CN102590411B - Hplc-icp-ms联用技术检测水产品中二价镉离子的方法 - Google Patents

Abstract

一种HPLC-ICP-MS联用技术检测水产品中二价镉离子的方法，属于水产品检测技术领域，包括以下步骤：1)、选用的仪器及设备，HPLC-ICP-MS联用系统；2)、配置试剂与标准溶液；3)、样品处理的步骤；4)、实验所用的仪器条件；5)、样品检测与结果计算；本发明对水产品中的镉采用中性水超声提取，镉的形态不会被改变，因此提取液中存在自由的离子态镉以及跟蛋白质等有机物络合的有机态镉。采用的流动相中草酸对镉离子具有很强的络合作用，而对于提取液中稳定的镉络合物没有吸附洗脱作用，保证了对样品中镉离子和镉络合物很好的分离；本发明填补了目前国标中仅有总镉测定方法而未有镉元素形态检测方法的空白，可以准确科学的评价水产品及其制品的质量安全，同时对制定水产品中有害元素限量的新标准具有重要意义。

Description

HPLC-ICP-MS联用技术检测水产品中二价镉离子的方法

技术领域：

本发明属于水产品检测技术领域，具体地涉及一种用高效液相色谱-电感耦合等离子质谱仪(HPLC-ICP-MS)联用技术测定水产品中二价镉离子的方法。

背景技术：

镉不是人体所必需的微量元素。新生婴儿体内几乎无镉，人体中镉全部是出生后通过外界环境(例如饮水、食物、香烟)进入人体的。研究显示，镉中毒会造成肾小管再吸收障碍，低分子量蛋白质和钙质等由尿中流失，长期下去容易形成骨质软化，关节疼痛、骨折及肾骼变形等。长期摄入过量的镉，会影响体内其他有益元素的效能，造成肝肾损害、肺气肿、支气管炎、内分必失调、食欲不振、失眠等问题。镉转移至动脉，使血压上升，引致血管脂肪化。另外，镉也是一种致癌物质，可能诱发前列腺癌症。

镉在正常环境中含量很低，但海藻、贝类等水生生物对镉的富集能力极强，因此镉是影响水产品食用安全的主要因素。镉在生物体内可以与蛋白质、有机酸等结合成有机镉形态存在，也可以无机态存在。环境学和毒理学研究结果证明，镉的毒性与其存在形态有关，离子态镉的毒性较高，结合态和有机态镉无毒或毒性非常微弱。若简单地仅采用镉的总含量、并以其离子态的毒性效应作为评价标准往往会高估其毒害效应，因此镉的形态差异成为影响海藻、贝类等水产品食用安全性评价的关键因素，但国内外有关水产品中镉形态的研究较少。

现行镉的检测方法是根据国标GB/T5009.15-2003中规定的食品中镉的测定方法，将水产品中各种形态镉通过高温、强氧化剂(硝酸和高氯酸)消解成离子态镉，因此该方法检测到的是水产品中镉的总量。对水产品中镉的食用安全评价尤其是对于具有高镉积累特性的海藻和贝类，不能仅以镉总量来评价，研究水产品中镉的化学形态，并建立离子态镉的分析技术已迫在眉睫。目前国际ISO和CAC标准中尚无测定水产中二价镉离子的方法标准。

发明内容：

本发明要解决的技术问题是提供一种HPLC-ICP-MS联用技术检测水产品中二价镉离子的方法，使用高效液相色谱-电感耦合等离子质谱仪联用(HPLC-ICP-MS)形态分析技术，对水产品中的镉元素进行定性和定量分析，准确测定水产品中的二价镉离子含量。

本发明是按照以下操作方法完成的：

一种HPLC-ICP-MS联用技术检测水产品中二价镉离子的方法，包括以下步骤：1)、选用的仪器及设备，HPLC-ICP-MS联用系统，2)、配置试剂与标准溶液，3)、样品处理的步骤，4)、实验所用的仪器条件，5)、样品检测与结果计算；具体步骤如下：

1)选用的仪器及设备：

(1)、液相色谱仪HPLC：使用SERIES200高压液相泵，配有自动进样器，配有保护柱CG5A4×50mm和相同材质填料的CS5A 4×250mm阳离子交换色谱柱；

(2)、电感耦合等离子体质谱仪ICP-MS：配有动态反应池，进样系统，射频发生器，等离子体系统，Chromera形态分析全自动处理接口，离子透镜系统，四极杆，真空系统，检测器，气路控制系统；

(3)、冷却循环水；

(4)、涡旋混合器；

(5)、纯水系统；

(6)、循环式真空砂芯抽滤器；

(7)、高速冷冻离心机，转速不小于8000r/min；

(8)、数控超声波清洗器；

(9)、0.22μm的水相微孔滤膜；

(10)、纯度≥99.99％的氩气；

2)配置试剂与标准溶液：

(1)、浸提液：超纯水；

(2)、流动相：50mM草酸+95mM氢氧化锂溶液，使用前经过0.22μm滤膜过滤并超声脱气；

所有的试剂均是优级纯，整个实验用水均为超纯水；玻璃仪器使用前经15％硝酸浸泡24h；

(3)、二价镉离子的标准使用液：

将100μg/mL二价镉离子标准溶液稀释至1.00μg/mL的储备液，置4℃冰箱存放备用，由1.00μg/mL的二价镉离子储备液用水稀释成10.0ng/mL、50.0ng/mL、100.0ng/mL、200.0ng/mL、500.0ng/mL的标准使用液，现用现配；

3)样品处理的步骤：

称取经粉碎过40目筛的干样0.500g～1.000g或鲜样匀浆称取2.000g～4.000g置于50mL塑料具塞刻度离心管中，加水40mL涡旋混匀后，超声浸提40min，8000r/min 4℃离心10min，取出上清液用0.22微米的水系微孔滤膜过滤后为待测样液，移入进样瓶中，上机测定待测样液中镉离子的值；

4)实验所用的仪器条件：

(1)、高效液相色谱条件：流动相为50mM草酸+95mM氢氧化锂溶液，流速1.0mL/min；进样体积50μL，自动进样；

(2)、电感耦合等离子质谱仪条件：射频功率1150W，等离子体气流速：15L/min，雾化气流速0.94L/min，透镜电压7.00V，辅助气流速1.2L/min，检测器模拟级电压-1800V，检测器脉冲级电压900V，质量通带带宽0.25，采样时间10min；

5)样品检测与结果计算：

开机后按上述仪器条件进行设置，待稳定后，先做标准曲线，然后测定处理好的待测样液；在上述高效液相色谱和电感耦合等离子质谱仪条件下采用全自动进样器进样50μL进行测定，高效液相色谱仪进行分离，电感耦合等离子质谱仪对二价镉离子进行检测；在上述仪器条件下二价镉离子保留时间约为3.2min；

(2)、定量：待测样液中二价镉离子的色谱峰保留时间与标准使用液相比变化范围在±10％之内即认为是该待测定物质；

结果计算与表述：

用数据处理软件中的外标法，确定二价镉离子保留时间及分离度脉冲强度，以浓度为横坐标，脉冲强度积分为纵坐标，绘制标准工作曲线，然后将待测样液幸分析处理，即可得到待测样液中的二价镉离子的浓度，按下面式(1)计算，可得样品中二价镉离子的含量：

X＝C×V/m×1000...............            (1)

式中：

X-样品中二价镉离子的含量，mg/kg；

C-待测样液中二价镉离子的浓度，ng/ml；

m-称样量，g；

V-测定液体总体积，mL。

本发明与现有技术相比的有益效果是：

1、本发明采用高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱联用技术分析水产品中的二价镉离子，提取液首先由高效液相色谱，采用阳离子交换色谱技术洗脱分离提取液中的二价镉离子，再由电感耦合等离子体质谱仪做为检测器进行分析。阳离子交换色谱柱能吸附提取液中的二价镉离子，通过流动相中草酸对镉离子的络合作用，将二价镉离子洗脱，通过电感耦合等离子体质谱仪对二价镉离子进行分析，得到二价镉离子的保留时间及其分离度的脉冲强度。根据标准系列溶液的强度和脉冲强度积分，由仪器计算机拟合得到线性回归方程。该实验条件选择合理，检测数据准确可靠。

2、本发明对水产品中的镉采用中性水超声提取，镉的形态不会被改变，因此提取液中存在自由的离子态镉以及跟蛋白质等有机物络合的有机态镉。采用的流动相中草酸对镉离子具有很强的络合作用，而对于提取液中稳定的镉络合物没有吸附洗脱作用，保证了对样品中镉离子和镉络合物很好的分离。

3、本发明填补了目前国标中仅有总镉测定方法而未有镉元素形态检测方法的空白，可以准确科学的评价水产品及其制品的质量安全，同时对制定水产品中有害元素限量的新标准具有重要意义。

附图说明：

图1：二价镉离子标准使用液色谱图；

图2：扇贝中二价镉离子分析色谱图

具体实施方式：

下面通过实施例详细叙述本发明的技术内容：

本发明为利用高效液相色谱-电感耦合等离子质谱仪(HPLC-ICP-MS)联用技术分析水产品中二价镉离子的方法，步骤包括：1、选用的仪器及设备，2、配置试剂与标准溶液，3、样品提取的步骤，4、实验所用的仪器条件，5、样品检测与结果计算。

水产品品种繁多，如贝类、鱼类、甲壳类、头足类以及各种藻类等；在其生长过程中对镉的富集作用和机理各不相同，其体内镉的含量和存在形式也相差很大，其中海藻和贝类对镉具有较强的富集能力，如紫菜、扇贝、牡蛎等。镉在具有高富集能力水产品中的存在形态是影响其食用安全性评价的关键因素。因此，我们选择水产品中最有代表性且争议最大的紫菜、扇贝、牡蛎作为验证的实施例。

实施例1：扇贝中二价镉离子即Cd(II)的测定：

1、本实施例选用的仪器及设备：HPLC-ICP-MS联用系统：

(1)、HPLC(美国Perkin-Elmer公司，型号Series 200)部分：使用SERIES200高压液相泵，配有自动进样器，配有保护柱CG5A 4×50mm和相同材质填料的CS5A 4×250mm阳离子交换色谱柱；

(2)、ICP-MS(美国Perkin-Elmer公司，型号ELAN DRC II)部分：配有动态反应池，自动进样系统，射频发生器，等离子体系统，Chromera形态分析全自动处理接口，离子透镜系统，四极杆，真空系统，检测器，气路控制系统；

(3)、冷却循环水(美国POLYSCIENCE公司，型号SHA-C)；

(4)、漩涡混合器(IKA MS 3 basic)；

(5)、纯水系统(美国Millipore，Milli-Q Gradient A10)；

(6)、循环式真空砂芯过滤器泵(真空泵，上海亚荣生化仪器厂、型号SHZ-III；砂芯过滤装置、型号SH/T0093)；

(7)、高速冷冻离心机(Thermo，型号D-37520)；

(8)、数控超声清洗器(昆山市超声仪器有限公司，型号KQ-600DE)；

(9)、水系微孔滤膜(0.22μm)；

(10)、氩气(纯度≥99.99％)。

2、配置试剂与标准溶液；

(1)、浸提液：超纯水。

(2)、流动相：50mM草酸+95mM氢氧化锂溶液，使用前经过0.22μm滤膜过滤并超声脱气。

所有的试剂均是优级纯，整个实验都使用超纯水；玻璃仪器使用前经15％硝酸浸泡24h；

(3)、二价镉离子Cd(II)的标准使用液：

从国家标准物质中心购得100μg/mL Cd(II)的标准溶液，稀释至1.00μg/mL作为Cd(II)的储备液(置4℃冰箱存放备用)；1.00μg/mL的Cd(II)储备液用水稀释成10.0ng/mL、50.0ng/mL、100.0ng/mL、200.0ng/mL、500.0ng/mL的Cd(II)标准使用液，现用现配。

3、样品处理的步骤：：

称取均匀匀浆扇贝约3.000g置于50mL具塞刻度离心管中，加水40mL混匀，超声浸提40min。8000r/min 4℃离心10min，取出上清液用0.22微米的水系微孔滤膜过滤，移入进样瓶中，上机测定待测样液中二价镉离子的值。

4、实验所用的仪器条件：

(1)、高效液相色谱条件(HPLC)：流动相：50mM草酸+95mM氢氧化锂溶液，流速1mL/min；进样体积50μL，自动进样。

(2)、电感耦合等离子质谱仪条件(ICP-MS)：射频功率1150W，等离子体气流速15L/min，雾化气流速0.94L/min，透镜电压7.00V，辅助气流速1.2L/min，检测器模拟级电压-1800V，，检测器脉冲级电压900V，质量通带带宽0.25，采样时间10min。

5、样品检测与结果计算：

(1)、定性：开机后按上述条件进行设置，待稳定后，取标准使用溶液1mL移入进样瓶中，自动进样注入高效液相色谱仪(HPLC)，进行洗粉离成分，然后应用电感耦合等离子体质谱仪(ICP/MS)作为检测器对Cd(II)进行分析，确定Cd(II)的保留时间及其分离度的脉冲强度，以浓度为横坐标，脉冲强度的积分为纵坐标，由仪器的计算机作线性拟合，得到标准曲线方程。在上述高效液相色谱和电感耦合等离子质谱仪条件下采用全自动进样器进样50μL样品提取液进行测定，高效液相色谱仪进行分离，电感耦合等离子质谱仪对Cd(II)进行检测；在上述仪器条件下Cd(II)保留时间约为3.2min；详见图1；

(2)、定量：待测样品中Cd(II)的色谱峰保留时间与标准使用液相比变化范围在±10％之内即认为是该待测定物质；

结果计算与表述：

用数据处理软件(chromera)中的外标法，确定Cd(II)保留时间及分离度脉冲强度，以浓度为横坐标，脉冲强度积分为纵坐标，绘制标准工作曲线，将标准工作曲线保存，然后将样品峰分析处理，即可得到待测样液中的Cd(II)的浓度，按下面式(1)计算，可得试样中Cd(II)的含量：

X＝C×V/m×1000...............        (1)

式中：

X-样品中Cd(II)的含量，mg/kg；

C-待测样液中Cd(II)的浓度，ng/ml；

m-称样量，g；

V-测定液体总体积，mL；

6、结果：

本方法Cd(II)检出限量为0.03mg/kg。通过对扇贝样品的加标回收率试验，回收率为＞85％，相对标准偏差＜5％，证明上述检测方法的可行。

对牡蛎中的二价镉离子的测定方法与扇贝相同，扇贝和牡蛎加标回收率的测定结果见表1。

表1、扇贝、牡蛎加标回收率的测定结果：

实施例2：对紫菜中Cd(II)的测定：

称取紫菜粉碎干制样品1.000g置于50mL具塞塑料刻度离心管中，加水40mL混匀。超声提取40min，8000r/min 4℃离心10min，取出上清液用0.22微米的水系微孔滤膜过滤，上机测定浸提液中Cd(II)的值。其它条件均与扇贝、牡蛎的相同。

紫菜中样品的加标回收率试验，加标回收率为91.2％，相对标准偏差＜5％，满足分析要求，紫菜中二价镉离子的测定结果见表2。

表2、紫菜加标回收率的测定结果(以干基计)

为确保实验数据的准确可靠我们采取的描施有：①干制样品需粉碎过40目筛，鲜样需匀浆可使样品均匀，浸提完全；②采用中性冰提取液提取，可以保证冰产品中镉形态不发生变化；③、选用的保护柱CG5A 4×50mm，分析柱CS5A 4×250mm阳离子交换柱能吸附离子态Cd(II)，再通过草酸的络合作用洗脱，使离子态镉与络合态有机镉很好的分离，见图2。

因此高效液相色谱-电感耦合等离子质谱仪联用(HPLC-ICP-MS)技术是分析水产品中二价镉离子的首选方法。这种方法可以将二价镉离子与有机镉很好的分离并对无二价镉离子进行定性定量，该方法回收率高，稳定性好，灵敏度高，前处理简便，解决了水产品中的毒性较高的二价镉离子的分析问题，特别是对于具有高富集特性的紫菜、扇贝、牡蛎等水产生物，该方法可以更为清晰、准确的反应其中二价镉离子的含量，为科学准确的进行质量安全性评价提供重要技术支持。

Claims (1)

1.一种HPLC-ICP-MS联用技术检测水产品中二价镉离子的方法，包括以下步骤：1）、选择仪器及设备，采用HPLC-ICP-MS联用系统，2）、配制试剂与标准溶液，3）、样品处理的步骤，4）、选择实验所用的仪器条件，5）、样品检测与结果计算；其特征在于具体步骤如下：

1）选择仪器及设备，采用HPLC-ICP-MS联用系统，系统中各仪器设备按以下条件选择：

（1）、液相色谱仪HPLC：使用SERIES200高压液相泵，配有自动进样器，配有保护柱CG5A4×50mm和相同材质填料的CS5A4×250mm阳离子交换色谱柱；

（2）、电感耦合等离子体质谱仪ICP-MS：配有动态反应池，进样系统，射频发生器，等离子体系统，Chromera形态分析全自动处理接口，离子透镜系统，四极杆，真空系统，检测器，气路控制系统；

（3）、冷却循环水；

（4）、涡旋混合器；

（5）、纯水系统；

（6）、循环式真空砂芯抽滤器；

（7）、高速冷冻离心机，转速不小于8000r/min；

（8）、数控超声波清洗器；

（9）、0.22μm的水相微孔滤膜；

（10）、纯度≥99.99%的氩气;

2）配制试剂与标准溶液：

（1）、浸提液：超纯水；

（2）、流动相：50mM草酸+95mM氢氧化锂溶液，使用前经过0.22μm滤膜过滤并超声脱气；

所有的试剂均是优级纯，整个实验用水均为超纯水;玻璃仪器使用前经15%硝酸浸泡24h；

（3）、二价镉离子的标准使用液：

将100μg/mL二价镉离子标准溶液稀释至1.00μg/mL的储备液，置4℃冰箱存放备用，由1.00μg/mL的二价镉离子储备液用水稀释成10.0ng/mL、50.0ng/mL、100.0ng/mL、200.0ng/mL、500.0ng/mL的标准使用液，现用现配;

3）样品处理的步骤:

称取经粉碎过40目筛的干样0.500g～1.000g或鲜样匀浆称取2.000g～4.000g置于50mL塑料具塞刻度离心管中，加水40mL涡旋混匀后，超声浸提40min，8000r/min4℃离心10min，取出上清液用0.22微米的水系微孔滤膜过滤后为待测样液，移入进样瓶中，上机测定待测样液中镉离子的值;

4）选择实验所用的仪器条件：

（1）、高效液相色谱条件：流动相为50mM草酸+95mM氢氧化锂溶液，流速1.0mL/min；进样体积50μL，自动进样；

（2）、电感耦合等离子质谱仪条件：射频功率1150W，等离子体气流速:15L/min，雾化气流速0.94L/min，透镜电压7.00V，辅助气流速1.2L/min，检测器模拟级电压-1800V，检测器脉冲级电压900V，质量通带带宽0.25，采样时间10min；

5）样品检测与结果计算:

（1）、定性：开机后按上述仪器条件进行设置，待稳定后，先做标准曲线，然后测定处理好的待测样液；在上述高效液相色谱和电感耦合等离子质谱仪条件下采用全自动进样器进样50μL进行测定，高效液相色谱仪进行分离，电感耦合等离子质谱仪对二价镉离子进行检测；在上述仪器条件下二价镉离子保留时间约为3.2min；

（2）、定量：待测样液中二价镉离子的色谱峰保留时间与标准使用液相比变化范围在±10%之内即认为是该待测定物质；

结果计算与表述：

用数据处理软件中的外标法，确定二价镉离子保留时间及分离度脉冲强度，以浓度为横坐标，脉冲强度积分为纵坐标，绘制标准工作曲线，然后将待测样液峰分析处理，即可得到待测样液中的二价镉离子的浓度，按下面式（1）计算，可得样品中二价镉离子的含量：

X=C×V/m×1000...............(1)

式中：

X—样品中二价镉离子的含量，mg/kg；

C—待测样液中二价镉离子的浓度，ng/ml；

m—称样量，g；

V—测定液体总体积，mL。

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