FI89133B

FI89133B - Medel foer test av oeverkaenslighet

Info

Publication number: FI89133B
Application number: FI862282A
Authority: FI
Inventors: Torkel Ingemar Fischer
Original assignee: Torkel Ingemar Fischer
Priority date: 1984-10-01
Filing date: 1986-05-29
Publication date: 1993-05-14
Also published as: FI862282A; WO1986001994A1; SE8404895D0; AU573917B2; CA1261746A; SE8404895L; BR8506946A; EP0197101A1; JPH0552293B2; DK248086D0; CN1016760B; NO169872C; NO169872B; JPS62500305A; SE443914B; KR870700323A; KR940000857B1; ES9300001A1; DE197101T1; DK153204B

Description

1 89133

Yliherkkyystestiväline Tämä keksintö koskee uutta välinettä, jonka avulla voidaan suorittaa epikutaanitestejä suljetussa tilassa (lapputestejä). Tämän tyyppistä testiä käytetään saamaan selville kontaktial-lergioita (kontaktiherkistyminen) jonkin spesifisen aineen suhteen (allergeeni) tai testaamaan jonkin aineen allergeeni-siä ja/tai ärsyttäviä ominaisuuksia. Yksinkertaisuuden vuoksi tämän keksinnön menetelmää tullaan kutsumaan "TRUE - testiksi".

Termi "lapputesti" johtuu siitä seikasta, että alunperin käytettiin kangas- tai paperilappuja testien suorittamiseen siten, että nämä laput kastettiin testattavaan aineeseen. Vuosien kuluessa on käytetty useita erityyppisiä lappuja. Keksinnön yhteydessä termi "lappu" tarkoittaa pääasiassa aluetta, jossa on testiainetta.

Epikutaanitestimenetelmässä pannaan ainetta, jolla epäillään olevan allergeenisiä tai ärsyttäviä ominaisuuksia, normaalin ihon päälle suljetussa tilassa määrätyksi ajaksi siten, että testiainetta levitetään sopivassa formuloinnissa ja konsentraa-tiossa ja kontrolloidulla tavalla. Kontaktiallergian tapauksissa tästä aiheutuu testialueella allergista ihottumaa. Ärsyttävät aineet aikaansaavat luonteenltaan samankaltaisia ärtyneitä ihottumareaktioita (Manual of Contact Dermatitis; Fregert S, 2. painos, Munksgaard, Kööpenhamina /1981/ sivut 71-76) . Testiaine levitetään tavallisesti jossakin sopivassa apuaineessa, tavallisimmin vaseliinissa tai vedessä. "Laput" ovat nykyään lapputestimenetelmässä pieniä alumiinikalvo-onteloita, jotka silloin kun testi suoritetaan, täytetään sopivasti formuloidulla testiaineen valmisteella ja asetetaan siten, että testi tapahtuu suljetussa tilassa. Usein kiinnitetään hyvin useita lappuja liimateippiin, joka on peitetty irrotettavalla suojakalvolla.

2 89133

Lapputesteissä tavallisesti käytetyt menetelmät ja materiaalit eivät ole tyydyttäviä turvallisuusvaatimusten suhteen; tämä koskee erityisesti menetelmiä ja materiaaleja, joita käytetään metallisuolojen kanssa. Parannukset ovat sen vuoksi tarpeen.

Vrt. Kalimo, K. et ai., Contact Dermatitis 10 (1984), sivut 25,29; Schmidt H. et ai., Contact Dermatitis 6 (1980), sivut 91-94. Allergian testausmenetelmissä ovat ärtymisreaktiot tavallisia, erikoisesti silloin jos testiaineita käytetään konsentraa-tioissa, jotka ovat lähellä niiden ärsytyskynnystä. Ainakin osaksi tämä johtuu siitä, että testiaineet eivät ole jakaantuneet tasaisesti ihon kontaktialueella. Standardilapputestiai-neen mikroskooppiset tutkimukset ovat osoittaneet, että useimmat allergeenit ovat suositelluissa vaseliiniapuaineissa epätasaisesti jakautuneina, joko eri kokoisten hiukkasten tai pisaroiden muodossa (Vannestre D. et ai., Contact Dermatitis 6 (1980), sivut 197-203; Fossereau J. et ai., Occupational Contact Dermatitis; Munksgaard, Kööpenhamina /1982/ sivu 45). Suurimmat näistä inkluusioista ovat mitoiltaan yli 0,5 mm läpimittaisia.

Nämä hiukkaset liukenevat hikeen ja synnyttävät korkeita paikallisia allergeenin konsentraatioita ja aiheuttavat huokosten tulehduksia ("poritis") ihokarvojen tuppiloiden ympärillä. Vielä eräs haitta on se, että standardilapputestissä käytetyn testiaineen määrä voi vaihdella kuusinkertaisella vahvuusvälillä. (Fischer T. et ai., Contact Dermatitis 1 (1984), sivut 285-287). Kaikki tämä osoittaa, että olisi erittäin toivottavaa saada aikaan parannuksia lapputestimenetelmissä käytettävien materiaalien farmakologisiin ominaisuuksiin.

TRUE-testi ratkaisee useita edellä mainituista probleemoista antamalla testiaineen tarkan annostuksen, tasaisen pinnalle jakautumisen ja korkea-asteisen bio-soveltuvuuden. TRUE-testi tarjoaa siten ratkaisun sellaisiin pulmiin kuten huono bio-soveltuvuus, epävarma annostus ja epätasainen jakautuminen pinnalle, kuten voi helposti tapahtua käytettäessä vaseliinia apuaineena .

Kyseessä oleva keksintö tarjoaa menetelmiä, joita voidaan soveltaa testitekniikkaan suljetussa tilassa, ja mainitut menetel- 3 89133 mat a) minimoivat tarvittavan testiainemäärän ja lisäävät sen annostuksen tarkkuutta (annos per pintayksikkö), b) mahdollistavat testivalmisteet, jotka ovat stabiileja varastoinnin aikana ja c) mahdollistavat esivalmistetut testi-liuskat, joista kukin sisältää hyvin useita testiainevalmis-teita, joissa keskinäisen ristikontaminaation vaara on pieni.

On korostettava, että TRUE-testiä ei pidä sekoittaa erilaisiin ei-suljetussa tilassa tapahtuviin tekniikkoihin. Ok-luusiotekniikassa tapahtuu kontakti testiaineen ja ihon välillä umpitilassa; tämä tarkoittaa ilmalta ja sen kosteudelta suojattuna, ja samanaikaisesti ovat testi-ihon kosteus (hiki) yhdessä testiaineen kanssa suojattuina kalvon sisällä. Tässä tarkoituksessa käytetään tiiviisti sulkevaa materiaalia, esimerkiksi alumiinikalvoa tai ilmanpitävää muovikalvoa. Tämä suljetun tilan menetelmä tekee okluusio-tekniikan helposti standardisoitavaksi ja se on osoittautunut luotettavia tuloksia antavaksi (Pirilä, V., Contact Dermatitis 1/1975/sivut 48-52). Aikaisemmin on käytetty kalvoa muodostavia polymeerejä ei-suljetun tilan tekniikassa (ks. AU-A-7672).

Keksinnön mukaan ratkaistaan edellä mainitut probleemat käyttämällä lappua, joka on käytännöllisesti katsoen kosteutta ja vettä läpäisemätön ja johon on lisätty testiaine apuaineessa, joka on taipuisaa kalvoa, johon testiaine on jakautunut tasaisesti. Tätä lappua tullaan nimittämään "kalvomaisesti kantajaksi" tämän jälkeen. Termi "taipuisa" merkitsee, että kalvo ei ole niin haurasta, että se murtuisi käytettäessä TRUE-testissä. Kalvon käyttöhetkellä sen tulisi olla riittävän kuiva ja hydrofiilinen, jotta se pystyisi absorboimaan ihon eritteet kun se on levitetty iholle suljetuissa olosuhteissa.

Kerroksen paksuuden, jotta se voitaisiin katsoa oikeaksi "kalvoksi", tulisi olla alle 0,25 mm, ks. Encyclopedia of Polymer Science and Technology, Plastics, Resins, Rubbers, Fibers, osa 6, sivu 764 (1967); John Wiley & Sons Inc., USA.

4 89133

Keksinnön parhaana pidetyssä toteutusmuodossa käytetään siis kalvoja, joiden paksuus on alle 0,25 mm, etupäässä alle noin 0,1 mm, esimerkiksi alle noin 0,05 mm. Nämä paksuusarvot tarkoittavat kalvoa ennen kuin se on levitetty ihon päälle, eli ennen sitä tilaa, jossa se on adsorboinut itseensä mitään ihosta. Jokaisen lapun kalvon alue voidaan jakaa osa-alueisiin, vaikka kalvon alue on mieluimmin täysin yhtenäinen.

Testiaineet

Keksintöä voidaan käyttää ensiksikin kontaktiallergioiden selville saamiseen ja testiaineet valitaan sen vuoksi pääasiassa niistä allergeeneistä, jotka aiheuttavat tai joiden epäillään aiheuttavan näitä allergioita; mutta voidaan käyttää myös ärsyttäviä aineita. Tämän keksinnön mukaan on mahdollista käyttää kaikkia ja minkälaisia kontaktiallergeeneja ja ärsyttäviä aineita tahansa huolimatta siitä, luokitellaanko ne kiinteiksi vai nestemäisiksi aineiksi, orgaanisiksi vai epäorgaanisiksi, metallisuoloiksi vai ei-metallisuoloiksi, liukeneviksi vai ei liukeneviksi (esimerkiksi veteen).

Lapputestauksen työn helpottamiseksi on kaikkein yleisimmät allergeenit eri maantieteellisiltä seuduilta valittu kullekin ko. seudulle. Pöhjois-Amerikkaa varten on siten olemassa stan-dardiluettelo, jonka on koonnut v. 1984 American Academy of Dermatology, ja siihen kuuluvat seuraavat: bentsokaiini (5 % vaseliinia), imidatsolidinyyliurea (2 % vettä), tiuramiseos (1 % vaseliinia), kanelialkoholi (5 % vaseliinia), dibukaiini (1 % vaseliinia), merkaptobentsotiatsoli (1 % vaseliinia), neo-mysiinisulfaatti (20 % vaseliinia), p-fenyleenidiamiini (1 % vaseliinia), tetrakaiini (1 % vaseliinia), p-tert.butyylifenoli-formaldehydihartsi (1 % vaseliinia), tiomersaali (0,1 % vaseliinia) , formaldehydi (2 % vettä), hydroksisistronellali (4 % vaseliinia), Carba-seos (3 % vaseliinia), kanelialdehydi (2 % vaseliinia), kolofoni (20 % vaseliinia), PPD-seos (mustakumi-seos) (0,6 % vaseliinia), villa (lanoliini)-alkoholit (30 % vaseliinia), syklometykaiini (1 % vaseliinia), eugenoli (4 % vaseliinia), Quaternium-15 (2 % vaseliinia), isoeugenoli (4 % vaseliinia), merkaptoseos (1 % vaseliinia), epoksihartsi 5 89133 1 % vaseliinia), kaliumdikromaatti (0,5 % vaseliinia), kaiini-seos ilman bentsokaiinia (3 % vaseliinia), etyleenidiamiini-dihydrokloridi (1 % vaseliinia), bentsoyyliperoksidi (1 % vaseliinia), Peru-balsami (25 % vaseliinia), Quaternium-15 (2 % vettä) , tammivaahto (abs. mousse de ohene) (5 % vaseliinia), nikkelisulfaatti (2,5 % vaseliinia). Eurooppaa varten suositeltu lista vuodelta 1984 sisälsi seuraavat (yksinkertaisuuden vuoksi on konsentraatiot ja apuaineet jätetty tästä pois): neomysiinisulfaatti, kaliumdikromaatti, villa-alkoholit, merkaptoseos, bentsokaiini, nikkelisulfaatti, epoksihartsit, etyleenidiamiini-dihydrokloridi, kobolttikloridi, Peru-balsa-min tiuramiseos, parabeenit (seos), p-fenyleenidiamiinidihydro-kloridi, kolofoni, kinoliiniseos, mustakumiseos, p-tert.butyyli-fenoli-formaldehydihartsi, Carba-seos, hajusteseos, Quaternium-15, primiini, formaldehydi. On olemassa myös standardilistoja kontaktidermatitis-tilalle ruumiin eri osissa, esimerkiksi dermatitis jalan alaosassa: neomysiinisulfaatti, kinoformi, bentsokaiini, villa-alkoholit, Peru-balsami, klorokinaldoli, parabeenit (seos), vedetön eukeriini, kolofoni.

Näitä ns. "standardi-allergeenejä" käytetään testeissä lähes kaikilla potilailla. Usein käytetään apuna myös potilaan kliinistä kertomusta päätettäessä, mitä muita allergeenejä sisällytetään erikoisesti hänen testisarjaansa. On olemassa vielä noin 2000 tunnettua allergeeniä, joiden voidaan ajatella olevan hyödyksi lapputestimenetelmässä.

Keksinnön mukaan lisätään testiaine homogeeniseen pehmeään kiinteään faasiin, jossa mainittu aine on valinnanvaraisesti mikro-hiukkasmuodossa. Kalvon tasossa on hiukkaskoko alle 100 ^um, esimerkiksi alle 50 ^um. Suorassa kulmassa kalvotasoon nähden voi hiukkaskoko olla alle 10 ^um, esimerkiksi alle 5 ^um.

Apuaine

Apuaine valitaan aineista, joilla on kalvon muodostamisominai-suuksia. Se on tavallisesti polymeeriä, joka yhdessä haihtuvan nesteen kuten veden kanssa muodostaa geelin tai koalesoivan emulsion, johon valittu testiaine voi jakautua homogeenisesti 6 89133 joko liuenneessa, kiteisessä, mikronisoidussa, emulsoituneessa tai dispergoituneessa tilassa; keksinnön kaikkein käytännölli-simmässä toteutusmuodossa valitaan sellainen polymeeri, jonka geeli tai emulsio siveltynä voi kuivua muodostaen kalvon. Apuaineella tulisi olla hydrofiilisiä ominaisuuksia, niin että se absorboi kosteutta, kun se on käytössä.

Tietoa apuaineen eri ominaisuuksista, joista käy ilmi niiden hydrofiiliset ominaisuudet, on saatavissa käsikirjoissa ja valmistajilta, ks. esimerkiksi Encyclopedia of Polymer Science and Technology, Plastics, Rubbers, Resins, Fibers; John Wiley &

Sons Inc., osa 6 sivut 778-779 (1967). Sopivia polymeerejä on löydettävissä niiden joukosta, joiden veden absorptioarvo (24 h) ylittää 0,5 %, mieluummin yli 1 % (mitattuna ASTM D 570.63 mukaan, American Standard Type Methods). Kalvoa muodostavat polymeerit valitaan siten etupäässä sellaisista polymeereistä, joilla on moninkertainen polaarinen rakenne, esimerkiksi karboksyyli- ja/tai esteriryhmiä (kuten poly(met)akrylaatit), amidiryhmiä (kuten poly(met)akryyliamidit ja polyamidit), eet-teriryhmiä (kuten korkeammat polyetyleeni- ja polypropyleeni-glykolit), täysin alkyloidut polysakkaridit (esimerkiksi täysin metyloitu selluloosa jne.), alkoholiryhmiä (esimerkiksi poly-vinyylialkoholit ja polysakkaridit, kuten tärkkelys, valinnanvaraisesti derivaattien muodossa kuten hydroksialkyloiduissa ja osittain alkyloiduissa muodoissa, esimerkiksi hydroksipropyy-liselluloosa ja metyyliselluloosa vastaavasti). Polymeerin hydrofiilisyysasteen ratkaisevana tekijänä on sen polaaristen ryhmien pitoisuus. Siten esimerkiksi polymeereillä kuten poly-propyleenillä, polystyreenillä jne. on käytännöllisesti katsoen olematon veden adsorptiokyky, kun taas polymeereillä, joilla on useita hyvin lähekkäisiä polaarisia rakenteita, on huomattavat adsorptioarvot ja ne ovat sopivampia tämän keksinnön yhteydessä käytettäviksi (kalvoa muodostavat polysakkaridit, poly-vinyylialkoholit jne.). Kalvoa muodostavilla polymeereillä, jotka perustuvat luonnossa esiintyviin polymeereihin (biopoly-meereihin), on tavallisesti riittävä hydrofiilisyys.

7 89133

Apuaineen oikea valinta on kussakin tapauksessa riippuvainen mm. käytetystä testiaineesta ja kalvomaisesta kantajasta. Testiaineen tulisi voida jakautua homogeenisesti apuaineeseen. Apuaine ja kalvomainen kantaja tulisi valita siten, että ne kiinnittyvät toinen toisiinsa. Hydrofiiliset testiaineet (esimerkiksi aineet, jotka liukenevat polaariseen haihtuvaan liuot-timeen kuten vesi, etanoli, metanoli) vaativat tavallisesti apuaineita, jotka pystyvät adsorboimaan vettä runsaammin (hydro-fiilisempiä apuaineita) verrattuna tapauksiin, joissa käytettävät hydrofobiset testiaineet vaativat apuaineita, jotka eivät ole ainoastaan hydrofiilisiä, vaan lisäksi omaavat jonkin asteisia lipofiilisiä ominaisuuksia. Hydrofobisista testiaineista voidaan mainita hiiliterva, balsamit ja useat hajusteet. Ottamalla lähtökohdaksi testiaineen kemiallinen rakenne ja suorittamalla joitakin yksinkertaisia testejä, pystyy työntekijä löytämään apuaineen, joka on kaikkein sopivin kussakin yksittäisessä tapauksessa. Huomattakoon, että metallisuolalle ja hydrofiili-sille testiaineille on huomattu olevan tärkeätä valita kalvoa muodostava polymeeri, joka pystyy muodostamaan kalvon yhdessä polaarisen haihtuvan liuottimen, etupäässä veden, etanolin, meta-nolin jne. kanssa, tai niiden homogeenisten seosten kanssa.

Tämän tyyppisille testiaineille valitaan sopivat polymeerit kalvoa muodostavista polysakkarideista, esimerkiksi alkyloiduis-ta tai hydroksialkyloiduista selluloosista. Eräs tällainen apuaine on osittain metyloitu selluloosa; sillä on oikein hyvä hydrofiili-hydrofobi-tasapaino sen lisäksi että sillä on hyvät kalvonmuodostamisominaisuudet, eikä se ärsytä ihmisihoa.

Apuaine voi olla edellä mainittujen polymeerien seos; toisin sanoen apuaine sisältää ainakin yhtä näistä polymeereistä.

Yksi vaatimus kuitenkin on, että seoksen on pystyttävä muodostamaan kalvo, joka paisuu ollessaan suljettuun tilaan levitettynä, esimerkiksi epikutaanitestissä.

Tähän päivään mennessä ovat keksinnön parhaana pidetyt toteutus-muodot niitä joissa käytetään metyyli- ja hydroksipropyylisel-luloosaa vastaavasti esimerkkien 2 ja 3 mukaisesti.

8 89133 Tärkeitä seikkoja, jotka on otettava huomioon apuaineen valinnassa on se, että apuaine on farmaseuttisesti sopiva, ei ärsytä ihoa ja on inertti kalvomaiseen kantajaan nähden ja että sen ei tulisi, ainakaan olennaisessa määrin, muuttaa testiaineen allergeenisiä ja/tai ärsyttäviä ominaisuuksia.

Nesteen sanotaan olevan "haihtuva", jos se voi haihtua siinä lämpötilassa, johon käytetty testiaine jää kalvoon ilman että kantaja hajoaisi. Säännön mukaan on mahdollista käyttää nestettä, jolla on suhteellisen korkea höyrynpaine huoneenlämmössä.

Kalvomainen kantaja

Kalvomainen kantaja voi olla lähes täysin kosteutta ja vettä läpäisemätön, mutta tämä ei ole ehdottoman välttämätöntä. Kalvomaisessa kantajassa ei tulisi olla mitään aineita, jotka saattaisivat ärsyttää ihoa. Tämän keksinnön yhteydessä soveltuvia useita materiaaleja markkinoidaan useista yhtiöistä, kuten esimerkiksi muovipäällysteisiä papereita (Reynolds plastic-coated freezer paper (Reynolds'in muovipäällysteinen paperi pakasteita varten), Reynolds Metal Co., Richmond, Virginia), Saran0 "brilliant" paper ("kiiltävä" paperi), Saran® "dull" paper, ("himmeä" paperi) (Dow Chemical Co., Midland, Michigan), hydrofobiset muovikalvot (esimerkiksi polyesteri/Mylar /) ja alumiinikalvo. Kalvomaisen kantajan valinta ei ole missään suhteessa ratkaisevan tärkeä keksinnölle; noudattamalla yksinkertaisesti edellä esitettyjä yleisiä pääpiirteitä voi työntekijä päättää, onko jokin tietty materiaali sopiva suunniteltuun tarkoitukseen vai eikö ole. Jos valitaan kosteutta läpäisevä kalvomainen kantaja, on tärkeätä, että ryhdytään toimenpiteisiin, jotta sitä voitaisiin käyttää suljetussa tilassa.

Testilapun valmistaminen

Valmistusmenetelmässä on kaksi tärkeää vaihetta, jotka ovat ensiluokkaisen tärkeitä saadulle tulokselle; 1) testiallergeenin on jakauduttava tasaisesti kalvoa muodostavaan materiaaliin.

2) Kalvomainen kantaja on päällystettävä tasapaksuisen kalvon kanssa toistettavasti. Jos valitaan hydrofiilinen apuaine käytettäväksi kalvomaisen kantajan päällä, joka on luonteeltaan 9 39133 liian hydrofobinen, saattaa olla vaikeata päällystää kantaja tasaisesti apuaineella. Tällaisessa tapauksessa voidaan kantajaa käsitellä siten, että se tulee hydrofiilisemmäksi. Siten esimerkiksi polyesterikalvoa voidaan käsitellä lyhyen aikaa sähköisessä kentässä (esimerkiksi koronapurkauskäsittely), tai polyetyleenikalvoa voidaan osittain oksidoida polaarisen rakenteen muodostamiseksi.

Parhaan tähän asti tunnetun menetelmän mukaan, jonka avulla voidaan valmistaa kalvo, lisätään testiaine kalvoa muodostavaan polymeeriin (apuaine), liuotettuna tai geeliytettynä haihtuvaan nesteeseen. Jos testiaine liukenee nesteeseen, se voidaan lisätä suoraan seokseen, joka sisältää polymeerin. Jos se on liukenematonta, se voidaan dispergoida tai emulgoida homogeenisesti hienojakoisessa tilassa seoksen sisään. Vaihtoehtona näissä molemmissa tapauksissa voidaan testiaine esidispergoida pieneen määrään haihtuvaa nestettä, joka on geelissä olevaan nesteeseen sekoittuva. Kalvomainen kantaja päällystetään sitten geelin tasaisella kerroksella, jonka annetaan sitten kuivua, minkä jälkeen tämä materiaali voidaan leikata sopivaksi määräksi lappuja, jotka jälkimmäiset ovat mieluimmin saman muotoisia ja saman kokoisia (pinta-ala). Voi olla edullista, että päällystetyt laput muotoillaan kalvon puoleiselta reunaltaan viistoiksi tai pyöristetyiksi. Kuivan kalvon paksuus voi olla esimerkiksi 0,2, 0,1, 0,05 tai 0,01 mm riippuen päällystysgeelin tyypistä. Lap- 2 pusten pinta-ala voi olla 0,2-4 cm . Testiaineen määrä kalvossa pintayksikköä kohti vaihtelee allergeenin tyypin mukaan. Jotkut allergeenit ovat voimakkaampia kuin toiset; työntekijän on sen vuoksi tehtävä joitakin sovituskokeita saadakseen selville sopivan tehokkaan määrän pintayksikköä kohti. TRUE-testissä voidaan yleiset suuntaviiva-arvot johtaa aikaisemmista arvoista, joiden on empiirisesti havaittu olevan sopivia okluusioteknii-kassa, vaikkakin tässä olisi muistettava, että kyseessä olevan keksinnön yhteydessä voidaan odottaa tarvittavan määrän pinta-yksikköä kohti olevan alempi kuin okluusiotekniikassa vaaditut arvot, mikäli bio-sopivuus paranee. Termi "tehokas määrä pinta-yksikköä kohti" tarkoittaa testiaineen määrää, joka testissä käytettynä aiheuttaa allergisen tai ärsytysreaktion useimmilla 10 891 33 herkistyneillä tai normaaleilla yksilöillä. Säännön mukaisesti 2 o on testiaineen määrä alle 10 mg/cm , esimerkiksi alle 1 mg/cm .

2

Nikkelin ollessa kyseessä on tehokas määrä 0,5 ^umoolia/cm . (TRUE-testi, apuaine: metyyliselluloosa).

Joissakin tapauksissa saattaa olla edullista määrätä ns. kynnysarvot potilaalle. Tätä tarkoitusta varten valmistetaan lappuja, joissa on erisuuruinen määrä/pintayksikköä kohti samaa antigeeniä.

Laput pannaan sitten paineherkän liimalevymateriaalin päälle, jossa on ainakin noin 5 mm, mieluummin ainakin noin 1 cm leveä reuna, joka työntyy kunkin lapun yli (kunkin lapun kalvolla päällystetty puoli on pantu siten, että se kääntyy poispäin liimalevymateriaalista). Laput on järjestetty alle 10 cm:n välimatkan päähän toisistaan. Niiden muoto ei ole erityisen tarkka tämän keksinnön mukaan. Periaatteessa on mahdollista käyttää liuskoja yhtä hyvin kuin muun tyyppisiä lappumuotoja.

Liimamateriaali voi olla kosteutta läpäisevää, mikäli kalvomai-nen kantaja on läpäisemätöntä, ja sen tulisi olla sen laatuista, että se mukautuu pehmeästi ihoon.

Testimenetelmän helpottamiseksi on mahdollista järjestää etukäteen useita lappuja yhden yhteisen liimamateriaalin palasen päälle ja yksittäisissä lapuissa on kussakin eri allergeeni ja/tai samaa allergeeniä eri suuruisina määrinä per pintayksikkö. Tällä tavoin esijärjestelemällä lappuja saadaan testiliuska, jonka avulla potilas voidaan testata samanaikaisesti useiden allergeenien suhteen ja/tai vastaavasti erisuuruisten määrien suhteen samaa allergeeniä pintayksikköä kohti. Nämä liuskat voivat sisältää lappuja, jotka vastaavat standardiluetteloa; kukin liuska voi sisältää jopa 25 lappua, etupäässä 12 lappua.

Keksinnön mukainen testiliuska käsittää siis liimamateriaali-liuskan ("itseliimautuva", paineherkkä liimamateriaali), jonka liimapuolella on ainakin yksi alue (=lappu) päällystetty kalvolla, johon on yhdistetty testiaine. Liuska voidaan peittää 11 89133 suojakalvolla, joka kuoritaan pois välittömästi ennen käyttöä.

Laivausta ja myyntiä varten liuska suojalevyineen voidaan pakata niin, että se on hermeettisesti suljettuna ilman, veden, kosteuden ja valon suhteen, mikäli halutaan, inertissä atmosfäärissä, kuten kaasumaisessa typpiatmosfäärissä.

Testimenetelmä Tämä menetelmä suoritetaan ennestään tunnetulla tavalla, mutta käyttäen kyseessä olevan keksinnön mukaisia lappuja. Yksi tai useampia TRUE-testiliuskoja (liimamateriaalin päälle kiinnitettyjä lappuja, kuten edellä on esitetty) pannaan potilaan iholle siten, että kalvo tulee kontaktiin ihon kanssa testi-alueella, minkä jälkeen liuska painetaan tiiviisti ihoa vasten määrättyyn asentoon.

Keksintöä tullaan valaisemaan muutamien ei-rajoittavien esimerkkien avulla.

Esimerkki 1

Alustavana kokeena lisättiin malliainetta (metyleenisineä) useihin kalvoa muodostaviin apuaineisiin, jotka perustuivat selluloosaan ja polyetyleeniglykoliin, minkä jälkeen ne levitettiin kalvomaisten kantajien päälle ja käytettiin keksinnön mukaisesti. Näin saadut kalvon jäljet paljastivat malliaineen tasaisen jakautumisen ja osoittivat näin, että apuaineet sopivien kalvomaisten kantajien ja sopivien testiaineiden kanssa ovat käyttökelpoisia tämän keksinnön mukaisen menetelmän käytännöllisessä toteutuksessa. Metyyliselluloosalla havaittiin olevan ehdottomasti parhaat kalvoa muodostavat ominaisuudet, sen vuoksi suoritettiin lisäkokeita tämän selluloosajohdannaisen kanssa.

Esimerkki 2 Testimateriaali

Kobolttikloridi 1 %, nikkelisulfaatti 5 %, kaliumdikromaatti 0,5 % vaseliinissa (Hermal-Chemie, Rsinbek b. Hamburg, Saksan liittotasavalta).

Finn Chambers® (Epicon Oy, Suomi) Scanpor®.

Scanpor (Norgesplaster A/S, Norja).

12 891 33

Kemikaalit:

Kobolttikloridi pro analyysi, nikkelikloridi pro analyysi, nikkelisulfaatti pro analyysi, kaliumdikromaatti pro analyysi, natriumhydroksidi pro analyysi, dimetyyliglyoksiimi, kiteinen, (Sigma Chemical Co., St. Louis, USA). ~

Dodekyylinatriumsulfaatti ( = natriumlauryylisulfaatti) tekninen laatu, Matheson Coleman & Bell, Norwood, Ohio, USA).

Methocel A4M (metyyliselluloosa) metylointiaste 27-31 %/glu-koosiyksikkö; (Dow Chemical Co., Midland, Mich. USA).

Valkea vaseliini (Hermal-Chemie, Reinbek b. Hamburg, Saksan liittotasavalta).

Muovikalvot ja muovipäällysteiset paperit (kalvomaiset kantajat) ;

Reynolds muovipäällysteinen pakastinpaperi (Reynolds Metal Co., Richmond, Virginia, USA).

Polyesteri 0,03 mm (Mylar®).

Saran® kiiltävä 35 CIS/10 SARAN/15 PE, ja himmeä 45 paperi/15 PE (Dow Chemical Co., Midland, Mich., USA).

Kuusi vapaaehtoista, jotka olivat yliherkkiä nikkelille.

Testimateriaalin valmistaminen ®

Methocel -geeliä (3 % paino/tilavuus) valmistettiin kuumavesi-menetelmän avulla siten, että (Methocel sekoitettiin kiehuvassa vedessä; tuloksena oleva seos muodostaa geelin jäähdyttyään). Metallisuoloja - kiteisiä tai veteen liuotettuina - lisättiin geeliin. Vettä lisättiin lopulliseen Methocel®:n konsentraatioon 2,4 % paino/tilavuus. Sitten sekoitettiin geelejä hyvin mag-neettisekoittajalla, kunnes suolat olivat homogeenisesti dis-pergoituneet ja liuenneet. Ennen kuin geelejä käytettiin, niitä sontrifugoitiin, niin että ne olivat ilmakuplista vapaita.

Nämä geelit valmistettiin seuraavilla metallisuolakonsentraa-tioilla: 13 891 33

Laimennuskynnykset (moolia/litra) 0,8, 0,4, 0,2, 0,1, 0,05, 0,025, 0,013, 0,0063, 0,0031, 0,0016, 0,00078, 0,00039, 0,00020, 0,00010 ja 0,000049.

NiCl2: 0,8 - 0,000049

NiS04: 0,2 - 0,000049

CoCl2: 0,2 - 0,0031 K2Cr20?: 0,1 - 0,0031

Dodekyylinatriumsulfaatti (paino-%) 4,0, 2,0, 1,0 ja 0,5.

Geelit levitettiin sitten tasaisen paksuksi kerrokseksi (noin 0,1 mm) kalvomaisten kantajien päälle, jotka oli puhdistettu etanolilla. Geelikerroksen annettiin kuivua huoneen lämmössä (kalvon paksuudeksi tuli noin 0,01 mm) ja se leikattiin sitten neliömäisiksi lapuiksi terävän veitsen avulla.

Vertailun vuoksi valmistettiin nikkelisulfaatin laimennussarja, johon standardilapputestimateriaali sekoitettiin vaseliinin kanssa käyttäen kaksitoista laimennusastetta (5 %, 2,5 %, 1,3 % jne... ja kahdestoista laimennusaste oli 0,0025 %) .

Nikkelianalyysi

Lappuja (1,0 x 1,0 cm), joissa oli 0,1 M nikkelisulfaattigeeli-kalvot edellä esitettyjen erilaisten kalvomaisten kantajien päällä, analysoitiin kymmenen sarjassa. Ne pantiin 8 ml:n sekaan deionoitua vettä ja niitä sonikoitiin 1 min ajan ennen kuin lisättiin 12 ml indikaattoriliuosta: yhtä suuret määrät 1,0 N natriumhydroksidia deionoidussa vedessä ja 1 % dimetyyli-glyoksiimia etanolissa. Näytteet luettiin neljä tuntia myöhemmin spektrofotometrissä aallonpituudella 470 nm.

Lapputestimenetelmä

Testimateriaalia, jossa oli vaseliini/nikkelisulfaattia ja edellä esitettyjä lappuja pantiin kunkin henkilön selän yläosaan (g) <§) käyttäen apuna Finn Chambers on Scanpor -teippiä tai yksin-omaan Scanpor -teippiä ja ne olivat tällä tavoin kiinnitettyinä 48 h. Lukemat otettiin 48 h ja 72 h kuluttua.

14 391 33

Tulokset

Nikkelianalyysit

Nikkelin määrä neljässä eri testipaperissa 1,0 x 1,0 cm, 0,1 M nikkelisulfaattigeeliä ja 9-16 mg:n näytteitä 5 % nikkelisul-faatin kanssa vaseliinissa ^umoolia Ni mg NiSO^

Polyesteri Mylar® 0,68 + 0,06 0,180 + 0,017

Muovipäällysteinen paperi 0,66 + 0,02 0,174 + 0,006

Saran himmeä 0,73 + 0,08 0,192 + 0,021

Saran® kiiltävä 0,71 + 0,02 0,186 + 0,006

Nikkelisulfaatti, 5 % vaselii- 2,50 + 0,61 0,660 + 0,160 nissa Nämä nikkelianalyysien tulokset osoittavat, että kyseessä olevan keksinnön mukaiset testimateriaalit antavat paremman annos-tustarkkuuden kuin mitä on voitu saavuttaa aikaisemman tekniikan avulla.

Mikroskooppisessa tutkimuksessa näkyvät kiteet olivat kaikki alle suunnilleen 90 ^um kalvon pinnalla ja kaikki alle noin 10 ^um kalvon pinnan kanssa kohtisuoralla pinnalla.

Lapputestit

Kullekin kuudesta henkilöstä, jotka olivat yliherkkiä nikkelille (eräs heistä oli yliherkkä myös koboltille) suoritettiin lapputesti nikkelisulfaatin laimennussarjoilla vaseliinissa ja keksinnön mukaisilla lapuilla, jotka sisälsivät nikkelisulfaat-tia, nikkelikloridia, kobolttikloridia, kaliumdikromaattia ja natriumlauryylisulfaattia. Keksinnön mukaiset laput olivat 2 1 cm kooltaan. Kolme henkilöä testattiin lisäksi nikkelisul- ® 2 faatin kanssa polyesteri- ja Saran -lapuilla (kumpikin 1 cm ).

2

Kaksi henkilöä testattiin 0,7 x 0,7 cm (0,5 cm ) kokoisilla lapuilla, joissa nikkelisulfaatti oli muovipäällystetyllä paperilla .

Tämän keksinnön mukaisella testimenetelmällä saatiin tulokseksi IS 89133 laajemmin ja tarkemmin jakautuvia testireaktioita kuin testeillä, jotka käyttivät Finn Chambers -teippejä; tämä voitiin nähdä kaikkein selvimmin niissä tapauksissa, joissa laput sisälsivät allergeeniä hyvin laimennetussa muodossa. Testireaktion voimakkuus 5 %:n nikkelisulfaatilla vaseliinissa vastasi tavallisesti tämän keksinnön lappuja, jotka sisälsivät 0,05 M nikkeli- 2 sulfaattigeeliä (0,3 ^umoolia Ni/cm ). 0,7 x 0,7 cm laput an toivat yhtä voimakkaat reaktiot ja laimennussarjojen saman loppupisteen kuin 1,0 x 1,0 cm laput, mutta ne olivat vaikeammat arvioida. Reaktiot testisarjoissa polyesterin ja Saran -teipin päällä olivat identtiset paperi/muovisarjojen kanssa. Se henkilö, joka oli yliherkkä koboltille, reagoi yhtä voimakkaasti kun testattiin 1 % kobolttikloridilla vaseliinissa ja silloin kun testattiin 0,013 M kobolttikloridigeelin kanssa muovipääl-lysteisellä paperilla. Keksinnön mukainen menetelmä 0,2 ja 0,3 M kobolttikloridigeelien kanssa ja kaliumdikromaatin kanssa antoi tulokseksi ärsytysreaktiot, joiden voimakkuus oli sama kuin 5-10 % kanssa näitä suoloja vaseliinissa saadut (testit suoritettiin normaaleille ihmisille).

Kun ihoa ärsyttävää natriumlauryylisulfaattia yhdistettiin keksinnön mukaiseen kalvoon (0,5 - 4 %), saatiin ärsytysreaktioita, jotka vastaavat niitä, jotka oli saatu konventionaalisella lappu-testauksella saman aineen kanssa vesiliuoksilla (0,25 - 2 %) .

Sinä aikana kun TRUE-lappujen annettiin viipyä paikoillaan testihenkilöihin kiinnitettyinä, havaittiin kalvon paisuvan. Tämä lisää kontaktia kalvo/iho ja oletettavasti helpottaa testiaineiden tunkeutumista ihoon niin että vesiliukoiset aineet pääsevät helpommin ihon vesifaasiin ja rasvaliukoiset aineet löytävät helpommin tiensä ihon lipaasifaasiin. Esimerkki osoittaa, että kiinteätä, taipuisaa kalvoa voidaan käyttää apuaineena.

®

Muista testiaineista, joita on yhdistetty Methocel -kalvoihin ja analysoitu menestyksellisesti kliinisesti, mainittakoon seuraavat;

Neomysiinisulfaatti, etyleenidiamiinihydrokloridi ja Peru-balsami.

16 891 33

Esimerkki 3

Klucel -geelejä (hydroksipropylaattiselluloosaa, Hercules Inc., USA), jotka sisälsivät useita testiaineita, pantiin kalvomaisten kantajien päälle ja annettiin kuivua, ja kaikki tapahtui esimerkin 2 kanssa analogisesti. Käytetyt liuottimet olivat veden ja etanolin eri seoksia, ja etanolikonsentraatio oli kussakin tapauksessa riittävä liuottamaan kulloinkin käytetyn testiaineen.

®

Allergeenityyppi Klucel :n Liuottimen Allergeenin konsen- konsentraatio konsentraatio traatio

Erilaisten tuok- 66 % EtOH paino/ suaineiden seos 5,6 % tilavuus 53 - 0,1 mg/cnr3

Kolofoni 5,6 % 60 % EtOH paino/ 200- 2,3 mg/cm^ tilavuus p-fenyleenidi- 5,0 % 0 % EtOH paino/ 6,7- 0,01 mg/cm^ amiini tilavuus

Kalvomainen kantaja oli polyesterikalvoa, joka oli hydrofili-soitu koronapurkauskäsittelyn avulla, jotta kalvon adheesio olisi parempi. Kun kuivia kalvoja tutkittiin mikroskooppisesti, ei nähty kiteiden muodostumista. Iholla saadut testitulokset oli helppo lukea.

®

Muista testiaineista, joita on yhdistetty Klucel -kalvoihin ja analysoitu kliinisesti menestyksellä, mainittakoon: nikkelisul-faatti, kaliumdikromaatti, kaiiniseos, Peru-balsami, etyleeni-diamiinihydrokloridi, kobolttikloridi, tiuramiseos ja epoksi-hartsit.

Testatuista aineista sisältävät Peru-balsami ja tuoksuseos haihtuvia aineosia.

Esimerkki 4

Mikronisoitua hydrokortisoniasetaattia (esimerkki aineesta, jolla on vallitseva lipofiilinen luonne) tehtiin lietteeksi ® veteen (10 % paino/tilavuus) ja lisättiin Methocel -geeliin, joka oli valmistettu kuumavesimenetelmän avulla. Geeli siveltiin sitten kalvon muodossa muovipäällysteisen paperin päälle (esimerkin 2 mukaisesti). Mikroskooppinen tutkimus osoitti, että hydrokortisoniasetaatti oli jakautunut tasaisesti kalvoon.

Claims

17 891 33

1. Testiliuska, jonka päällä on ainakin yksi olennaisesti kosteutta ja vettä läpäisemätön, kontaktiallergian testi-ainetta sisältävä lappu ja joka on tarkoitettu käytettäväksi suljetussa tilassa suoritettavaan epikutaanitestiin kontaktiallergian selville saamiseksi, tunnettu siitä, että testi-aine on tasaisesti sisällytetty apuaineeseen, joka on muotoiltu taipuisaksi, kuivaksi kalvoksi, jonka paksuus on pienempi kuin 0,25 mm, testiliuskan ainakin yhdelle lapulle, joka apuaine kalvoa muodostavana aineena sisältää kalvoa muodostavan polymeerin, joka kykenee absorboimaan kosteutta testattavalta ihoalueelta testiliuskan ollessa käytössä.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen testiliuska, tunnettu siitä, että testiliuska sisältää useita lappuja.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen testiliuska, tunnettu siitä, että ainakin yhden lapun pinta-ala on 0,2-4 cm^.

4. Jonkin patenttivaatimuksen 1-3 mukainen testiliuska, tunnettu siitä, että kalvon paksuus on pienempi kuin 0,10 mm.

5. Jonkin patenttivaatimuksen 1-4 mukainen testiliuska, tunnettu siitä, että apuaine muodostuu ainakin yhdestä hydrofiilisestä kalvoa muodostavasta polymeeristä.

6. Jonkin patenttivaatimuksen 2-5 mukainen testiliuska, tunnettu siitä, että kalvoa muodostava polymeeri ainakin yhdellä useista lapuista sisältää useita polaarisia ryhmiä tai on sen kalvoa muodostava johdannainen.

7. Jonkin patenttivaatimuksen 2-6 mukainen testiliuska, tunnettu siitä, että kontaktiallergian testiaine ainakin yhdellä useista lapuista on metallisuola.

8. Jonkin patenttivaatimuksen 2-7 mukainen testiliuska, tunnettu siitä, että kalvoa muodostava polymeeri ainakin 18 89 1 33 yhdellä useista lapuista on metyloitu tai hydroksipropy-loitu selluloosa tai niiden seos.

9. Jonkin patenttivaatimuksen 1-8 mukainen testiliuska, tunnettu siitä, että polymeeri muodostaa geelin veden kanssa.