CN101852791B

CN101852791B - 一种离子液体中诺氟沙星分子印迹整体柱的制备方法

Info

Publication number: CN101852791B
Application number: CN2010101784198A
Authority: CN
Inventors: 刘烜; 何佳; 肖亚兵; 郑文杰; 林安清; 孙祥丽
Original assignee: Tianjin Entry Exit Inspection and Quarantine Bureau of Animals Plants and Food Inspection Center
Current assignee: Tianjin Entry Exit Inspection and Quarantine Bureau of Animals Plants and Food Inspection Center
Priority date: 2010-05-21
Filing date: 2010-05-21
Publication date: 2012-08-29
Anticipated expiration: 2030-05-21
Also published as: CN101852791A

Abstract

一种离子液体中诺氟沙星分子印迹整体柱的制备方法。其步骤如下：将模板分子诺氟沙星、功能单体甲基丙烯酸加入到二甲基亚砜和N，N-二甲基甲酰胺的混合溶剂中，超声溶解后加入致孔剂离子液体振荡作用4-6小时后，加入交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯、引发剂偶氮二异丁腈，超声脱气后通氮气除氧，将此溶液注入10cm不锈钢柱，放入60℃水浴中热引发反应12小时得到分子印迹整体柱。将柱子接到高压输液泵上清洗除去致孔剂和模板分子，最后得到具有良好分离效果的印迹整体柱。本发明具有制备简单、避免繁琐的研磨过程、分子识别性能好等特点。所提供的分子印迹整体柱作为一种液相色谱填料，可实现对喹诺酮类抗生素的高效分离、富集和纯化。

Description

一种离子液体中诺氟沙星分子印迹整体柱的制备方法

【技术领域】：本发明属于生物工程技术领域，涉及一种离子液体中分子印迹整体柱的制备，具体的说，是涉及一种对喹诺酮类抗生素具有特异性识别的分子印迹整体柱的制备。

【背景技术】：喹诺酮类(quinolones，QNs)抗菌药是指人工合成的含有4-喹酮母核的一类广谱抗微生物药，目前广泛使用的是第三代产品，如恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星、氧氟沙星。其具有广谱抗菌活性、具有很强的渗透性，用于治疗水产动物由细菌引起的出血性败血症、细菌性烂鳃病、赤鳍病、溃疡等细菌性疾病和动物支原体病。正在以较快的速度和较大的份额占据养殖业的抗感染药物的市场，并且这类抗菌药物在我国还用于畜禽促生长剂。根据喹诺酮类抗菌药药理机制，该药物是极易造成高浓度的组织材料残留的药物，喹诺酮类药物主要威胁来自于耐药性细菌的产生，一旦细菌的耐药性传递给人类，就会出现用抗生素无法控制人类细菌感染性疾病的情况。

由于食用抗菌素污染的食品可引起人群的过敏变态反应，具有潜在致畸致癌和致突变的威胁，污染的食物链形成动物体和人体耐药菌的产生、传递和蔓延已引起了国内外的高度重视。如美国食品药品监督管理局(FDA)通过其网站发布消息，不允许将抗菌剂药物恩诺沙星用于家禽和水产品的细菌感染的治疗；欧共体早在1973年就禁止喹诺酮类抗菌药物作为饲料添加剂；日本于2006年6月开始实施的日本肯定列表规定禽肉中喹诺酮的限量为0.02mg/kg。而我国的现状是广泛用于畜禽疾病的治疗并作为促生长剂长期低剂量添加在饲料中。相形之下，国外的高要求对我国的动物源食品出口是一种严峻的挑战。在检出中国出口的禽肉中抗菌素超标后，欧盟曾要求立即退货，并暂时停止从中国进口该商品。这种措施会造成上亿美元的损失，而且随着“暂时”的时间不断推延，损失势必会越来越严重。

目前对喹诺酮类药物残留的检测的方法有微生物抑制分析法(MIA)、荧光分光光度法、免疫化学测定法等，这些方法只能对喹诺酮药物进行初步评估，不能准确地对各种喹诺酮类药物进行权威的判定，也不能精确地对各种喹诺酮类药物含量进行定量的评价。这些方法已经不能完全满足日益提高的国际标准。为此国家2007年10月制订了《动物源性食品中14种喹诺酮药物残留检测方法液相色谱-质谱/质谱法》(GB/T 21312-2007)。该方法在实施过程中存在的主要问题是我国目前的分析检测限不能达到美国、日本和欧洲一些国家的分析水平。这使得我国在食品中喹诺酮药物残留检测方面在国际上处在非常被动的地位，为动物源性食品顺利出口带来了隐患和困难。因此建立高灵敏、高精度、准确可靠、严格定量的喹诺酮药物残留检测方法是十分必要和急需的。

因此，如何从复杂样品中检测出喹诺酮残留已经成为食品安全检测工作中重要的研究课题，其中样品的前处理是动物源性食品中抗生素残留检测中的关键步骤。固相萃取(solid-phaseextraction，SPE)是近年来迅速发展起来的专门用于样品纯化和浓缩的一项技术，是在许多领域进行样品预处理的标准模式，也是目前抗生素残留检测中样品前处理中的主流技术。其中以分子印迹聚合物作为填料的分子印迹固相萃取技术(molecular imprinting solid-phase extraction，MISPE)以其高度的特异性、选择性和快速简洁的优势，已成为当前国际上最先进最受关注的痕量样品富集和提取方法之一。

分子印迹技术是一种高选择性的仿生识别方法，从分子水平通过空间立体作用和结构匹配性，识别和富集目标分子。分子印迹聚合物以其制备简单、选择性好、性能稳定、价格便宜等诸多优点广泛用于固相萃取及色谱柱填料中。整体柱(monolithic column)是通过有机或无机聚合方法在色谱柱内进行原位聚合的制备的固定相，它是当前国际上色谱柱制备技术的研究热点，具有制备方法简单灵活，功能可调性强，色谱柱渗透性好，分离快速的特点。

分子印迹整体柱(molecular imprinting monolithic column)是分子识别机制和色谱制备技术的有机结合，近年来在合成方法、色谱柱功能性控制和分子识别机理方面有了迅速发展，是国际上分离技术研究的热门课题。与传统的液相提取和固相萃取等样品处理方法相比，分子印迹整体柱萃取技术能够高效、快速地对目标药物分子进行有效的提取，在低丰度药物残留的富集提取方面具有很大潜力。将分子印迹整体柱提取技术与液相色谱-质谱/质谱分析方法的联合使用，是高度选择性提取技术和高度准确检测技术的有机结合，在提高分析平台检测灵敏度和准确性方面具有很大的潜力。这两项技术的联合使用可以建立对食品中喹诺酮药物残留的高灵敏、高精度、准确可靠、严格定量的检测方法，提高我国在这方面的检测水平，达到国际领先水平。

目前该技术主要应用于医学、制药和环境检测，国际上这种技术应用于食品检测的研究不是很多，尚未有将该技术应用于喹诺酮类药物残留的报道。

【发明内容】：本发明的目的是解决大多数喹诺酮类药物残留的常规检测方法往往无法从复杂样品中准确检测到痕量抗生素残留的问题，提供一种具有选择性富集痕量喹诺酮类药物残留的、离子液体中诺氟沙星分子印迹整体柱的制备方法。

本发明提供的离子液体中诺氟沙星分子印迹整体柱的制备方法，包括以下步骤：

第一、将模板分子诺氟沙星、功能单体甲基丙烯酸超声溶解于由二甲基亚砜和N，N-二甲基甲酰胺组成的混合溶剂中，然后加入致孔剂离子液体1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐(1-butyl-3-methylimidazolium tetrafluoroborate，[BMIm]BF₄)混合、超声，静置作用4-6小时形成复合物；

第二、向上步形成的复合物中加入交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯、引发剂偶氮二异丁腈，超声脱气5-10min，通氮气除氧，将混合液注入不锈钢柱封好后热引发聚合反应，引发条件为60℃水浴中反应不低于12小时；

第三、将第二步合成的分子印迹整体柱接到高压输液泵上，清洗除去致孔剂和模板分子，得到诺氟沙星分子印迹整体柱。

所述的模板分子、功能单体、交联剂的物质的量比为1∶6∶30；混合溶剂中二甲基亚砜和N，N-二甲基甲酰胺的体积比为5∶1；致孔剂总用量为功能单体和交联剂总体积的2至5倍。

所述的混合溶剂用量为可溶解模板分子的最小用量，引发剂用量为模板分子、功能单体、混合溶剂、致孔剂、交联剂混合液总质量的1％；

第二步中所述的不锈钢柱，柱长为10cm；

第三步所述的清洗除去致孔剂和模板分子使用的清洗液为甲醇或体积比为94∶6的甲醇/乙酸溶液。

本发明的优点和积极效果：

本发明制备的诺氟沙星分子印迹整体柱与传统本体聚合得到的聚合物相比，具有如下的优点：

1、制备过程简单易行，可避免传统填充柱制作过程中繁琐的研磨过程，在不锈钢柱中原位合成即可作为色谱固定相；

2、离子液体辅助制备，反应更快速均一，且离子液体不易挥发，制得的聚合物形态更好；

3、得到的整体固定相有大孔结构可以保证快的传质速率和较低的背压；

4、分子识别性能好，色谱分离峰形好，柱效高；

5、交叉反应性好，印迹诺氟沙星分子，对其他结构类似的多种喹诺酮类抗生素也有很好的识别性能。

本发明方法步骤简单，得到的印迹聚合物整体柱分子识别性能好，可直接作为新型液相色谱填料用于离线或在线固相萃取前处理，从而达到去除复杂样品中的杂质、选择性富集痕量喹诺酮类药物残留的目的。重要的是可将分子印迹整体柱提取技术与液相色谱-质谱/质谱分析方法联合使用，用高度选择性的提取技术达到提高分析平台检测灵敏度和准确性的目的，从而建立对食品中喹诺酮类药物残留的高灵敏、高精度、准确可靠、严格定量的检测方法。

【附图说明】：

图1-3为不同离子液体用量的分子印迹整体柱MIP2-MIP4的SEM图；

图4为非印迹柱NIP3的SEM图；

图5为普通致孔剂制得的印迹柱MIP6的SEM图。

【具体实施方式】：

实施例1.

首先将模板分子诺氟沙星0.1mmol、功能单体MAA0.6mmol加入二甲基亚砜和N，N-二甲基甲酰胺(5∶1，v/v)的混合溶剂(用量为可溶解模板分子的最小用量1.44ml)中，超声溶解。加入致孔剂(离子液体1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐，1.3ml)，使之相互作用6h以形成复合物，再加入交联剂EDMA3mmol、引发剂AIBN 20mg，溶液经过超声脱气5-10min，通氮气除氧10-20min，然后将此混合液注入到10cm不锈钢柱中，热引发60℃水浴反应12h。将制得的分子印迹整体柱接到高压输液泵上分别用甲醇、甲醇/乙酸(94∶6，v/v)溶液清洗除去致孔剂和模板分子得到聚合物1(MIP1)。

实施例2.

加入致孔剂(离子液体1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐，1.95ml)，其他同实施例1，可得MIP2(见附图1)。

实施例3.

加入致孔剂(离子液体1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐，2.6ml)，其他同实施例1，可得MIP3(见附图2)。

实施例4.

加入致孔剂(离子液体1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐，3.25ml)，其他同实例1，可得MIP4(见附图3)。

为比较离子液体与普通致孔剂的不同作用，做了如下实验：

实施例5.

加入致孔剂2.6ml(癸醇∶十二醇，1∶2，v/v)，其他同实施例1，可得MIP5。

实施例6.

加入致孔剂2.6ml(癸醇∶十二醇，1∶1，v/v)，其他同实施例1，可得MIP6(见附图5)。

实施例7.

加入致孔剂2.6ml(癸醇∶十二醇，2∶1，v/v)，其他同实施例1，可得MIP7。

为比较印迹与非印迹柱的不同，做了如下实验：

实施例8.

不加模板分子诺氟沙星，其他同实施例3，可得NIP3(见附图4)。

通过不同离子液体用量得到的分子印迹整体柱SEM图1-3可以看出，随着离子液体用量的增加(丛图1到图3)，制得的整体柱孔径越大，同时柱压也越小。印迹柱相较于非印迹柱(图4)和用普通致孔剂(图5)制得的印迹柱，其孔径更大、均一性也更好。

为了验证对比所得到的一系列整体柱的选择性能，做了如下实验：

用1.0mL/min甲醇/乙酸(99.95∶0.05，v/v)溶液作为流动相测试MIP1-MIP7对氯霉素(CAP)和诺氟沙星(NOR)的分离效果，结果见表1。

表1聚合过程各物质用量及各整体柱对氯霉素(CAP)和诺氟沙星(NOR)的分离效果

容量因子(k′)由公式k′＝(t_R-t₀)/t₀计算，其中t_R和t₀分别代表诺氟沙星的保留时间及体系的死时间；分离因子(α)由公式α＝k′_NOR/k′_CAP计算，其中k′_NOR和k′_CAP分别是诺氟沙星(NOR)和氯霉素(CAP)的容量因子。

Claims

1.一种离子液体中诺氟沙星分子印迹整体柱的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

第一、将模板分子诺氟沙星、功能单体甲基丙烯酸超声溶解于由二甲基亚砜和N，N-二甲基甲酰胺组成的混合溶剂中，然后加入致孔剂混合、超声，静置作用4-6小时形成复合物，其中，模板分子、功能单体、交联剂的物质的量比为1∶6∶30；混合溶剂中二甲基亚砜和N，N-二甲基甲酰胺的体积比为5∶1；致孔剂为离子液体1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐；致孔剂总用量为功能单体和交联剂总体积的2至5倍；混合溶剂用量为可溶解模板分子的最小用量；

第二、向上步形成的复合物中加入交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯、引发剂偶氮二异丁腈，超声脱气5-10min，通氮气除氧，将混合液注入不锈钢柱封好后热引发聚合反应，引发条件为60℃水浴中反应不低于12小时，引发剂用量为模板分子、功能单体、混合溶剂、致孔剂、交联剂混合液总质量的1％；

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于第三步所述的清洗除去致孔剂和模板分子使用的清洗液为甲醇或体积比为94∶6的甲醇/乙酸溶液。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于第二步中所述的不锈钢柱，柱长为10cm。