CN101980012A - 水产品中氨苄青霉素和阿莫西林残留量的高效液相色谱荧光检测法 - Google Patents

水产品中氨苄青霉素和阿莫西林残留量的高效液相色谱荧光检测法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了水产品中氨苄青霉素和阿莫西林残留量的高效液相色谱荧光检测法，属食品安全检测领域，操作步骤是1、制备标准液；2、抽样，经捣碎取不少于500克样品，均分二份在-18℃下保存；3、提取，取5克样品，加入磷酸二氢钠，加水溶至500毫升，制备成提取液30毫升，二次均质离心取上清液，加三氯乙酸作备用液；4、净化，依次用甲醇、蒸馏水、三氯乙酸润洗，控制20滴/min，抽干后用5毫升乙腈洗脱；5、衍生，40℃下氮气吹干，取0.5毫升标准液加入三氯乙酸和7%甲醛溶液混匀，密封置于沸水浴中加热30min，冷却后用乙腈洗脱溶液定容至1ML，过滤后供液相色谱检测，检测限小于5μg/kg。

Description

水产品中氨苄青霉素和阿莫西林残留量的高效液相色谱荧光检测法
技术领域
    本发明涉及的是水产品中氨苄青霉素和阿莫西林残留量的高效液相色谱荧光检测方法，属于食品安全检测领域。
背景技术
    氨苄青霉素和阿莫西林药物的检测方法有薄层色谱法、毛细管电泳法、化学发光法、液相色谱法和色谱联用技术。薄层色谱法，毛细管电泳法，化学发光法，方法简便，不需昂贵的仪器，但检出限不高。高效液相色谱紫外检测法法稳定性高，重现性好，但是由于多数青霉素化合物在紫外区没有特征吸收光谱，一般在200~235nm有吸收，但该波长范围内的选择性较差。色谱联用技术存在设备昂贵，对检测人员要求高，分析费时等问题。样品中青霉素药物残留量为ug/L数量级，背景干扰严重，迄今尚未见对水产品中氨苄青霉素和阿莫西林残留量既经济又正确的检测方法的报道，因而有加以研究的必要。
发明内容
    本发明提出水产品中氨苄青霉素和阿莫西林残留量的一种检测方法是高效液相色谱荧光检测法具体按下列步骤操作：
1.制备标准液   购买氨苄青霉素标准品，含氨苄青霉素(C16H18N3NaO4S)不少于96.5%；阿莫西林标准品,含阿莫西林(C16H19N3O5S)不少于98.5%。
制备混合标准储备溶液：准确称取氨苄青霉素10.0mg、阿莫西林10.0mg加水溶解并稀释至浓度均为1.0mg/ml的储备液,本溶液于0℃～4℃保存，一周内有效。
 制备混合标准中间溶液：准确移取混合标准储备溶液100μL，用水定容至100mL，配成每升含氨苄青霉素1.0mg、阿莫西林1.0mg的混合标准中间溶液。
    制备混合标准工作溶液：以混合标准中间溶液配制氨苄青霉素标准使用浓度系列：0.1、1.0、5.0、20.0、50.0μg/L；以混合标准中间溶液配制阿莫西林标准使用浓度系列：1.0、5.0、20.0、50.0、100.0μg/L。此标准工作液临用时现配。
   2.抽样   本发明提供的检测方法，从原始样品中任意抽取样品，经高速组织捣碎机捣碎。四分法缩分出不少于500g样品，混匀，均分成两份。装入清洁容器，加封，标明标记。-18℃以下冷冻保存。
3.提取   称取5g样品（精确至0.01g）置于50mL聚丙烯离心管中，加入1.68g磷酸二氢钠，加适量水溶解，定容至500mL制备成提取液30mL，以10000r/min均质3min，再于室温下以3000 r/min离心10min，上清液移入离心管中，残留物用20mL提取液同上法均质、离心所得二次上清液，合并二次上清液于离心管中，加入浓度为750 mg/ml三氯乙酸0.5mL，振摇5min，3000 r/min离心10min，上清液做备用液。
4.净化   固相萃取小柱预先依次用5mL甲醇、5mL蒸馏水、加入浓度为200 mg/ml三氯乙酸5mL润洗，将备用液过柱，控制速度在20滴/min，依次用浓度为200 mg/ml三氯乙酸5mL和蒸馏水洗涤，真空抽干，再用5mL乙腈洗脱，真空抽干,收集洗脱液于离心管中。
5.衍生   洗脱液在40℃下氮气吹干，加0.5mL水溶解或准确量取0.5mL的标准工作液加入浓度为200 mg/ml三氯乙酸0.1mL和7%甲醛溶液0.1mL,旋涡混匀20s，密封，置于沸水浴中加热30 min。取出,冷却至室温,用20%乙腈水溶液定容至1mL。
6.过滤   经0.45μm微孔滤膜过滤，供液相色谱测定。
7.测定   色谱测定条件为
色谱柱：C18柱，粒度5μm，4.6mm（id）×150mm，或性能相当者。
检测器：荧光检测器，Ex=380nm，Em=465nm。
流速：1.0mL/min。
进样量：50μL。
柱温：40℃。
流动相：磷酸盐缓冲溶液（称取磷酸二氢钾2.72g，用水溶解，再用85%的浓磷酸调pH至3.5±0.05,加水稀释至刻度,摇匀即得）－乙腈 (75+25，v/v)。
本发明提供的检测方法，通过衍生技术，在荧光检测器条件下，可以很大程度上提高检测灵敏度。且检出限小于5ug/kg。解决了薄层色谱法，毛细管电泳法，化学发光法等方法检出限高，以及紫外检测器条件下背景干扰严重的问题，并且与质谱相比，分析成本较低。
具体实施方式
1.制备标准液   购买氨苄青霉素标准品，含氨苄青霉素(C16H18N3NaO4S)不少于96.5%；阿莫西林标准品,含阿莫西林(C16H19N3O5S)不少于98.5%。
制备混合标准储备溶液：准确称取氨苄青霉素10.0mg、阿莫西林10.0mg加水溶解并稀释至浓度均为1.0mg/ml的储备液,本溶液于0℃～4℃保存，一周内有效。
 制备混合标准中间溶液：准确移取混合标准储备溶液100μL，用水定容至100mL，配成每升含氨苄青霉素1.0mg、阿莫西林1.0mg的混合标准中间溶液。
    制备混合标准工作溶液：以混合标准中间溶液配制氨苄青霉素标准使用浓度系列：0.1、1.0、5.0、20.0、50.0μg/L；以混合标准中间溶液配制阿莫西林标准使用浓度系列：1.0、5.0、20.0、50.0、100.0μg/L。此标准工作液临用时现配。
   2.抽样   从原始样品中任意抽取样品，经高速组织捣碎机捣碎。四分法缩分出不少于500g样品，混匀，均分成两份。装入清洁容器，加封，标明标记。-18℃以下冷冻保存。
3.提取   称取5g样品（精确至0.01g）置于50mL聚丙烯离心管中，加入1.68g磷酸二氢钠，加适量水溶解，定容至500mL制备成的提取液30mL，以10000r/min均质3min，再于室温下以3000 r/min离心10min，上清液移入离心管中，残留物用20mL提取液同上法均质、离心所得二次上清液，合并二次上清液于离心管中，加入浓度为750 mg/ml三氯乙酸0.5mL，振摇5min，3000 r/min离心10min，上清液做备用液。
4.净化   固相萃取小柱预先依次用5mL甲醇、5mL蒸馏水、加入浓度为200 mg/ml三氯乙酸5mL润洗，将备用液过柱，控制速度在20滴/min，依次用浓度为200 mg/ml三氯乙酸5mL和蒸馏水洗涤，真空抽干，再用5mL乙腈洗脱，真空抽干,收集洗脱液于离心管中。
5.衍生   洗脱液在40℃下氮气吹干，加0.5mL水溶解或准确量取0.5mL的标准工作液加入浓度为200mg/mL三氯乙酸0.1 mL和7%甲醛溶液0.1mL,旋涡混匀20s，密封，置于沸水浴中加热30 min。取出,冷却至室温,用20%乙腈水溶液定容至1mL。
6.过滤   经0.45μm微孔滤膜过滤，供液相色谱测定。
7.测定   色谱测定条件为：
色谱柱：C18柱，粒度5μm，4.6mm（id）×150mm，或性能相当者。
检测器：荧光检测器，Ex=380nm，Em=465nm。
流速：1.0mL/min。
进样量：50μL。
柱温：40℃。
流动相：磷酸盐缓冲溶液（称取磷酸二氢钾2.72g，用水溶解，再用85%的浓磷酸调pH至3.5±0.05,加水稀释至刻度,摇匀即得）－乙腈 (75+25，v/v)。
本发明的水产品中氨苄青霉素和阿莫西林残留量的检测方法通过大黄鱼、南美白对虾、扇贝和鱿鱼四种样品进行准确度、精密度和检出限的方法确认。
一、准确度和精密度
1）分别称取22份不含青霉素类药物的鱼类（大黄鱼）样品各5g（称准至0.01g），1份作为样品空白，3份作为检出限检测样品(S/N≧3时样品的浓度为标准样品溶液的最低检测限)，加入氨苄青霉素、阿莫西林的浓度分别为1.0mg/L的混合标准中间液5μL、25μL；18份样品中加入氨苄青霉素浓度为1.0mg/L的混合标准中间液100μL 6份 、250μL 6份、500μL 6份，阿莫西林浓度为1.0mg/L的混合标准中间液100μL 6份 、250μL 6份、500μL 6份，用玻璃棒搅匀；样品中氨苄青霉素、阿莫西林药物的添加水平分别为0.001mg/kg、0.005mg/kg、0.02mg/kg、0.05mg/kg、0.1 mg/kg。以大黄鱼鱼肉为基质，测定回收率。回收率、平均回收率和精密度如表1、表2。
Figure 2010105163011100002DEST_PATH_IMAGE002
2）分别称取22份不含青霉素类药物的甲壳类（南美白对虾）样品各5g（称准至0.01g），1份作为样品空白，3份作为检出限检测样品(S/N≧3时样品的浓度为标准样品溶液的最低检测限)，加入氨苄青霉素、阿莫西林的浓度分别为1.0mg/L的混合标准中间液5μL、25μL；18份样品中加入氨苄青霉素浓度为1.0mg/L的混合标准中间液100μL 6份 、250μL 6份、500μL 6份，阿莫西林浓度为1.0mg/L的混合标准中间液100μL 6份 、250μL 6份、500μL 6份，用玻璃棒搅匀；样品中氨苄青霉素、阿莫西林药物的添加水平分别为0.001mg/kg、0.005mg/kg、0.02mg/kg、0.05mg/kg、0.1 mg/kg。
以南美白对虾肉为基质，测定回收率。回收率、平均回收率和精密度如表3、表4。
Figure 2010105163011100002DEST_PATH_IMAGE003
3）分别称取22份不含青霉素类药物的贝类（扇贝）样品各5g（称准至0.01g），1份作为样品空白，3份作为检出限检测样品(S/N≧3时样品的浓度为标准样品溶液的最低检测限)，加入氨苄青霉素、阿莫西林的浓度分别为1.0mg/L的混合标准中间液5μL、25μL；18份样品中加入氨苄青霉素浓度为1.0mg/L的混合标准中间液100μL 6份 、250μL 6份、500μL 6份，阿莫西林浓度为1.0mg/L的混合标准中间液100μL 6份 、250μL 6份、500μL 6份，用玻璃棒搅匀；样品中氨苄青霉素、阿莫西林药物的添加水平分别为0.001mg/kg、0.005mg/kg、0.02mg/kg、0.05mg/kg、0.1 mg/kg。
以扇贝肉为基质，测定回收率。回收率、平均回收率和精密度如表5、表6。
Figure 2010105163011100002DEST_PATH_IMAGE004
4）分别称取22份不含青霉素类药物的头足类（鱿鱼）样品各5g（称准至0.01g），1份作为样品空白，3份作为检出限检测样品(S/N≧3时样品的浓度为标准样品溶液的最低检测限)，加入氨苄青霉素、阿莫西林的浓度分别为1.0mg/L的混合标准中间液5μL、25μL；18份样品中加入氨苄青霉素浓度为1.0mg/L的混合标准中间液100μL 6份、 250μL 6份、 500μL 6份，阿莫西林浓度为1.0mg/L的混合标准中间液100μL 6份 、250μL 6份、500μL 6份，用玻璃棒搅匀；样品中氨苄青霉素、阿莫西林药物的添加水平分别为0.001mg/kg、0.005mg/kg、0.02mg/kg、0.05mg/kg、0.1 mg/kg。以鱿鱼肉为基质，测定回收率。回收率、平均回收率和精密度如表7、表8。
Figure 2010105163011100002DEST_PATH_IMAGE005
二、检出限
对大黄鱼、南美白对虾、扇贝、鱿鱼各以氨苄青霉素0.001mg/ kg，阿莫西林0.005mg/ kg加标进行回收率试验，试验结果表明回收率都在75%以上，因此把此浓度作为最小检出浓度。氨苄青霉素、阿莫西林作为常用抗生素，目前广泛用于兽医药治疗和预防牲畜疾病，容易残留在食用组织中。长期食用其残留物的食品，人体会产生耐药性，还可能出现过敏反应等不良影响。欧盟规定抗生素残留小于4μg/L,美国FDA规定阿莫西林、氨苄青霉素残留小于10ng/mL。因此，本试验把氨苄青霉素0.001mg/ kg，阿莫西林0.005mg/ kg作为最小检出浓度，能够满足国内外的要求。
本发明提供的检测方法主要是通过衍生技术，在荧光检测器条件下，很大程度上提高了检测灵敏度。解决了紫外检测器条件下背景干扰严重的问题。本发明提供的检测方法检出限小于5μg/kg，而薄层色谱法、毛细管电泳法、化学发光法等方法检出限较高。并且与质谱相比，本发明提供的检测方法分析成本较低。与其他检测方法相比，本发明提供的检测方法具有选择性强、灵敏度高、高效快速、检出率高等优点，对今后水产品中氨苄青霉素和阿莫西林残留量的检测，具有重要的应用价值，为水产品出口贸易提供良好的技术保障，使水产品出口能从容应对国内外技术贸易壁垒的挑战，同时收到较好的经济效益和社会效益。

Claims (1)

1. 水产品中氨苄青霉素和阿莫西林残留量的高效液相色谱荧光检测法，其特征在于按下列步骤操作：
（1）.制备标准液   购买氨苄青霉素标准品，含氨苄青霉素(C16H18N3NaO4S)不少于96.5%；阿莫西林标准品,含阿莫西林(C16H19N3O5S)不少于98.5%;
制备混合标准储备溶液：准确称取氨苄青霉素10.0mg、阿莫西林10.0mg加水溶解并稀释至浓度均为1.0mg/ml的储备液,本溶液于0℃～4℃保存，一周内有效;
 制备混合标准中间溶液：准确移取混合标准储备溶液100μL，用水定容至100mL，配成每升含氨苄青霉素1.0mg、阿莫西林1.0mg的混合标准中间溶液;
 制备混合标准工作溶液：以混合标准中间溶液配制氨苄青霉素标准使用浓度系列：0.1、1.0、5.0、20.0、50.0μg/L；以混合标准中间溶液配制阿莫西林标准使用浓度系列：1.0、5.0、20.0、50.0、100.0μg/L。此标准工作液临用时现配;
   （2）.抽样   本发明提供的检测方法，从原始样品中任意抽取样品，经高速组织捣碎机捣碎。
四分法缩分出不少于500g样品，混匀，均分成两份。装入清洁容器，加封，标明标记。-18℃以下冷冻保存；
（3）.提取   称取5g样品（精确至0.01g）置于50mL聚丙烯离心管中，加入1.68g磷酸二氢钠，加适量水溶解，定容至500mL制备成提取液30mL，以10000r/min均质3min，再于室温下以3000 r/min离心10min，上清液移入离心管中，残留物用20mL提取液同上法均质、离心所得二次上清液，合并二次上清液于离心管中，加入浓度为750 mg/ml三氯乙酸0.5mL，振摇5min，3000 r/min离心10min，上清液做备用液；
（4）.净化   固相萃取小柱预先依次用5mL甲醇、5mL蒸馏水、加入浓度为200 mg/ml三氯乙酸5mL润洗，将备用液过柱，控制速度在20滴/min，依次用浓度为200 mg/ml三氯乙酸5mL和蒸馏水洗涤，真空抽干，再用5mL乙腈洗脱，真空抽干,收集洗脱液于离心管中；
（5）.衍生   洗脱液在40℃下氮气吹干，加0.5mL水溶解或准确量取0.5mL的标准工作液加入浓度为200 mg/ml三氯乙酸0.1mL和7%甲醛溶液0.1mL,旋涡混匀20s，密封，置于沸水浴中加热30 min。取出,冷却至室温,用20%乙腈水溶液定容至1mL；
（6）.过滤   经0.45μm微孔滤膜过滤，供液相色谱测定。
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