CN103399117A - 水产品中硒形态的检测方法 - Google Patents

Abstract

一种水产品中硒形态的检测方法，属于水产品检测技术领域，水产品中的硒形态采用超级恒温混匀仪震荡提取，用高效液相色谱-氢化物发生原子荧光光谱联用形态分析技术测定，提取液通过阴离子色谱柱对其分离，由流动相将不同形态的硒依次洗脱，洗脱溶液经过硼氢化钾还原剂和盐酸发生氢化反应，生成氢化物进入原子化器，与原子荧光联用进行分析测定。从而给出了水产品中的硒更为完整的生物学特性；该实验条件选择合理，检测数据准确可靠，样品回收率在88.79%-94.88%，精密度小于5%，该方法具有灵敏度高、干扰小、样品前处理简单，既能准确测无机硒：亚硒酸盐、硒酸盐，同时也能测定有机硒：硒代胱氨酸、硒代蛋氨酸等优点，可以用于水产品中硒形态的检测。

Description

水产品中硒形态的检测方法

技术领域

本发明属于水产品检测技术领域，具体地涉及一种利用高效液相色谱-氢化物发生原子荧光光谱联用(HPLC-HGAFS)形态分析技术测定水产品中硒形态的检测方法。

背景技术

当前，元素分析化学的一项前沿内容是对元素的不同形态进行定性和定量，而不仅仅是测定元素的总量，这主要是因为同一元素的不同形态具有完全不同的化学性质和毒理性质。硒是人体的必需微量元素，其形态常分为无机态硒和有机态硒。无机硒包括单质硒（Se）、硒化物（Se^2-）、硒酸盐（SeO₄ ^2-）和亚硒酸盐（SeO₃ ^2-）；有机硒包括硒代氨基酸、硒肽和硒蛋白等。硒是构成多种蛋白质的必需成分，具有催化和结构功能，在水产品的生长、发育、繁殖、肉质、健康，特别是免疫的维持方面扮演重要角色。有机硒比无机硒具有较高的生物活性(比无机硒约高100倍)，无机硒的含量基本能够反映有毒硒的含量。本检测方法旨在为揭示水产品中硒的赋存形态和科学制定水产品中有毒无机硒的限量提供技术支撑和方法依据，目前国际ISO和CAC标准中尚无测定水产中硒形态的检测方法。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种水产品中硒形态的检测方法，借助元素形态分析仪，使用高效液相色谱-氢化物发生原子荧光光谱联用（HPLC-HGAFS）形态分析技术,对水产品中硒的不同形态进行定性和定量检测，准确测定水产品中有毒的无机硒（硒酸盐Se（Ⅵ）、亚硒酸盐Se（Ⅳ））和有机硒（硒代胱氨酸SeCys、硒代蛋氨酸SeMet），从而给出更为准确可靠的生物学特性。

本发明是按照以下操作方法完成的：

一种水产品中硒形态的检测方法，包括：1、选用的仪器及设备，2、配置试剂与标准溶液，3、进行测试步骤，4、所用的仪器条件，5、结果计算；

1.选用的仪器及设备：HPLC-HGAFS联用系统：

（1）HPLC部分，使用L C-10ATVP高压液相泵；配有100μL定量环的7725i六通进样阀；采用Hamilton PRP-X100、250mm×4.1mm i.d,10μm的阴离子色谱柱，配有相同材质填料的保护柱25mm×2.3mm i.d，12-20μm；

（2）HGAFS-9130原子荧光光度计，配有激发光源，高性能硒空心阴极灯，形态分析测量软件；

（3）冷却循环水；

（4）超级恒温混匀仪；

（5）砂芯过滤器；

（6）循环式真空泵；

（7）离心机；

（8）数控超声清洗器；

（9）0.45μm的水系微孔滤膜；

（10）氩气（纯度≥99.99%）；

2、配置试剂与标准溶液

（1）试剂：体积比为7%盐酸溶液、终浓度为5g/L氢氧化钾溶液+终浓度为20g/L硼氢化钾溶液的混合溶液，流动相为pH6.0浓度40mmol/L磷酸氢二铵溶液；

（2）硒形态的标准使用液的配置：

通过溶解相应量的Se(VI)、Se(IV)、SeMet、SeCys得到1mg/L的各单标溶液的储备标准溶液,用水逐级稀释成5.0ng/mL、25.0ng/mL、50.0ng/mL、75.0ng/mL、100.0ng/mL的标准使用液；

3、进行测试步骤:

准确称取样品置容器中，加去离子水混匀，至70℃超级恒温混匀仪震摇1h，使试样充分浸提后，取出冷却，离心，取出上清液用0.45微米的水水系微孔滤膜过滤，上机测定硒形态的值。

4、所用的仪器条件：

（1）液相色谱条件（HPLC）：流动相40mmol/L(NH₄)₂HPO₄(pH6.0)，流速1mL/min；进样体积100μL；辅阴极46mA；蠕动泵转速65rpm；

（2）氢化物发生条件（HG）：还原剂成分：终浓度为5g/L氢氧化钾溶液+终浓度为20g/L硼氢化钾溶液的混合溶液,流速：6.0mL/min；载流成分：体积比为7%HCl,流速：6.0mL/min；

（3）原子荧光光谱条件（AFS）：高性能硒空心阴极灯，负高压300V，灯电流,60mA；载气为氩气，400mL/min；屏蔽气为氩气，600mL/min；

5、结果计算:根据色谱图对硒各形态进行定性与定量计算。

（1）定性：开机后按步骤4的仪器条件进行设置，待稳定后，先做标准曲线，然后测定处理好的样品溶液；在上述液相色谱和原子荧光条件下用进样针吸取0.3-0.5mL，采用手动进样器进行测定；在上述色谱条件下四种硒形态依次出峰顺序为硒代胱氨酸、亚硒酸盐、硒代蛋氨酸、硒酸盐，用出峰时间定性；

（2）定量：待测样品中硒代胱氨酸（SeCys）亚硒酸盐Se(IV)、硒代蛋氨酸（SeMet）、硒酸盐Se(VI)的色谱峰保留时间与标准溶液相比变化范围在±10%之内即认为该待测定物质，用峰面积外标法定量；

结果计算与表述：

用数据处理软件中的外标法，绘制标准工作曲线，将标准工作曲线保存，然后将样品峰分析处理，用外标校正，即可得到待测溶液中的硒代胱氨酸SeCys、亚硒酸盐Se(IV)、硒代蛋氨酸SeMet、硒酸盐Se(VI)的浓度，按下面式（1）计算，可得试样中待测物的含量：

X=C×V×F/m×1000...............(1)

式中：

X—样品中待测物的含量，mg/kg；

C—待测液中硒的浓度，ng/ml；

m—称样量，g；

V—测定液体总体积，mL；

F—稀释倍数。

进一步，所述的流动相的pH用10%的甲酸调节，使用之前经过0.45μm水系微滤膜过滤并超声脱气；

进一步，所述的步骤2中的试剂均是分析纯或是优级纯，整个实验均使用MΩ为18.2超纯水;玻璃仪器使用前经15%硝酸浸泡24h；

本发明与现有技术相比的有益效果：

1、该实验条件选择合理，检测数据准确可靠，水产品中的硒经提取后，通过阴离子色谱柱，由流动相将硒代胱氨酸（SeCys）、亚硒酸盐Se(IV)、硒代蛋氨酸（SeMet）、硒酸盐Se(VI)依次洗脱，由于阴离子色谱柱对其吸附能力不同，洗脱溶液经过硼氢化钾还原剂和盐酸发生氢化反应，生成氢化物进入原子化器，与原子荧光联用进行分析测定；

2、本发明既能准确测无机硒：亚硒酸盐Se(IV)、硒酸盐Se(VI)，同时也能测定有机硒：硒代胱氨酸(SeCys)、硒代胱氨酸(SeCys)。

3、本发明填补了目前国标中仅有总硒测定方法而未有硒形态分析方法的空白，能准确科学的评价水产品的质量；

附图说明

图1：四种硒形态标准溶液谱图，从图1中可以看出四种硒形态均获得良好的分离效果，说明本发明选用的仪器条件和分离条件完全能满足硒形态检测要求。

图2：扇贝试样中硒赋存形态谱图；

由图2可知：扇贝中的硒主要以有机硒：硒代蛋氨酸(SeMet)、硒代胱氨酸(SeCys)形态存在。

图3：海参试样中硒赋存形态谱图；由图3可知：海参中的硒主要以亚硒酸盐Se(IV)和硒代胱氨酸(SeCys)形态存在。

具体实施方式

下面通过实施例详细叙述本发明的技术内容：

水产品品种繁多，如贝类、鱼类、头足类以及各种藻类等；在其生长过程中对硒的富集作用和机理各不相同，其体内硒的含量和存在形式也相差很大，元素形态差异是影响水产品食用安全性评价的关键因素,这给存在于不同生物体内中硒的测定提出了更高的要求，因此，我们选择水产品中对硒富集能力较强的贝类作为验证的实施例。

本发明为利用高效液相色谱-氢化物发生原子荧光光谱联用（HPLC-HGAFS）对水产品中硒形态的检测方法，包括：1、选用的仪器及设备，2、配置试剂与标准溶液，3、进行测试步骤，4、:所用的仪器条件，5、结果计算。

实施例1：扇贝中硒形态的检测：

1.选用的仪器及设备：HPLC-HGAFS联用系统：

（1）HPLC部分，使用L C-10ATVP高压液相泵；配有100μL定量环的7725i六通进样阀(Rheodyne,Cotati,CA,USA)；采用Hamilton PRP-X100、250mm×4.1mm i.d,10μm的阴离子色谱柱，配有相同材质填料的保护柱25mm×2.3mmi.d，12-20μm；

（2）HGAFS-9130原子荧光光度计，配有激发光源，高性能硒空心阴极灯，形态分析测量软件（北京吉天仪器有限公司）；

（3）冷却循环水（型号SHA-C）；

（4）超级恒温混匀仪（型号TMS-200）；

（5）砂芯过滤器（型号SH/T0093）；

（6）循环式真空泵（型号SHZ-D）；

（7）离心机（型号LD5-10）；

（8）数控超声清洗器（型号KQ-600DE）；

（9）水系微孔滤膜(0.45μm)；

（10）氩气（纯度≥99.99%）：

2、配置试剂与标准溶液

（1）试剂：

1）盐酸溶液(7%)：量取280mL盐酸，慢慢加入3720mL水中，混匀；

2）氢氧化钾溶液（5g/L）：称取氢氧化钾5g溶于水中，并稀释至1000mL；

3）硼氢化钾溶液（20g/L）；称取硼氢化钾20g溶于1000m L氢氧化钾溶液（5g/L）中；

4）流动相为40mmol/L磷酸氢二铵溶液，用10%的甲酸调节pH值=6.0，使用之前经过0.45μm水系微孔滤膜过滤并超声脱气；

所有的试剂均是分析纯或是优级纯，整个实验均使用MΩ为18.2超纯水;玻璃仪器使用前需经体积比15%硝酸浸泡24h；

（2）硒形态的标准使用液的配置：

Se(VI)标准溶液（GBW08675）：86.2mg/kg（以硒计）；Se(IV)标准溶液（GBW(E)080215）：100mg/kg，（以硒计）；硒代胱氨酸（SeMet）标准溶液（GBW08617）：1000mg/kg，以上硒标准溶液从国家标准物质中心购得；硒代蛋氨酸（SeCys）标准溶液7.3mg/kg从中国计量科学研究院购得；

1）通过溶解相应量的Se(VI)、Se(IV)、SeMet、SeCys得到1mg/L的各单标溶液的储备标准溶液,(四种标液可在4℃冰箱存放备用)；

2）混合硒标准溶液的配制

由以上的储备标准溶液用水逐级稀释成5.0ng/mL、25.0ng/mL、50.0ng/mL、75.0ng/mL、100.0ng/mL的标准使用液，临用时现配；

3、进行测试步骤:

准确称取经粉碎过40目筛的干样约0.500g(可根据试样含量而定)与25mL具塞刻度试管中，加水10mL混匀，或称取鲜样(需捣碎匀浆)2.000g-4.000g(可根据试样含量而定)与25mL具塞刻度试管中,加水10mL混匀，至70℃超级恒温混匀仪震摇1h，使试样充分浸提，取出冷却。4000r/min离心15min，取出上清液用0.45微米的水系微孔滤膜过滤，上机测定硒形态的值。

4、所用的仪器条件：

（1）液相色谱条件（HPLC）：流动相40mmol/L(NH₄)₂HPO₄(pH6.0)，流速1mL/min；进样体积100μL；辅阴极46mA；蠕动泵转速65rpm；

（2）氢化物发生条件（HG）：还原剂成分：终浓度为5g/L氢氧化钾溶液+终浓度为20g/L硼氢化钾溶液的混合溶液,流速：6.0mL/min；载流成分：体积比为7%的HCl,流速：6.0mL/min；

（3）原子荧光光谱条件（AFS）：高性能硒空心阴极灯，负高压300V，灯电流60mA；载气为氩气，400mL/min；屏蔽气为氩气，600mL/min；

5、结果计算:

（1）、定性：开机后按4所述条件进行设置，待稳定后，先做标准曲线，然后测定处理好的样品溶液；在上述液相色谱和原子荧光条件下用进样针吸取200-300μL，采用手动进样器进行测定，用出峰时间定性；在上述色谱条件下硒代胱氨酸（SeCys）、亚硒酸盐Se(IV)、硒代蛋氨酸（SeMet）、硒酸盐Se(VI)依次保留时间为2.391min、4.121min、5.544min、12.286min；

（2）、定量：待测样品中硒代胱氨酸（SeCys）、亚硒酸盐Se(IV)、硒代蛋氨酸（SeMet）、硒酸盐Se(VI)的色谱峰保留时间与标准溶液相比变化范围在±10%之内即认为该待测定物质，峰面积外标法定量；

结果计算与表述：

用数据处理软件中的外标法，绘制标准工作曲线，将标准工作曲线保存，然后将样品峰分析处理，用外标校正，即可得到待测溶液中的硒代胱氨酸（SeCys）、亚硒酸盐Se(IV)、硒代蛋氨酸（SeMet）、硒酸盐Se(VI)的浓度，按下面式（1）计算，可得试样中待测物的含量：

X=C×V×F/m×1000...............(1)

式中：

X—样品中待测物的含量，mg/kg；

C—待测液中硒的浓度，ng/ml；

m—称样量，g；

V—测定液体总体积，mL；

F—稀释倍数。

6、结果与讨论：

表1、仪器的分析性能

由表1可知：四种硒形态均获得良好的线性范围,相关系数和检出限，说明本发明定量结果准确可靠，重复性和精确度良好。该仪器的分析性能完全符合测定四种硒形态要求；

表2、扇贝加标回收率的测定结果（以干基计）：

由表2可知:我们加标的回收率在88.7%以上，回收效果理想。

为确保实验数据的准确可靠我们采取的措施有：①样品需粉碎过40目筛这样可使样品均匀，浸提要完全（见表2）；②我们选用的仪器条件和阴离子分析柱Hamilton PRP-X100、250mm×4.1mm i.d,10μm及流动相能使硒形态间不造成干扰，分离和回收效果良好，均符合测定要，详见图1、图2和表2。

实施例2：对海参中硒形态的测定：

准确称取量经粉碎过40目筛的干样0.500g(可根据试样含量而定)与25mL具塞刻度试管中，加水10mL混匀，或称取鲜样(需捣碎匀浆)2.000g-4.000g(可根据试样含量而定)与25mL具塞刻度试管中,加水10mL混匀，至70℃超级恒温混匀仪震摇1h，使试样充分浸提，取出冷却。4000r/min离心15min，取出上清液适量用0.45微米的水水系微孔滤膜过滤，上机测定硒形态的值。其它条件均与扇贝的相同，海参加标回收率的测定结果见表3，其硒赋存形态见图3。

表3、海参加标回收率的测定结果（以干基计）

由表3可知:我们加标的回收率在89.9%以上，回收效果理想。

综上所述，由表1、图1、图2和图3可知：该仪器的分析性能完全符合测定无机硒的要求，由2和表3可知:我们加标的回收率在88.79%--94.88%，符合测定要求。这得益于我们选用的仪器及仪器条件、色谱柱、流动相、提取温度和提取时间合理到位。该方法的亮点：水产品中的硒形态经提取后，通过阴离子色谱柱对硒的各种形态的吸附能力不同，流动相将其依次洗脱，洗脱溶液经过硼氢化钾还原剂和盐酸发生氢化反应，生成氢化物进入原子化器，与原子荧光联用进行分析测定。

水产品中硒形态的检测，采用高效液相色谱-氢化物发生原子荧光联用（HPLC-HGAFS）形态分析方法给出了水产品中的硒更为完整的生物学特性，特别是当前人民对食品安全越来越重视的情况下，采用更为清晰、准确的HPLC-HGAFS联用形态分析法是最佳首选。以其填补ISO和CAC标准中尚无水产中硒形态检测方法的空白。

Claims (5)

1.一种水产品中硒形态的检测方法，包括：1）选用的仪器及设备，2）配置试剂与标准溶液，3）进行测试步骤，4）所用的仪器条件，5）结果计算；其特征在于具体步骤如下：

1）选用的仪器及设备：HPLC-HGAFS联用系统：

（1）HPLC部分，使用L C-10ATVP高压液相泵；配有100μL定量环的7725i六通进样阀；采用Hamilton PRP-X100、250mm×4.1mm i.d,10μm的阴离子色谱柱，配有相同材质填料的保护柱25mm×2.3mm i.d，12-20μm；

（2）HGAFS-9130原子荧光光度计，配有激发光源，高性能硒空心阴极灯，形态分析测量软件；

（3）冷却循环水；

（4）超级恒温混匀仪；

（5）砂芯过滤器；

（6）循环式真空泵；

（7）离心机；

（8）数控超声清洗器；

（9）0.45μm的水系微孔滤膜；

（10）纯度≥99.99%氩气；

2）配置试剂与标准溶液

（1）试剂：体积比为7%盐酸溶液、终浓度为5g/L氢氧化钾溶液+终浓度为20g/L硼氢化钾溶液的混合溶液，流动相为pH6.0浓度为40mmol/L磷酸氢二铵溶液；

（2）硒形态的标准使用液的配置：

通过溶解相应量的Se(VI)、Se(IV)、SeMet、SeCys得到1mg/L的各单标溶液的储备标准溶液,用水逐级稀释成5.0ng/mL、25.0ng/mL、50.0ng/mL、75.0ng/mL、100.0ng/mL的标准使用液；

3）进行测试步骤:

准确称取样品置容器中，加去离子水混匀，至70℃超级恒温混匀仪震摇1h，使试样充分浸提后，取出冷却，离心，取出上清液用0.45微米的水水系微孔滤膜过滤，上机测定硒形态的值；

4）所用的仪器条件：

（1）液相色谱条件：流动相pH6.040mmol/L(NH₄)₂HPO₄，流速1mL/min；进样体积100μL；辅阴极46mA；蠕动泵转速65rpm；

（2）氢化物发生条件：还原剂成分：终浓度为5g/L氢氧化钾溶液+终浓度为20g/L硼氢化钾溶液的混合溶液,流速：6.0mL/min；载流成分：体积比7%HCl,流速：6.0mL/min；

（3）原子荧光光谱条件：高性能硒空心阴极灯，负高压300V，灯电流60mA；载气为氩气，400mL/min；屏蔽气为氩气，600mL/min；

5）结果计算:根据色谱图对硒各形态进行定性与定量计算。

2.根据权利要求1所述的一种水产品中硒形态的检测方法，其特征在于所述的流动的pH用10%的甲酸调节，使用之前经过0.45μm水水系微孔滤膜过滤并超声脱气。

3.根据权利要求1所述的一种水产品中硒形态的检测方法，其特征在于所述的步骤2）中的试剂均是分析纯或是优级纯，整个实验均使用MΩ为18.2超纯水;玻璃仪器使用前经体积比15%硝酸浸泡24h。

4.根据权利要求1所述的一种水产品中硒形态的检测方法，其特征在于所述的步骤5）中硒各形态的定性：开机后按步骤4的仪器条件进行设置，待稳定后，先做标准曲线，然后测定处理好的样品溶液；在上述液相色谱和原子荧光条件下用进样针吸取200-300μL，采用手动进样器进行测定，用出峰时间定性，在上述色谱条件下四种硒形态依次出峰顺序为硒代胱氨酸、亚硒酸盐、硒代蛋氨酸、硒酸盐。

5.根据权利要求1所述的一种水产品中硒形态的检测方法，其特征在于所述的步骤5）中硒各形态的定量：待测样品中硒代胱氨酸、亚硒酸盐Se(IV)、硒代蛋氨酸、硒酸盐的色谱峰保留时间与标准溶液相比变化范围在±10%之内即认为该待测定物质，用峰面积外标法定量；

结果计算与表述：

用数据处理软件中的外标法，绘制标准工作曲线，将标准工作曲线保存，然后将样品峰分析处理，用外标校正，即可得到待测溶液中的硒代胱氨酸SeCys、亚硒酸盐Se(IV)、硒代蛋氨酸SeMet、硒酸盐Se(VI)的浓度，按下面式（1）计算，可得试样中待测物的含量：

X=C×V×F/m×1000...............(1)

式中：

X—样品中待测物的含量，mg/kg；

C—待测液中硒的浓度，ng/ml；

m—称样量，g；

V—测定液体总体积，mL；

F—稀释倍数。

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