CN107202839A - 一种兽药制剂中122种非处方药物的筛查方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种兽药制剂中122种非处方药物的筛查方法，具体包括以下步骤：标准工作溶液的配制、待测样品的分析前处理、数据库的建立和定性分析等，本发明搭建的高通量筛查和定性的检测平台，使得在本领域内从检测单一化合物向同时检测多种化合物的方向发展，与原有的技术相比，检测一种物质中多种化合物的技术手段更加完善，成本降低了很多，极大提高了工作效率。该方法在农业部实施的兽药非法添加及细菌耐药性计划中发挥了重要的作用。在我国省级畜产品质量检测中心进行样品检测，据不完全统计，推广应用样品数量共计万余份。

Description

一种兽药制剂中122种非处方药物的筛查方法
技术领域
本发明属于兽药检测技术领域，具体涉及一种兽药制剂中122种非处方成分的筛查方法。
背景技术
兽药是指用于预防、治疗、诊断动物疾病或者有目的地调节动物生理机能的物质(含药物饲料添加剂)，主要包括：血清制品、疫苗、诊断制品、微生态制品、中药材、中成药、化学药品、抗生素、生化药品、放射性药品及外用杀虫剂、消毒剂等。随着我国城镇居民和农村居民人均可支配收入水平的不断提高，肉类消费的巨大需求拉动我国经济动物规模逐年扩大，这直接推动兽药需求的不断增长。以我国GDP、畜牧业生产总值和我国兽药消费总额来分别衡量我国宏观经济的发展情况、我国经济动物的养殖规模和我国兽药行业的需求量，不难发现，在2010年至2015年之间，这三大指标的增长率间存在十分明显的正相关性。随着我国畜牧业产值及其占农业总产值比例的稳步提升，我国兽药行业也进入了快速发展的上升通道。随着现代养殖技术的迅速发展，兽药是现代养殖业不可或缺的物质基础，其具有预防动物疾病、促进动物生长、提高饲料效率、改善畜产品品质、调节养殖生产、保护生态环境等多方面作用，对养殖业起到保障生产、降低成本、增加产量、改善质量，提高社会和生态效益的功效。但是，目前在兽药行业中，不按规定处方生产，在兽药中添加非处方成份的现象较为普遍，直接影响到兽药的安全使用，增加动物性食品中药物残留的风险而且，引起细菌耐药性的增加，对人体健康造成潜在危害。
近年来，一些兽药生产企业违规在兽药产品中非法添加化学药物，使兽药能达到快速有效的结果，从而提高销量来获得更大的利润。兽药非法添加行为带来了药物超量使用的中毒风险和药物残留隐患，通过食物链传递，造成食品安全隐患，给人类健康造成严重的危害。人类长期摄入含兽药的动物原性食品后，药物不断在人体内蓄积，就会对人体产生毒性作用。在临床诊治实践中，不断发现乱用兽药给人的身体健康、养殖安全、经济效益、社会效益等带来了巨大负面影响的情况，使得消费者不敢吃，不愿吃，不想吃动物食品。因此必须采取有效措施，控制兽药产品的质量，制定出兽药中风险物质的检测方法，为监测提供可靠的技术手段尤为必要。
目前，针对兽药中是否添加抗菌药物检测手段中，最常用的有普通高效液相色谱仪和液相色谱-质谱联用法。然而普通液相色谱法由于分离效率低、分析时间长等缺点，无法实现高通量、同时检测多种抗菌药物的目的。液相色谱-质谱联用法虽然可以做到高通量定性鉴别，但是质谱仪造价昂贵，且兽药制剂中非法抗菌药物的浓度较高，远超过质谱检测器的线性范围，也限制了该方法的推广应用。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供一种兽药制剂中122种非处方成分的筛查方法，为兽用药品中添加多种抗菌药物提供了一种完整的检测方法，填充了国家兽用药品的检测方法，增添了兽药中多种抗菌药物筛查技术手段，为国家畜牧行业及食品安全提供了安全保障。
本发明的目的是以下述技术方案实现的：
一种兽药制剂中122种非处方药物的筛查方法，具体包括以下步骤：
所述122种非处方药物为：
(a)磺胺类：磺胺间甲氧嘧啶、磺胺甲噁唑、磺胺间二甲氧嘧啶、磺胺喹噁啉、磺胺氯吡嗪、磺胺二甲嘧啶、磺胺氯哒嗪、磺胺吡啶、磺胺甲氧嗪、磺胺邻二甲氧嘧啶、磺胺嘧啶、磺胺甲嘧啶、磺胺异噁唑、苯酰磺胺、磺胺硝苯、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺噻唑、甲氧苄啶、磺胺二甲唑、磺胺甲噻二唑、磺胺二甲异嘧啶；
(b)β-内酰胺类：氨苄西林、苯唑西林、氟氯西林、头孢噻肟、头孢噻呋、青霉素G；
(c)四环素类：土霉素、四环素、金霉素、多西环素；
(d)酰胺醇类：氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考；
(e)大环内酯类：泰乐菌素、替米考星、泰妙菌素、阿奇霉素、克拉霉素、红霉素、罗红霉素、吉他霉素A5；
(f)林可胺类：林可霉素、克林霉素；
(g)氟喹诺酮类：恩诺沙星、环丙沙星、沙拉沙星、二氟沙星、那氟沙星、司帕沙星、诺氟沙星、恶喹酸、培氟沙星、奥比沙星、氟甲喹、萘啶酸、洛美沙星、氧氟沙星、氟罗沙星；
(h)喹噁啉类：喹烯酮、卡巴氧、乙酰甲喹、喹乙醇；
(i)硝基呋喃类：呋喃唑酮、呋喃它酮；
(j)硝基咪唑类：奥硝唑、地美硝唑、异丙硝唑、塞克硝唑、甲硝唑；
(k)抗球虫类：氯苯胍、氯羟吡啶；
(l)苯并咪唑类：苯硫胍、氟苯达唑、阿苯达唑、芬苯哒唑、奥苯达唑、奥芬哒唑、噻苯达唑、阿苯达唑砜、甲苯达唑；
(m)β-受体激动剂：克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇、氯丙那林、拉贝特罗、班布特罗、喷布特罗、溴布特罗；
(n)镇静剂类：氯丙嗪、氟哌利多、氟哌啶醇、阿扎哌隆、异丙嗪、赛拉嗪、硝西泮、地西泮、奋乃近；
(o)抗病毒类：金刚烷胺、金刚乙胺、泛昔洛韦；
(p)解热镇痛类：对乙酰氨基酚、安乃近；
(q)糖皮质激素类：地塞米松、氢化可的松；
(r)抗胆碱类：氨茶碱、二羟丙茶碱；
(s)其他：阿托品；
(1)标准工作溶液的配制：
准确称取各标准品10mg，于10mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，配制成1mg/mL各标准贮备液；对于难溶药物，恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星加入少量0.1mol/L HCl溶液，洛美沙星加入少量0.1mol/L NaOH溶液，头孢喹肟、喹乙醇和喹烯酮加适量二甲基亚砜使其溶解后，用甲醇定至刻度；
量取各标准贮备液1.0mL于100mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，配制成浓度为10μg/mL混合标准中间工作溶液；
量取各混合标准中间工作液0.1mL，用乙腈+水(V/V＝50/50)混合液稀释，制成1μg/mL混合标准工作液；
(2)待测样品的分析前处理：
1)粉/散/预混剂：称取2±0.02g试样于50mL聚丙烯离心管中，加入20mL提取液，旋涡0.5min，超声10min，离心10min，取上清液，用稀释液稀释，过0.22μm微孔尼龙滤膜；
2)注射液/溶液：移取2±0.02ml试样至10ml容量瓶，用提取液定容，超声10min，用稀释液稀释，过0.22μm微孔尼龙滤膜；
3)注射用粉针：取试样1支，加注射用水溶解，振摇，用稀释液稀释，过0.22μm微孔尼龙滤膜；
(3)数据库的建立：确定122种非处方药物的分子式和精确分子量，将非处方成分的混合标准工作液进行液相色谱-串联质谱测定，得到混合标准工作液的总离子流图，再把每种药物的离子色谱图提取出来，确定每种药物的保留时间；
将药物的分子量和保留时间输入MSMS分析系统，对混合标准工作液进行MSMS分析，得到各药物的子离子扫描质谱图，并根据各药物的碎片的断裂机理和断裂难度，确定各药物的特征碎片离子；
将各药物的种类、名称、分子式、保留时间和特征碎片离子信息汇总，建立122中非处方药物筛查数据库，如下表所示：
表1数据库
(4)定性分析：
1)对经过步骤(2)所述方法处理的待测样品进行液相色谱-串联质谱分析，将得到的结果与数据库中的数据进行比较，空白溶剂不能出现与标准溶液相同的离子峰，试样的母离子及特征碎片离子的精确质量数应与标准溶液的一致，偏差均应≤0.05Da，试样色谱峰的保留时间，应与标准溶液的保留时间一致，容许偏差为±0.2min，母离子与碎片离子色谱峰的信噪比(S/N)都在3:1以上，信噪比以峰对峰(PtP)计算，全扫描光谱记录时，试样中特征碎片离子的相对丰度必须超过标准溶液参照的特征离子光谱丰度的10％，筛选出满足定性条件的药物，即为疑似阳性样品；
2)对于疑似阳性样品，根据药物的保留时间和分子量编辑MS/MS方法，并采集数据，所得到的疑似物质的子离子扫描质谱图，与标准溶液的子离子扫描质谱图进行比较，在相同的条件和相近的浓度下，试样中主要碎片离子相对丰度与标准溶液的相对丰度的允许偏差不超过下表规定的范围，则可判定为样品中存在对应的待测物：
表2主要碎片离子相对丰度与标准溶液的相对丰度的允许偏差
所述步骤(3)和步骤(4)中的液相色谱分析条件为：色谱柱：Waters UPLCTM BEHC18，2.1mm×100mm，1.7μm；有机相比例从初始的2％缓慢变化到95％，以保证所有药物都能有效检出，梯度洗脱程序见下表：
表3色谱梯度洗脱程序
注：ESI+：A：0.1％甲酸溶液；B：乙腈，梯度洗脱；
ESI-：A：水；B：乙腈，梯度洗脱；
1为即时变化，6为线性变化。
所述步骤(3)中的质谱分析条件如下表所示：
表4离子源参数
表5筛查质谱方法参数
注：亮氨酸脑啡肽实时在线分子量校正，分子量为556.2771(ESI+)/554.2615(ESI-)，扫描时间0.5s，扫描间隔10s。
所述步骤(1)中乙腈和水的混合液中的乙腈和水的体积比为1:1。
所述步骤(2)中的提取液为乙腈、甲醇和水混合溶液，乙腈、甲醇和水的体积比为1:1:2。
所述步骤(2)中的稀释液为乙腈和水混合液，乙腈和水的体积比为1:1。
还包括对122种非处方药物的检测限的测定，测定方法为：对于散剂和预混剂，通过添加10μg/mL标准溶液100μL，经提取后测定，根据各药物的信噪比S/N＞3，最终确定各药物的检测限为0.5mg/kg。
相对于现有技术，本发明搭建的高通量筛查和定性的检测平台，使得在本领域内从检测单一化合物向同时检测多种化合物的方向发展，与原有的技术相比，检测一种物质中多种化合物的技术手段更加完善，成本降低了很多，极大提高了工作效率。该方法在农业部实施的兽药非法添加及细菌耐药性计划中发挥了重要的作用。在我国省级畜产品质量检测中心进行样品检测，据不完全统计，推广应用样品数量共计万余份。从实验成本来说，使用高通量筛查方法，大大降低了检测成本，缩短了近一半的时间，经济效益每年可节省1000余万元，在食品安全和人类健康方面有不可估量的效益。本发明应用为我国兽药产品的质量安全提供了安全保障；为我国畜产品进入国际市场，冲破“绿色贸易壁垒”的限制提供保障；提高我国在国际贸易中的竞争地位，保证我国农产品的安全出口，增加外汇收入，创造良好的经济效益；同时对保证食品生产行业的健康发展，促进经济的持续发展，维护社会稳定，产生巨大社会效益。
本发明所述的兽药筛查方法具有高灵敏度和高准确性，在复杂多样的样品中能够获取准确的化合物信息，专属性高，实现“一针多参数”的检测，检测效率高。
附图说明
图1是混合标准工作液的总离子流图(ESI+)。
图2是芬苯达唑的母离子提取离子色谱图(ESI+)。
图3是芬苯达唑二级碎片离子质谱图。
图4是甲氧苄啶标准溶液特征碎片离子提取色谱图。
图5是甲氧苄啶标准溶液母离子提取色谱图。
图6是供试品1中甲氧苄啶特征碎片离子提取色谱图。
图7是供试品1中甲氧苄啶母离子提取色谱图。
图8是供试品1中甲氧苄啶二级碎片离子质谱图。
图9是空白溶剂中甲氧苄啶的二级碎片离子质谱图。
图10是甲氧苄啶标准溶液二级碎片离子质谱图。
图11是对乙酰氨基酚标准溶液特征碎片离子提取色谱图。
图12是对乙酰氨基酚标准溶液母离子提取色谱图。
图13是供试品1中对乙酰氨基酚特征碎片离子提取色谱图。
图14是供试品1中对乙酰氨基酚母离子提取色谱图。
图15是供试品1中对乙酰氨基酚二级碎片离子质谱图。
图16是空白溶剂中对乙酰氨基酚的二级碎片离子质谱图。
图17是对乙酰氨基酚标准溶液二级碎片离子质谱图。
图18是乙酰甲喹标准溶液特征碎片离子提取色谱图。
图19是乙酰甲喹标准溶液母离子提取色谱图。
图20是供试品2中乙酰甲喹特征碎片离子提取色谱图。
图21是供试品2中乙酰甲喹母离子提取色谱图。
图22是供试品2中乙酰甲喹二级碎片离子质谱图。
图23是空白溶剂中乙酰甲喹的二级碎片离子质谱图。
图24是乙酰甲喹标准溶液二级碎片离子质谱图。
图25是林可霉素标准溶液母离子提取色谱图。
图26是林可霉素标准溶液特征碎片离子提取色谱图。
图27是供试品3中林可霉素母离子提取色谱图。
图28是供试品3中林可霉素特征碎片离子提取色谱图。
图29是供试品3中林可霉素二级碎片离子质谱图。
图30是空白溶剂中林可霉素二级碎片离子质谱图。
图31是林可霉素标准溶液二级碎片离子质谱图。
具体实施方式
所检122种非处方药物为：
(a)磺胺类(21种)：磺胺间甲氧嘧啶、磺胺甲噁唑、磺胺间二甲氧嘧啶、磺胺喹噁啉、磺胺氯吡嗪、磺胺二甲嘧啶、磺胺氯哒嗪、磺胺吡啶、磺胺甲氧嗪、磺胺邻二甲氧嘧啶、磺胺嘧啶、磺胺甲嘧啶、磺胺异噁唑、苯酰磺胺、磺胺硝苯、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺噻唑、甲氧苄啶(增效剂)、磺胺二甲唑(中间体)、磺胺甲噻二唑(中间体)、磺胺二甲异嘧啶(中间体)；磺胺异噁唑为人用药物；
(b)β-内酰胺类(6种)：氨苄西林、苯唑西林、氟氯西林、头孢噻肟、头孢噻呋、青霉素G；
(c)四环素类(4种)：土霉素、四环素、金霉素、多西环素；
(d)酰胺醇类(3种)：氯霉素(人用药物，兽药禁用)、甲砜霉素、氟苯尼考；
(e)大环内酯类(8种)：泰乐菌素、替米考星、泰妙菌素、阿奇霉素、克拉霉素、红霉素、罗红霉素、吉他霉素A5；阿奇霉素、克拉霉素、罗红霉素为人用药物；
(f)林可胺类(2种)：林可霉素、克林霉素(人用)；
(g)氟喹诺酮类(15种)：恩诺沙星、环丙沙星、沙拉沙星、二氟沙星、那氟沙星、司帕沙星、诺氟沙星、恶喹酸、培氟沙星、奥比沙星、氟甲喹、萘啶酸、洛美沙星、氧氟沙星、氟罗沙星；那氟沙星、司帕沙星、奥比沙星、氟罗沙星为人用药物；
(h)喹噁啉类(4种)：喹烯酮、卡巴氧、乙酰甲喹、喹乙醇；
(i)硝基呋喃类(2种)：呋喃唑酮、呋喃它酮，均为兽药禁用；
(j)硝基咪唑类(5种)：奥硝唑、地美硝唑、异丙硝唑、塞克硝唑、甲硝唑；奥硝唑、异丙硝唑、塞克硝唑、甲硝唑为人用药物；
(k)抗球虫类(2种)：氯苯胍、氯羟吡啶；
(l)苯并咪唑类(9种)：苯硫胍、氟苯达唑、阿苯达唑、芬苯哒唑、奥苯达唑、奥芬哒唑、噻苯达唑、阿苯达唑砜、甲苯达唑；
(m)β-受体激动剂(8种)：克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇、氯丙那林、拉贝特罗、班布特罗、喷布特罗、溴布特罗；克伦特罗、沙丁胺醇、氯丙那林、拉贝特罗、班布特罗、喷布特罗、溴布特罗为人用药物；
(n)镇静剂类(9种)：氯丙嗪、氟哌利多、氟哌啶醇、阿扎哌隆、异丙嗪、赛拉嗪、硝西泮、地西泮、奋乃近；氟哌利多、氟哌啶醇、奥沙西泮、硝西泮、奋乃近为人用药物；
(o)抗病毒类(3种)：金刚烷胺、金刚乙胺、泛昔洛韦，均为人用药物；
(p)解热镇痛类(2种)：对乙酰氨基酚、安乃近；
(q)糖皮质激素类(2种)：地塞米松、氢化可的松；
(r)抗胆碱类(2种)：氨茶碱、二羟丙茶碱(为人用药物)；
(s)其他(1种)：阿托品。
1.标准工作溶液的配制：
准确称取各标准品10mg，于10mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，配制成1mg/mL各标准贮备液；对于难溶药物，恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星加入少量0.1mol/L HCl溶液，洛美沙星加入少量0.1mol/L NaOH溶液，头孢喹肟、喹乙醇和喹烯酮加适量二甲基亚砜使其溶解后，用甲醇定至刻度；
量取各标准贮备液1.0mL于100mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，配制成浓度为10μg/mL混合标准中间工作溶液；
量取各混合标准中间工作液0.1mL，用乙腈+水(V/V＝50/50)混合液稀释，制成1μg/mL混合标准工作液。
2.待测样品的分析前处理：
2.1样品采集
样品主要选择市售样品，分别从兽药生产厂家、兽药经营门市部和畜禽养殖企业采集。
2.2样品处理
2.2.1粉/散/预混剂：称取2g试样于50mL聚丙烯离心管中，加入20mL提取液，旋涡0.5min，超声10min，离心10min，取上清液，用稀释液稀释，过0.22μm微孔尼龙滤膜；
2.2.2注射液/溶液：移取2ml试样至10ml容量瓶，用提取液定容，超声10min，用稀释液稀释，过0.22μm微孔尼龙滤膜；
2.2.3注射用粉针：取试样1支，加注射用水溶解，振摇，用稀释液稀释，过0.22μm微孔尼龙滤膜；
注:对于没有标注规格的样品应稀释1000-10000倍并根据情况做相应的调整。
以兽药注射液、溶液及可溶性粉等剂型为检测对象，目标分析物有110多种，药物性质差别较大，溶剂的选择至关重要。参考相关文献，我们考察了乙腈、甲醇和水这三种较常用的溶剂。发现甲醇或乙腈作为稀释溶剂时，有些药物稀释过程容易析出，如硫酸庆大霉素用有机试剂稀释时溶液混浊，用水稀释则澄清。因此，我们选择不同比例的乙腈+水作为稀释溶剂。通过用20％、50％和90％乙腈溶液稀释标准溶液，发现20％乙腈溶液做稀释剂时，有些药物不稳定，容易降解；90％乙腈溶液做稀释剂时，有些药物峰型不好，如阿托品，50％乙腈水作为稀释溶剂，绝大多数药物稳定，峰型较好。因此，选择50％乙腈水溶液为稀释溶液。
兽药的剂型比较多，而且同一剂型，即使同一品种，处方也差异也很大，而且，兽药的含量规格也很多，通常是百分之几的含量，若获得近百种药物的添加试样比较困难，所以粉散剂、预混剂的提取受到很大限制。参考相关文献，我们考察了乙腈、甲醇和水这三种较常用的溶液。为了提高粉散剂和预混剂中药物的溶解性，本实验分别选用不同比例的乙腈、甲醇、水混合溶液作为提取溶剂。经过试验，最终采用乙腈+甲醇+水(25+25+50)作为粉散剂和预混剂提取溶剂。
对于可溶性粉剂和注射用粉针，我们根据药物的给药方式，一般选择用纯水做最初的提取溶剂，再用50％乙腈水溶液进行稀释。
3.液相色谱条件:
考虑到药物的极性差异较大，实验采用Waters UPLCTM BEH C18(2.1mm×100mm，1.7μm)色谱柱，乙腈-0.1％甲酸水(ESI+)、乙腈-水(ESI-)作为流动相，有机相比例从初始的2％缓慢变化到95％，以保证所有药物都能有效检出，梯度洗脱程序见下表3-1。
表3-1色谱梯度洗脱程序
注：ESI+：A：0.1％甲酸溶液；B：乙腈，梯度洗脱。
ESI-：A：水；B：乙腈，梯度洗脱。
1为即时变化，6为线性变化。
4.质谱色谱条件：
由于涉及的药物种类多，且药物性质差异大，不可能每种药物都达到最佳检测条件。经过优化后，最终确定离子源参数筛查质谱方法参数，如表4-1、表4-2所示，在此条件下，大部分药物都有较好的响应。
表4-1离子源参数
表4-2筛查质谱方法参数
注：亮氨酸脑啡肽实时在线分子量校正，分子量为556.2771(ESI+)/554.2615(ESI-)，扫描时间0.5s，扫描间隔10s。
5.数据库的建立：
确定122种非处方药物的分子式和精确分子量，将非处方成分的混合标准工作液进行液相色谱-串联质谱测定，得到混合标准工作液的总离子流图，如图1所示；再把每种药物的离子色谱图提取出来，确定每种药物的保留时间，以芬苯达唑为例，提取结果如图2所示；
将药物的分子量和保留时间输入MSMS分析系统，对混合标准工作液进行MSMS分析，得到各药物的子离子扫描质谱图，以芬苯达唑为例，芬苯达唑的二级碎片离子扫描质谱图如图3所示，并根据各药物的碎片的断裂机理和断裂难度，确定各药物的特征碎片离子；
将各药物的种类、名称、分子式、保留时间和特征碎片离子信息汇总，建立122中非处方药物筛查数据库，如下表所示：
表5-1数据库
6.对经过步骤2所述方法处理的待测样品进行液相色谱-串联质谱分析测定，进样顺序为：
溶剂空白进1针；
标准工作液进1针，其RSD<10％，确定系统是否在允许误差之内；
溶剂空白进1针；
样品1进1针；
溶剂空白进1针；
…………
交替进行；
…………
试剂空白进1针；
标准工作液进1针；
…………
7.定性分析及结果确证
7.1定性分析
将步骤6得到的结果与数据库中的数据进行比较，空白溶剂不能出现与标准溶液相同的离子峰，试样的母离子及特征碎片离子的精确质量数应与标准溶液的一致，偏差均应≤0.05Da，试样色谱峰的保留时间，应与标准溶液的保留时间一致，容许偏差为±0.2min，母离子与碎片离子色谱峰的信噪比(S/N)都在3:1以上，信噪比以峰对峰(PtP)计算，全扫描光谱记录时，试样中特征碎片离子的相对丰度必须超过标准溶液参照的特征离子光谱丰度的10％，筛选出满足定性条件的药物，即为疑似阳性样品。
7.2结果确证
对于疑似阳性样品，根据药物的保留时间和分子量编辑MS/MS方法，并采集数据，所得到的疑似物质的子离子扫描质谱图，与标准溶液的子离子扫描质谱图进行比较，在相同的条件和相近的浓度下，试样中主要碎片离子相对丰度与标准溶液的相对丰度的允许偏差不超过下表规定的范围，则可判定为样品中存在对应的待测物：
表7-1主要碎片离子相对丰度与标准溶液的相对丰度的允许偏差
相对离子丰度(％) >50 >20～50 >10～20 ≤10
允许的最大偏差(％) ±20 ±25 ±30 ±50
8.样品检测
用上述方法对待测样品进行检测，结果如表8-1所示，阳性结果见图4-31。
表8-1实际样品检测结果
样品编号 商品名 样品来源 检出非处方成分
1 银黄提取物注射液 养殖场 甲氧苄啶，对乙酰氨基酚
2 盐酸沙拉沙星注射液 门市部 乙酰甲喹
3 喉炎净散 养殖场 林可霉素
4 甘草颗粒 生产厂家 未检出
5 硫酸新霉素可溶性粉 生产厂家 未检出
6 硫酸粘菌素预混剂 门市部 未检出
7 注射用青霉素钠 养殖场 未检出
9.检测限的确定
为了不引起仪器的污染，在样品上机测定之前，对样品至少稀释1000倍后测定。注射液、溶液及可溶性粉经提取液稀释后，上机测定的溶液与标准品的溶液基本等同。我们将各种药物标准品的检测限定为本方法的检测限。对于散剂和预混剂，通过添加10μg/mL标准溶液100μL，经提取后测定，根据各药物的信噪比S/N＞3(按峰对峰计)，确定本方法的检测限，最终确定将本方法各药物的检测限为0.5mg/kg。
10.回收率实验
在确定样品处理方法后，选择可溶性粉(选用常见的可溶性粉辅料做空白基质添加)、中药散剂(白头翁散)、注射液(鱼腥草注射液)样品做为测试对象，进行加标回收率实验。添加标准溶液，做6次平行实验，结果见表10-1。
表10-1回收率试验结果
以上所述的仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明整体构思前提下，还可以作出若干改变和改进，这些也应该视为本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种兽药制剂中122种非处方药物的筛查方法，其特征在于：具体包括以下步骤：
所述122种非处方药物为：
(a)磺胺类：磺胺间甲氧嘧啶、磺胺甲噁唑、磺胺间二甲氧嘧啶、磺胺喹噁啉、磺胺氯吡嗪、磺胺二甲嘧啶、磺胺氯哒嗪、磺胺吡啶、磺胺甲氧嗪、磺胺邻二甲氧嘧啶、磺胺嘧啶、磺胺甲嘧啶、磺胺异噁唑、苯酰磺胺、磺胺硝苯、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺噻唑、甲氧苄啶、磺胺二甲唑、磺胺甲噻二唑、磺胺二甲异嘧啶；
(b)β-内酰胺类：氨苄西林、苯唑西林、氟氯西林、头孢噻肟、头孢噻呋、青霉素G；
(c)四环素类：土霉素、四环素、金霉素、多西环素；
(d)酰胺醇类：氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考；
(e)大环内酯类：泰乐菌素、替米考星、泰妙菌素、阿奇霉素、克拉霉素、红霉素、罗红霉素、吉他霉素A5；
(f)林可胺类：林可霉素、克林霉素；
(g)氟喹诺酮类：恩诺沙星、环丙沙星、沙拉沙星、二氟沙星、那氟沙星、司帕沙星、诺氟沙星、恶喹酸、培氟沙星、奥比沙星、氟甲喹、萘啶酸、洛美沙星、氧氟沙星、氟罗沙星；
(h)喹噁啉类：喹烯酮、卡巴氧、乙酰甲喹、喹乙醇；
(i)硝基呋喃类：呋喃唑酮、呋喃它酮；
(j)硝基咪唑类：奥硝唑、地美硝唑、异丙硝唑、塞克硝唑、甲硝唑；
(k)抗球虫类：氯苯胍、氯羟吡啶；
(l)苯并咪唑类：苯硫胍、氟苯达唑、阿苯达唑、芬苯哒唑、奥苯达唑、奥芬哒唑、噻苯达唑、阿苯达唑砜、甲苯达唑；
(m)β-受体激动剂：克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇、氯丙那林、拉贝特罗、班布特罗、喷布特罗、溴布特罗；
(n)镇静剂类：氯丙嗪、氟哌利多、氟哌啶醇、阿扎哌隆、异丙嗪、赛拉嗪、硝西泮、地西泮、奋乃近；
(o)抗病毒类：金刚烷胺、金刚乙胺、泛昔洛韦；
(p)解热镇痛类：对乙酰氨基酚、安乃近；
(q)糖皮质激素类：地塞米松、氢化可的松；
(r)抗胆碱类：氨茶碱、二羟丙茶碱；
(s)其他：阿托品；
(1)标准工作溶液的配制：
准确称取各标准品10mg，于10mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，配制成1mg/mL各标准贮备液；对于难溶药物，恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星加入少量0.1mol/L HCl溶液，洛美沙星加入少量0.1mol/L NaOH溶液，头孢喹肟、喹乙醇和喹烯酮加适量二甲基亚砜使其溶解后，用甲醇定至刻度；
量取各标准贮备液1.0mL于100mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，配制成浓度为10μg/mL混合标准中间工作溶液；
量取各混合标准中间工作液0.1mL，用乙腈和水的混合液稀释，制成1μg/mL混合标准工作液；
(2)待测样品的分析前处理：
1)粉/散/预混剂：称取2±0.02g试样于50mL聚丙烯离心管中，加入20mL提取液，旋涡0.5min，超声10min，离心10min，取上清液，用稀释液稀释，过0.22μm微孔尼龙滤膜；
2)注射液/溶液：移取2±0.02ml试样至10ml容量瓶，用提取液定容，超声10min，用稀释液稀释，过0.22μm微孔尼龙滤膜；
3)注射用粉针：取试样1支，加注射用水溶解，振摇，用稀释液稀释，过0.22μm微孔尼龙滤膜；
(3)数据库的建立：确定122种非处方药物的分子式和分子量，将非处方药物的混合标准工作液进行液相色谱-串联质谱测定，得到混合标准工作液的总离子流图，再把每种药物的离子色谱图提取出来，确定每种药物的保留时间；
将药物的分子量和保留时间输入MSMS分析系统，对混合标准工作液进行MSMS分析，得到各药物的子离子扫描质谱图，并根据各药物的碎片的断裂机理和断裂难度，确定各药物的特征碎片离子；
将各药物的种类、名称、分子式、保留时间和特征碎片离子信息汇总，建立122种非处方药物筛查数据库，如下表所示：
表1数据库
(4)定性分析：
1)对经过步骤(2)所述方法处理的待测样品进行液相色谱-串联质谱分析，将得到的结果与数据库中的数据进行比较，空白溶剂不能出现与标准溶液相同的离子峰，试样的母离子及特征碎片离子的精确质量数应与标准溶液的一致，偏差均应≤0.05Da，试样色谱峰的保留时间，应与标准溶液的保留时间一致，容许偏差为±0.2min，母离子与碎片离子色谱峰的信噪比(S/N)都在3:1以上，信噪比以峰对峰(PtP)计算，全扫描光谱记录时，试样中特征碎片离子的相对丰度必须超过标准溶液参照的特征离子光谱丰度的10％，筛选出满足定性条件的药物，即为疑似阳性样品；
2)对于疑似阳性样品，根据药物的保留时间和分子量编辑MSMS方法，并采集数据，所得到的疑似物质的子离子扫描质谱图，与标准溶液的子离子扫描质谱图进行比较，在相同的条件和相近的浓度下，试样中主要碎片离子相对丰度与标准溶液的相对丰度的允许偏差不超过下表规定的范围，则可判定为样品中存在对应的待测物：
表2主要碎片离子相对丰度与标准溶液的相对丰度的允许偏差
2.根据权利要求1所述的兽药制剂中122种非处方药物的筛查方法，其特征在于：所述步骤(3)和步骤(4)中的液相色谱分析条件为：色谱柱：Waters UPLCTM BEH C18，2.1mm×100mm，1.7μm；有机相比例从初始的2％缓慢变化到95％，以保证所有药物都能有效检出，梯度洗脱程序见下表：
表3色谱梯度洗脱程序
注：ESI+：A：0.1％甲酸溶液；B：乙腈，梯度洗脱；
ESI-：A：水；B：乙腈，梯度洗脱；
1为即时变化，6为线性变化。
3.根据权利要求1所述的兽药制剂中122种非处方药物的筛查方法，其特征在于：所述步骤(3)和步骤(4)中的质谱分析条件如下表所示：
表4离子源参数
表5筛查质谱方法参数
注：亮氨酸脑啡肽实时在线分子量校正，分子量为556.2771(ESI+)/554.2615(ESI-)，扫描时间0.5s，扫描间隔10s。
4.根据权利要求1所述的兽药制剂中122种非处方药物的筛查方法，其特征在于：所述步骤(1)中乙腈和水的混合液中的乙腈和水的体积比为1:1。
5.根据权利要求1所述的兽药制剂中122种非处方药物的筛查方法，其特征在于：所述步骤(2)中的提取液为乙腈、甲醇和水混合溶液，乙腈、甲醇和水的体积比为1:1:2。
6.根据权利要求1所述的兽药制剂中122种非处方药物的筛查方法，其特征在于：所述步骤(2)中的稀释液为乙腈和水的混合液，乙腈和水的体积比为1:1。
7.根据权利要求1所述的兽药制剂中122种非处方药物的筛查方法，其特征在于：还包括对122种非处方药物的检测限的测定，测定方法为：对于散剂和预混剂，通过添加10μg/mL标准溶液100μL，经提取后测定，根据各药物的信噪比S/N＞3，最终确定各药物的检测限为0.5mg/kg。
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