SE443914B - Medel for en overkenslighetstest - Google Patents

Description

'~=~»*iv4c1 u et al., Contact Dermatitis 6(l980) s. 197-203); Fossereau J. et al-- Occupational Contact Dermatitis, Munksgards Copenhagen (1982) s. 45). De största av dessa inklusioner har en diameter på mer än 0,5 mm. När sådana partiklar löser sig i svett producerar de en hög lokal koncentration av allergen och förorsakar porinflammationef kring hårfolliklarna. Ytterligare en nackdel är att mängden test- substans som appliceras vid en standarilapptest kan variera med en sexpotens (Fisher T. et al., Contact Dermatitis (1984)). Allt detta betyder att det är önskvärt med förbättringar av de farmakologiska egenskaperna hos material avsedda för lapptest.

TRUE-testen löser en stor del av de nyss nämnda problemen och ger en exakt dosering, jämn ytfördelning och en hög biologisk tillgänglig- het för testsubstansen. TRUE-testen erbjuder alltså en lösning av problemen med låg biologisk tillgänglighet, osäker dosering och ojämn ytfördelning som lätt kan uppkoma med vaselin som vehikel.

Uppfinningen erbjuder metoder applicerbara på ocklusiv lapptest- teknik vilka a) minimerar mängden och ökar precisionen i dosering av testsubstans (dosering i mängd per ytenhet), b) möjliggör fram- ställning av lagringsstabila testpreparationer och c) möjliggör prefabricering av testremsor som var och en innehåller ett flertal testsubstanspreparationer med liten risk för korskontaminering dem emellan.

Det måste påpekas att TRUE-testen ej får förväxlas med olika icke- ocklusiva tekniker. I en ocklusiv teknik sker kontakten mellan testsubstans och hud i ett slutet rum, d v s luft och dess fuktighet stängs ute samtidigt som fuktighet (svett) från det testade hudom- rådet stängs inne tillsammans med testsubstansen. Detta sker med hjälp av ett tätande material t ex en aluminium- eller tät plast- folie. På grund av det slutna utrymet är den ocklusiva tekniken lätt att standardisera och har bevisats ge pålitliga resultat.

(Pirilä, V; Contact Dermatitis 1 (1975) s. 48-S2). Pilmbildande polymerer har tidigare använts i icke-ocklusiva tekniker (se Accesion Nummer 31888 (Prov A358) Central Patents Index, Section B, Farmdoc, Derwent Publications Ltd., London 1968). z Enligt uppfinningen löses de nyss nfamda problemen genom att lan använder en lapp som är väsentligen impermeabel mot fukt och vatten och på vilken testsubstansen är inkorporerad i en vehikel som föreligger som en tunn smidig film, i vilken testsubstansen ifråga har en jämn fördelning. Porsättningsvis kallas lappen för filmbärare. Med smidig avses att filmen ej är så skör att den spricker när den användes i TRUE-testen. För att kallas film bör ett skikt vara mindre än 0,25 mm tjockt ((= 0,01 in) Encyclopedia of Polymer Science and Technology; Plastics, Resins, Rubbers, Fibers; Vol. 6 s. 764 (1967): John Wiley G Sons Inc., USA).

Sålunda utnyttjar uppfinningen i sina föredragna utföringsformer filmer som är mindre än ca 0,25 mm, företrädesvis mindre än ca 0,1 mm såsom mindre än ca 0,05 mm tjocka. Filmen kan vara uppdelad i delytor.

Testsubstanser Uppfínningen är främst användbar för att påvisa kontakcallergier varför testsubstanserna främst är valda bland de allergener som förorsakar eller misstänks förorsaka sådana allergier men även irritativa ämnen kan utnyttjas. Potentiellt kan alla kontaktaller- gener och irritativa, substanser, utnyttjas i uppfinningen, oberoende av deras klassificering som fast eller flytande ämne, organiskt eller oorganiskt ämne, metallsalt eller icke metallsalt, lösligt eller icke lösligt (t ex i vatten) ämne.

För att underlätta lapptestningen har man för olika geografiska områden valt ut de vanligast förekommande allergenerna. För Nord- amerika finns 1984 således en standardpanel uppstâlld av American Academy of Dermatology och den består av: Bensokain (S 8 vaselin), Imidazolidinyl urea (2 \ ag.). Thiuram-mix (1 I vaselin), Kanel- alkohol (5 S vaselin), Dibukain ll 1 vaselin), Merkaptobenzotiazol (1 S vaselin), Neomycinsulfat (20 8 vaselin), p-Fenylendiamin (1 8 vaselin), Tetrakain (1 % vaselin), p-tert-Butylfenol formaldehyd harts (1 1 vaselin), Tiomersal (0,1 8 vaselin), Formaldehyd (2 t aq.), Hydroxycitronellaldehyd (4 Q vaselin), Carba-mix (3 l ffmwxfièevvfifivy” -i @a%¿äfisà«¿asfifi%safia¿š*. “ vaselin), Kanelaldehyd (2 Q vaselin), Rosin (Kolofonium) (20 S vaselin), PPD-mix (svartgummi-mix)(0,6 §'vaselin), Ullalkoholer (lanolin) (30 8 vaselin), Cyklometykain (l Q vaselin), Eugenol (4 8 vaselin)| Quaternium-15 (2 S vaselin), Isoeugenol (4 % vaselin), Merkapto-mix (1 % vaselin), Epoxyharts (l 8 vaselin), Kaliumdikromat (0,5 S vaselin), Kain-mix utan benzokain (3 8 vaselin), Etylendiamin dihydro- klorid (1 % vaselin), Benzoylperoxid (l % vaselin), Peru- balsam (25 % vaselin), Quaternium-15 (2 % aq.), Oak moss (abs mousse de chene) (5 % vaselin), Nickelsulfat (2,5 8 vaselin). För Europa innehöll den rekommenderade panelen 1984 (för enkelhets skull anges ej koncentrationer och vehikler): Neomycinsulfat, Kaliumdikromat, Ullalkoholer, Merkapto-mix, Bensokain, Nickelsulfat, Epoxyhartser, Etylen- diamin dihydroklorid, Koboltklorid, Perubalsam, Thiuram-mix, Parabener (mix), p-Fenylendiamin dihydroklorid, Kolofonium, Kinolin-mix, Svartgummi-mix, p-tert-Butylfenol formaldehyd harts, Carba-mix, Parfym-mix, Quaternium-15, Primin och Formaldehyd. För kontaktdermatiter på vissa kroppsdelar finns även standardpaneler t ex för nedre delen av benet: Neomycinsulfat, Kinoform, Bensokain, Ullalkoholer, Peru- balsam, Klorkinaldol, Parabener (mix), vattenfri Bucerin, Kolofonium.

Dessa s k "standardallergener' användes på flertalet patienter.

Man låter i många fall även patientens sjukdomshistoria avgöra vad han dessutom skall testas mot. Det finns ytterli- gare ca 2 000 kända allergener som är aktuella för lapptest- ning.

Vehikeln Denna skall vara vald bland de ämnen som har filmbildande egenskaper. Vanligtvis är den en polymer som tillsammans med en flyktig vätska, t ex vatten, ger en gel eller koalescer- bar emulsion i vilken testsubstansen ifråga kan fördelas homogent antingen i löst, kristalliserad, mikroniserad, emulgerad eller dispergerad form; varvid polymeren i den »..>. '- 11.2» a» :ff ~ .. v . a» 0wUfi07J'0 “ mest praktiska utföringsformen skall vara vald så att gelen eller emulsionen kan torka in till en film när den år utstruken. Vehikeln bör uppvisa hydrofila egenskaper så att fukt vid användningen kan absorberas i den.

Olika egenskaper som återspeglar en vehikels hydrofila egenskaper är åtkomliga i handböcker och från tillverkare, se t ex (Encyclopedia of Polymer Science and Technology: M Plastics, Rubbers, Resins, Fibers; John Wiley & Sons Inc.: i v01 s s. vvs-719 (1967). Lanpiign polymerer återfinns hinna ” dem som uppvisar en vattenadsorption (24h) på större än 0,5 % företrädesvis större än l S (mätt enligt ASTM D 570.63; American Standard Type Methods). Aktuella filmbildande polymerer väljes sålunda företrädesvis bland sådana som innehåller en mångfald polära strukturer, t ex karboxyl- och/eller estergrupper (såsom poly(met)akrylater), amid- grupper (såsom poly(met)akrylamider och polyamider), eter- grupper (såsom högre polyetylen- och polypropylenglykoler, fullständigt alkylerade polysackarider (t ex helt metylerad cellulosa) m m) alkoholgrupper (såsom polyvinylalkoholer och polysackarider (t ex stärkelse) eventuellt i derivatiserade former som hydroxyalkylerade och partiellt alkylerade former (Ex. Metylcellulosa). Graden av hydrofilicitet bestäms av hur stort inslaget av polära grupper är i en speciell polymer. Sålunda uppvisar polymerer som polypropylen, polystyren etc en helt försumbar vattenadsorption under det att polymerer med stor täthet polära strukturer uppvisar signifikanta adsorptionsvärden och är bättre lämpade i uppfinningen (filmbildande polysackarider, polyvinylalko- holer etc). Filmbildanås polymerer baserade på i naturen förekommande polymerer (biopolymerer) uppvisar som regel tillräcklig hydrofilicitet.

Det exakta valet av vehikel beror bl a på testsubstansen ifråga och den använda filmbäraren. Testsubstansen skall gå att homogent fördela i vehikeln. Vehikeln och filmbäraren I Oh I mzaææfiæænv. bör vara valda så att de fäster vid varandra. Hydrofila testsubstanser (t ex sådana som är lösliga i ett polärt flyktigt lösningsmedel såsom vatten, etanol, metanol) fordrar som regel vehikler med högre vattenadsorption (starkare hydrofiler) under det att hydrofoba testsubstanser fordrar vehikler som förutom att vara hydrofila även skall É år, _ ä š *i uppvisa en viss grad av lipofil karaktär. Som hydrofoba testsubstanser kan nämnas stenkolstjära, balsamer och många parfymer. Med utgångspunkt från en testsubstans kemiska struktur och enkla försök kan fackmannen finna ut vilken vehikel som är bäst lämpad i det speciella fallet. För metallsalter och hydxofila testsubstanser har det visat sig att det är väsentligt att välja en filmbildande polymer som tíllsamans med ett polärt flyktigt lösningsmedel, före- trädesvis vatten, etanol, metanol etc eller homogena bland- ningar därav, kan bilda en film. För dessa testsubstanser är lämpliga polymerer valda bland filmbildande polysackarider t ex alkylerad cellulosa. Fartiellt metylerad cellulosa är en sådan vehikel, vilken visat sig ha en mycket god balans mellan hydrofilicitet och hydrofobicitet tillsammans med att den har mycket goda filmbildande egenskaper och är icke- irriterande för human hud. Å 2.* Viktiga punkter att tänka på vid val av vehikel är att den skall vara farmaceutiskt acceptabel, icke-irriterande för huden, inert gentemot filmbäraren samt inte väsentligen förändra de allergena och/eller de irritativa egenskaperna hos avsedd testsubstans.

Med flyktig vätska avses att vätskan skall kunna evaporeras (avdunsta) vid en temperatur sådan att testsubstansen i fråga stannar kvar i filmen utan att bäraren förstörs. Van- ligtvis kan en vätska som uppvisar relativt högt àngtryck vid rumstemperatur användas. 0"'IU'§0JU"O Filmbäraren Som redan nämnts är huvudkravet på filmbäraren att den skall f' vara väsentligen impermeabel genteot fukt och vatten.

Givetvis bör den inte innehålla substanser som kan ge lhudirritationer. Olika material som är lämpade för uppfin- ningen saluförs av ett flertal firmor, t ex plastat papper (Reynolds plastbelagda fryspapper (Reynolds Metal Co, Richmond, Virginia) och Sarank blankt papper och matt papper (Dow Chemical Co, Midland, Michigan), hydrofoba plastfilmer (t ex Polyester (MylarR)) och aluminiumfolie. Valet av filmbärare är på intet sätt kritiskt för uppfinningen bara man följer de allmänna riktlinjer som getts ovan kan fack- mannen avgöra om ett material är lämpligt eller ej.

Framställning av testlapp I framställningen ingår två viktiga delsteg som är av betydelse för resultatet. För det första skall testaller- genet fördelas jämnt i det filmbildande materialet. För det andra skall filmbäraren beläggas reproducerbart med en jämntjock film.

I den för närvarande bäst kända metoden för att tillverka filmen, sättes testsubstansen till en filmbildande polymer (vehikel) vilken är upplöst eller gelad i en flyktig vätska. Är testsubstansen löslig i vätskan kan man sätta den direkt till blandningen innehållande polymeren. Är den olöslig kan man dispergera eller emulgera den homogent i finfördelad form in i blandningen. I båda fallen kan man som alternativ predispensera testsubstansen i en liten mängd av en flyktig vätska, som är blandbar med vätskan i gelen. Filmbäraren if» ~ belägges sedan med ett jämntjockt gellager som får torka och detta material kan sedan delas upp i lämpligt antal före- trädesvis likformiga och till ytan lika stora lappar. Den torkade filmen kan vara t ex 0,2, 0,1, 0,05, 0,01 cm tjock beroende pà den pâlagda gelen. Ytan av lapparna kan vara 0,2 - 4 cm2. Mängden per ytenhet av testsubstans i filmen “aaæwmamafimfiwmfimma :__ v ii. 7315 &wüuuJu”o \ - varierar beroende på allergen. Vissa allergen är mera potenta än andra så att fackmannen måste experimentera sig fram till lämplig effektiv mängd per ytenhet. I TRUE-testen kan man som riktvärden använda tidigare empiriskt funna värden för ocklusiv teknik, även om man måste räkna med att uppfinningen fordrar lägre mängder per ytenhet på grund av bättre biologisk tillgänglighet. Med effektiv mängd per ytenhet menas den mängd testsubstans som använd i testen framkallar en allergisk reaktion eller irritationsreaktion i flertalet sensibiliserade respektive normala individer. För nickel ligger den effektiva mängden på 0,5 /uMol/cmz (TRUE- test, vehikel metylcellulosa).

I vissa fall kan det vara av intresse att bestämma s k tröskelvärden för en patient. För detta ändamål framställer man lappar med olika mängd/ytenhet av ett och sama allergen.

Lapparna placeras sedan på självhäftande material, som erbjuder minst ca l cm överskjutande marginal runtom mot varje lapp (filmsidan skall därvid vara vänd från plåstret).

Lappens geometriska form är ej kritisk för uppfinningen. I princip kan alltså remsor användas ekvivalent med andra ~ former.

L För att underlätta testförfarandet kan flera lappar, med är olika allergen och/eller med ett och sama allergen, men i få olika mängd per ytenhet, i förväg placeras på samma bit av ett självhäftande material. Man erhåller härvid en testremsa avsedd för samtidig testning mot ett flertal allergener respektive flera mängder per ytenhet av sama allergen på en X patient. Sådana remsor kan innehålla lappar svarande mot en É- standardpanel och varje remsa kan innehålla upp till 25 “A företrädesvis upp till 12 lappar. 1:-, _; a» :lit §. .g -a s. , š w .wm@w..... ~ ~ 8404895-8 Testförfarandet Detta sker på i och för sig känt sätt men med användning av lappar enligt uppfinningen. Man fäster således en eller flera TRUE-testremsor (lappar som applicerats på själv- häftande material enligt ovan) på patienten, så att filmen bringas i kontakt med huden inom testområdet, varefter remsan tätande trycks fast mot huden.

Uppfinningen skall nu àskâdliggöras med ett antal icke- begränsande exempel.

Exempel l ==_=_-»__2 Som förförsök inkorporerades en modellsubstans (metylen- blått) i olika filmbildande vehiklar baserade på cellulosa och polyetylenglykol, applicerades på filnbärare och an- vändes enligt uppfinningen. De erhållna filmavtrycken visade pà en jämn fördelning av modellsubstansen, vilket visar att vehiklarna med lämplig filmbärare och lämplig testsubstans gar att använda enligt uppfinningen. Metylcellulosa hade de överlägset bästa filmbildande egenskaperna, varför ytter- ligare försök gjordes med den.

Exempel 2 222222222 Test material Koboltklorid 1 8, Nickelsulfat 5 8, Kaliumdikromat 0,5 % i vaselin (Hermal-Chemie, Reinbek b. Bamburg, W. Germany).

Finn Chambersn (Epicon Oy, Finland) på Scanpora.

Scanporn (Norgesplaster A/S, Norway).

Kemikalier: Koboltklorid, pro analysi, Nickelklorid, pro analysi, Nickelsulfat, pro analysi, Kaliumdikromat, pro analysi, Natriumhydroxid, pro analysi, Dimetylglyoxim, kristallin (Sigma Chemical Co, St. Louis, USA). »xf-fæqgfåu» v» s., 'vdulvu/v u _ 10 - Dodecyl Natriumsulfat ((1 Natriumaurylsulfat)teknisk kvalitet, Matheson Coleman 5 Bell, Norood, Ohio). _Methoce1R A4M ((Metylcellulosa) Metyleringsgrad 27-31 tlqlukos- enhet; Dow Chemical Co, Midland Mich. USA).

Vitt vaselin (Hermal-Chemie, Reinbek b. Hamburg, W. Germany).

Plastfolie och plastbelagda papper (filmbärare): Reynolds plastbelagda fryspapper (Reynolds Metal Co, Richmond, Virginia).

Polyester 0,03 mm (MylarR).

Sarana blankt 35 CIS/10 SARAN/IS PE och matt 45 Paper/ PE (Dow Chemical Co, Midland, Mich.) Sex nickelöverkänsliga frivilliga försökspersoner.

Framställning av testmaterial MethocelR gel (3 % w/v) framställdes med hjälp av hetvatten- metoden (Utrörning av MethocelR i kokande vatten. Den erhållna blandningen bildar en gel vid avsvalning). Metall- salter, kristallina eller upplösta i vatten, inkorporerades i gelen. Vatten adderades till en slutkoncentration av Methocela på 2,4 % w/v. Med magnetomrörare omrördes sedan gelerna omsorgsfullt tills dess att salterna var homogent dispenserade och lösta. Med centrifugering befriades gelerna från luftbubblor innan de applicerades. Gelerna framställdes med följande metallsaltkoncentrationer: L Spädningssteg: (mol/1) 0,8, 0,4, 0,2, 0,1, 0,05, 0,025, 0,013, 0,0063, 0,0031, 0,00l6, 0,00078, 0,00039, 0,00020, G,000l0 och 0,000049.

NiCl2: 0,8 till 0,000049 NiSO¿: 0,2 till 0,000049 CoCl2: 0,2 till 0,003l K2Cr2O7: 0,1 till 0,003l Dodecyl natriumsulfat: (vikta 8) 4,0, 2,0, 1,0 och 0,5. :få Ö4U4ÖÜÖ"Ö _ 11 _ Gelerna fördelades sedan som ett jämntjockt lager (ca 0,1 mm) på filmbärare som var rengjorda med etanol. Gellagret tilläts torka i rumstemperatur (filmtjocklek ca 0,01 mm erhölls) och skars sedan i kvadratiska lappar med en skarp kniv.

Som jämförelsematerial framställdes en spädningsserie av nickelsulfat genom att blanda standardlapptestmaterial med vaselin (5 3, 2,5 Q, 1,3 Q. etc i tolv steg till 0,0025 8).

Nickelanalys Lappar (1,0 x 1,0 cm) med film av den 0,1 M nickelsulfat- gelen på de olika filmbårarna analyserades i serier på tio.

Lapparna placerades i 8 ml avjoniserat vatten och behand- lades med ultraljud i en minut innan 12 ml indikatorlösning tillsattes; lika delar av 1,0 N natriumhydroxid i avjoni- serat vatten och 1 % dimetylglyoxim i etanol. Proven av- lästes fyra timmar senare i en spektrofotometer vid 470 nm.

Lapptestmetod ü Testmaterial med vaselin/nickelsulfat och lappar enligt ovan applicerade? på övre delen av testpersonernas ryggar med hjälp av Finn Chambersn på Scanpork tape respektive Scanporn tape och fack sitta kvar i 48 tim. Avlâsníngar gjordes vid 48 och 72 tim.

Resultat Nickelanalxser Mängden nickel i fyra olika testpapper 1,0 x 1,0 cm med 0,1 M nickelsulfatgel samt i 9 - 16 mg prov med 5 8 nickelsulfat i vaselin. /umol Ni mg NiSO 4 Palyesner ~ 0,60 _+_ 0,06 0,100 i 0,017 MylarR Plastat papper 0,66 i 0,02 0,174 1 0,006 saranR matt 0,13 ¿ 0,00 0,192 ¿ 0,021 saraaa blankt 0,11 ¿ 0,02 0,106 i 0,006 Nicxemulfat 2,50 i 0,61 0,660 i 0,160 % i vaselin Resultaten från nickelanalysen visar att testmaterial enligt uppfinningen ger större precision i doseringen än tidigare teknik.

Eàpntesterna var och en av sex nickelöverkänsliga individer (en av dem var också överkänslig mot kobolt) lapptestades med späd- ningsserier av nickelsulfat i vaselin och med lappar enligt uppfinningen innehållande nickelsulfat, nickelklorid, koboltklorid, kaliumdikromat och natriumlaurylsulfat.

Lapparna enligt uppfinningen var på 1 cmz. Tre personer testades också med níckelsulfat på lappar av polyester och SaranR (båda 1 cmz). Två individer testades med 0,7 x 0,7 cm (0,5 cmz) lappar av nickelsulfat på plastbelagt papper.

Testmetoden enligt uppfinningen gav större och jämnare fördelade testreaktioner än de där Finn Chambersa använts.

Detta var tydligast för de lappar där allergenet var mera ntspätt. Tntensiteten av testreaktionen med 5 S nickelsulfat i vaselin svarade i allmänhet mot lappar enligt uppfinningen «..¿-r.t.r“-f»~ 040462:-o_U -13- " som'innehöll 0,05 molar nickelsulfatgel (0,03 /umol Ni/cmz).

Lapparna på 0,7 x 0,7 cm gav samma reaktionsstyrka och samma ändpunkt av spädningsserierna som 1,0 x 1,0 cm lapparna, men var svårare att evaluera. Reaktionerna i testserierna på polyester och Sarana var identiska med papper/plastserierna.

Den koboltöverkänsliga individen visade reaktioner som var av likvärdig styrka vid testning med 1 % koboltklorid i vaselin och på 0,013 M gel på plastat papper. Sättet enligt uppfinningen med 0,2 och 0,1 M geler av koboltklorid och kaliumdikromat förorsakade lika starka irritationsreaktioner som när man testade normala personer med 5 - 10 8 av dessa salter i vaselin.

Det hudirriterande ämnet natriumlaurylsulfat inkorporerad i film (0,5 - 4 %) enligt uppfinningen gav irritativa reak- tioner motsvarande dem man erhåller vid klassisk lapptest- ning med ämnet i vattenlösningar (0,2S - 2 %).

Under den tid som TRUE-lapparna var applicerade på testper- sonerna observerades att filmen svällde upp. Detta ökar x kontakten mellan film och hud och underlättar troligen testsubstansernas penetration av huden genom att vattenlös- liga substanser kan bättre övergå till hudens vattenfas och fettlösliga till dess fettfas. Exemplet visar på att en film som är fast och smidig kan användas som vehikel.

Exempel 3 Mikroniserat hydrocortisonacetat (exempel på substans med företrädesvis lipofil karaktär) uppslammad i vatten (10 % w/v) sattes till Methocela gel framställd enligt hetvattenmetoden.

Gelen trycktes sedan som film på plastat papper (enligt ex 2). Míkroskopiering visade att hydrocortisonacetatet var jämt fördelad i filmen. x

Claims (1)

1. ówuwö3Q'ö _ 14 _ PATENTKRÅV

1. Testremsa med minst en lapp och avsedd att användas vid ocklusiv epikutantest, k ä n n e t e c k n a d av att den som vehikel för respektive testsubstans uppvisar ett till respektive lapp vidhäftande film i vilken en testsubstans är inkorporerad. Testremsa enligt krav 1, k 5 n n e t e c k n a d av att filmen består av en vid användningen svällbar polymer. Testremsa enligt något av krav 1 eller 2, k ä n n e - t e c k n a t av att filmen är mindre än ca 0,25 mm tjock, företrädesvis mindre än 0,1 m tjock. Testremsa enligt något av kraven l - 3, k ä n n e - t e c k n a d av att vehikeln är en alkylerad och/eller hydroxyalkylerad polysackarid, företrädesvis sådan cellulosa. »t . . s i Å “il Wr? s _ få