CN105510312A - 一种奥利司他的快速检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种奥利司他的快速检测方法，待测样品经提取、洗涤液、与盐酸羟胺溶液和强碱溶液反应萃取、酸化显色步骤，并根据颜色判断是否含有奥利司他。检测方法操作简便、分析成本低，待测样品经预处理后再与检测剂反应，可以排除相关因素的干扰，更有利于对溶液颜色的观察，对样品中是否有奥利司他做出更准确地判断。本发明的检测方法专属性强，通过提取、洗涤、萃取分离除去干扰物质，使显色反应的灵敏度提高、检测结果正确率高、显色反应迅速，现象明显，适用于现场快速检测。
Description
技术领域
本发明属于分析化学检测领域，涉及一种奥利司他的快速检测方法。
背景技术
近年来，随着人们生活水平的提高，饮食结构不合理、缺乏运动等因素引起的肥胖问题日益严重。世界卫生组织数据显示：2014年18岁及以上的成年人中有39%的人超重，13%的人肥胖。肥胖可诱发或加重糖尿病、脂肪肝、心脑血管系统疾病、睡眠呼吸暂停综合症、肌肉骨骼疾患以及某些癌症等，已成为影响人类健康的十大主要威胁之一。
随着人们对减肥的迫切需求，各种减肥产品也日益增多，鱼龙混杂。化学药物快速减肥通常会带来明显的不良反应，而保健品、食品和中成药大部分来源于天然物质，因此具有较高的安全性，在减肥市场中广受消费者青睐，但其存在起效慢或效果不明显的缺点。为谋取高额利益，部分不法分子利用人们急于见效的心理，在其中非法添加具有减肥作用的化学药品，目前常见的有酚酞、西布曲明等，消费者在不知情的情况下长期服用会使健康受到不同程度的危害，严重者甚至可导致死亡。
奥利司他（Orlistat）是目前市场上占有率较高的化学减肥药，1999年被批准上市，是一种强效和长效的特异性胃肠道脂肪酶抑制剂，可阻断饮食中三分之一的脂肪水解和吸收，达到控制体重的作用。目前报道的主要不良反应为便秘、腹痛、腹泻、头晕、月经紊乱、皮疹等，并存在发生肝损害及乳腺癌的风险，还可抑制脂溶性维生素的水解和吸收，另外奥利司他与一些药物之间可发生相互作用，对人体产生不同程度的危害。由于奥利司他减肥快速显著，且便宜易得，具有被非法添加到减肥类保健品、食品和中成药中的风险，因此亟需开发快速、可靠的奥利司他的检测方法，以保障人民群众的饮食用药安全。
目前，对奥利司他检测尤其是作为非法添加的药物的测定方法报道较少，国家药品监督管理局于2006年批准了针对治疗肥胖症的中成药的药品检验补充检验方法只适用于减肥类中成药中非法添加西布曲明、麻黄碱、芬氟拉明的检测，并没有奥利司他非法添加的检测方法。目前报道的奥利司他的检测方法主要为高效液相色谱法和液相色谱-质谱联用法。国内奥利司他及其制剂的含量测定均参考《美国药典》采用高效液相法，在195-210nm的低波长检测，不适用于复杂基质样品的检测；肖松、马微、王柯等分别利用液相色谱-质谱联用的方法进行了减肥保健食品中奥利司他的检测。
上述方法虽然能够达到检测目的，但是设备昂贵，运行费用高，对操作人员的要求也较高，不利于在基层部门广泛开展，人们需要一种操作简单、速度较快、成本较低的检测方法，以便快速鉴别出保健品、食品、中成药中是否添加奥利司他。利用化学反应的快速鉴别法，以其成本低，覆盖面广等优点得到很多人的重视。本发明针对目前市场上的大部分保健品、食品、中成药提供一种准确快速的奥利司他非法添加的检测方法，以满足检验及监管的需要。
发明内容
本发明针对现有技术中存在的上述缺点，提供一种奥利司他的快速检测方法，具有分析成本低、不需要使用贵重分析仪器，专属性强，灵敏度高，检验结果正确率高等优点，适用于减肥类中成药、保健食品和食品中是否添加奥利司他的现场快速检测。
为实现上述目的本发明采取如下技术方案：
一种奥利司他的快速检测方法，步骤为：
1）向待测样品中按体积比1:2加入提取液，振摇2～4min，静置分层3～5min，取上层溶液，然后加入与所取上层溶液等体积的洗涤液，轻摇1～2min，静置分层3～5min，再次取上层溶液；
2）向步骤1）上层溶液中按体积比2:1:1加入盐酸羟胺溶液和强碱溶液，轻摇2～4min，静置分层3～5min，取下层溶液，滴加酸化液调节溶液pH至2～4，然后滴加2～3滴显色液，混匀后，通过溶液颜色判断待测样品是否含有奥利司他。
所述颜色判断的方法为：溶液颜色变酒红色为待测样品中含有奥利司他。
步骤1）中，所述的提取液为非极性有机溶剂，优选石油醚、正己烷和环己烷中的一种或几种混合。
步骤1）中，所述的洗涤液为体积浓度60～80%的低级醇水溶液；所述低级醇为甲醇和乙醇中一种或二者混合，优选体积浓度70%的乙醇水溶液。
步骤2）中，所述的盐酸羟胺溶液为盐酸羟胺-醇-水溶液，其中盐酸羟胺质量分数为3.0～4.0%，优选3.5%，醇体积分数60～80%，优选70%；所述的醇为低级醇，优选甲醇和乙醇中一种或二者混合；所述的盐酸羟胺溶液优选盐酸羟胺-乙醇-水溶液。
步骤2）中，所述的强碱溶液为强碱-醇-水溶液，其中强碱浓度0.5～1.5mol/L，优选1mol/L，醇体积分数60～80%，优选70%；所述的强碱为氢氧化钠和氢氧化钾中一种或二者混合；所述的醇为低级醇，优选甲醇和乙醇中一种或二者混合；所述的强碱溶液优选为氢氧化钠-乙醇-水溶液。
步骤2）中，所述的酸化液为无机酸水溶液，浓度为0.5～1.5mol/L，优选1mol/L，所述的无机酸为盐酸、硫酸和硝酸的一种或几种混合，所述的酸化液优选盐酸的水溶液。
步骤2）中，所述的显色液为三氯化铁-水溶液，质量浓度为6～12%，优选9%。
奥利司他化学名为（3S,4S)-3-己基-4-[(2S)-2-羟基十三烷基]-2-氧杂环丁酮N-甲酰基-L-亮氨酸酯，白色结晶性粉末，不溶于水，易溶于氯仿，极易溶于甲醇和乙醇。化学结构中具有酯键和酰胺键，尤其是不稳定的四元内酯环结构，在碱性条件下易与盐酸羟胺作用生成羟肟酸衍生物，在酸性条件下与高价铁离子发生络合反应，呈色，因此利用羟肟酸铁反应可以快速鉴别奥利司他。但中成药、保健食品和食品中成分复杂，有大量有色物质（如植物色素等），他们中有些能溶于有机溶剂，而有些则可溶于水，如不分离，则会严重干扰快速检测方法的显色反应的观察，难以得出正确的判断结果。
奥利司他在甲醇、乙醇、氯仿、石油醚等有机溶剂中均具有较好的溶解性，但在提取植物色素含量较多或含咖啡成分的样品时，石油醚等非极性溶剂的提取液颜色较甲醇、乙醇等极性溶剂浅，且方便下一步洗涤、萃取等净化，故选择非极性溶剂为提取液可降低植物色素的干扰。根据奥利司他在低级醇水溶液中溶解度低的特点，对提取液用适宜比例低级醇水溶液洗涤，可以预先去除部分色素的干扰。根据奥利司他在碱性条件下与盐酸羟胺反应生成羟肟酸衍生物，极性显著增大，选择适宜比例的低级醇的水溶液可以把羟肟酸衍生物从非极性溶剂中萃取，实现与有色干扰物的分离。萃取液经酸化后，以三氯化铁溶液为显色液时，反应显色明显。
本发明与现有技术相比，有益效果如下：
1）待测样品通过提取、洗涤、与盐酸羟胺溶液和强碱溶液反应萃取、酸化显色四步即可检出样品中是否含有奥利司他，且所用提取液、洗涤液、萃取液、检测剂均为普通的化学试剂，操作简便，分析成本低；
2）待测样品经预处理后再与检测剂反应，可以排除相关因素的的干扰，更有利于对溶液颜色的观察，对样品中是否有奥利司他做出更准确地判断。
3）本发明的检测方法中，所用提取液、洗涤液、萃取液、检测剂的专属性强，通过提取、洗涤、萃取过程中三次利用不同物质溶解性差异分离除去干扰物质，使显色反应的灵敏度提高、检测结果正确率高、显色反应迅速，现象明显，适用于现场快速检测。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步描述本发明，在不脱离本发明上述技术思想情况下，根据本领域普通技术知识和惯用手段做出的各种替换或变更，均包括在本发明的范围内。
本发明快速检测方法验证：
在选择低级醇的水溶液时，本发明考察了以不同浓度的乙醇水溶液为萃取溶剂时，萃取石油醚（60-90℃）中的奥利司他、减肥茶样品中的植物色素、羟肟酸衍生物的萃取率。结果见下表1：
表1不同浓度萃取溶剂的萃取率
实验结果发现：乙醇水溶液浓度与奥利司他、羟肟酸衍生物及植物色素的萃取率正相关，但对羟肟酸衍生物萃取率远大于奥利司他和植物色素。因此，根据羟肟酸衍生物与植物色素的萃取率差异，选择60%～80%的低级醇的水溶液即可实现羟肟酸衍生物的良好萃取，降低约75%植物色素的干扰。进一步的，在前一步骤的洗涤过程中，选择同浓度的低级醇溶液为洗涤液，在减少奥利司损失的基础上，可以去除可溶于该浓度低级醇溶液的植物色素，避免其对下一步萃取显色的干扰。
实施例1：茶剂的检测
试剂配制：提取液为石油醚（60-90℃）；洗涤液为70%（v/v）乙醇水溶液；盐酸羟胺溶液为3.5wt%盐酸羟胺-70%（v/v）乙醇-水溶液；强碱溶液为1mol/L氢氧化钠-70%（v/v）乙醇-水溶液；酸化液为1mol/L盐酸水溶液；显色液为9wt%的三氯化铁水溶液。
样品：半生缘天信减肥茶（茶剂，标示服用量为1袋，LC-MS/MS方法测定本品不含奥利司他。）
检测方法，步骤为：
取上述待测样品1袋，内容物研细，取粉末1g，加入2mL的石油醚（60-90℃），充分振摇3min，静置分层4min，取上层清液2mL，然后加入2mL的70%（v/v）乙醇水溶液，轻摇2min，静置分层4min，取上层清液2mL，然后向所取上层溶液中加入1mL的3.5wt%盐酸羟胺-70%（v/v）乙醇-水溶液和1mL的1mol/L氢氧化钠-70%（v/v）乙醇-水溶液，轻摇3min，静置分层4min，取下层溶液，滴加1mol/L盐酸水溶液，调节溶液pH2～4，滴加3滴9wt%的三氯化铁水溶液，混匀后，观察溶液颜色，溶液颜色呈淡黄色。
结果分析：待测样品溶液颜色呈淡黄色，表明样品中不含有奥利司他，结果与实际相符。
实施例2：胶囊的检测
试剂配制：提取液为正己烷；洗涤液为80%（v/v）乙醇溶液；盐酸羟胺溶液为4.0wt%盐酸羟胺-80%（v/v）乙醇-水溶液；强碱溶液为1.5mol/L氢氧化钠-80%（v/v）乙醇-水溶液；酸化液为1.5mol/L硝酸水溶液；显色液为12wt%的三氯化铁水溶液。
待测样品：舒尔佳奥利司他胶囊（胶囊剂，标示服用剂量为1粒，LC-MS/MS方法测定本品含奥利司他。）
检测方法，步骤为：
取上述待测样品粉末0.5g，加入1mL的正己烷，充分振摇4min，静置分层5min，取上层清液，然后加入1mL的80%（v/v）乙醇溶液，轻摇2min，静置分层5min，取上层清液，向所取上层溶液中加入0.5mL的4.0wt%盐酸羟胺-80%（v/v）乙醇-水溶液和0.5mL的1.5mol/L氢氧化钾-80%（v/v）乙醇-水溶液，轻摇4min，静置分层5min，取下层溶液，滴加1.5mol/L硝酸水溶液，调节溶液pH2～4，滴加3滴9wt%的三氯化铁水溶液，混匀后，静置分层5min，观察溶液颜色，溶液颜色呈酒红色。
结果分析：待测样品溶液颜色呈酒红色，表明样品中含有奥利司他，结果与实际相符。实施例3：片剂的检测
试剂配制：提取液为环己烷；洗涤液为60%（v/v）甲醇水溶液；盐酸羟胺溶液为3.0wt%盐酸羟胺-60%（v/v）乙醇-水溶液；强碱溶液为0.5mol/L的氢氧化钠-70%（v/v）乙醇-水溶液；酸化液为0.5mol/L硫酸水溶液；显色液为6wt%的三氯化铁水溶液。
待测样品：秀妹尔减肥泡腾片（片剂,标示服用剂量为1片，LC-MS/MS方法测定本品不含奥利司他。）
检测方法，步骤为：
取上述待测样品粉末0.5g，加入1mL的环己烷，充分振摇2min，静置分层3min，取上层清液，然后加入1mL的60%（v/v）甲醇水溶液，轻摇1min，静置分层3min，取上层清液，向所取上层溶液中加入3.0wt%盐酸羟胺-60%（v/v）乙醇-水溶液和0.5mL的0.5mol/L的氢氧化钠-70%（v/v）乙醇-水溶液，轻摇2min，静置分层3min，取下层溶液滴加0.5mol/L硫酸水溶液，调节溶液pH2～4，滴加3滴6wt%的三氯化铁水溶液，混匀后，静置分层3min，观察溶液颜色，溶液颜色呈微黄色。
结果分析：待测样品溶液颜色呈微黄色，表明样品中不含有奥利司他，结果与实际相符。
实施例4咖啡冲剂类的检测
试剂配制：提取液为石油醚（60-90℃）；洗涤液为70%（v/v）乙醇水溶液；盐酸羟胺溶液为3.5wt%盐酸羟胺-70%（v/v）乙醇-水溶液；强碱溶液为1mol/L氢氧化钠-70%（v/v）乙醇-水溶液；酸化液为1mol/L盐酸水溶液；显色液为9wt%的三氯化铁水溶液。
待测样品：苗伊秀减肥颗粒（咖啡型）（颗粒剂，标示服用剂量为1袋，LC-MS/MS方法测定本品不含奥利司他。）
检测方法，步骤为：
取上述待测样品1袋，内容物研细，取粉末1g，加入2mL的石油醚（60-90℃），充分振摇3min，静置分层2min，取上层清液2mL，然后加入2mL的70%（v/v）乙醇水溶液，轻摇2min，静置分层4min，取上层清液2mL，然后向所取上层溶液中加入0.5mL的3.5wt%盐酸羟胺-70%（v/v）乙醇-水溶液和0.5mL的1mol/L氢氧化钠-70%（v/v）乙醇-水溶液，轻摇3min，静置分层4min，取下层溶液，滴加1mol/L盐酸水溶液，调节溶液pH2～4，滴加2滴9wt%的三氯化铁水溶液，混匀后，静置分层4min，观察溶液颜色，溶液颜色呈淡黄色。
结果分析：待测样品溶液颜色呈淡黄色，表明样品中不含有奥利司他，结果与实际相符。
实施例5：药品、保健品和食品中是否存在奥利司他的实验
采用实施例1的方法检测10批市售样品（标示为药品、保健品、食品）。并采用LC-MS/MS与检测结果比对，结果如表2：
表2样品检测结果对比
上述实验结果与二级质谱验证结果表明，该发明检测方法无一例假阳性报告，同时也未漏检任何含奥利司他的样品，结果准确可靠。
按本发明方法所述的取样量取上述奥利司他检测呈阴性反应的8个样品，分别掺入奥利司他对照品10mg，按照本发明方法进行实验，结果均呈阳性反应，表明本方法有良好的抗干扰能力，专属性强，有良好的准确性。
Claims (9)
1.一种奥利司他的快速检测方法，其特征在于，步骤为：
1）向待测样品中按体积比1:2加入提取液，振摇2～4min，静置分层3～5min，取上层溶液，然后加入与所取上层溶液等体积的洗涤液，轻摇1～2min，静置分层3～5min，再次取上层溶液；
2）向步骤1）上层溶液中按体积比2:1:1加入盐酸羟胺溶液和强碱溶液，轻摇2～4min，静置分层3～5min，取下层溶液，滴加酸化液调节溶液pH至2～4，然后滴加2～3滴显色液，混匀后，通过溶液颜色判断待测样品是否含有奥利司他；
所述颜色判断的方法为：溶液颜色变酒红色为待测样品中含有奥利司他。
2.根据权利要求1所述的快速检测方法，其特征在于：步骤1）中，所述的提取液为非极性有机溶剂。
3.根据权利要求2所述的快速检测方法，其特征在于：所述的提取液为石油醚、正己烷和环己烷中的一种或几种混合。
4.根据权利要求1所述的快速检测方法，其特征在于：步骤1）中，所述的洗涤液为体积浓度60～80%的低级醇水溶液；所述低级醇为甲醇和乙醇中一种或二者混合。
5.据权利要求4所述的快速检测方法，其特征在于：所述的洗涤液为体积浓度70%的乙醇水溶液。
6.根据权利要求1所述的快速检测方法，其特征在于：步骤2）中所述的盐酸羟胺溶液为盐酸羟胺-醇-水溶液，其中盐酸羟胺质量分数为3.0～4.0%，醇体积分数60～80%，所述的醇为低级醇；所述的强碱溶液为强碱-醇-水溶液，其中强碱浓度0.5～1.5mol/L，醇体积分数60～80%；所述的强碱为氢氧化钠和氢氧化钾中一种或二者混合；所述的醇为低级醇。
7.根据权利要求6所述的快速检测方法，其特征在于：所述的盐酸羟胺溶液中盐酸羟胺质量分数为3.5%，醇体积分数70%；所述的低级醇为甲醇和乙醇中一种或二者混合；所述的盐酸羟胺溶液为盐酸羟胺-乙醇-水溶液；所述的强碱溶液中强碱为1mol/L，醇体积分数为70%；所述的低级醇为甲醇和乙醇中一种或二者混合；所述的强碱溶液为氢氧化钠-乙醇-水溶液。
8.根据权利要求1所述的快速检测方法，其特征在于：步骤2）中，所述的酸化液为无机酸的水溶液，浓度为0.5～1.5mol/L，所述的无机酸为盐酸、硫酸和硝酸的一种或几种混合；所述的显色液为三氯化铁-水溶液，质量浓度为6～12%。
9.根据权利要求8所述的快速检测方法，其特征在于：所述的酸化液浓度为1mol/L，低级醇的体积分数为70%；所述的酸化液为盐酸的乙醇水溶液；所述的三氯化铁-水溶液，质量浓度为9%。
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