な感受性を維持するが、試料中に相互に生じる交差反応性タンパク質による任意の好ましくない干渉を抑制するために、「ブロッカー」の濃度（通常1〜100μg/μl）は重要であるだろう。
【００５０】
別の実施態様では、本発明は、堅い表面、粘着テープ、又はその両方からなる群から選択される細胞採集デバイス及び皮膚サンプル中の核酸を保護するのに好適な細胞溶解用バッファーを含む、非侵襲的に皮膚からサンプルを得るためのキットを提供する。別の実施態様では、本発明は、細胞採集デバイス、細胞溶解用バッファー及び組織中の刺激性反応とアレルギー反応を識別するmRNA検出試薬を含むキットを提供する。このキットは、ポリヌクレオチド検出試薬（例えば、IL-4などのサイトカインをコードするポリヌクレオチド配列に相補的なオリゴヌクレオチドプライマー）を含む。このようなキットは、バイアル、チューブなどの厳重に密封できる1以上の容器中に入れて区分した運搬手段を含んでいてもよく、その各容器は、この方法で用いられる個々の要素のうちの１つを含む。第２の容器が存在するならば、それに溶解用バッファーを入れることができる。あるいは、該キットは、その上で電流を用いて細胞を溶解できるコンピュータータイプのチップを含むことができる。
【００５１】
キットは、標的核酸配列の増幅又はそれへのハイブリダイゼーションのためのヌクレオチド(標識されていても標識されていなくてもよい)を含む容器、又はリポーター分子（例えば、酵素、蛍光、又は放射性核種で標識した分子など）に結合するビオチン結合性タンパク質（例えば、アビジン又はストレプトアビジンなど）などのリポーターを含む容器を含んでもよい。語句「検出可能なように標識したデオキシリボヌクレオチド」とは、デオキシリボヌクレオチドを同定するための手段を指す。例えば、検出可能な標識は、放射性標識ヌクレオチドか、又は十分に特性のわかっている大きな分子によって認識される小さな分子であって、ヌクレオチドに共有結合したものであり得る。これらの小さな分子の例は、アビチンが結合するビオチン、及び抗チロキシン抗体が結合するチロキシン（甲状腺ホルモン）である。酵素、蛍光化合物、化学発光化合物、燐光性化合物、及び生物発光化合物を含む他の標識方法は、当業者に公知である。
【００５２】
別の実施態様では、本発明は、皮膚炎の原因となる化合物をスクリーニング又は同定する方法を提供する。この方法では、皮膚の細胞（例えば、角質細胞及びメラノサイトを含む表皮細胞、又は線維芽細胞などの真皮細胞など）に、皮膚炎反応を誘導する条件下で被験化合物を接触させる。接触させる条件は可変的であり、化合物のタイプ、試験する皮膚中の細胞のタイプ及び量、試験するサンプル中の化合物の濃度、並びにその化合物への暴露時間に依存するだろう。ある化合物が皮膚炎を引き起こす適当な条件を決定する当業界の技術は公知であり、たとえ必要であるとしても、日常的な実験だけであろう。皮膚細胞は、上記の技術（例えば、こすり取り又はテープによる剥ぎ取り）を用いて単離でき、次いで、細胞をin vitroで被験化合物に暴露することができる。あるいは、培養された皮膚細胞又は皮膚構築物を用いることもできる。例えば、皮膚細胞を任意の供給源から得て、十分にコンフルエントになるまで標準的な細胞培養条件下にて固体又は半固体支持体上で培養してもよい。コンフルエント又はサブコンフルエントになると、細胞を被験化合物に暴露する。次いで、化合物に暴露した細胞からポリヌクレオチドを単離して、上記のように定量する。例えば、限定するものではないが、上記のテープによって、又はこすり取り方法によって、細胞を単離して、mRNAを単離することができる。次いでこのmRNAを特定のサイトカインに対するプローブを用いて定量する。あるいは、mRNAをポリヌクレオチドの検出の前にRT-PCRに供することができる。上記のように、サイトカインをコードするポリヌクレオチドの定量は、皮膚炎の指標となり、例えば、標準サンプルと比較してIL-4が増加していることはACDを示し、IL-4又はIL-13の増加を伴わないIL-8の増加はICDを示す。
【００５３】
本発明は以下に提示する具体的実施例によって範囲を限定されることはなく、実施例は本発明の個別の態様の１つの例示として意図されており、機能的に同等な方法及び構成成分は本発明の範囲内に含まれる。
【００５４】
実施例１
下層角質細胞（ sub-stratum corneum cell ）の非侵襲的回収
A. 硬質表面を用いた回収
皮膚細胞は、滅菌したNo. 15外科用メスによって皮膚から削り取ることによって非侵襲的に回収できる。外科用メスは、水平から約15度の角度で持ち、繰り返し、しかし優しく約1×1 cmのサイズの皮膚の区域を横切って削り取る。滅菌組織培養ウエルの内壁で刃を擦ることによって表皮細胞をウエルに移す。きらきら輝く表皮層に達したとき、出血を引き起こす前に削り取りを止め、削り取ったものが血液によって汚染されるのを避ける。細胞を滅菌された1 cmのペトリ皿に載せ、約300 mlの溶解用バッファーを培養用ウェルに添加する。表皮細胞が完全に溶解するまで、溶解用バッファーをピペットで吸ったり出したりする。
【００５５】
削り取りの開始から10分以内にRNA溶解用バッファーを添加する。滅菌組織培養ウエルをドライアイス上に置いておく。細胞をRNA溶解用バッファー中で溶解し、RNAseを含まない遠心チューブに移し、全RNAを抽出する。
【００５６】
B. 粘着性表面を用いた回収
皮膚細胞は、Ductテープ（333 Duct テープ、Nashua tape products社製）、Scotch（登録商標）テープ（3M Scotch（登録商標）810、ミネソタ州セントポール）、又はD-SQUAME（登録商標）（CuDerm社製、テキサス州ダラス）を用いて非侵襲的に回収できる。皮膚を最高25回まで剥ぎ取る。さらに、テープの粘着性が高ければ高いほど、必要な剥ぎ取りが少ないことが認識されるだろう。皮膚細胞は、攪拌（vortexing）、及び、続いて溶解用バッファーを含むRNAse不含のエッペンドルフチューブ中でテープを遠心分離することによって回収した。同じ溶解用バッファーを単一の皮膚部位で用いた各テープ片に再度使用した。全工程は90分未満で行った。テープ剥ぎ取りプロセス自体は、その工程がなされた後最初の数時間は皮膚サイトカインプロフィールに影響しない。さらに、剥ぎ取り後早期の数時間の間、炎症性細胞は血液循環から真皮又は表皮に移動しない。
【００５７】
直ちに0.5 mlのTriReagent（Molecular Research Center, Inc.製、オハイオ州シンシナティー）中でテープを激しく攪拌することによってストリップに付着した細胞からRNAを抽出した。次いで、担体RNAとして酵母トランスファーRNA（4μg）を添加した後、全RNAを単離し、製造業者用指示書に従って精製した。各サンプルから単離された全RNAを、前もって光学濃度（OD）測定によるRNA量測定を行わずにRNAseプロテクションアッセイ（RiboQuant（登録商標）Multiprobe RNAse Protection Assay System、PharMingen, Inc.製、カリフォルニア州サンディエゴ）に用いた。アッセイは、標準アクリルアミドシーケンシングゲル上でサンプルを用いて行い、消化されたサイトカインのメッセージを同定するために用いた。消化されたRNAバンドを含むゲルを、最初にPhosphor Screen（Molecular Dynamics, Inc.社製、カリフォルニア州サニーベール）に暴露した。次いで、暴露したスクリーンを燐光体イメージャーStorm 860（Molecular Dynamics, Inc.製）でスキャンした。各サンプル中のバンド強度をソフトウエアImageQuantTM（Molecular Dynamics, Inc.製）によって分析した。
【００５８】
皮膚は損傷された表皮細胞から遊離されるRNAを素早く分解できるRNAseの豊富な供給源なので、サンプルのRNAse汚染を避けるために適切な注意が払われるべきである。本明細書中に記載されたサンプル採集及び抽出技術は、RPAによるmRNAの検出能力によって示されるような顕著な分解を伴わずに、皮膚RNAが確かに得られることを示している。
【００５９】
実施例２
テープ剥ぎ取りによって得られた細胞の分析
蒸留水中の0.5％ラウリル硫酸ナトリウム（SLS）を72時間、上腕に適用することによって、刺激性接触皮膚炎（ICD）を誘導した。この暴露の後、紅斑標準スコアリングスケール（フィッシャーの接触皮膚炎（Fisher's Contact Dermatitis）, 第4版, Rietschel, R.L.及びFowler, J.F. Jr.編、Williams & Wilkins社、ボルティモア1995, 29頁）に従ってランク付けした。アセトン中のジブチルスクワレートを同じ被験体の上腕に48時間閉塞（occlurion）して適用することによってアレルギー性接触皮膚炎（ACD）を誘導した。同じ個体（被験体No. 1）の上腕を12回テープ剥ぎ取りし、上記実施例2で記載したように処理した。
【００６０】
図1のレーン1は、スクワレートによって誘導された臨床的に3+紅斑と読める皮膚のACD紅斑区域から単離されたRNAを示す。レーン3は、0.5％SLSに暴露することによって誘導された臨床的に2+紅斑と判定されるICD紅斑皮膚由来のRNAである。Ｘ線フィルムの暴露後、サイトカインIL-4のバンドは、レーン1では明瞭に見られるが、ICD細胞由来のRNAを含むレーン3には見られない。このように、ACD反応におけるサイトカインパターンは、ICD反応及びレーン2で見られる正常皮膚とは異なっていた。
【００６１】
その後の実験で、皮膚炎を有する全ての被験体がACD反応を示した区域の皮膚由来の細胞中のサイトカインIL-4をコードするmRNAを有していた（図2中のレーン8、11、13）。それに対して、IL-4は、任意のICD処理された皮膚区域又は同じ被験体から得られた正常皮膚サンプル中には見られなかった。さらに、5人の被験体のうちの4人（図2中の被験体2、3、4及び5）で、紅斑が刺激性反応又はアレルギー反応によって誘導された皮膚の紅斑区域中にIL-8が存在したが、正常皮膚から得られたRNA中には存在しなかった。すなわち、IL-8のmRNAは、皮膚炎の一般的な指標であった。
【００６２】
活性化されたT細胞によって分泌されるサイトカインであるIL-3をコードするmRNAは、アレルギー性炎症がスクワレートによって誘導された皮膚の4つの紅斑区域のうちの3つ（図2中のレーン5、8、11、13）に存在した。γインターフェロン（IFN-γ）に関連する分子量を有するmRNAを含有していると思われる近傍の位置に、かすかなバンドが見られた（図2中のレーン8及び11）。これらのバンドは、スクワレート（ACD）処理した5つの皮膚サンプルのうちの2つから抽出されたmRNA中に存在した。IL-13の場合のように、IL-4のmRNAを有する同じレーンでも、IFN-γのmRNAと思われるバンドが見られた。
【００６３】
B細胞成長因子であるIL-14は、スクワレート処理した皮膚サンプルの幾つか並びにSLS処理した皮膚サンプルの幾つかに存在した（図2）。この実験で視覚化できた全13サンプルで、多機能性サイトカインであるIL-9が検出された。さらに、明瞭に視覚化できた全てのレーン（15サンプル中13サンプル）で、一酸化窒素合成酵素の誘導性アイソフォーム（iNOS）及びIL-9のmRNAが見られた（図2）。
【００６４】
IL-13と同じレーンのIL-4の存在は、これら2つのサイトカインマーカーがサンプルを得た皮膚中のアレルギー反応によって誘導されることを強く示唆している。
【００６５】
種々の皮膚反応で見られる紅斑の臨床的定量化は、表1及び表2に記されている。
【００６６】
【表１】
ACD反応
＊；ゲルの解読不可能であった。
NT；試験せず
2+；中程度の紅斑（赤）
【００６７】
【表２】
ICD反応
＊；ゲルの解読不可能であった。
NT；試験せず
1+；軽度の紅斑（淡いピンク）
2+；中程度の紅斑（赤）
3+；重度の紅斑（濃い赤）
【００６８】
実施例３
被験体No. 3〜5でのサイトカインと炎症の程度との間の関係をさらに試験するために、IL-4、IL-8及びIL-13のRNAレベルを、対応するハウスキーピング遺伝子濃度に対して基準化した（表3）。分析した3つの被験体で、RNAレベルと反応の重篤度の間に相関関係が存在する。表2は、最も強い皮膚反応由来のサンプルも、ACD反応を有し、IL-8の最大の相対量を示すものであることを示している。例えば、ACD部位で2+の反応及びICD部位でわずかな（低い+1）反応のみを有する被験体No. 4は、上記のRPA法を用いてICDとACDとを比較したとき、IL-8／GAPDH比において約2倍の差を示した。さらに、もしゲル上にIL-4のバンドが存在し、IL-4／GAPDHの値が約0.001以上であるなら、ACD反応が想定される。また、約0.13以上のIL-13／GAPDH値を有してIL-13バンドが存在する場合には、ACD反応が確実視される（表3）。
【００６９】
【表３】
本発明の多数の実施態様を記載した。しかしながら、本発明の精神及び範囲から離れることなく種々の改変がなされ得ることは理解されるであろう。従って、他の実施態様は、以下の特許請求の範囲内である。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図1はある同一の被験体の上腕の3カ所の異なる領域をテープで剥ぎ取ることによって得られたRNAでRNaseプロテクションアッセイ(RPA)を行った結果を示すゲルの像を示している。
【図２】 図2はさらに4名の上腕の3カ所の異なる領域のテープによる剥ぎ取りによって得られたRNAを用いて行ったRPAの結果である。
Claims (13)
- 接着テープに付着している皮膚サンプルの単離を可能にする条件下で、被験体の皮膚に接着テープが適用されることにより得られた皮膚サンプルからのリボ核酸(RNA)の相対的発現量の定量方法であって、
(a) 皮膚サンプルからのRNAを検出すること、および
(b) 皮膚サンプル中のRNAのレベルをコントロールサンプルと比較し、RNAの相対的発現量を定量すること、
を含む前記方法。 - 皮膚サンプルが、接着テープの適用と除去により得られた角質層細胞および角質層と結合した細胞を含む、請求項１に記載の方法。
- 検出が、mRNAを検出することである、請求項１に記載の方法。
- 検出が、サイトカインをコードするRNAを検出することである、請求項１に記載の方法。
- 検出が、インターロイキンをコードするRNAを検出することである、請求項１に記載の方法。
- 検出が、インターロイキン-1(IL-1)、インターロイキン-2(IL-2)、インターロイキン-3(IL-3)、インターロイキン-4(IL-4)、インターロイキン-5(IL-5)、インターロイキン-6(IL-6)、インターロイキン-8(IL-8)、インターロイキン-10(IL-10)、インターロイキン-12(IL-12)、インターロイキン-13(IL-13)、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)またはインターフェロン、あるいはこれらの任意の組み合わせをコードするRNAを検出することである、請求項１に記載の方法。
- 検出が、炎症メディエーターをコードするmRNAを検出することである、請求項３に記載の方法。
- 皮膚サンプルが、疾患、障害または炎症反応に冒された被験体から得られたものである、請求項１に記載の方法。
- 被験体が皮膚炎に冒されている、請求項８に記載の方法。
- 被験体の皮膚が、皮膚に接着テープが適用されることにより皮膚サンプルが得られる前に、皮膚炎を引き起こす外因性作用物質と接触させられたものである、請求項１に記載の方法。
- 皮膚サンプルが哺乳動物から得られたものである、請求項１に記載の方法。
- 皮膚サンプルがヒトから得られたものである、請求項１に記載の方法。
- 皮膚サンプルが非ヒトから得られたものである、請求項１に記載の方法。
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