CN105044247A - 一种兽药中氯霉素药物残留的检测方法 - Google Patents

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王连民
刘珂飞
门婷婷
崔贞
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Abstract

本发明提供了一种兽药中氯霉素药物残留的检测方法，用液相色谱-串联质谱法测定兽药中的氯霉素药物残留，该方法样品前处理时省去了净化过程，具有处理程序简单，快速，测定准确率高等特点；从兽药源头进行分析，有效保障养殖业用药安全，提高动物食品安全。

Description

一种兽药中氯霉素药物残留的检测方法
技术领域
本发明涉及分析化学技术领域，尤其是一种兽药中氯霉素药物残留的检测方法。
背景技术
氯霉素是对革兰氏阳性、阴性细菌均有抑制作用的广谱抗生素，1947年首次从链丝菌的培养液中提取而得到的抗生素。因其效价高，价格低廉，曾经在我国畜牧业中得到广泛应用，成为畜禽疾病防治的重要药物。随着氯霉素应用的增加，人们逐渐发现其对人类有很大的毒、副作用，可引起再生性障碍性贫血和其他恶性血液病。而且，长期微量摄入氯霉素不仅使沙门氏菌、大肠杆菌产生耐药性，而且还会引起机体正常菌群失调，使人类易患各种疾病。氯霉素在动物体内的残留，通过肉、蛋、奶等传递给人类，在不知不觉中使人体受害。2002年农业部发布第193号公告将氯霉素及其盐、酯列入食品动物禁用兽药名单。
氯霉素残留问题已引起世界各国各地区的广泛关注，成为众人关注的焦点。国内外学者一直十分关注氯霉素残留检测技术，建立起众多氯霉素残留检测方法，主要有微生物学方法、免疫分析方法以及色谱分析方法等。然而,现有的检测方法和标准中绝大部分都只针对动物源性食品，鲜有从兽药源头进行分析的。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种兽药中氯霉素药物残留的检测方法。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
一种兽药中氯霉素药物残留的检测方法，用液相色谱-串联质谱法测定兽药中的氯霉素药物残留，具体步骤如下：
(1)标准工作液和样品溶液在设定的液相色谱-串联质谱条件下进样，以质量浓度X为横坐标，峰面积的比值Y为纵坐标，绘制5点标准工作曲线，用标准工作曲线对样品进行定量，样品溶液中药物的响应值应在仪器检测的线性范围内，其中，所设定的液相色谱-串联质谱条件如下：
①液相色谱条件
色谱柱：HypersilGoldC18,100mm×2.1mm,1.9μm
流动相：水/乙腈；流速：0.3mL/min柱温：35℃进样量10μL液相梯度条件
②质谱条件
(2)在上述色谱条件下，判断样品中是否存在相应的被测物，需要满足如下条件：样品溶液中出现的质量色谱峰保留时间与混合基质标准工作液一致，允许偏差小于±2.5％，该色谱峰所对应的药物在设定质谱定性离子的相对丰度与浓度相当的基质标准工作液的相对离子丰度一致，相对丰度偏差不超过设定的规定，则可确定含有该药物。
优选的，上述兽药中氯霉素药物残留的检测方法，所述样品溶液的制备方法，试样首先通过水溶过滤，乙酸乙酯两步提取，氮吹复溶后过0.22μm微孔滤膜，复溶用甲醇试剂为色谱纯试剂。
优选的，上述兽药中氯霉素药物残留的检测方法，所述样品溶液的制备方法，具体步骤如下：
(1)准确称取1g试样，精确到0.01g，置于50mL聚苯乙烯离心管中，加3mL水，涡动至水饱和状态，离心力4000g-6000g，室温(20-25℃)条件下离心10min，水溶液过0.22μm滤膜转移至另一50mL聚苯乙烯离心管中，加入3mL乙酸乙酯，室温(25±2℃)条件下摇床300rpm振摇10min，离心力4000g-6000g，室温(20-25℃)条件下离心10min，取出上清液取至10mL干净的离心管中；
(2)残渣继续用3mL乙酸乙酯重复提取，合并两次提取液，55℃氮吹至干，以2mL甲醇复溶，溶液过0.22μm微孔滤膜，即可供液相色谱-串联质谱仪测定。
本发明的有益效果是：
上述兽药中氯霉素药物残留的检测方法，用液相色谱-串联质谱法测定兽药中的氯霉素药物残留，该方法样品前处理时省去了净化过程，具有处理程序简单，快速，测定准确率高等特点；从兽药源头进行分析，有效保障养殖业用药安全，提高动物食品安全。
附图说明
图1为兽药阴性样品检测氯霉素总离子流图；
图2为兽药样品添加氯霉素后总离子流图(药物浓度为5μg/kg)；
图3为氯霉素子离子全扫描质谱图；
图4为氯霉素的结构图和UPLC-MS/MS可能的裂解图。
具体实施方式
为了使本领域的技术人员更好的理解本发明的技术方案，下面结合具体实施方式对本发明所述技术方案作进一步的详细说明。
实施例1
一、提取
选取4种不同的兽药样品做3种不同浓度的添加回收实验进行方法验证，兽药中待测药物的提取溶剂，分别采用乙腈，甲醇和乙酸乙酯，3种试剂进行提取条件的选择。实验结果表明，对于兽药中的氯霉素残留，乙酸乙酯的提取效率好于另外两种试剂。
具体操作：准确称取1g试样，精确到0.01g，置于50mL聚苯乙烯离心管中，加3mL水，涡动至水饱和状态，离心力5000g(4000g-6000g范围内均可)，室温(20-25℃)离心10min，水溶液过0.22μm滤膜转移至另一50mL聚苯乙烯离心管中，加入3mL乙酸乙酯，室温(25±2℃)下，摇床300rpm振摇10min，离心力5000g(4000g-6000g范围内均可)，室温(20-25℃)离心10min。取出上清液取至10mL干净的离心管中。残渣继续用3mL乙酸乙酯重复提取，合并两次提取液。55℃氮吹至干，以2mL甲醇复溶，溶液过0.22μm微孔滤膜，供液相色谱-串联质谱仪测定。
二、测定
本实验定量方法为外标法定量。从冰箱中取出氯霉素100ng/mL标准工作液，恢复至室温后用甲醇做溶剂配制浓度分别为0.1ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL的氯霉素标准溶液，每一浓度平行进样3针，按其所得峰面积比值平均数Y为纵坐标，相应的标准品浓度X为横坐标绘制标准曲线。根据试样中被测物的药物含量，选取响应值相近的氯霉素标准工作液同时进行分析。氯霉素标准工作液和待测液中药物的响应值均应在仪器线性响应范围内。如果含量超过标准曲线范围，应用基质空白溶液(甲醇)稀释到合适浓度后分析。
具体检测参数如下：
①液相色谱条件
色谱柱：HypersilGoldC18,100mm×2.1mm,1.9μm
流动相：水/乙腈；流速：0.3mL/min柱温：35℃进样量10μL液相梯度条件
②质谱条件
在上述色谱条件下，判断样品中是否存在相应的被测物，需要满足如下条件：样品溶液中出现的质量色谱峰保留时间与混合基质标准工作液一致，允许偏差小于±2.5％，该色谱峰所对应的药物在设定质谱定性离子的相对丰度与浓度相当的基质标准工作液的相对离子丰度一致，相对丰度偏差不超过设定的规定，则可确定含有该药物(如图1-图2所示)。
三、具体实施案例结果
本实验共选取4种兽药进行氯霉素做添加回收试验，具体回收率和精密度结果如下表：
综上可见，本发明采用液相色谱-串联质谱法测定兽药中的氯霉素药物残留，样品首先通过水溶过滤，乙酸乙酯两步提取，氮吹复溶后过微孔滤膜，然后用液相色谱-串联质谱法进行测定，外表法定量，回收率为77％～95.2％；相对标准偏差小于10％。在样品提取和LC-MS/MS检测时，对样品提取液和检测条件都进行了优化处理，氯霉素分子式为C11H12O5N2Cl2,分子质量为322.0，以m/z321.0为母离子，子离子分别为m/z151.8、256.7(如图3、图4所示)。本发明的检测方法样品处理程序简单、快速，省去了样品净化过程，降低了检测成本，并且可快速准确的测定出兽药中残留的氯霉素。方法测定氯霉素底限为1μg/kg，完全满足药物残留检测的要求。
上述参照具体实施方式对该一种兽药中氯霉素药物残留的检测方法进行的详细描述，是说明性的而不是限定性的，可按照所限定范围列举出若干个实施例，因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种兽药中氯霉素药物残留的检测方法，其特征在于：用液相色谱-串联质谱法测定兽药中的氯霉素药物残留，具体步骤如下：
(1)标准工作液和样品溶液在设定的液相色谱-串联质谱条件下进样，以质量浓度X为横坐标，峰面积的比值Y为纵坐标，绘制5点标准工作曲线，用标准工作曲线对样品进行定量，样品溶液中药物的响应值应在仪器检测的线性范围内，其中，所设定的液相色谱-串联质谱条件如下：
①液相色谱条件
色谱柱：HypersilGoldC18,100mm×2.1mm,1.9μm
流动相：水/乙腈；流速：0.3mL/min柱温：35℃进样量10μL液相梯度条件
②质谱条件
(2)在上述色谱条件下，判断样品中是否存在相应的被测物，需要满足如下条件：样品溶液中出现的质量色谱峰保留时间与混合基质标准工作液一致，允许偏差小于±2.5％，该色谱峰所对应的药物在设定质谱定性离子的相对丰度与浓度相当的基质标准工作液的相对离子丰度一致，相对丰度偏差不超过设定的规定，则可确定含有该药物。
2.根据权利要求1所述的兽药中氯霉素药物残留的检测方法，其特征在于：所述样品溶液的制备方法为试样首先通过水溶过滤，乙酸乙酯两步提取，氮吹复溶后过0.22μm微孔滤膜，复溶用甲醇试剂为色谱纯试剂。
3.根据权利要求2所述的兽药中氯霉素药物残留的检测方法，其特征在于：所述样品溶液的制备方法，具体步骤如下：
(1)准确称取1g试样，精确到0.01g，置于50mL聚苯乙烯离心管中，加3mL水，涡动至水饱和状态，离心力4000g-6000g，室温条件下离心10min，水溶液过0.22μm滤膜转移至另一50mL聚苯乙烯离心管中，加入3mL乙酸乙酯，室温条件下摇床300rpm振摇10min，离心力4000g-6000g，室温条件下离心10min，取出上清液取至10mL干净的离心管中；
(2)残渣继续用3mL乙酸乙酯重复提取，合并两次提取液，55℃氮吹至干，以2mL甲醇复溶，溶液过0.22μm微孔滤膜，即可供液相色谱-串联质谱仪测定。
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