WO2003069338A2 - Analyse von vitalstoffen - Google Patents

Analyse von vitalstoffen Download PDF

Info

Publication number
WO2003069338A2
WO2003069338A2 PCT/EP2003/001359 EP0301359W WO03069338A2 WO 2003069338 A2 WO2003069338 A2 WO 2003069338A2 EP 0301359 W EP0301359 W EP 0301359W WO 03069338 A2 WO03069338 A2 WO 03069338A2
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
vitamin
micronutrient
group
acid
cells
Prior art date
Application number
PCT/EP2003/001359
Other languages
English (en)
French (fr)
Other versions
WO2003069338A3 (de
Inventor
Jürgen Wilhelm Richard BERNHARDT
Felix Oliver Heinrich
Karin Engelhart-Jentzsch
Original Assignee
Biotesys Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Biotesys Gmbh filed Critical Biotesys Gmbh
Priority to US10/504,185 priority Critical patent/US20050118671A1/en
Priority to EP03704594A priority patent/EP1474685A2/de
Priority to JP2003568408A priority patent/JP2005517926A/ja
Priority to AU2003206882A priority patent/AU2003206882A1/en
Publication of WO2003069338A2 publication Critical patent/WO2003069338A2/de
Publication of WO2003069338A3 publication Critical patent/WO2003069338A3/de

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/82—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving vitamins or their receptors

Definitions

  • the invention relates to a method for determining the supply profile of at least one micronutrient in a biological sample and an analysis kit for obtaining and preparing a biological sample with cells for determining the intracellular concentration of at least one micronutrient in accordance with the features in the preambles of claims 1 and 17 and the use of the analysis kit according to claim 18.
  • the therapeutic principle of orthomolecular medicine is based on the knowledge that the human body needs vital substances (micronutrients) for all organs to function properly and smoothly. What is meant are vitamins, minerals, trace elements and essential
  • Orthomolecular therapeutic agents are also known as eubiotics. In the right dosage, they offer optimal health protection.
  • Linus Pauling The principle of action is defined by Linus Pauling as follows:
  • Orthomolecular medicine is maintaining good health and treating diseases by changing the concentration of substances that are normally present in the body and / or are responsible for health.
  • Orthomolecular medicine uses only substances that occur naturally in both food and our body. There are vital substances, such as vitamins and minerals, that our body cannot produce or can only produce insufficiently. As micronutrients, they must therefore be regularly added in suitable doses so that we remain healthy and productive.
  • vital substance status is different in each individual. The individual status depends on various external and internal factors, such as eating and living habits, age, state of health and environmental influences. Under certain circumstances, these factors can increase demand so much that it is often not possible to cover the vitamin and mineral requirements optimally, even with healthy, varied mixed foods. Gaps in vital substances are therefore almost inevitable.
  • the vitamin status is mostly only recorded for sick people, especially chronically sick people.
  • the vitamin status survey is also interesting for healthy people because it provides important information about a deficiency of a vital substance in the body and thus diseases that result from such deficiencies or excesses can be recognized and prevented at an early stage.
  • the vitamin status survey is currently still linked to a doctor's visit, a blood sample and an extensive laboratory analysis and is therefore not yet established in the prophylactic examination due to the large amount of time and the high costs.
  • US 5,800,979 A a method for determining the in vivo concentration of the folic acid coenzyme in body fluids.
  • a known amount of folic acid is used as an internal standard as a comparison with the folic acid concentration from a body fluid.
  • At least one coenzyme is contained in this body fluid.
  • a purification of the internal folic acid standard, a quantification of the folic acid coenzyme concentration and an evaluation by means of gas chromatography or mass spectrometry are described. The quantification is carried out from biological fluids such as blood, urine, cerebrospinal fluid and amniotic fluid.
  • EP 840 127 AI describes a table and a method for examining the vitamin and mineral substance profile.
  • a table is shown on which indicator values of vitamins and minerals in the blood are plotted. These areas indicate the target value of a healthy person. This table is after blood analysis the resulting value is entered and thus a deficiency or an excess of this substance can be logged. The health status and the aging process of the test person can be determined on the basis of the deviations. Water-soluble vitamins, fat-soluble vitamins and minerals from the blood are analyzed.
  • WO 95/29628 AI also describes a method for the rapid detection of the vitamin deficit in a person.
  • the vitamin deficit is determined by the measure of the person's ability to adapt to darkness, which is demonstrated by different test systems under different lighting conditions.
  • the analysis data of vitamins from these examinations are comparable to the results from biological liquids.
  • a competitive binding analysis for vitamin B12 in serum is known from WO 89/12826 AI.
  • This method uses immobilized vitamin B to compete with vitamin B12 from a sample for a binding partner.
  • the amount of binding partner bound to the immobilized vitamin B12 is measured and is inversely proportional to the concentration of free vitamin B12 in the sample.
  • the binding partner is biotinylated and is bound to a reporter group by a reaction with avidin.
  • the immobilized vitamin B12 is bound to beads by a protein linker, such as an anti-vitamin B12 antibody.
  • the prior art shows that the concentration determination of micronutrients takes place from the blood or serum or other body fluids.
  • the disadvantage of these methods is that only the concentration of the circulating vital substances but not the actual concentration that is in the cell can be shown.
  • the present invention is therefore based on the object of specifying a method for ascertaining a micronutrient status in a cell.
  • the object of the invention is achieved by the method according to the features in the characterizing part of claim 1.
  • the advantage of this method is that for the physiological function, such as signal transduction, and thus the (patho) physiological state of a cell, a tissue, an organ or an organism, both the extracellular and the intracellular concentration of the substances is of enormous importance.
  • Another advantage is that the intracellular concentration determination actually amount of the micronutrient absorbed by the cell can be measured and not, as previously, only the biological availability of both micronutrients (eubiotics) and xenobiotics is always determined on the basis of the circulating amount of the substance in the blood.
  • the intracellular concentration determination of micronutrients also has the advantage that, for example, during a supplementation, a progress check is made possible and thus an untargeted intake of the vital substance preparations and a resulting oversupply with this substance is prevented.
  • a screening of the entire range of vital substances can determine which micronutrients are to be supplemented before the start of the supplementation.
  • the embodiment according to claim 2 is advantageous, with which a possibility for the current status assessment as well as a progress check for each tissue is possible separately and, unlike a measurement in the blood, the concentration of the entire organism is determined.
  • an embodiment according to claim 3 is advantageous, according to which an easily accessible and easily isolable tissue is available for the analysis by using an epithelial tissue, in particular a mucosa, and as a result no complex biopsy or blood sampling procedures have to be carried out.
  • this process also enables self-monitoring of the micronutrient level for those people who buy micronutrient products as OTC (over the counter) preparations in any pharmacy without a doctor's prescription and thus over-supply with these preparations can be avoided.
  • OTC over the counter
  • Another advantage is that this procedure can be carried out simply and quickly because the elimination of the blood draw, which must be carried out by medically trained personnel, simplifies the entire procedure and thus reduces costs in the financially severely weakened health system.
  • a further development of the method according to claim 5 is advantageous, according to which the concentrate is determined on many different substances.
  • the intracellular concentration of one of these substances or a combination of these substances provides important data for the prophylaxis of diseases. But of course, this data can also be used to obtain important information for the course of diseases, especially chronic diseases.
  • micronutrient concentrations can often achieve a significantly greater therapeutic range than by xenobiotic concentration determinations, because synergistic effects often result due to combinations of eubiotics, whereby the pharmacology of the micronutrients sometimes differs significantly from that of foreign medicines .
  • concentration it can be demonstrated, for example, that oxidative protection is not yet achieved by taking a micronutrient, whereas a combination of two or more micronutrients with antioxidative properties shows an antioxidative effect.
  • Orthomolecular measures are used to set biochemical stimuli that can be used and answered by the organism in a meaningful way, since the body is dealing with "original parts", ie with active substances that are familiar to it. This means that early interventions in energy metabolism are an optimization the repair mechanisms, the elimination of free radicals and many other things possible.
  • the method makes it possible to determine the concentration of the amounts of vitamins provided which the organism needs for vital functions but which cannot be synthesized in the metabolism or cannot be synthesized to a sufficient extent and must therefore be regularly supplied with food.
  • vitamins are also components of coenzymes that catalyze cell metabolism. It has also proven to be advantageous that, despite the mostly very low amount of vitamins required, specific deficiency symptoms (avitaminoses) e.g. below the minimum concentration, e.g. Night blindness (vitamin A), scurvy (vitamin C), rickets (vitamin D), pernicious anemia (vitamin B12), beriberi (vitamin Bl) and coagulation disorders (vitamin K). Otherwise, an excessive intake of certain vitamins (A, D) leads to intoxication symptoms (hypervitaminoses).
  • a further development according to claim 7 is advantageous, according to which, by determining the concentration of compounds with a retinoid structure, biochemical functions related to the visual process, growth, development and differentiation of epithelial tissue, reproduction (spermatogenesis, development of the placenta, fetal development) and Testosterone formation are involved, can be demonstrated.
  • biochemical functions related to the visual process, growth, development and differentiation of epithelial tissue, reproduction (spermatogenesis, development of the placenta, fetal development) and Testosterone formation are involved.
  • Vitamin A deficiency is rather rare in industrialized countries, which means that uncontrolled or incorrectly carried out vitamin A supplementation can lead to an increased concentration of vitamin A and nausea, vomiting, headache, dry skin and mucous membranes and later also to swelling of the peri osts, hemorrhages, hair loss, irritability, spontaneous fractures and teratogenic effects. In developing countries, vitamin A deficiency symptoms come first among the vitamin deficiency states.
  • Vitamin B complex which is responsible for many regulatory functions in metabolism, a monitoring of these functions is made possible. Since the human body has only a low storage capacity for this vitamin complex, regular concentration determination is necessary for general well-being and the maintenance of physiological functions.
  • nutrition-related supply problems can also be detected, e.g. with exclusive nutrition of mechanically peeled and polished rice and cereal products.
  • the shell in which the majority of thiamine is located, is at least partially removed.
  • Early symptoms of thiamine deficiency include fatigue, nervousness, poor memory, sleep disorders, anorexia, abdominal complaints and constipation.
  • Riboflavin deficiency manifests itself primarily in tissues of ectodermal origin.
  • niacin concentration of niacin
  • concentration of niacin proves to be advantageous because severe niacin deficiency causes pelagra.
  • Primary deficiency symptoms typically occur in areas where maize is the main component of food.
  • the bound niacin as in Maize is not assimilated in the intestine without prior alkali treatment.
  • the signs of the Pelagra can be observed on the skin, on the mucous membrane, on the CNS and gastrointestinal tract.
  • Pantothenic acid is found in many foods and is an essential component of Coenzyme A, which is used in many enzymatic reactions, such as. B. in the citric acid cycle and in the fatty acid cycle, serves as an acyl transfer cofactor, and by detecting its concentration, a derailment from the physiological balance can be prevented at an early stage.
  • Pyridoxine comes as pyridoxol (alcohol), as pyridoxal (aldehyde) and as pyridoxamine
  • a concentration determination of folic acid is of great importance and importance, especially for women of childbearing age, because an undersupply of this vitamin can cause severe fetal malformations.
  • Extensive studies have documented beyond any doubt that additional folic acid, which is taken before and at the start of pregnancy, is particularly serious in its deformity, e.g. Preventing neural tube defects (spina bifida) and other malformations of the spinal cord and brain.
  • the prophylactic effect is not 100% certain, but around three quarters of all cases with this serious malformation that lead to lifelong disability can be avoided.
  • Cobalamin is the only vitamin that practically only occurs in animal organisms.
  • a determination of the concentration is therefore particularly advisable for pure vegetarians who not only refrain from consuming meat but also from other animal products, such as milk and eggs.
  • Vitamin B12 deficiency is particularly evident in tissues with a high cell division rate and can influence the biosynthesis of DNA.
  • the determination of the content of biotin which is an essential coenzyme in both the metabolism of fats and carbohydrates, is particularly advantageous because a lack of biotin results in retarded mental and physical development, alopecia, keratoconjunctivitis and disorders of T and B cell-dependent immunity is manifested, and thus recognized early and the sequelae can be prevented.
  • prophylaxis can be carried out by detecting the concentration of ascorbic acid, which is essential for the formation of collagen and the maintenance of substances of mesenchymatic origin (connective tissue, osteoid substance of the bone, dentin of the teeth) or accompanying
  • Measures can be taken during a chronic illness.
  • the need for vitamin C is also increased during pregnancy and lactation, for acute and chronic inflammatory diseases, operations and burns as well as for thyrotoxicosis, whereby a determination of the concentration advantageously provides data that enables a correctly dosed supplementation of vitamin C.
  • Ascorbic acid as a strong reducing agent, can reversibly transfer hydrogen or electrons, is involved in phenylalanine and tyrosine metabolism and, as a reducing agent, activates those enzymes that hydroxylate the proline and lysine of the protocol agent after translation to hydroxyproline and hydroxylysine.
  • Vitamin C also causes folic acid, which is linked to food components, to be released from these conjugates and also promotes iron absorption, whereby the determination of the concentration of ascorbic acid and the resulting dosage of vitamin C produce many synergistic effects.
  • a determination of the concentration also proves to be advantageous, according to which a primary deficiency occurs in adults mostly due to food idiosyncrasies or due to one-sided diet. Increased exposure to cold or heat also increases vitamin C excretion in the urine.
  • the determination of the concentration of calciferol can avert serious consequences for human health.
  • the main source of calciferols is UV-dependent synthesis taking place in the skin.
  • Provitamin D 3 is formed in the skin by photochemical means from 7-dehydrocholesterol and slowly isomerized to vitamin D3, which is removed by a vitamin D-binding protein.
  • the main effect of 1,25 - dehydroxycholecalciferol is namely the increased intestinal calcium absorption and thereby the promotion of normal bone formation and mineralization.
  • Vitamin E is also closely related to selenium. Especially in premature babies, infants and toddlers who are fed a diet with a high proportion of unsaturated fatty acids, a determination of the concentration proves to be of advantage because it can quickly identify a primary tocopherol deficiency. In adults, vitamin E deficiency leads to a shorter lifespan for erythrocytes, keratinuria and
  • vitamin K detection ensures maintenance of the blood coagulation cascade.
  • Vitamin K deficiency manifests itself in a reduction in the ability of the blood to clot and in a tendency to bleed (hemorrhages). Since vitamin K can also be produced in the body by intestinal bacteria, regular determination of the concentration for monitoring the status of vitamin K proves to be advantageous.
  • Trace elements that are essential for warm-blooded animals can be determined.
  • the elements sodium, potassium, magnesium and calcium in physiological concentration are responsible for maintaining homeostasis.
  • the introduction of synthetic diets in the treatment of metabolic abnormalities based on congenital genetic defects, the development of intravenous nutrition and the dialysis treatment of patients with end-stage renal insufficiency reveal the iatrogenic risks, the importance of determining the concentration and the consequent nutritional intake of these Underline elements.
  • Trace elements which occur in the body in minimal concentrations (less than 0.005% of the body weight), play an important role in the physiology of humans. However, it comes with the increasing development of synthetic ones Foods with excessive intake of these elements, which cause symptoms of toxicity that can only manifest themselves after years.
  • dolomite rock For example, many health magazines and health food stores advertise dolomite rock with the note that it is rich in calcium and magnesium. Large sections of the population are susceptible to this type of information. However, as published reports indicate, dolomite rock also contains metals such as iron, chromium, phosphorus, nickel, silicon, zinc and cadmium in potentially toxic concentrations. Especially with such complex effects of minerals and trace elements, the method according to the invention proves to be particularly advantageous due to the possibility of detecting a large number of micronutrients.
  • taurine which is a conditionally essential amino acid and can be found in the tissues of most animal species, does not serve as a building block of proteins, but is present in free form in many tissues. Taurine is involved in a number of physiological processes, e.g. the conjugation of bile acid, osmoregulation, detoxification of xenobiotics, the stabilization of cell membranes, the control of cellular calcium flow and the modulation of neuronal excitability. Lower taurine levels have been associated with retinal degeneration, retarded growth and cardiomyopathy.
  • a concentration determination of acetyl-L-carnitine proves to be advantageous because it promotes the absorption of acetyl-coenzyme A into the mitochondria during fatty acid oxidation, increases the production of acetylcholine and stimulates the synthesis of proteins and membrane phospholipids. Because of its structural similarities with acetylcholine, acetyl-L-carnitine also acts as a parasympatomimetic. In addition, a high acetyl-L-carnitine concentration has a positive effect on the course of Alzheimer's disease, age depression, HIV infection, diabetic neuropathy, cerebral ischemia and alcohol-induced cognitive disorders.
  • quercetin acts in a variety of ways on the human organism, even a determination of the concentration of this micronutrient can provide important information for the general condition of a person. For example, it protects the cardiovascular system, counteracts the development of carcinomas and ulcerations, prevents allergic reactions, and prevents cataract development and has an antiviral and anti-inflammatory effect.
  • bromelain concentration determination of bromelain can benefit people with coagulation disorders and a weakened immune system.
  • the anti-inflammatory effect of bromelain is based on various physiological conditions
  • bradikinin formation at the inflammation site is inhibited by exhaustion and the fibrin formation is reduced as a result of the reduction in certain intermediate products of the coagulation cascade.
  • bromelain promotes the conversion of plasminogen to plasmin and thus stimulates fibrinolysis.
  • a deficiency in high-quality proteins can be detected by determining the amino acid concentration.
  • Amino acids are building blocks of proteins and hormones. A lack of essential amino acids leads to the breakdown of the physiological function of the human body. For example, arginine increases the number of lymphocytes and generally promotes the formation of immune-competent cells. It also increases the cytolytic capacity of macrophages and NK cells. It also plays an important role in wound healing. Histidine acts as an antiallergic and serves as a precursor to histamine. Isoleuzin, leuzin and vallin are important components of the muscle proteins.
  • Lysine is the main component of collagen, carnitine antibodies, hormones and enzymes, supports wound healing and promotes herpes simplex healing.
  • Methionine is an antioxidant, detoxifies the liver and is essential for the selenium effect (absorption, transport, bioavailability).
  • Phenylalanine has an antidepressant effect and prolongs the action and increases the activity of endorphins.
  • Threonine is a lipotropic factor. Tryptophan is important for the synthesis of vitamin
  • B3 is a precursor of serotonin and melatonin (sleep rhythm).
  • a concentration determination of essential fatty acids can take place.
  • An optimal concentration of essential fatty acids for the organism is extremely important, especially during growth and in the second half of life. For example, they maintain the elasticity of the membranes of all body cells and the mitochondria and ensure cell rejuvenation.
  • the immune system also needs them to build defense and phagocytes. They occur in the gonads and form the building blocks for the body's own hormone production in the endocrine gland system but also in the cell tissue. Play an outstanding role among essential fatty acids the linoleic and the ⁇ -linolenic acid.
  • arachidonic acid is only found in animal fats and is a starting product for prostaglandin synthesis. Excess arachidonic acid can have a negative impact on rheumatic arthritis.
  • the object of the invention is independently achieved by an analysis kit according to the features in the characterizing part of claim 17.
  • the advantage of this is that the analysis kit contains all the necessary devices and reagents for carrying out the extraction and storage of the mucosal cells.
  • Another advantage is that the simple way of storing the analysis kit at room temperature makes it possible to store it at home.
  • the object of the invention is also achieved independently by using the analysis kit according to the features in the characterizing part of claim 18. It has proven to be advantageous that the use of the analysis kit enables a quick and uncomplicated determination of the concentration of the micronutrients.
  • a multiple mouthwash for example with sterile water, physiological saline (0.9% NaCl), phosphate-buffered saline (PBS), etc., is selected in a volume from a range from 10 ml to 1000 ml, in particular 50 ml to 500 ml, preferably 100 ml to 250 ml.
  • a wooden or plastic spatula, a swab such as a cotton swab, or a brush, such as a toothbrush is moistened with PBS or 0.9% NaCl solution and then each inside of the cheek 10 times to 30 times, preferably 15 times to 20 times scraped or brushed with light pressure from top to bottom. While scraping or brushing, the
  • Saliva not to be swallowed The mouth is selected once to 5 times, preferably 2 times to 3 times with PBS, 0.9% NaCl or water in a volume, from a range from 5 ml to 100 ml, in particular 10 ml to 50 ml, preferably 20 ml to 30 ml, rinsed out and the rinsing liquid is collected in a sample vessel.
  • the spatula or brush is rinsed out in this solution and wiped off at the edge of the sample vessel.
  • buffer solution or water is already placed in the sample vessel.
  • the sample vessel can also contain reagents for stabilizing or lysing the cells in the rinsing liquid.
  • the sample vessel is then cooled. This is done either in a refrigerator, e.g. a refrigerator or freezer or in a container such as an aluminum bag, styrofoam box, cooler bag, which is provided with ice or cold packs.
  • Transport to the laboratory takes place in a cooled state.
  • the rinsing liquid is centrifuged in the sample vessels in the laboratory. This centrifugation is carried out for 30 minutes, preferably 20 minutes, in particular 10 minutes, at 2000 g, preferably 1500 g, in particular 1400 g, in a range from -10 ° C. to 15 ° C., preferably between 0 ° C. and 10 ° C. , especially between 4 ° C and 8 ° C.
  • the supernatant is decanted and the cell pellet is washed and resuspended in 30 ml, preferably 25 ml, in particular 20 ml PBS, preferably in cold PBS.
  • a volume of 15 ml, in particular 10 ml, has proven to be advantageous.
  • the homogenized cells are centrifuged again for a period of 1 minute to 15 minutes, in particular 2 minutes to 10 minutes, preferably 3 minutes to 5 minutes, at 1000 g, in particular 1400 g, preferably 1800 g.
  • the centrifugation step takes place at a temperature in a range from -10 ° C. to 20 ° C., in particular -5 ° C. to 15 ° C., preferably 0 ° C. to 10 ° C.
  • the volume of the solution for resuspending the pellet is in a range between 0.5 ml and 5 ml, in particular between 1 ml and 3 ml, preferably between 1.25 ml and 2 ml.
  • the homogenization is carried out with a 10 ml, preferably with a 5 ml pipette and, for better homogenization, is finally carried out with a 1 ml, preferably with a 0.5 ml pipette.
  • the cells are centrifuged again for a period of 0.5 minutes to 5 minutes, in particular 1 minute to 4 minutes, preferably 1.5 minutes to 3 minutes, at 10,000 g, preferably 15,700 g, in particular 18,000 g.
  • the supernatant is suctioned off and the cell pellet is gassed with nitrogen for a period of 1 s to 60 s, preferably 5 s to 30 s, in particular 10 s to 20 s, and then frozen at -20 ° C., preferably at -80 ° C. , During the last resuspension step, the homogenized solution can also be aliquoted, e.g. in 500 ⁇ l or 400 ⁇ l or 300 ⁇ l portions. The cell pellet is either frozen or processed directly.
  • the mucosal cells can also be obtained from various mucous membranes according to known standard methods from the specialist literature.
  • blood cells can of course also be used to determine the intracellular supply profile with at least one micronutrient.
  • the blood cells are isolated according to a standard isolation method known from the specialist literature or, for example, with analysis kits from Qiagen for the purification of blood cells.
  • the cell number is determined using known cell number determination methods, such as by counting cells using a counting chamber with the aid of a microscope, or by automatic counting processes such as using a Coulter counter.
  • the isolated mucosal cells are lysed.
  • the cell pellet in the first sample vessel is resuspended in a volume of 50 to 100 ⁇ l, preferably 100 to 300 ⁇ l, in particular 200 ⁇ l to 250 ⁇ l PBS, 0.9% NaCl solution or water.
  • ethanol in a volume of 50 .mu.l to 500 .mu.l, in particular 100 .mu.l to 300 .mu.l and preferably from 200 .mu.l to 250 .mu.l mixed with sodium dodecyl sulfate (SDS) and butylated hydroxytoluene (BHT) each in a concentration selected from a range of 0.1% to 10%, preferably 0.5% to 5%, in particular 1% to 2%.
  • SDS sodium dodecyl sulfate
  • BHT butylated hydroxytoluene
  • the solution is then mixed, preferably whirled, for a period selected from a range from 1 s to 60 s, in particular 10 s to 50 s, preferably 30 s to 40 s.
  • n-hexane is added in a volume range from 100 .mu.l to 1000 .mu.l, in particular 200 .mu.l to 800 .mu.l, preferably 300 .mu.l to 400 .mu.l and it is again for a period of 1 s to 60 s, preferably 5 s to 50 s, in particular 10 s to 20 s, mixed, preferably whirled.
  • the solution is selected from a period
  • the n-hexane phase is pipetted off into a second sample vessel.
  • the original first sample vessel is again overlaid with n-hexane in a volume of 100 ⁇ l to 1 ml, preferably 200 ⁇ l to 500 ⁇ l, in particular 300 ⁇ l to 400 ⁇ l.
  • the solution is whirled for a period selected from a range from 1 s to 60 s, in particular from 5 s to 50 s, and preferably from 10 s to 30 s, and then selected from a range from 10 s to 5 for a period Minutes, preferably 30 s to 3 minutes, in particular 1 minute to 2 minutes, with 1000 g, preferably 10,000 g, in particular 16,000 g, centrifuged.
  • the upper phase is again removed and pipetted into the same second sample vessel as the previously transferred phase and the upper phases of the first and second centrifugation steps are combined.
  • complete evaporation is carried out in a nitrogen stream (evaporator).
  • the pellet is selected in a volume from a range of 10 .mu.l to 1000 .mu.l, in particular 100 .mu.l to 500 .mu.l and preferably 200 .mu.l to 300 .mu.l, eluent and pipetted into micro-inserts of autosampler vials.
  • a Nucleosil 120, C 18, 300 x 3 mm column is used as the column for HPLC.
  • the Superplasticizer A consists of acetonitrile, methanol and ammonium acetate in a concentration selected from a range of 0.1% to 10%, in particular 1% to 5%, preferably 2% to 3%.
  • the substances of the flow agent A acetonitrile: methanol: ammonium acetate are used in a ratio of 171: 29: 15, in particular of 171: 17: 7, preferably 163: 21: 19.
  • Tetrahydrofuran (THF) is used as flow agent B.
  • An eluent gradient is built up for liquid chromatography, which is composed according to one of the three variants listed below.
  • the flow rate is in a range selected between 0.1 ml / minute and 5 ml / minute, in particular 0.2 ml / minute and 4 ml / minute and preferably between 0.5 ml / minute and 3 ml / minute.
  • Detection is carried out with UV light and with visible light in each case with a wavelength for UV light selected from a range between 282 nm and 396 nm, in particular between 293 nm and 348 nm, in particular between 298 nm and 326 nm and for visible light selected from a range between 400 nm and 800 nm, in particular between 456 nm and 721 nm, preferably between 532 nm and 678 nm.
  • the temperature during liquid chromatography is in a range between 20 ° C. and 60 ° C., in particular 30 ° C to 50 ° C and preferably between 40 ° C and 45 ° C.
  • An internal standard is also added to H manuclearol, in order to calibrate the HPLC
  • buccal mucosa cells multiple mouthwashes are carried out, for example with a total of 500 ml of PBS.
  • a brush e.g. a toothbrush is moistened with a PBS and then brushed each cheek inside 10 times from top to bottom with light pressure. Saliva should not be swallowed during brushing.
  • the mouth is rinsed once with 50 ml of PBS and the rinsing liquid is collected in a sample vessel.
  • 10 ml of buffer solution are already in the sample vessel.
  • the brush is rinsed out in this solution and wiped off at the edge of the sample vessel.
  • the sample vessel is then cooled. This is done in a refrigerator.
  • the transport to the laboratory takes place in a styrofoam box filled with ice cubes.
  • the rinsing liquid is centrifuged in the sample vessel for 30 minutes at 2000 g and a temperature of 0 ° C.
  • the supernatant is decanted and the cell pellet resuspended in 30 ml PBS.
  • the homogenized cells are centrifuged again at 1800 g for a period of 1 minute. The centrifugation takes place at a temperature of 0 ° C.
  • the supernatant is decanted again and the cell pellet is taken up in 0.5 ml PBS using a 1 ml pipette.
  • the cells are centrifuged again at 10,000 g for 5 minutes.
  • the supernatant is suctioned off and the cell pellet is gassed with nitrogen for 30 s.
  • Lysis of the cells The cell pellet in the sample vessel is resuspended in a volume of 100 ⁇ l PBS. This is followed by the addition of 100 ⁇ l of ethanol mixed with 0.5% SDS and 0.5% BHT and the solution is vortexed for 30 s.
  • sample preparation for HPLC 300 ⁇ l of n-hexane are added and the sample is vortexed again for 30 s. The solution is then centrifuged at 10,000 g for 3 minutes. After centrifugation, the n-hexane phase is pipetted off into a second sample vessel. The original first sample vessel is again covered with 300 ⁇ l of n-hexane, vortexed for 30 s and centrifuged at 10,000 g for 3 minutes. The upper phase is again removed and pipetted into the same second sample vessel as the previously transferred phase and the upper phases of the first and second centrifugation steps are combined. At the end of the sample preparation, the sample is completely evaporated with nitrogen. The pellet is resuspended in 300 ⁇ l superplasticizer and pipetted into micro inserts of autosampler vials.
  • a Nucleosil 120, C 18, 300 x 3 mm column is used as the column for HPLC.
  • the flow agent A consists of acetonitrile, methanol and 5% ammonium acetate.
  • the fluids A acetonitrile: methanol: ammonium acetate are used in a ratio of 163: 21: 19.
  • THF is used as flow agent B.
  • the eluent gradient shown below is used for liquid chromatography.
  • the flow rate is 0.5 ml / minute and the detection is carried out with UV-VIS at 292 nm and 456 nm.
  • the temperature during liquid chromatography is around 20 ° C.
  • An internal standard is also added to solvent A to enable calibration of the HPLC system.
  • vaginal mucosa cells To obtain vaginal mucosa cells, a multiple vaginal irrigation is carried out, for example with a total of 200 ml of water.
  • a stick e.g. a cotton swab
  • cells are wiped off the vaginal mucosa with light pressure.
  • a further vaginal rinse is carried out with 20 ml water and the rinsing liquid is collected in a sample vessel.
  • the cotton swab is also rinsed in the rinsing liquid to loosen the adhering cells.
  • the sample vessel is then cooled in the refrigerator at 4 ° C.
  • the transport to the laboratory takes place in a cool bag filled with cool packs.
  • the rinsing liquid is centrifuged for 20 minutes at 1500 g and a temperature of 15 ° C.
  • the supernatant is decanted and the cell pellet is resuspended in 20 ml of water.
  • the homogenized cells are centrifuged again at 1000 g for a period of 10 minutes. The centrifugation takes place at a temperature of 15 ° C.
  • the supernatant is decanted again and the cell pellet is taken up in 1 ml of water with a 5 ml pipette.
  • the cells are centrifuged again at 18,000 g for 4 minutes.
  • the supernatant is suctioned off and the cell pellet is gassed with nitrogen for 1 minute.
  • the cell pellet in the sample vessel is resuspended in a volume of 50 ⁇ l water. This is followed by the addition of 50 ⁇ l of ethanol mixed with 2% SDS and 2% BHT and the solution is vortexed for 40 s.
  • sample preparation for HPLC 200 ⁇ l n-hexane is added and the sample is vortexed again for 40 s. The solution is then centrifuged at 10,000 g for 2 minutes. After centrifugation, the n-hexane phase is pipetted off into a second bengefäß. The original sample vessel is again covered with 200 ⁇ l of n-hexane, vortexed for 40 s and centrifuged at 10,000 g for 2 minutes. The upper phase is again removed and pipetted into the same second sample vessel as the previously transferred phase, and the upper phases of the first and second centrifugation steps are combined. At the end of the sample preparation, the sample is completely evaporated with nitrogen. The pellet is resuspended in 300 ⁇ l superplasticizer and pipetted into micro inserts from autosampler vials.
  • a Nucleosil 120, C 18, 300 x 3 mm column is used as the column for HPLC.
  • the flow agent A consists of acetonitrile, methanol and 1% ammonium acetate.
  • the substances of the flow agent A acetonitrile: methanol: ammonium acetate are used in a ratio of 171: 29: 15.
  • THF is used as flow agent B.
  • the fluid gradient shown below is used for liquid chromatography.
  • the flow rate is 1 ml / minute and the detection is carried out with UV-VIS at 292 nm and 456 nm.
  • the temperature during liquid chromatography is 20 ° C.
  • An internal standard is also added to solvent A to enable calibration of the HPLC system.
  • the cells are obtained and lysed according to working examples 1 and 2. After lysis of the cells, the dissolved components in the cell supernatant are pumped in promoted an atomic absorption device and the concentration of calcium is analyzed there according to the operating instructions of the equipment used.
  • the cells are obtained and lysed according to working examples 1 and 2. After the cells have been lysed, the concentration of magnesium is determined using mass spectrometry with inductively coupled plasma in accordance with the operating instructions for the apparatus used.
  • the ICP-MS detects individual ions after mass separation, so that very small amounts of the element can be detected.
  • cells of non-human origin such as of animals, plants, to determine their supply profile with at least one micronutrient.

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Optical Measuring Cells (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By Optical Means (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung des Versorgungsprofils zumindest eines Mikronutrienten in einer biologischen Probe. Aus der biologischen Probe, insbesondere nach der Bestimmung der Anzahl und/oder Menge der darin enthaltenen Zellen, werden durch Lyse der Zellen, gegebenenfalls nach deren Isolation, Zellproteine, insbesondere Zellmembranproteine, freigesetzt und dadurch, erforderlichenfalls nach einer Denaturierung. Mikronutrienten aus dem Lysat gewonnen und deren Anteil an der Probe, insbesondere deren Gewicht, als Mass für die intrazelluläre Konzentration gemessen.

Description

Analyse von Vitalstoffen
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung des Versorgungsprofils zumindest eines Mikronutrienten in einer biologischen Probe und einen Analysekit zur Gewinnung und Vor- bereitung einer biologischen Probe mit Zellen für die Bestimmung der intrazellulären Konzentration zumindest eines Mikronutrienten entsprechend den Merkmalen in den Oberbegriffen der Ansprüche 1 und 17 sowie die Verwendung des Analysekits entsprechend dem Anspruch 18.
Das Ernährungsbewusstsein und auch das Gesundheitsbewusstsein der Menschen in den Industrieländern bekommt in den letzten Jahren einen immer höheren Stellenwert. Es zeigt sich allerdings, dass trotz ausreichender Nahrungsversorgung nach wie vor Krankheiten aufgrund von Mangelerscheinungen ausgewählter Nährstoffe auftreten. Für einen gesunden Organismus ist es daher wichtig, die Unter- oder Überversorgung mit bestimmten Nährstoffen zu er- kennen und in der Folge durch eine Supplementation oder eine Reduktion der Nährstoffaufnahme auszugleichen.
Bereits in den 60-iger Jahren wurden erstmals Defizite in der Nährstoffaufnahme erkannt und unter dem Begriff „Orthomolekulare Medizin" zusammengefasst. Der Begriff „Orthomole- kular" hat seinen Ursprung in „Orthos" (griechisch) d.h. richtig, gut und „Molekül" (lateinisch) = Baustein von Substanzen. Dieser Begriff wurde vom zweifachen Nobelpreisträger Linus Pauling bereits 1968 gewählt, weil es das Therapieprinzip gut verdeutlicht. Das Therapieprinzip der Orthomolekularen Medizin beruht auf der Erkenntnis, dass der menschliche Körper für ein gesundes und reibungsloses Funktionieren aller Organe, Vitalstoffe (Mikro- nutrienten) benötigt. Gemeint sind Vitamine, Mineral Stoffe, Spurenelemente und essentielle
Fettsäuren. Orthomolekulare Therapeutika sind auch unter dem Begriff Eubiotika bekannt. In der richtigen Dosierung bieten sie den optimalen Gesundheitsschutz.
Das Wirkprinzip wird von Linus Pauling wie folgt definiert:
„ Orthomolekulare Medizin ist die Erhaltung guter Gesundheit und die Behandlung von Krankheiten durch Veränderung der Konzentration von Substanzen, die normalerweise im Körper vorhanden und/ür die Gesundheit verantwortlich sind. "
Gesundheitsschutz und Krankheitsvorsorge erfolgt durch Orthomolekulare Substanzen in op- timaler Dosis. Die Orthomolekulare Medizin nutzt ausschließlich Substanzen, die sowohl in der Nahrung als auch in unserem Körper ganz natürlich vorkommen. Es sind Vitalstoffe, wie z.B. Vitamine und Mineralien, die unser Körper nicht oder nur unzureichend selbst herstellen kann. Sie müssen daher als Mikronährstoffe regelmäßig in geeigneter Dosierung zugeführt werden, damit wir gesund und leistungsfähig bleiben. Der Vital Stoffstatus ist allerdings in jedem einzelnen Individuum unterschiedlich. Der individuelle Status ist von verschiedenen äußeren und inneren Faktoren abhängig, wie z.B. Ernährungs- und Lebensgewohnheiten, Alter, Gesundheitszustand und Umwelteinflüssen. Diese Faktoren wirken sich unter Umständen so stark bedarfssteigernd aus, dass die optimale Deckung des Vitamin- und Mineralstoffbe- darfs selbst mit gesunder, vielseitiger Mischkost oft nicht zu schaffen ist. Vital stofflücken sind daher fast unvermeidlich. Heutzutage wird der Vitaminstatus meist nur bei kranken Personen, insbesondere chronisch kranken Personen erhoben. Die Vitaminstatuserhebung ist aber auch für gesunde Personen interessant, weil diese wichtige Hinweise über einen Mangelzustand eines Vitalstoffes im Körper gibt und somit frühzeitig Krankheiten, die aus solchen Mängeln oder Überschüssen resultieren, erkannt und verhindert werden können. Allerdings ist die Vitaminstatuserhebung zur Zeit noch mit einem Arztbesuch, einer Blutabnahme und einer aufwendigen Laboranalyse verknüpft und somit aufgrund des großen Zeitaufwands und den hohen Kosten noch nicht in der Prophylaxeuntersuchung etabliert.
Zur Analyse von Vitalstoffen, insbesondere Vitamine, wurden im Stand der Technik verschiedenste Lösungen vorgeschlagen. Ein Weg um diese Ziele zu erreichen, ist eine Bestimmung und Quantifizierung von Mikronutrienten mittels Gaschromatographie oder Massen- spektrometrie. So beschreibt z.B. die US 5,800,979 A eine Methode zur Bestimmung der in vivo Konzentration des Folsäure-Coenzyms in Körperflüssigkeiten. Bei dieser Methode wird eine bekannte Menge der Folsäure als interner Standard als Vergleich mit der Folsäurekon- zentration aus einer Körperflüssigkeit verwendet. In dieser Körperflüssigkeit ist zumindest ein Coenzym enthalten. Weiters ist eine Aufreinigung des internen Folsäurestandards, eine Quantifizierung der Folsäure-Coenzymkonzentration und eine Auswertung mittels Gaschromatographie bzw. Massenspektrometrie beschrieben. Die Quantifizierung wird aus biologi- sehen Flüssigkeiten wie Blut, Harn, Cerebrospinalflüssigkeit und Fruchtwasser durchgeführt.
In der EP 840 127 AI wird eine Tabelle und eine Methode zur Untersuchung des Vitamin- und Mineral Stoffprofils beschrieben. Es wird eine Tabelle gezeigt, auf der Indikatorwerte von Vitaminen und Mineral Stoffen im Blut aufgetragen werden. Diese Bereiche zeigen den Ziel- wert eines gesunden Menschens an. Auf dieser Tabelle wird nach durchgeführter Blutanalyse der daraus resultierende Wert eingetragen und somit kann ein Mangel oder ein Überschuss dieses Stoffes protokolliert werden. Aufgrund der Abweichungen kann der Gesundheitsstatus und der Alterungsprozess der Testperson bestimmt werden. Es werden wasserlösliche Vitamine, fettlösliche Vitamine und Mineralstoffe aus dem Blut analysiert.
Auch aus der WO 95/29628 AI ist eine Methode zum raschen Nachweis des Vitamindefizits in einer Person beschrieben. Die Bestimmung des Vitamindefizits erfolgt durch das Maß der Fähigkeit der Person sich an Dunkelheit anzupassen, was durch verschiedene Testsysteme unter unterschiedlichen Lichtbedingungen nachgewiesen wird. Die Analysedaten von Vitami- nen aus diesen Untersuchungen sind vergleichbar mit den Ergebnissen aus biologischen Flüssigkeiten.
Aus der WO 89/12826 AI ist eine kompetitive Bindungsanalyse für Vitamin B12 im Serum bekannt. Bei dieser Methode wird immobilisiertes Vitamin B verwendet um mit Vitamin B12 aus einer Probe um einen Bindungspartner zu kompetitieren. Die Menge des Bindungspartners gebunden an das immobilisierte Vitamin B12 wird gemessen und ist umgekehrt proportional zu der Konzentration von freiem Vitamin B12 in der Probe. Der Bindungspartner ist bi- otinyliert und wird durch eine Reaktion mit Avidin gebunden an eine Reportergruppe, detek- tiert. Das immobilisierte Vitamin B12 ist durch einen Proteinlinker, wie beispielsweise einen Anti -Vitamin B12 Antikörper, an Beads gebunden.
Im Stand der Technik wird gezeigt, dass die Konzentrationsbestimmung von Mikronutrienten aus dem Blut bzw. Serum oder anderen Körperflüssigkeiten erfolgt. Nachteilig an diesen Methoden ist, dass lediglich die Konzentration der zirkulierenden Vitalstoffe aber nicht die tatsächliche Konzentration, die sich in der Zelle befindet, gezeigt werden kann.
Der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Erhebung eines Mikronutrientenstatus in einer Zelle anzugeben.
Die Aufgabe der Erfindung wird durch das Verfahren entsprechend den Merkmalen im Kennzeichenteil des Anspruches 1 gelöst. Der Vorteil dieses Verfahrens liegt darin, dass für die physiologische Funktion, wie z.B. die Signaltransduktion, und somit den (patho)physiologi- schen Zustand einer Zelle, eines Gewebes, eines Organs bzw. eines Organismus sowohl die extrazelluläre als auch die intrazelluläre Konzentration der Stoffe von enormer Bedeutung ist. Vorteilhaft ist weiters, dass durch die intrazelluläre Konzentrationsbestimmung die tatsächlich von der Zelle resorbierte Menge des Mikronutrienten gemessen werden kann und nicht wie bisher nur die biologische Verfügbarkeit sowohl von Mikronutrienten (Eubiotika) als auch Xenobiotika immer anhand der zirkulierenden Menge des Stoffes im Blut bestimmt wird. Die intrazelluläre Konzentrationsbestimmung von Mikronutrienten bietet weiters den Vorteil, dass z.B. während einer Supplementation eine Verlaufskontrolle ermöglicht wird und somit eine ungezielte Einnahme der Vitalstoffpräparate und eine daraus resultierende Überversorgung mit diesem Stoff verhindert wird. Außerdem kann durch ein Screening der gesamten Vitalstoffpalette bereits vor Beginn der Supplementation festgestellt werden, welche Mikronutrienten ergänzt werden sollen.
Von Vorteil ist die Ausführung nach Anspruch 2, womit eine Möglichkeit zur momentanen Statuserhebung als auch eine Verlaufskontrolle für jedes Gewebe separat möglich ist und, nicht wie bei einer Messung im Blut, die Konzentration des gesamten Organismus bestimmt wird.
Vorteilhaft ist weiters eine Ausgestaltung nach Anspruch 3, wonach durch die Verwendung eines Epithelgewebes, insbesondere einer Mukosa, ein leicht zugängliches und leicht isolierbares Gewebe für die Analyse zur Verfügung steht und dadurch keine aufwendigen Biopsie- verfahren bzw. Blutabnahmeverfahren durchgeführt werden müssen.
Dabei erweist des weiteren als vorteilhaft, dass durch dieses Verfahren auch für jenen Personenkreis, welcher Mikronutrientenprodukte als OTC (over the counter)-Präparate in jeder Apotheke ohne ärztliche Verschreibung kauft, eine Selbstkontrolle des Mikronutrientenspie- gels ermöglicht wird und somit eine Überversorgung mit diesen Präparaten vermieden werden kann. Von Vorteil ist dabei weiters, dass dieses Verfahren einfach und rasch durchgeführt werden kann, weil durch den Wegfall der Blutabnahme, welche durch medizinisch geschultes Personal erfolgen muss, das gesamte Verfahren vereinfacht wird und somit Kosten im finanziell stark geschwächten Gesundheitssystem reduziert werden.
Von Vorteil ist die Weiterbildung nach Anspruch 4, wonach die Konzentration mit verschiedenen bzw. auch mit einer Kombination von mehreren Analyseverfahren bestimmt wird. Als vorteilhaft dabei erweist sich, dass durch diese Analyseverfahren sehr rasch die Konzentration einer Vielzahl von Proben bestimmt werden kann.
Vorteilhaft ist eine Weiterbildung des Verfahrens nach Anspruch 5, wonach die Konzentrati- on vieler verschiedener Stoffe bestimmt wird. Die intrazelluläre Konzentration eines dieser Stoffe bzw. einer Kombination dieser Stoffe liefert wichtige Daten für die Prophylaxe von Krankheiten. Aber natürlich können aus diesen Daten auch wichtige Informationen für den Verlauf von Krankheiten, vor allem chronischen Krankheiten, gewonnen werden. Weiters ist von Vorteil, dass durch die Bestimmung mehrerer Mikronutrientenkonzentrationen häufig eine wesentlich größere therapeutische Breite als durch Xenobiotikakonzentrationsbestim- mungen erzielt werden kann, weil oft aufgrund von Kombinationen von Eubiotika synergistische Effekte resultieren wodurch sich die Pharmakologie der Mikronährstoffe zum Teil deutlich von jener körperfremder Arzneimittel unterscheidet. Durch eine Konzentrationsbestim- mung kann beispielsweise nachgewiesen werden, dass durch die Einnahme eines Mikronutrienten noch kein oxidativer Schutz erzielt wird, wohingegen eine Kombination aus zwei oder mehreren Mikronutrienten mit antioxidativen Eigenschaften antioxidative Wirkung zeigen. Durch orthomolekulare Maßnahmen werden biochemische Reize gesetzt, die vom Organismus sinnvoll verwertet und beantwortet werden können, da es der Körper mit „Original- teilen" zu tun hat, d.h. mit Wirkstoffen, die ihm vertraut sind. Dadurch sind frühzeitige Interventionen im Energiestoffwechsel, eine Optimierung der Repairmechanismen, die Beseitigung von freien Radikalen und vieles andere möglich.
Gemäß Anspruch 6 ermöglicht das Verfahren eine Konzentrationsbestimmung für die bereit- gestellten Mengen von Vitaminen, die der Organismus für lebenswichtige Funktionen benötigt aber im Stoffwechsel nicht oder nicht in ausreichendem Umfang synthetisiert werden können und daher regelmäßig mit der Nahrung zugeführt werden müssen. Neben den spezifischen Funktionen sind beispielsweise Vitamine auch Bestandteile von Coenzymen, die den Zellstoffwechsel katalysieren. Von Vorteil erweist sich weiters, dass trotz der meist sehr ge- ring benötigten Menge an Vitaminen es bei Unterschreitung einer der Mindestkonzentration zu spezifischen Mangelerscheinungen (Avitaminosen) z.B. Nachtblindheit (Vitamin A), Skorbut (Vitamin C), Rachitis (Vitamin D), Perniziöse Anämie (Vitamin B12), Beriberi (Vitamin Bl) und Gerinnungsstörungen (Vitamin K) kommt. Anderenfalls führt aber auch eine zu hohe Zufuhr bestimmter Vitamine (A, D) zu Intoxikationserscheinungen (Hypervitaminosen).
Von Vorteil ist eine Weiterbildung nach Anspruch 7, wonach durch die Konzentrationsbestimmung von Verbindungen mit Retinoidstuktur biochemische Funktionen, die am Sehvorgang, am Wachstum, an der Entwicklung und Differenzierung von Epithelgewebe, an der Reproduktion (Spermatogenese, Entwicklung der Plazenta, Fötalentwicklung) sowie an der Testosteronbildung beteiligt sind, nachgewiesen werden können. Durch eine Konzentrations- bestimmung können Mangelerscheinungen von Vitamin A vor allem bei Risikogruppen, wie Frühgeborenen, jungen Frauen und Männer über 65 Jahren, frühzeitig erkannt werden. Durch eine längere Mangelerscheinung, bedingt durch Fehlernährung, Maldigestion bzw. Malab- sorbtion (z.B. Morbus Crohn), total parenterale Ernährung, Pankreaserkrankungen und Alko- holkrankheit kann es zu verzögerter Dunkeladaption, Störungen des Wachstums, der Knochenbildung, der Fortpflanzung und in der Schwangerschaft zu Fehlbildungen des Föten kommen. In den Industriestaaten ist Vitamin A Mangel eher selten, dadurch kann durch eine unkontrollierte oder fälschlicherweise selbst durchgeführte Vitamin A Supplementation dies zu einem erhöhten Konzentrationsspiegel von Vitamin A führen und Übelkeit, Erbrechen, Kopfschmerzen, trockene Haut und Schleimhäute und später auch zu Schwellung des Peri- osts, Hämorrhagien, Haarausfall, Reizbarkeit, Spontanfrakturen und teratogene Effekte hervorrufen. Vitamin A-Mangelerscheinungen stehen in den Entwicklungsländern unter den Vitaminmangelzuständen an erster Stelle.
Von Vorteil nach Anspruch 8 erweist sich, dass durch die Konzentrationsbestimmung des
Vitamin B Komplexes, der für viele regulatorische Funktionen im Stoffwechsel verantwortlich ist, eine Überwachung dieser Funktionen ermöglicht wird. Da der menschliche Körper nur eine geringe Speicherfähigkeit für diesen Vitamin Komplex aufweist, ist eine regelmäßige Konzentrationsbestimmung für das allgemeine Wohlbefinden und die Aufrechterhaltung der physiologischen Funktionen notwendig.
Mit einer Konzentrationsbestimmung können auch ernährungsbedingte Versorgungsprobleme nachgewiesen werden, wie z.B. bei ausschließlicher Ernährung von maschinell geschältem und poliertem Reis und Getreideprodukten. Durch die Bearbeitung wird nämlich die Schale, in der sich der Großteil von Thiamin befindet, zumindest teilweise entfernt. Frühsymptome des Thiaminmangels sind Mattigkeit, Nervosität, Gedächtnisschwäche, Schlafstörungen, Ano- rexie, abdominale Beschwerden und Verstopfung.
Der Konzentrationsmangel an Riboflavin resultiert vor allem aus unzureichender Ernährung mit Milch und anderen tierischen Proteinen. Riboflavinmangel manifestiert sich vorwiegend in Geweben ektodermalen Ursprungs.
Eine Konzentrationsbestimmung von Niacin erweist sich als vorteilhaft, weil schwerer Nia- cinmangel Pelagra verursacht. Primäre Mangelerscheinungen treten typischerweise in Gebie- ten auf, wo Mais den Hauptbestandteil der Nahrung bildet. Das gebundene Niacin, wie es in Mais vorliegt, wird im Intestinum ohne vorhergehende Alkalibehandlung nicht assimliert. Die Zeichen der Pelagra sind an der Haut, an der Schleimhaut, am ZNS und Gastrointestinaltrakt zu beobachten.
Pantothensäure kommt in vielen Nahrungsmitteln vor und ist eine essentielle Komponente von Coenzym A, dass bei vielen enzymatischen Reaktionen, wie z. B. im Zitratzyklus und im Fettsäurezyklus, als Acyltransfer-Cofaktor dient, und durch dessen Konzentrationsnachweis eine Entgleisung aus dem physiologischen Gleichgewicht frühzeitig verhindert werden kann.
Pyridoxin kommt als Pyridoxol (Alkohol), als Pyridoxal (Aldehyd) und als Pyridoxamin
(Amin) vor. Diese Stoffe mit qualitativ und quantitativ gleicher Vitaminwirkung werden zur Pyridoxingruppe zusammengefasst. Eine Konzentrationsbestimmung von Pyridoxin, das im Körper zum Pyridoxalphosphat phosphoryliert wird, ermöglicht daher eine frühzeitige Detek- tion von Mangel bzw. Überfluss dieses Vitamins, das den Stoffwechsel des Blutes, der Haut und des zentralen Nervensystems steuert, weil es bei vielen Reaktionen als Coenzym fungiert
(Decarboxylierung und Transaminierung von Aminosäuren, Desaminierung von Hydroxya- minosäuren und Cystein, Umwandlung von Tryptophan zu Niazin und Fettsäuremetabolismus).
Eine Konzentrationsbestimmung von Folsäure ist vor allem für Frauen im gebärfähigem Alter von großer Bedeutung und Wichtigkeit, weil durch eine Unterversorgung mit diesem Vitamin schwere Missbildungen des Föten hervorgerufen werden können. Es ist in umfangreichen Studien zweifelsfrei dokumentiert, dass zusätzliche Folsäure, die vor und zu Beginn einer Schwangerschaft eingenommen wird, besonders folgenschwere Missbildung, wie z.B. Neural- rohrdefekte (Spina bifida) und andere Fehlbildungen des Rückenmarks und Gehirns verhüten hilft. Die prophylaktische Wirkung ist nicht zu 100% sicher, aber es können doch etwa drei Viertel aller Fälle mit dieser folgenschweren Fehlbildung, die zu einer lebenslangen Invalidität führen, vermieden werden.
Cobalamin ist das einzige Vitamin, das praktisch nur in tierischen Organismen vorkommt.
Eine Konzentrationsbestimmung ist daher insbesondere bei reinen Vegetariern angezeigt, die nicht nur den Konsum von Fleisch sondern auch von anderen tierischen Produkten, wie Milch und Eiern, ablehnen. Vitamin-B12-Mangel zeigt sich vor allem in Geweben mit hoher Zellteilungsrate und kann die Biosynthese von DNA beeinflussen. Die Bestimmung des Gehalts an Biotin, welches ein essentielles Coenzym sowohl im Stoffwechsel der Fette als auch der Kohlenhydrate ist, zeigt sich als besonders vorteilhaft, weil sich ein Biotinmangel in retardierter geistiger und physischer Entwicklung, Alopezie, Kerato- konjunktivitis und Störungen der T- und B-zellabhängigen Immunität manifestiert, und somit frühzeitig erkannt und die Folgeerscheinungen verhindert werden können.
Von Vorteil erweist sich weiters die Weiterbildung nach Anspruch 9, wonach durch den Konzentrationsnachweis von Ascorbinsäure, das essentiell für die Bildung von Kollagen und die Erhaltung von Substanzen mesenchymatösen Ursprungs (Bindegewebe, Osteoidsubstanz des Knochens, Dentin der Zähne) ist, eine Prophylaxe getroffen werden kann bzw. begleitende
Maßnahmen während einer chronischen Erkrankung ergriffen werden können. Auch während der Schwangerschaft und Laktation, bei akuten und chronischen entzündlichen Erkrankungen, Operationen und Verbrennungen sowie bei Thyreotoxikose ist der Vitamin-C-Bedarf erhöht, wobei hier vorteilhafterweise eine Konzentrationsbestimmung Daten liefert, die eine richtig dosierte Supplementation von Vitamin C ermöglicht. Ascorbinsäure kann als starkes Reduktionsmittel reversibel Wasserstoff bzw. Elektronen übertragen, ist am Phenylalanin- und Tyro- sinstoffwechsel beteiligt und aktiviert als Reduktionsmittel diejenigen Enzyme, die das Prolin und Lysin des Protokollagens nach der Translation zu Hydroxyprolin und Hydroxylysin hydroxilieren. Vitamin C bewirkt auch, dass Folsäure, die an Bestandteile von Nahrungsmittel gekoppelt ist, aus diesen Konjugaten herausgelöst wird und fördert darüber hinaus die Eisenresorption, wobei hier die Konzentrationsbestimmung von Ascorbinsäure und die daraus resultierende Dosierung von Vitamin C viele synergistische Effekte hervorruft. Weiters erweist sich eine Konzentrationsbestimmung von Vorteil, wonach bei Erwachsenen ein primärer Mangel meistens durch Nahrungsmittelidiosynkrasien oder durch einseitige Kost auftritt. Auch eine erhöhte Kälte- oder Hitzebelastung erhöht die Vitamin-C-Ausscheidung im Urin.
Viele Menschen vermuten durch die umfangreiche Zufuhr von Obst und Gemüse eine ausreichende Ascorbinsäurezufuhr zu gewährleisten. Wie aber bekannt ist, zerstören Hitze (z.B. bei der Sterilisation von Nährstofflösungen oder beim Kochen) das Vitamin C in Nahrungsmitteln und somit können dennoch Mangelerscheinungen auftreten, welche durch eine Konzent- rationsbestimmung nachgewiesen werden können.
Von Vorteil erweist sich nach Anspruch 10, dass die Konzentrationsbestimmung von Calcife- rolen schwerwiegende Folgen für die Gesundheit des Menschen abwenden kann. Die Hauptquelle für Calciferole ist die in der Haut stattfindende UV-Licht abhängige Synthese. Provi- tamin D 3 wird in der Haut auf photochemischem Weg aus 7-Dehydrocholesterin gebildet und langsam zu Vitamin D3 isomerisiert, welches durch ein Vitamin-D-bindendes Protein abtransportiert wird. Weiters erweist sich als vorteilhaft, dass durch die Konzentrationsbestimmung von Calciferolen eine Risikoabwägung für die Entstehung von Osteoporose erfolgen kann. Die Hauptwirkung von 1,25 - Dehydroxycholecalciferol ist nämlich die erhöhte intesti- nale Calziumresorption und dadurch die Förderung der normalen Knochenbildung und Mineralisation.
Gemäß Anspruch 11 erweist sich als vorteilhaft, dass mit dem Nachweis von Tocopherolen Antioxidantien, die die Lipidperoxidation der mehrfach ungesättigten Fettsäuren in den Zellen verhindern und dadurch die Membranstabilität aufrecht erhalten, zur Verfügung stehen. Vitamin E steht außerdem in enger metabolischer Beziehung zu Selen. Vor allem bei Frühgeborenen, Säuglingen und Kleinkindern, die eine Nahrung mit hohem Anteil an ungesättigten Fettsäuren erhalten, zeigt sich eine Konzentrationsbestimmung von Vorteil, weil dadurch ein primärer Tocopherolmangel rasch festgestellt werden kann. Beim Erwachsenen führt der Vita- min E Mangel zu einer verkürzten Lebensdauer der Erythrozyten, zur Keratinurie und zur
Zeroidablagerung in den Muskelzellen.
Gemäß Anspruch 12 erweist sich von Vorteil, dass ein Konzentrationsnachweis von Vitamin K in ausreichender Menge eine Aufrechterhaltung der Blutgerinnungskaskade gewährleistet. Vitamin- K-Mangel äußert sich in der Herabsetzung der Gerinnungsfähigkeit des Blutes und in einer Blutungsneigung (Hämorrhagien). Da Vitamin K im Körper auch von Darmbakterien gebildet werden kann, erweist sich eine regelmäßige Konzentrationsbestimmung zur Statusüberwachung zu Vitamin K als vorteilhaft.
Von Vorteil nach Anspruch 13 erweist sich, dass die Konzentration von Mineral Stoffen und
Spurenelementen, die für Warmblüter essentiell sind, bestimmt werden kann. Die Elemente Natrium, Kalium, Magnesium und Kalzium in physiologischer Konzentration sind für die Aufrechterhaltung der Homöostase verantwortlich. Die Einführung synthetischer Diäten bei der Behandlung von Stoffwechselanomalien, die auf angeborenen genetischen Defekten beru- hen, die Entwicklung der intravenösen Ernährung und die Dialysebehandlung von Patienten mit terminaler Niereninsuffizienz decken die iatrogenen Risiken auf, die die Bedeutung der Konzentrationsbestimmung und die daraus folgernde alimentäre Zufuhr dieser Elemente unterstreichen. Spurenelemente, die im Körper in minimalen Konzentrationen (weniger als 0,005 % des Körpergewichtes) vorkommen, kommt eine wichtige Rolle in der Physiologie des Menschen zu. Allerdings kommt es mit der zunehmenden Entwicklung von synthetischen Nahrungsmitteln zu exzessiver Aufnahme dieser Elemente, die Toxizitätserscheinungen hervorrufen, welche sich erst nach Jahren manifestieren können. Beispielsweise preisen viele Gesundheitsmagazine und Reformhäuser Dolomitgestein mit dem Hinweis an, es sei reich an Kalzium und Magnesium. Weite Kreise der Bevölkerung sind für diese Art von Hinweisen empfänglich. Wie aber veröffentlichten Mitteilungen zu entnehmen ist, enthält Dolomitgestein auch Metalle, wie Eisen, Chrom, Phosphor, Nickel, Silizium, Zink und Cadmium in potentiell toxischen Konzentrationen. Gerade bei solch komplexen Wirkungen von Mineralstoffen und Spurenelementen erweist sich das erfindungsgemäße Verfahren durch die Möglichkeit eine Vielzahl von Mikronutrienten nachzuweisen als besonders vorteilhaft.
Weiters erweist sich nach Anspruch 14 von Vorteil, dass durch den Nachweis der Konzentration dieser Stoffe ein wichtiger Indikator für das allgemeine Wohlbefinden der Menschen bestimmt wird. Beispielsweise dient Taurin, welche eine bedingt essentielle Aminosäure und in Geweben der meisten Tierarten zu finden ist, nicht als Baustein von Proteinen, sondern ist in vielen Geweben in freier Form vorhanden. Taurin ist an einer Reihe physiologischer Prozesse beteiligt, z.B. der Konjugation von Gallensäure, der Osmoregulation, der Detoxifikation von Xenobiotika, der Stabilisierung von Zellmembranen, der Steuerung des zellulären Kalziumstroms und der Modulation der neuronalen Erregbarkeit. Erniedrigte Taurinspiegel werden mit Netzhautdegenerationen, retartiertem Wachstum und Kardiomyopathie in Verbindung gebracht.
Eine Konzentrationsbestimmung von Acetyl-L-Carnitin erweist sich als vorteilhaft, weil es während der Fettsäureoxidation die Aufnahme von Acetyl-Coenzym A in die Mitochondrien fördert, die Produktion von Acetylcholin steigert und die Synthese von Proteinen und Membranphospholipiden stimuliert. Aufgrund seiner strukturellen Gemeinsamkeiten mit A- cetylcholin wirkt Acetyl-L-Carnitin zudem als Parasympatomimetikum. Außerdem wirkt sich eine hohe Acetyl-L-Carnitin Konzentration positiv auf den Verlauf von Morbus Alzheimer, Altersdepression, HIV-Infektion, diabetische Neuropathie, zerebraler Ischämie und bei durch Alkohol induzierten kognitiven Störungen aus.
Von Vorteil ist weiters, dass durch den in experimentellen Studien erbrachten Nachweis, dass Querzetin in vielfältiger Weise auf den menschlichen Organismus wirkt, auch eine Konzentrationsbestimmung dieses Mikronutrienten eine wichtige Information für den Allgemeinzustand eines Menschen liefern kann. Es schützt z.B. das Herz-Kreislauf-System, wirkt der Ent- stehung von Karzinomen und Ulzerationen entgegen, verhindert allergische Reaktionen, beugt der Kataraktentwicklung vor und wirkt antiviral und antiinflammatorisch.
Weiters zeigt sich von Vorteil, dass durch die Konzentrationsbestimmung von Bromelain gerade Menschen mit Gerinnungsstörungen und geschwächtem Immunsystem profitieren kön- nen. Die antiphlogistische Wirkung von Bromelain beruht auf verschiedenen physiologischen
Mechanismen. Eine Ursache liegt nachweislich darin, dass die Bradikininbildung am Entzündungsort durch Erschöpfung gehemmt ist und die Fibrinbildung in Folge der Verminderung bestimmter Zwischenprodukte der Gerinnungskaskade gedrosselt wird. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass Bromelain die Umwandlung von Plasminogen in Plasmin fördert und somit die Fibrinolyse stimuliert.
Gemäß der Weiterbildung des Verfahrens nach Anspruch 15 kann durch die Bestimmung der Aminosäurekonzentration ein Mangel an biologisch hochwertigen Proteinen nachgewiesen werden. Aminosäuren sind Bausteine von Proteinen und Hormonen. Ein Mangel an essen- tiellen Aminosäuren führt zum Zusammenbruch der physiologischen Funktion des menschlichen Körpers. Beispielsweise erhöht Arginin die Lymphozytenzahl und fördert allgemein die Bildung von immunkompetenten Zellen. Außerdem erhöht es die cytolytische Kapazität von Makrophagen und NK-Zellen. Es spielt auch eine wichtige Rolle bei der Wundheilung. Histi- din wirkt als Antiallergikum und dient als Vorstufe von Histamin. Isoleuzin, Leuzin und Va- lin sind wichtige Bestandteile der Muskelproteine. Lysin ist der Hauptbestandteil von Collagen, Carnitinantikörpern, Hormonen und Enzymen, unterstützt die Wundheilung und fördert die Herpes simplex Heilung. Methionin ist ein Antioxidans, entgiftet die Leber und ist essentiell für die Selenwirkung (Absorption, Transport, Bioverfügbarkeit). Phenylalanin besitzt antidepressive Wirkung und verlängert die Wirkung und erhöht die Aktivität von Endorphi- nen. Threonin ist ein lipotroper Faktor. Tryptophan ist wichtig für die Synthese von Vitamin
B3 und ist ein Vorstufe des Serotonins und Melatonins (Schlafrhythmus).
Gemäß der Ausgestaltung nach Anspruch 16, kann eine Konzentrationsbestimmung von essentiellen Fettsäuren, erfolgen. Eine für den Organismus optimale Konzentration von essen- tiellen Fettsäuren ist vor allem während des Wachstums und in der zweiten Lebenshälfte von außerordentlicher Bedeutung. So erhalten sie z.B. die Elastizität der Membranen aller Körperzellen sowie der Mitochondrien und sorgen für eine Zellverjüngung. Auch das Immunsystem benötigt sie zum Bau von Abwehr- und Fresszellen. Sie kommen in den Gonaden vor und bilden die Bausteine für die körpereigene Hormonproduktion im endokrinen Drüsensystem aber auch im Zellgewebe. Eine herausragende Rolle unter den essentiellen Fettsäuren spielen die Linol- und die α-Linolensäure. Sie dienen als Strukturelement der Zellmembran und steuern mit den aus ihnen entstandenen Produkten, wie z.B. Prostaglandine, Thromboxan und Leukotriene, viele lebenswichtige Prozesse im Organismus. Die Arachidonsäure kommt nur in tierischen Fetten vor und ist ein Ausgangsprodukt für die Prostaglandinsynthese. Ein Übermaß an Arachidonsäure kann einen negativen Einfluss auf rheumatische Gelenkentzündungen haben.
Die Aufgabe der Erfindung wird eigenständig auch durch einen Analysekit entsprechend den Merkmalen im Kennzeichenteil des Anspruches 17 gelöst. Vorteilhaft daran ist, dass der Analysekit alle notwendigen Vorrichtung und Reagenzien zur Durchführung der Gewinnung und Aufbewahrung der Mukosazellen enthält. Von Vorteil ist weiters, dass durch die einfache Aufbewahrungsart des Analysekits bei Raumtemperatur eine Lagerung im Haushalt möglich ist.
Die Aufgabe der Erfindung wird eigenständig auch durch die Verwendung des Analysekits entsprechend den Merkmalen im Kennzeichenteil des Anspruches 18 gelöst. Von Vorteil erweist sich, dass durch die Verwendung des Analysekits eine rasche und unkomplizierte Konzentrationsbestimmung der Mikronutrienten ermöglicht wird.
Nachstehend werden aufgrund der Vielzahl möglicher vorgenannter Mikronutrienten zur
Konzentrationsbestimmung diese exemplarisch angeführt und es sei anzumerken, dass selbstverständlich auch andere Mikronutrientenkonzentrationsbestimmungen, als die in den beschriebenen Ausführungsbeispielen möglich sind, die ebenfalls dem Grundgedanken der Erfindung Rechnung tragen. Diese anderen Mikronutrientenkonzentrationsbestimmungen, ob- wohl nicht explizit aufgelistet, jedoch dem Fachmann aufgrund der Lehre dieser Beschreibung erschlossen, stellen selbstverständlich auch einen Teil der Erfindung dar und sind vom Schutzumfang mitumfasst.
Im folgenden Text stellen alle Prozentangaben Gew.-% dar.
Gewinnung der Mukosazellen
Zur Gewinnung von Buccalmukosazellen wird eine mehrmalige Mundspülung, beispielsweise mit sterilem Wasser, physiologischer Kochsalzlösung (0,9 % NaCl), phosphatgepufferte Salz lösung (PBS), etc., in einem Volumen ausgewählt aus einem Bereich von 10 ml bis 1000 ml, insbesondere 50 ml bis 500 ml, vorzugsweise 100 ml bis 250 ml, durchgeführt. Ein Holzoder Kunststoffspatel, ein Stäbchen, wie z.B. ein Wattestäbchen, oder eine Bürste, z.B. eine Zahnbürste, wird mit PBS oder 0,9 % NaCl-Lösung angefeuchtet und anschließend jede Wangeninnenseite 10 Mal bis 30 Mal, vorzugsweise 15 Mal bis 20 Mal, von oben nach unten mit leichtem Druck abgeschabt bzw. gebürstet. Während des Schabens bzw. Bürstens darf der
Speichel nicht geschluckt werden. Der Mund wird ein Mal bis 5 Mal, vorzugsweise 2 Mal bis 3 Mal mit PBS, 0,9 % NaCl bzw. Wasser in einem Volumen, ausgewählt aus einem Bereich von 5 ml bis 100 ml, insbesondere 10 ml bis 50 ml, vorzugsweise 20 ml bis 30 ml, ausgespült und die Spülflüssigkeit wird in einem Probengefäß aufgefangen. Zusätzlich wird der Spatel bzw. die Bürste in dieser Lösung ausgespült und am Rand des Probengefäßes abgestreift.
Wahlweise ist im Probengefäß bereits Pufferlösung oder Wasser vorgelegt. Das Probengefäß kann aber auch Reagenzien zur Stabilisierung oder Lyse der Zellen in der Spülflüssigkeit beinhalten. Das Probengefäß wird anschließend gekühlt. Dies erfolgt entweder in einem Kühl gerät, wie z.B. einem Kühlschrank oder Tiefkühlschrank oder in einem Behältnis, wie z.B. eine Alutasche, Styroporbox, Kühltasche, das mit Eis oder Kühlakkus versehen ist. Der
Transport zum Labor erfolgt im gekühlten Zustand.
Im Labor wird die Spülflüssigkeit in den Probengefäßen zentrifugiert. Diese Zentrifugation erfolgt 30 Minuten, vorzugsweise 20 Minuten, insbesondere 10 Minuten, bei 2000 g, vor- zugsweise 1500 g, insbesondere 1400 g, in einem Bereich von -10 °C und 15 °C, vorzugsweise zwischen 0 °C und 10 °C, insbesondere zwischen 4 °C und 8 °C.
Der Überstand wird dekantiert und das Zellpellet in 30 ml, vorzugsweise 25 ml, insbesondere 20 ml PBS, vorzugsweise in kaltem PBS gewaschen und resuspendiert. Als vorteilhaft hat sich ein Volumen von 15 ml, insbesondere 10 ml erwiesen. Die homogenisierten Zellen werden erneut für einen Zeitraum von 1 Minute bis 15 Minuten, insbesondere 2 Minuten bis 10 Minuten, vorzugsweise 3 Minuten bis 5 Minuten mit 1000 g, insbesondere 1400 g, vorzugsweise 1800 g zentrifugiert. Der Zentrifugationsschritt läuft bei einer Temperatur in einem Bereich von -10 °C bis 20 °C, insbesondere -5 °C bis 15 °C, vorzugsweise 0 °C bis 10 °C ab. Als vorteilhaft hat sich eine Temperatur, ausgewählt aus einem Bereich zwischen 2 °C und
8 °C, insbesondere zwischen 4 °C und 6 °C, erwiesen.
Der Überstand wird erneut dekantiert und das Zellpellet in PBS, 0,9 % NaCl Lösung oder
Wasser aufgenommen. Das Volumen der Lösung zum Resuspendieren des Pellets liegt in einem Bereich zwischen 0,5 ml und 5 ml, insbesondere zwischen 1 ml und 3 ml, Vorzugs- weise zwischen 1,25 ml und 2 ml. Die Homogenisierung erfolgt mit einer 10 ml, vorzugsweise mit einer 5 ml Pipette und wird zuletzt zur besseren Homogenisierung noch mit einer 1 ml, vorzugsweise mit einer 0,5 ml Pipette durchgeführt. Die Zellen werden erneut für einen Zeitraum von 0,5 Minuten bis 5 Minuten, insbesondere 1 Minute bis 4 Minuten, vorzugsweise 1 ,5 Minuten bis 3 Minuten, mit 10.000 g, vorzugsweise 15.700 g, insbesondere 18.000 g, zentrifugiert.
Der Überstand wird abgesaugt und das Zellpellet für einen Zeitraum von 1 s bis 60 s, vorzugsweise 5 s bis 30 s, insbesondere 10 s bis 20 s, mit Stickstoff begast und anschließend bei -20 °C, vorzugsweise bei -80 °C, eingefroren. Während des letzten Resuspensionsschrittes kann die homogenisierte Lösung auch aliquotiert werden, z.B. in 500 μl oder 400 μl oder 300 μl Portionen. Das Zellpellet wird entweder eingefroren oder direkt weiterverarbeitet.
Die Mukosazellen können auch gemäß bekannten Standardverfahren aus der Fachliteratur aus verschiedenen Schleimhäuten gewonnen werden.
Anstelle der Mukosazellen können selbstverständlich auch Blutzellen zur Bestimmung des intrazellulären Versorgungsprofils zumindest mit einem Mikronutrienten verwendet werden. Die Blutzellen werden gemäß einem aus der Fachliteratur bekannten Standardisolationsver- fahren bzw. beispielsweise mit Analysekits der Firma Qiagen zur Aufreinigung von Blutzellen isoliert.
Vor Durchführung der Lyse der Zellen erfolgt eine Bestimmung der Zellzahl mittels bekannten Zellzahlbestimmungsmethoden, wie z.B. durch Auszählen von Zellen mittels einer Zähl- kammer unter zu Hilfenahme eines Mikroskops, oder durch automatische Zählverfahren wie z.B. mittels eines Coulter-Counters.
Lyse der Zellen
Die isolierten Mukosazellen werden lysiert. Das Zellpellet im ersten Probengefäß wird in einem Volumen von 50 bis 100 μl, vorzugsweise 100 bis 300 μl, insbesondere 200 μl bis 250 μl PBS, 0,9 % NaCl-Lösung oder Wasser resuspendiert. Daraufhin erfolgt die Zugabe von Etha- nol in einem Volumen von 50 μl bis 500 μl, insbesondere 100 μl bis 300 μl und vorzugsweise von 200 μl bis 250 μl versetzt mit Sodium Dodecylsulfat (SDS) und butylated Hydroxytoluen (BHT) jeweils in einer Konzentration, ausgewählt aus einem Bereich von 0,1 % bis 10 %, vorzugsweise 0,5 % bis 5 %, insbesondere 1 % bis 2 %. Daraufhin wird die Lösung für einen Zeitraum, ausgewählt aus einem Bereich von 1 s bis 60 s, insbesondere 10 s bis 50 s, vorzugsweise 30 s bis 40 s, gemischt, vorzugsweise gewirbelt.
Vorbereitung der Probe zur Hochleistungschromatographie (HPLC)
Im Anschluss erfolgt die Zugabe von n-Hexan in einem Volumsbereich von 100 μl bis 1000 μl, insbesondere 200 μl bis 800 μl, vorzugsweise 300 μl bis 400 μl und es wird erneut für einen Zeitraum von 1 s bis 60 s, vorzugsweise 5 s bis 50 s, insbesondere 10 s bis 20 s, ge- mischt, vorzugsweise gewirbelt. Die Lösung wird für einen Zeitraum ausgewählt aus einem
Bereich von 10 s bis 5 Minuten, vorzugsweise 30 s bis 3 Minuten, insbesondere 1 Minute bis 2 Minuten, mit 1000 g, vorzugsweise 10.000 g, insbesondere 16.000 g, zentrifugiert. Nach der Zentrifugation erfolgt ein Abpipettieren der n-Hexanphase in ein zweites Probengefäß. Das ursprüngliche erste Probengefäß wird wiederum mit n-Hexan in einem Volumen von 100 μl bis 1 ml, vorzugsweise 200 μl bis 500 μl, insbesondere 300 μl bis 400 μl, überschichtet. Für einen Zeitraum, ausgewählt aus einem Bereich von 1 s bis 60 s, insbesondere von 5 s bis 50 s, und vorzugsweise von 10 s bis 30 s, wird die Lösung gewirbelt und anschließend für einen Zeitraum ausgewählt aus einem Bereich von 10 s bis 5 Minuten, vorzugsweise 30 s bis 3 Minuten, insbesondere 1 Minute bis 2 Minuten, mit 1000 g, vorzugsweise 10.000 g, insbesonde- re 16.000 g, zentrifugiert. Es wird wiederum die obere Phase abgenommen und in das selbe zweite Probengefäß, wie die zuvor überführte Phase pipettiert und die oberen Phasen des ersten und des zweiten Zentrifugationsschrittes werden vereinigt. Zum Abschluss der Probenaufbereitung erfolgt ein vollständiges eindampfen im Stickstoffstrom (Evaporator). Das Pellet wird in einem Volumen ausgewählt aus einem Bereich von 10 μl bis 1000 μl, insbesondere 100 μ bis 500 μl und vorzugsweise 200 μl bis 300 μl, Fließmittel resuspendiert und in Mikro- einsätze von Autosampier Vials pipettiert.
Durchführung der HPLC
Nachstehend werden aufgrund der Vielzahl von variablen Parametern für die Durchführung der HPLC eine Auswahl dieser exemplarisch dargestellt und es sei anzumerken, dass selbstverständlich auch andere Parameter als die in den folgenden Ausführungsbeispielen möglich sind, die ebenfalls dem Grundgedanken der Erfindung Rechnung tragen.
Als Säule für die HPLC wird eine Nucleosil 120, C 18, 300 x 3 mm Säule verwendet. Das Fließmittel A besteht aus Acetonitril, Methanol und Ammoniumacetat in einer Konzentration, ausgewählt aus einem Bereich von 0,1 % bis 10 %, insbesondere 1 % bis 5 %, vorzugsweise 2 % bis 3 %. Die Stoffe des Fließmittels A Acetonitril : Methanol : Ammoniumacetat werden in einem Verhältnis von 171 : 29 : 15, insbesondere von 171 : 17 : 7, vorzugsweise 163 : 21 : 19 verwendet. Als Fließmittel B wird Tetrahydrofuran (THF) verwendet. Für die Flüssigkeitschromatographie wird ein Elutionsmittelgradient aufgebaut, der nach einer der drei nachfolgend angeführten Varianten zusammengesetzt ist.
oder
oder
Figure imgf000017_0001
ie Fließgeschwindigkeit liegt in einem Bereich, ausgewählt zwischen 0,1 ml/Minute und 5 ml/Minute, insbesondere 0,2 ml/Minute und 4 ml/Minute und vorzugsweise zwischen 0,5 ml/Minute und 3 ml/Minute. Besonders vorteilhaft hat sich ein Bereich zwischen 0,6 ml/Minute und 2 ml/Minute, insbesondere zwischen 0,8 ml/Minute und 1 ,5 ml/Minute, erwiesen. Die Detektion erfolgt mit UV-Licht und mit sichtbarem Licht jeweils mit einer Wellenlänge für UV-Licht, ausgewählt aus einem Bereich zwischen 282 nm und 396 nm, insbeson- dere zwischen 293 nm und 348 nm, insbesondere zwischen 298 nm und 326 nm und für sichtbares Licht ausgewählt aus einem Bereich zwischen 400 nm und 800 nm, insbesondere zwischen 456 nm und 721 nm, vorzugsweise zwischen 532 nm und 678 nm. Die Temperatur während der Flüssigkeitschromatographie liegt in einem Bereich zwischen 20 °C und 60 °C, insbesondere 30 °C bis 50 °C und vorzugsweise zwischen 40 °C und 45 °C. Zum Hießmittel A wird zusätzlich noch ein interner Standard zugesetzt, um eine Kalibrierung des HPLC-
Systems zu ermöglichen.
Ausführungsbeispiel 1
Bestimmung des Tocopherolversorgungsprofils in Buccalmukosazellen
Zur Gewinnung von Buccalmukosazellen wird eine mehrmalige Mundspülung, beispielsweise mit insgesamt 500 ml PBS, durchgeführt. Eine Bürste, z.B. eine Zahnbürste, wird mit einer PBS angefeuchtet und anschließend jede Wangeninnenseite 10 Mal von oben nach unten mit leichtem Druck gebürstet. Während des Bürstens darf der Speichel nicht geschluckt werden.
Der Mund wird ein Mal mit 50 ml PBS ausgespült und die Spülflüssigkeit wird in einem Probengefäß aufgefangen. Im Probengefäß sind außerdem bereits 10 ml Pufferlösung vorgelegt. Zusätzlich wird die Bürste in dieser Lösung ausgespült und am Rand des Probengefäßes abgestreift. Das Probengefäß wird anschließend gekühlt. Dies erfolgt in einem Kühlschrank. Der Transport zum Labor erfolgt in einer mit Eiswürfel gefüllten Styroporbox.
Im Labor wird die Spülflüssigkeit im Probengefäß 30 Minuten bei 2000 g und einer Temperatur von 0 °C zentrifugiert. Der Überstand wird dekantiert und das Zellpellet in 30 ml PBS resuspendiert. Die homogenisierten Zellen werden erneut für einen Zeitraum von 1 Minute mit 1800 g zentrifugiert. Die Zentrifugation erfolgt bei einer Temperatur von 0 °C. Der Überstand wird erneut dekantiert und das Zellpellet mit einer 1 ml Pipette in 0,5 ml PBS aufgenommen. Die Zellen werden erneut 5 Minuten mit 10.000 g zentrifugiert. Der Überstand wird abgesaugt und das Zellpellet 30 s mit Stickstoff begast.
Lyse der Zellen Das Zellpellet im Probengefäß wird in einem Volumen von 100 μl PBS resuspendiert. Daraufhin erfolgt die Zugabe von 100 μl Ethanol versetzt mit 0,5 % SDS und 0,5 % BHT und die Lösung wird 30 s gevortext.
Vorbereitung der Probe zur HPLC
Zur Probenaufbereitung für die HPLC erfolgt die Zugabe von 300 μl n-Hexan und die Probe wird erneut 30 s gevortext. Anschließend wird die Lösung 3 Minuten mit 10.000 g zentrifugiert. Nach der Zentrifugation erfolgt ein Abpipettieren der n-Hexanphase in ein zweites Pro- bengefäß. Das ursprüngliche erste Probengefäß wird wiederum mit 300 μl n-Hexan überschichtet, 30 s gevortext und 3 Minuten mit 10.000 g zentrifugiert. Es wird wiederum die obere Phase abgenommen und in das selbe zweite Probengefäß, wie die zuvor überführte Phase pipettiert und die oberen Phasen des ersten und des zweiten Zentrifugationsschrittes werden vereinigt. Zum Abschluss der Probenaufbereitung erfolgt ein vollständiges eindampfen der Probe mit Stickstoff. Das Pellet wird in 300 μl Fließmittel resuspendiert und in Mikroeinsätze von Autosampler-vials pipettiert.
Durchführung der HPLC
Als Säule für die HPLC wird eine Nucleosil 120, C 18, 300 x 3 mm Säule verwendet. Das Fließmittel A besteht aus Acetonitril, Methanol und 5 % Ammoniumacetat. Die Stoffe des Fließmittels A Acetonitril : Methanol : Ammoniumacetat werden in einem Verhältnis von 163 : 21 : 19 verwendet. Als Fließmittel B wird THF verwendet. Für die Flüssigkeitschromatographie wird der im folgenden dargestellte Elutionsmittelgradient verwendet.
Figure imgf000019_0001
Die Fließgeschwindigkeit beträgt 0,5 ml/Minute und die Detektion erfolgt mit UV-VIS bei 292 nm und 456 nm. Die Temperatur während der Flüssigkeitschromatographie liegt bei 20 °C. Zum Fließmittel A wird zusätzlich noch ein interner Standard zugesetzt, um eine Kalibrierung des HPLC-Systems zu ermöglichen.
Ausführungsbeispiel 2
Bestimmung des Folsäuregehalts in Vaginalmukosazellen
Zur Gewinnung von Vaginalmukosazellen wird eine mehrmalige Vaginal Spülung, beispielsweise mit insgesamt 200 ml Wasser, durchgeführt. Ein Stäbchen, z.B. ein Wattestäbchen, wird mit Wasser angefeuchtet und anschließend werden mit leichtem Druck an der Vaginalschleimhaut Zellen abgestrichen. Es erfolgt eine weitere Vaginalspülung mit 20 ml Wasser und die Spülflüssigkeit wird in einem Probengefäß aufgefangen. Das Wattestäbchen wird auch in der Spülflüssigkeit gespült um die daran haftenden Zellen zu lösen. Das Probengefäß wird anschließend im Kühlschrank bei 4 °C gekühlt. Der Transport zum Labor erfolgt in einer mit Kühlakkus gefüllten Kühltasche.
Im Labor wird die Spülflüssigkeit im Probengefäß 20 Minuten bei 1500 g und einer Temperatur von 15 °C zentrifugiert. Der Überstand wird dekantiert und das Zellpellet in 20 ml Wasser resuspendiert. Die homogenisierten Zellen werden erneut für einen Zeitraum von 10 Mi- nuten mit 1000 g zentrifugiert. Die Zentrifugation erfolgt bei einer Temperatur von 15 °C.
Der Überstand wird erneut dekantiert und das Zellpellet mit einer 5 ml Pipette in 1 ml Wasser aufgenommen. Die Zellen werden erneut 4 Minuten mit 18.000 g zentrifugiert. Der Überstand wird abgesaugt und das Zellpellet 1 Minute mit Stickstoff begast.
Lyse der Zellen
Das Zellpellet im Probengefäß wird in einem Volumen von 50 μl Wasser resuspendiert. Daraufhin erfolgt die Zugabe von 50 μl Ethanol versetzt mit 2 % SDS und 2 % BHT und die Lösung wird 40 s gevortext.
Vorbereitung der Probe zur HPLC
Zur Probenaufbereitung für die HPLC erfolgt die Zugabe von 200 μl n-Hexan und die Probe wird erneut 40 s gevortext. Anschließend wird die Lösung 2 Minuten mit 10.000 g zentrifu- giert. Nach der Zentrifugation erfolgt ein Abpipettieren der n-Hexanphase in ein zweites Pro- bengefäß. Das ursprüngliche Probengefäß wird wiederum mit 200 μl n-Hexan überschichtet, 40 s gevortext und 2 Minuten mit 10.000 g zentrifugiert. Es wird wiederum die obere Phase abgenommen und in das selbe zweite Probengefäß, wie die zuvor überführte Phase, pipettiert und die oberen Phasen des ersten und des zweiten Zentrifugationsschrittes werden vereinigt. Zum Abschluss der Probenaufbereitung erfolgt ein vollständiges eindampfen der Probe mit Stickstoff. Das Pellet wird in 300 μl Fließmittel resuspendiert und in Mikroeinsätze von Auto- sampler-vials pipettiert.
Durchführung der HPLC
Als Säule für die HPLC wird eine Nucleosil 120, C 18, 300 x 3 mm Säule verwendet. Das Fließmittel A besteht aus Acetonitril, Methanol und 1 % Ammoniumacetat. Die Stoffe des Fließmittels A Acetonitril : Methanol : Ammoniumacetat werden in einem Verhältnis von 171 : 29 : 15 verwendet. Als Fließmittel B wird THF verwendet. Für die Flüssigkeitschromatographie wird der im folgenden dargestellte Fließmittelgradient verwendet.
Figure imgf000021_0001
Die Fließgeschwindigkeit beträgt 1 ml/Minute und die Detektion erfolgt mit UV-VIS bei 292 nm und 456 nm. Die Temperatur während der Flüssigkeitschromatographie liegt bei 20 °C. Zum Fließmittel A wird zusätzlich noch ein interner Standard zugesetzt, um eine Kalibrierung des HPLC-Systems zu ermöglichen.
Ausführungsbeispiel 3
Bestimmung des Calciumversorgungsprofils in Buccalmukosazellen
Die Zellen werden gemäß den Ausführungsbeispielen 1 und 2 gewonnen und lysiert. Nach Lyse der Zellen werden die gelösten Bestandteile im Zellüberstands mithilfe einer Pumpe in eine Atomabsorptionsgerät gefördert und die Konzentration von Calcium wird dort gemäß den Bedienungsvorschriften der jeweils verwendeten Apparatur analysiert.
Ausführungsbeispiel 4
Bestimmung des Magnesiumversorgungsprofils in Buccalmukosazellen
Die Zellen werden gemäß den Ausführungsbeispielen 1 und 2 gewonnen und lysiert. Nach Lyse der Zellen wird die Konzentration von Magnesium mithilfe von Massenspektrometrie mit induktiv gekoppeltem Plasma gemäß den Bedienungsvorschriften der jeweils verwendeten Apparatur bestimmt. Durch die ICP-MS werden nach der Massentrennung einzelne Ionen detektiert, sodass sehr geringe Mengen des Elements nachgewiesen werden können.
Als biologisches Material können selbstverständlich auch Zellen nicht humanen Ursprungs, wie z.B. von Tieren, Pflanzen, zur Bestimmung deren Versorgungsprofils mit zumindest einem Mikronutrienten verwendet werden.
Wie bereits erwähnt, sollen die dargestellten Beispiele an möglichen Konzentrationsbestimmungen keinerlei einschränkenden Charakter auf den Schutzumfang der Erfindung darstellen.

Claims

P a t e n t a n s p r ü c h e
1. Verfahren zur Bestimmung des Versorgungsprofiis zumindest eines Mikronutrienten in einer biologischen Probe, dadurch gekennzeichnet, dass aus der biologischen Probe, insbesondere nach der Bestimmung der Anzahl und/oder Menge der darin enthaltenen Zellen, durch Lyse der Zellen, gegebenenfalls nach deren Isolation, Zellproteine, insbesondere Zellmembranproteine, freigesetzt werden und dadurch, erforderlichenfalls nach einer Denaturierung, Mikronutrienten aus dem Lysat gewonnen werden und deren Anteil an der Probe, insbesondere deren Gewicht, als Maß für die intrazelluläre Konzentration gemessen wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als biologische Probe Zellen eines Gewebes zur Bestimmung der intrazellulären Konzentration von Mikronutrienten lysiert werden.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen des Gewebes von einem Epithelgewebe, insbesondere einer Mukosa, wie z.B. Buccalmukosazellen, Vagi- nalmukosazellen, Zervikalmukosazellen, etc., verwendet werden.
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Anteil des zumindest einen Mikronutrienten an der Probe mittels eines Analyseverfahrens ausgewählt aus einer Gruppe umfassend Hochleistungschromatographie (HPLC), Gaschromatographie (GC), Ionenchromatographie, Atomabsorptions-Spektrometrie (AAS), induktiv gekoppelte Plasmaanalyse Massenspektrometrie (ICP-MS), Kapillarelektrophorese (CE), Massenspektrometrie (MS), etc., gemessen wird.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass als Mikronutrient zumindest ein Stoff, aus einer Gruppe umfassend Provitamine, Vitamine, Mineralstoffe und Spurenelemente, Aminosäuren, Fettsäuren, Polyphenole, Hormone und Organextrake bzw. deren Syntheseprodukte, wie z.B. Pankreatin, Gallensäure, Knorpel grund- Substanz, etc., ausgewählt wird.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass als Mikronutrient ein Vitamin aus einer Gruppe umfassend natürliche und synthetische Verbindungen mit Retinoid- struktur (Vitamine A), Vitamin-B-Komplex, Ascorbinsäuren (Vitamine C), Calciferole (Vi- tamine D), Tocopherole (Vitamine E), Vitamine K, Flavanoide und Biotin, ausgewählt wird.
7. Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, dass als Mikronutrient zumindest eine Verbindung mit Retinoidstruktur aus einer Gruppe umfassend Retinol, Reti- nyl-Acetat, Retinyl-Palmitat, 3,4-Didehydroretinol (Vitamin A2), Retinal, Retinsäure und Provitamine, wie z.B. α-, ß-, γ-Carotin, ausgewählt wird.
8. Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, dass als Mikronutrient zumindest eine Verbindung des Vitamin-B-Komplexes aus einer Gruppe umfassend Thiamin (Vitamin Bl) bzw. Thiaminhydrocholorid bzw. Thiaminmonomitrat, Riboflavin (Vitamin B2) bzw. Natrium-Riboflavin-5-Phosphat, Niacin (Vitamin B3) bzw. Nikotinsäure bzw. Neacin, Pantothensäure (Vitamin B5) bzw. Calcium-D-Pantothenat bzw. Natrium-D-Pantothenat bzw.
D-Panthenol, Pyridoxin (Vitamin B6) bzw. Pyridoxinhydrochlorid bzw. Pyridoxin-5- Phosphat bzw. Pyridoxindipalmitat bzw. Pyridoxalphosphat, Folsäure (Vitamin B9) bzw. Pte- roylglutaminsäure, Cobalamin (Vitamin B12) bzw. Cyanocobalamin bzw. Hydroxycobala- min, Biotin, Cholin, Inosit und p-Aminobenzoesäure, ausgewählt wird.
9. Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, dass als Mikronutrient zumindest eine Verbindung der Ascorbinsäuren aus einer Gruppe umfassend L-Ascorbin- säure, Natrium-L-Ascorbat, Calcium-L-Ascorbat, Kalium-L-Ascorbat und L-Ascorbyl-6- Palmitat, ausgewählt wird.
10. Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, dass als Mikronutrient zumindest eine Verbindung der Calciferole aus einer Gruppe umfassend Ergocalciferol (Vitamin D2), Cholecalciferol (Vitamin D3), 1,25-Dihydroxycholecalciferol und die Provitamine Ergosterol bzw. 7-Dehydrocholesterol, ausgewählt wird.
11. Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, dass als Mikronutrient zumindest eine Verbindung der Tocopherole aus einer Gruppe umfassend D-α-Tocopherol, DL-α-Tocopherol, D-α-Tocopherylacetat, DL-α-Tocopherylacetat und D-α-Tocopheryl- säuresuccinat, ausgewählt wird.
12. Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, dass als Mikronutrient zumindest eine Verbindung der Vitamine K aus einer Gruppe umfassend Phylloquinon (Vitamin Kl), Menoquinon (Vitamin K2), Menadion (Vitamin K3) und Menadionhydroxiquinon (Vitamin K4), ausgewählt wird.
13. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass als Mikronutrient zumindest ein Mineralstoff bzw. Spurenelement in der Reihenfolge ihrer Bedeutung für den Organismus aus einer Gruppe umfassend Na, K, Mg, Ca, Fe, I, Cu, Mn, Zn, Co, Mo, Se, Cr, F, Si, Ni, As, Sn, V, P, Cl, B, AI und Br, gewählt wird.
14. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass als Mikronutrient zumindest eine Komponente aus einer Gruppe umfassend Coenzym Q-10, Quercetin, Bromelain, Inositol, Cholin, Pycnogenol, Carnitin, Taurin, Mesoinosit, ausgewählt wird.
15. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass als Mikronutrient zumindest eine essentielle Aminosäure aus einer Gruppe umfassend Histidin, Isoleuzin, Leuzin, Lysin, Methionin, Phenylalanin, Threonin, Tryptophan, Valin und Arginin, ausgewählt wird.
16. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass als Mikronutrient zumin- dest eine Fettsäure ausgewählt aus einer Gruppe umfassend Linolsäure, Linolensäure und
Arachidonsäure, ausgewählt wird.
17. Analysekit zur Gewinnung und Vorbereitung einer biologischen Probe mit Zellen für die Bestimmung der intrazellulären Konzentration zumindest eines Mikronutrienten zur Ver- wendung in einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16 umfassend eine Probeentnahmevorrichtung, wie z.B. eine Spatel, eine Bürste, ein Stäbchen, eine Kapillare, weiters ein verschließbares Probengefäß, gegebenenfalls mit zumindest einem Reagenz ausgewählt aus einer Gruppe umfassend Wasser, eine gepufferte Salzlösung, eine 0,9 % ige NaCl Lösung, einen Stabilisator und ein Detergens, insbesondere ein Lysereagenz, und gegebenenfalls ein Thermobehältnis zur Aufnahme des Probengefäßes, insbesondere zum Kühlen des Probengefäßes mit den Zellen.
18. Verwendung des Analysekits nach Anspruch 17 zur Bestimmung der Konzentration zumindest eines Mikronutrienten in Mukosazellen.
PCT/EP2003/001359 2002-02-12 2003-02-12 Analyse von vitalstoffen WO2003069338A2 (de)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US10/504,185 US20050118671A1 (en) 2002-02-12 2003-02-12 Analysis of vital substances
EP03704594A EP1474685A2 (de) 2002-02-12 2003-02-12 Analyse von vitalstoffen
JP2003568408A JP2005517926A (ja) 2002-02-12 2003-02-12 生体物質の分析
AU2003206882A AU2003206882A1 (en) 2002-02-12 2003-02-12 Analysis of vital substances

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
AT2192002 2002-02-12
ATA219/02 2002-02-12

Publications (2)

Publication Number Publication Date
WO2003069338A2 true WO2003069338A2 (de) 2003-08-21
WO2003069338A3 WO2003069338A3 (de) 2004-03-25

Family

ID=27671428

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/EP2003/001359 WO2003069338A2 (de) 2002-02-12 2003-02-12 Analyse von vitalstoffen

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20050118671A1 (de)
EP (1) EP1474685A2 (de)
JP (1) JP2005517926A (de)
AU (1) AU2003206882A1 (de)
WO (1) WO2003069338A2 (de)

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006066804A1 (de) * 2004-12-20 2006-06-29 Biotesys Gmbh In-vitro diagnostikum für analyten mit immunspezifischem nachweis
DE202009002663U1 (de) 2008-02-27 2009-04-30 Biotesys Gmbh Kit zur Gewinnung und Aufbereitung zellulärer Proben
CN102662026A (zh) * 2012-05-30 2012-09-12 山东阿如拉药物研究开发有限公司 一种中药前列宁制剂的质量检测方法
CN103399117A (zh) * 2013-08-26 2013-11-20 中国水产科学研究院黄海水产研究所 水产品中硒形态的检测方法
CN103439444A (zh) * 2013-09-10 2013-12-11 广西大学 检测鱼类血浆中肉碱含量的高效液相色谱法
CN105259284A (zh) * 2015-09-25 2016-01-20 中国科学技术大学苏州研究院 一种富硒螺旋藻中硒形态测定的方法
CN107515270A (zh) * 2017-08-24 2017-12-26 广西壮族自治区食品药品检验所 灵芝二维甲硫氨酸胶囊的质量控制方法
CN108088925A (zh) * 2017-12-14 2018-05-29 金华傲农生物科技有限公司 一种浓缩饲料脂溶性维生素含量的检测方法
CN110308229A (zh) * 2019-08-13 2019-10-08 深圳凯吉星农产品检测认证有限公司 一种测定海藻类制品中无机砷含量的方法

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7700365B2 (en) 2004-10-29 2010-04-20 Mayo Foundation For Medical Education And Research Vitamin D deficiencies
WO2010019566A2 (en) * 2008-08-11 2010-02-18 Mayo Foundation For Medical Education And Research Methods for determining levels of 1,25 dihydroxy vitamin d2 and d3
CN102435700B (zh) * 2011-09-22 2014-07-30 明一（福建）婴幼儿营养品有限公司 测定婴幼儿食品和乳品中维生素ade的含量的方法
JP6925933B2 (ja) 2017-10-25 2021-08-25 アークレイ株式会社 アスコルビン酸測定用電極およびバイオセンサ
CN111595969B (zh) * 2017-11-20 2022-10-18 国药控股星鲨制药（厦门）有限公司 一种hplc检测复方三维右旋泛酸钙糖浆b族维生素的方法
CN108776190B (zh) * 2018-04-19 2020-08-07 中国林业科学研究院林业研究所 沙棘中酚类物质定量检测方法
CN110763788A (zh) * 2018-07-26 2020-02-07 深圳华大生命科学研究院 一种定量检测血浆中5种脂溶性维生素的试剂盒及方法
CN109541110A (zh) * 2018-12-07 2019-03-29 浙江核力欣健药业有限公司 一种检测小儿碳酸钙d3颗粒中维生素d3有关物质的方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE4304728A1 (de) * 1993-02-13 1994-08-18 Igor Dr Popov Verfahren und Testbesteck zur Bestimmung von Ascorbinsäure in biologischen Proben
EP0840127A1 (de) * 1996-10-30 1998-05-06 Nikken Foods Company Limited Tabelle und Verfahren zur Beurteilung von Vitamin-Mineral Profildaten
WO2000010579A1 (en) * 1998-08-18 2000-03-02 California Skin Research Institute Method for detection of biological factors in epidermis
US6287796B1 (en) * 1998-06-16 2001-09-11 Niadyne Inc Biochemical method to measure niacin status in a biological sample

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4818516A (en) * 1985-04-22 1989-04-04 The Board Of Regents For The University Of Oklahoma Method of nutritional assessment and therapy
US5051249A (en) * 1990-01-11 1991-09-24 Jack Metcoff Method of nutritional therapy
ATE211167T1 (de) * 1993-11-02 2002-01-15 Innogenetics Nv Monoklonale antikörper gegen schaumzellen und ihre pharmazeutische und diagnostische anwendung
US5800979A (en) * 1994-12-01 1998-09-01 Kolhouse; J. Fred Gas chromatography/mass spectrometric determination of folic acid coenzymes
US6365407B1 (en) * 2001-03-05 2002-04-02 Council Of Scientific & Industrial Research Culture medium composition useful for induction and proliferation of Taxus calli

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE4304728A1 (de) * 1993-02-13 1994-08-18 Igor Dr Popov Verfahren und Testbesteck zur Bestimmung von Ascorbinsäure in biologischen Proben
EP0840127A1 (de) * 1996-10-30 1998-05-06 Nikken Foods Company Limited Tabelle und Verfahren zur Beurteilung von Vitamin-Mineral Profildaten
US6287796B1 (en) * 1998-06-16 2001-09-11 Niadyne Inc Biochemical method to measure niacin status in a biological sample
WO2000010579A1 (en) * 1998-08-18 2000-03-02 California Skin Research Institute Method for detection of biological factors in epidermis

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ANNOUS KATHLEEN F ET AL: "Pantothenic acid uptake and metabolism by red blood cells of rats" JOURNAL OF NUTRITION, Bd. 125, Nr. 10, 1995, Seiten 2586-2593, XP009019061 ISSN: 0022-3166 *
LENTON KEVIN J ET AL: "Direct correlation of glutathione and ascorbate and their dependence on age and season in human lymphocytes" AMERICAN JOURNAL OF CLINICAL NUTRITION, Bd. 71, Nr. 5, Mai 2000 (2000-05), Seiten 1194-1200, XP002257892 ISSN: 0002-9165 *
PIYATHILAKE C J ET AL: "Cigarette smoking, intracellular vitamin deficiency, and occurrence of micronuclei in epithelial cells of the buccal mucosa" CANCER EPIDEMIOLOGY BIOMARKERS AND PREVENTION, Bd. 4, Nr. 7, 1995, Seiten 751-758, XP009019081 ISSN: 1055-9965 *
PIYATHILAKE C J ET AL: "Effect of smoking on buccal mucosal vitamin B-12 levels" FASEB JOURNAL, Bd. 7, Nr. 3-4, 1993, Seite A743 XP009019165 Meeting of the Federation of American Societies for Experimental Biology on Experimental Biology '93;New Orleans, Louisiana, USA; March 28-April 1, 1993 ISSN: 0892-6638 *
PIYATHILAKE C J ET AL: "Effect of smoking on folate levels in buccal mucosal cells" INTERNATIONAL JOURNAL OF CANCER, Bd. 52, Nr. 4, 1992, Seiten 566-569, XP009019156 ISSN: 0020-7136 *
VANDERVEEN E ET AL: "VITAMINS AND OTHER NUTRIENTS" REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, EASTON, MACK PUBLISHING CO, US, 1985, Seiten 1002-1005, XP002054039 *

Cited By (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006066804A1 (de) * 2004-12-20 2006-06-29 Biotesys Gmbh In-vitro diagnostikum für analyten mit immunspezifischem nachweis
DE202009002663U1 (de) 2008-02-27 2009-04-30 Biotesys Gmbh Kit zur Gewinnung und Aufbereitung zellulärer Proben
CN102662026A (zh) * 2012-05-30 2012-09-12 山东阿如拉药物研究开发有限公司 一种中药前列宁制剂的质量检测方法
CN103399117A (zh) * 2013-08-26 2013-11-20 中国水产科学研究院黄海水产研究所 水产品中硒形态的检测方法
CN103439444A (zh) * 2013-09-10 2013-12-11 广西大学 检测鱼类血浆中肉碱含量的高效液相色谱法
CN105259284A (zh) * 2015-09-25 2016-01-20 中国科学技术大学苏州研究院 一种富硒螺旋藻中硒形态测定的方法
CN107515270A (zh) * 2017-08-24 2017-12-26 广西壮族自治区食品药品检验所 灵芝二维甲硫氨酸胶囊的质量控制方法
CN107515270B (zh) * 2017-08-24 2021-01-08 广西壮族自治区食品药品检验所 灵芝二维甲硫氨酸胶囊的质量控制方法
CN108088925A (zh) * 2017-12-14 2018-05-29 金华傲农生物科技有限公司 一种浓缩饲料脂溶性维生素含量的检测方法
CN110308229A (zh) * 2019-08-13 2019-10-08 深圳凯吉星农产品检测认证有限公司 一种测定海藻类制品中无机砷含量的方法

Also Published As

Publication number Publication date
EP1474685A2 (de) 2004-11-10
WO2003069338A3 (de) 2004-03-25
AU2003206882A1 (en) 2003-09-04
JP2005517926A (ja) 2005-06-16
US20050118671A1 (en) 2005-06-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP1474685A2 (de) Analyse von vitalstoffen
Friedrich Vitamins
DE60030253T2 (de) Antioxidative zusammensetzungen für haustiere
Amadieu et al. Nutrient biomarker patterns and long-term risk of dementia in older adults
EP2976091B1 (de) Antioxidativ wirksame zusammensetzung und deren verwendung
EP0874618A1 (de) Präparat zur verbesserung des haarwuchses, der hautstruktur und/oder der nagelregeneration
EP2627330A2 (de) Neue omega-3- und omega-6 fettsäurzusammensetzungen und ihre verwendung
Arroyave et al. Five decades of vitamin A studies in the region of Central America and Panama
Cals et al. Extensive laboratory assessment of nutritional status in fit, health-conscious, elderly people living in the Paris area. Research Group on Aging.
AT414082B (de) Verfahren zur herstellung von tocotrienol-angereicherten präparationen
Uribe et al. New advances about the effect of vitamins on human health: vitamins supplements and nutritional aspects
WO2016108195A1 (de) Haarwuchspräparat bzw. nahrungsergänzungsmittel
AT510810B1 (de) Kombinationspräparat zur verbesserung der weiblichen fertilität
Cimpoiu et al. Thin layer chromatography for the analysis of vitamins and their derivatives
WO2006066804A1 (de) In-vitro diagnostikum für analyten mit immunspezifischem nachweis
Dias et al. Minerals and vitamin B9 in dried plants vs. infusions: Assessing absorption dynamics of minerals by membrane dialysis tandem in vitro digestion
AT10300U1 (de) Kit zur gewinnung und aufbereitung zellulärer proben
US20210085742A1 (en) Fruit extract and uses thereof
Miodownik et al. The neuroprotective efficacy of vitamins
AT411426B (de) Verwendung eines aus elektrolytangereicherten pflanzenkeimlingen hergestellten präparates
Van Schoor Vitamin and mineral supplements
AT411425B (de) Verwendung eines aus elektrolytangereicherten pflanzenkeimlingen hergestellten präparates
Joseph Investigating the Dietary Antioxidant and Mineral Constituents of Three Commonly Consumed Powder Vegetables Sold in Lapai Market, Lapai-Niger State, Nigeria
Radu The influence of vitamin D and zinc on the mineralization matrix of human metabolism.
EVENSON MARILYN A. SWANSON

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A2

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BY BZ CA CH CN CO CR CU CZ DE DK DM DZ EC EE ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS JP KE KG KP KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX MZ NO NZ OM PH PL PT RO RU SC SD SE SG SK SL TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN YU ZA ZM ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A2

Designated state(s): GH GM KE LS MW MZ SD SL SZ TZ UG ZM ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IT LU MC NL PT SE SI SK TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW ML MR NE SN TD TG

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
DFPE Request for preliminary examination filed prior to expiration of 19th month from priority date (pct application filed before 20040101)
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2003568408

Country of ref document: JP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2003704594

Country of ref document: EP

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 2003704594

Country of ref document: EP

REG Reference to national code

Ref country code: DE

Ref legal event code: 8642

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 10504185

Country of ref document: US

WWW Wipo information: withdrawn in national office

Ref document number: 2003704594

Country of ref document: EP