CN106124683A

CN106124683A - 一种同时检测兽药中多种抗菌成分的方法

Info

Publication number: CN106124683A
Application number: CN201610741784.2A
Authority: CN
Inventors: 于晓辉; 万仁玲; 杨秀玉; 张广川; 马秋冉; 张璐; 董玲玲; 韩宁宁; 杨星; 赵富华
Original assignee: China Institute of Veterinary Drug Control
Current assignee: China Institute of Veterinary Drug Control
Priority date: 2016-08-26
Filing date: 2016-08-26
Publication date: 2016-11-16
Anticipated expiration: 2036-08-26
Also published as: CN106124683B

Abstract

本发明公开了一种同时检测兽药中多种抗菌成分的方法，包括制备对照储备液、制备样品溶液、UPLC‑PDA检测和比对图谱。本发明利用UPLC法联合PDA法建立了一种能够同时分离、并测定兽药中22种磺胺类药物和9种喹诺酮类药物的检测方法。本发明方法既可以定性，也可以定量测定，通过与对照色谱图中的保留时间和光谱图中峰型的比较，可对其中的药物成分进行定性，在此基础上，通过外标法对药物成分进行定量检测。本发明提出的检测方法操作简便、快速、准确，适用范围宽、设备造价低廉、同时检出的目标化合物多，可以作为兽药制剂中非法添加物的检查方法，为规范兽药市场提供了技术保障，为兽药市场的监管提供了技术支持。

Description

一种同时检测兽药中多种抗菌成分的方法

技术领域

本发明涉及兽药检测的技术领域，特别是涉及一种兽药中多种抗菌成分(尤其是非法添加的)同时检测的方法。

背景技术

兽药是用于预防、治疗、诊断动物疾病或有目的地调节动物生理机能的物质(含药物饲料添加剂)，主要包括血清制品、疫苗、诊断制品、微生态制品、中药材、化学药品、抗生素、生化药品、放射性药品及外用杀虫剂、消毒剂等。由于市场经济的调节，市场上兽药品种较多，虽然国家出台了《兽药管理条例》，但很多企业为了追求利润，擅自改变兽药制剂组方、非法添加标准处方外的药物甚至违禁药物，这种造假行为极大地扰乱了兽药市场秩序，也成为农业部近年来重点打击查处的违法行为之一。

磺胺类药物和喹诺酮类药物是兽药中常用的成分，具有吸收好、抗菌谱广等优点，但部分企业盲目追求兽药的疗效，不按照批准的处方生产兽药，而在批准的处方外额外添加其他的药物，磺胺类药物和喹诺酮类药物是经常被部分企业非法添加到多种兽药制剂中两类药物，这样做很容易造成用药安全性的不可控，因此这种行为是被禁止的。为了维持兽药市场的正常秩序，有关部门需要定期/不定期检查/抽查上市兽药的实际成分与其批准成分是否一致，是否有非法添加的物质。

目前，针对兽药中是否非法添加上述两类药物的检测手段中，最常用的有普通高效液相色谱法和液相色谱-质谱联用法。然而普通液相色谱法由于分离效率低、分析时间长等缺点，无法实现高通量、同时检测多种抗菌药物的目的。液相色谱-质谱联用法虽然可以做到高通量定性鉴别，但是质谱仪造价昂贵，且兽药制剂中非法抗菌药物的浓度较高，远超过质谱检测器的线性范围，也限制了该方法的推广应用。

郑和辉.超高效液相色谱法检测化妆品中的12种磺胺抗生素[J].分析测试学报，2007,25(2):238-240.和陈静.超高效液相色谱法同时测定化妆品中的19种喹诺酮类抗生素[J].分析化学，2013,41(6):931-935.两篇文献中分别公开了用UPLC-PDA方法测定化妆品中的磺胺类药物或喹诺酮类药物，由于化妆品的剂型与兽药不同，样品的前处理方法也不一致，无法用来检测兽药中的磺胺类药物和喹诺酮类药物。另外，文献中两种方法分别对磺胺类药物或喹诺酮类药物进行检测，通常兽药中这两类药物都会添加，用文献的方法需要进行两次检测，检测效率低。不仅如此，文献中的两种方法对磺胺类药物的检测种类和数量都比较少(只能检测12种)，用于兽药的检测时，会造成漏检、结果不准确等问题，无法用于兽药中磺胺类药物和喹诺酮类药物的检测。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中存在的技术缺陷，提供一种能够同时分离、并测定兽药中多种抗菌成分(22种磺胺类药物和9种喹诺酮类药物)的方法，包括以下步骤：

步骤1)、制备对照储备液：分别将多种抗菌成分用溶剂A配制成浓度均为1mg/ml的对照储备液；

步骤2)、制备样品溶液：称取兽药样品，用溶剂A配制成样品溶液；

步骤3)、UPLC-PDA检测：分别将步骤1)得到的对照储备液和步骤2)得到的样品溶液注入超高效液相色谱仪(UPLC)，以PDA为检测器进行梯度洗脱程序，得到对照图谱和样品图谱(所述图谱包括色谱图和光谱图)；

步骤4)、比对图谱：将步骤3)得到的样品图谱与对照图谱分别进行比对，得出兽药样品中添加的抗菌成分的种类和添加量。

所述抗菌成分为磺胺类药物和/或喹诺酮类药物。

所述磺胺类药物包括磺胺脒、磺胺、苯磺酰胺、磺胺醋酰、磺胺嘧啶、甲氧苄啶、磺胺吡啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺甲氧哒嗪、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺氯哒嗪钠、磺胺多辛、磺胺甲恶唑、磺胺异噁唑、磺胺苯甲酰、磺胺氯吡嗪钠、磺胺地索辛、磺胺喹噁啉、磺胺苯吡唑、磺胺硝苯。

所述喹诺酮类药物包括马波沙星、氧氟沙星、洛美沙星、二氟沙星、培氟沙星、环丙沙星、达氟沙星、恩诺沙星、沙拉沙星。

所述步骤3)UPLC-PDA检测的色谱柱选用Agilent ZORBAX SB-C18HD(2.1mm×150mm，1.8μm)；流速：0.2mL/min；柱温：25℃；进样量：1μL。

所述步骤3)UPLC-PDA检测的流动相为：流动相A为0.05％-0.2％(体积百分含量，v/v)甲酸水溶液(pH＝3.35-3.45)，流动相B为乙腈。

所述步骤3)UPLC-PDA检测的梯度洗脱程序分为八个阶段：阶段①：0-7min,9％-14％流动相B；阶段②：7-20min，14％-15.5％流动相B；阶段③：20-25min，15.5％-20％流动相B；阶段④：25-30min，20％-24％流动相B；阶段⑤：30-37min，24％-30％流动相B；阶段⑥：37-39min，30％-50％流动相B；阶段⑦：39-39.5min，50％-9％流动相B；阶段⑧：39.5-42min，9％-9％流动相B。

所述步骤4)的比对图谱具体为：先比对样品色谱图与对照色谱图中是否有保留时间相同的峰；如果没有，说明样品中未添加对照图谱对应的抗菌成分，如果有，再进一步比对该保留时间相同的峰在样品光谱图和对照光谱图中的整体峰型、最大吸收波长是否一致，如果一致，则判断样品中含有对照图谱对应的抗菌成分，得到样品中添加的抗菌成分的种类，如果不一致，则判断样品中不含有对照图谱对应的抗菌成分；进一步计算样品色谱图中该峰的峰面积，得到该抗菌成分的添加量。

所述溶剂A为乙腈与0.1％(体积百分含量，v/v)甲酸水溶液的混合液，其中，乙腈：0.1％甲酸水溶液的体积比为(40:60)-(70:30)。

所述步骤2)制备样品溶液具体为：称取兽药样品，加入溶剂A，摇匀，超声3分钟以上，室温下0.22μm滤膜过滤，即得。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明利用UPLC法(超高效液相色谱法)联合PDA法(Photo-Diode Array，即光电二极管阵列检测器)建立了一种能够同时分离、并测定兽药中22种磺胺类药物和9种喹诺酮类药物的检测方法，主要对该方法中的流动相和梯度洗脱程序的参数(包括样品制备方法、色谱柱和检测器)进行了筛选和优化。本发明方法采用UPLC将兽药中的抗菌成分分离，进而对它们进行分别的鉴别测定。本发明方法既可以定性，也可以定量测定，通过与对照色谱图中的保留时间和光谱图中峰型的比较，可对其中的抗菌成分进行定性检测，在此基础上，通过外标法计算峰面积，对抗菌成分进行定量检测。本发明采用PDA检测器，利用全波段光谱图、纯度角和保留时间三项指标对色谱峰进行定性，解决了UV检测器仅依靠保留时间这一项指标，容易产生定性不准确的问题。同时，31种抗菌成分的最大吸收波长差异较大，采用PDA检测器也保证了各色谱峰均能得到最大吸光度值，提高了该检测方法的灵敏度。本发明提出的检测方法操作简便、快速、准确，适用范围宽、设备造价低廉、同时检出的目标化合物多，可以作为兽药制剂中非法添加物的检测方法，为规范兽药市场提供了技术保障，为兽药市场的监管提供了技术支持。此外，本发明方法还适用于水、土壤等对象中磺胺类化合物和喹诺酮类化合物的检测。

附图说明

图1所示为在280nm下按实施例4的色谱条件检测步骤3)的31种对照储备稀释液得到的色谱图；其中：1、磺胺脒，2、磺胺，3、苯磺酰胺，4、磺胺醋酰，5、磺胺嘧啶，6、甲氧苄啶，7、磺胺吡啶，8、马波沙星，9、磺胺甲基嘧啶，10、氧氟沙星，11、培氟沙星，12、环丙沙星，13、磺胺二甲嘧啶，14、洛美沙星，15、磺胺对甲氧嘧啶，16、磺胺甲氧哒嗪，17、达氟沙星，18、恩诺沙星，19、磺胺间甲氧嘧啶，20、磺胺氯哒嗪钠，21、沙拉沙星，22、磺胺多辛，23、二氟沙星，24、磺胺甲噁唑，25、磺胺异噁唑，26、磺胺苯甲酰，27、磺胺氯吡嗪钠，28、磺胺地索辛，29、磺胺喹噁啉，30、磺胺苯吡唑，31、磺胺硝苯；

图2-图7分别为图1中31种抗菌成分1-31对应的PDA光谱图；

图8所示为比较例1的结果图；

图9所示为比较例2的结果图；

图10所示为比较例3当pH为3.6时的结果图；

图11所示为比较例3当pH为3.2时的结果图；

图12所示为比较例6当色谱柱为Hypersil Gold C₁₈时的结果图；

图13所示为比较例6当色谱柱为Waters Hss T3时的结果图；

图14所示为在280nm下按实施例4的色谱条件检测金芩芍注射液得到的色谱图；

图15-图17分别为图14中峰#Ⅰ-峰#Ⅲ对应的PDA光谱图；

图18所示为在280nm下按实施例4的色谱条件检测氟苯尼考粉得到的色谱图；

图19-图22分别为比较例7-10的结果图。

具体实施方式

本发明提出的能够同时检测兽药中多种磺胺类药物和喹诺酮类药物(以下可简称抗菌成分)的方法，包括以下步骤：

步骤1)、分别精密称取22种磺胺类药物：磺胺脒、磺胺、苯磺酰胺、磺胺醋酰、磺胺嘧啶、甲氧苄啶、磺胺吡啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺甲氧哒嗪、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺氯哒嗪钠、磺胺多辛、磺胺甲恶唑、磺胺异噁唑、磺胺苯甲酰、磺胺氯吡嗪钠、磺胺地索辛、磺胺喹噁啉、磺胺苯吡唑和磺胺硝苯；和9种喹诺酮类药物：马波沙星、氧氟沙星、洛美沙星、二氟沙星、培氟沙星、环丙沙星、达氟沙星、恩诺沙星和沙拉沙星，各50mg作为对照品，分别置于31个50ml容量瓶中，用溶剂A溶解并稀释至刻度，制成浓度均为1mg/ml的对照储备液；溶剂A为乙腈-0.1％(体积百分含量，v/v)甲酸水溶液，其中，乙腈：0.1％甲酸水溶液的体积比为(40:60)-(70:30)，0.1％甲酸水溶液是由1mL的甲酸置于1000mL的容量瓶中，用水溶解并稀释至刻度制得。

步骤2)、称取兽药样品1.0g，加入20mL溶剂A，摇匀，超声3分钟以上，室温下0.22μm滤膜过滤，制得样品溶液；溶剂A与步骤1)的溶剂A相同。

步骤3)、将步骤1)得到的对照储备液分别用溶剂A稀释100倍，得到浓度为0.01mg/ml的对照储备稀释液；分别精密吸取对照储备稀释液和样品溶液1μL注入超高效液相色谱仪(UPLC)，按照如下的色谱条件进行测定。色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18HD(2.1mm×150mm，1.8μm)；流速：0.2mL/min；柱温：25℃；进样量：1μL；流动相：A为0.05％-0.2％(体积百分含量，v/v)甲酸水溶液(三乙胺调节pH值至3.35-3.45)，B为乙腈；梯度洗脱程序：阶段①：0-7min,9％-14％B(0-7分钟内流动相B的体积百分含量在9％-14％之间线性缓慢增加，对应的，在这段时间内流动相A的体积百分含量在91％-86％之间线性缓慢降低，以下同理)；阶段②：7-20min，14％-15.5％B；阶段③：20-25min，15.5％-20％B；阶段④：25-30min，20％-24％B；阶段⑤：30-37min，24％-30％B；阶段⑥：37-39min，30％-50％B；阶段⑦：39-39.5min，50％-9％B；阶段⑧：39.5-42min，9％-9％B(即维持流动相B的体积百分含量为9％，流动相A的体积百分含量为91％不变)；得到对照图谱和样品图谱(包括对照色谱图、对照光谱图和样品色谱图、样品光谱图)。

步骤4)、将步骤3)得到的样品图谱与对照图谱进行比对，即可以判断出兽药样品中是否添加了磺胺类药物和/或喹诺酮类药物，添加了哪些种类的抗菌成分，以及每种抗菌成分的添加量。

步骤4)的比对过程具体为：先比对色谱图：样品色谱图与对照色谱图中是否有保留时间相同的峰；如果没有，说明样品中没有对照色谱图中的抗菌成分，如果有，再比对光谱图：进一步比较该保留时间相同的峰在样品光谱图和对照光谱图中的整体峰型、最大吸收波长是否一致，如果一致，则判断样品中含有对照图谱对应的物质，如果不一致，则判断样品中不含有对照图谱对应的抗菌成分；还可以根据UPLC不同保留时间下的峰面积直接计算出对应峰的含量，得到含有的抗菌成分的添加量。

超高效液相色谱仪购自Waters公司的ACQUITY UPLC。磺胺类药物购自德国Dr.Ehrenstorfer公司；喹诺酮类药物购自中国食品药品检定研究院和中国兽医药品监察所。乙腈、甲醇为色谱纯，其他试剂均为分析纯，均可商购得到。

以下结合具体实施例，更具体地说明本发明的内容，并对本发明作进一步阐述，但这些实施例绝非对本发明进行限制。

实施例

1、标准样品的制备：按上述步骤1)得到22种磺胺类药物、9种喹诺酮类药物浓度均为1mg/ml的共31个对照储备液，量取31种对照储备液各0.1ml，置于同一10ml容量瓶中，用溶剂A稀释至刻度，即得标准样品。

2、检测样品的制备：按上述步骤2)制得样品溶液，检测样品包括市场上售卖的氟苯尼考粉、阿莫西林可溶性粉、盐酸林可霉素注射液、伊维菌素注射液、恩诺沙星注射液、盐酸环丙沙星可溶性粉、烟酸诺氟沙星注射液、氧氟沙星注射液、金芩芍注射液、止痢散、黄芪多糖注射液、健胃散共12种30批不同类型的兽药制剂。

3、检测：按上述步骤3)对标准样品和样品溶液进行检测，检测参数见表1。

表1本发明检测方法的参数

4、比对：将检测样品中的检出峰与标准样品色谱图中各种抗菌成分的保留时间及PDA光谱图进行比对，得到上述兽药制剂中是否含有31种抗菌成分以及含有哪些抗菌成分的定性检测结果；用UPLC计算检出峰的峰面积，得到含有的抗菌成分的添加量。

以金芩芍注射液和氟苯尼考粉为例，以实施例4为例，标准样品的检测结果见图1，检测样品的结果见图14和图18。通过比较图14和图18中色谱峰的保留时间与对照图谱中的保留时间是否一致，同时比较保留时间一致的相应峰的光谱图(图15-图17)，看二者之间的峰型和最大吸收波长是否相同，定性得出这两种兽药制剂中是否含有31种抗菌成分，以及含有哪些种抗菌成分的结论。

图1的结果显示：31种化合物之间的分离度良好，图2-7的PDA光谱图特征明显；根据图1中的保留时间，结合图2-7中的光谱图特征，可以实现对添加物定性检测的目的；在此基础上，还可以利用外标法对检测出来的添加物进行定量测定。当甲酸浓度在0.05％-0.2％之间(如实施例1-6)，只能使部分色谱峰的位置改变(如，当以0.05％甲酸水溶液为流动相A时，只能使沙星类的色谱峰的出峰时间整体推迟)，但不会改变同类化合物峰之间的分离度。

由图14和图18的结果表明，金芩芍注射液中非法添加了甲氧苄啶、氧氟沙星、磺胺间甲氧嘧啶，其中甲氧苄啶的含量为0.037mg/ml，氧氟沙星的含量为0.031mg/ml，磺胺间甲氧嘧啶的含量为0.074mg/ml；氟苯尼考粉中未发现添加物。

比较例1：

以实施例4为例，将步骤3)流动相B中的乙腈替换成甲醇，其它步骤和参数不变，结果见图8。结果显示：用甲醇做流动相B时，部分色谱峰重叠，完全分不开，尤其是保留时间在8-14min期间的峰发生大量地重叠，说明针对磺胺类药物和喹诺酮类药物甲醇的洗脱力弱于乙腈，所有色谱峰之间的分离度均远小于乙腈，甲醇不适用于分离磺胺类药物和喹诺酮类药物。

比较例2：

以实施例4为例，仅调整步骤3)流动相A甲酸水溶液中甲酸的浓度至0.5％、0.01％，其它步骤和参数不变，结果见图9。结果显示：用流动相A中甲酸的浓度过高或过低，都会发生部分色谱峰重叠，完全分不开的情况，尤其是保留时间在7-13min期间的峰发生大量地重叠，分离度变差，甲酸的浓度过高或过低均不适用于分离磺胺类药物和喹诺酮类药物。

比较例3：

以实施例4为例，仅调整步骤3)流动相A甲酸水溶液的pH值为3.6、3.2，其它步骤和参数不变，结果见图10和图11。结果显示：当流动相A的pH值≧3.5时(如3.6)，沙拉沙星和磺胺多辛之间的分离度降低(见图10中保留时间为23min附近两个重叠峰)；当流动相A的pH值≦3.3时(如3.2)，磺胺甲氧哒嗪和达氟沙星之间的分离度降低(见图11中保留时间为14min附近的两个重叠峰)。

比较例4：

以实施例4为例，仅调整步骤2)溶剂中乙腈和0.1％甲酸水溶液之间的配比，其它步骤和参数不变。发现：当乙腈：0.1％甲酸水溶液的体积比＞70：30时(如80:20)，二氟沙星、洛美沙星等化合物不能完全溶解，试管底部有肉眼可见的未溶解固体；当乙腈：0.1％甲酸水溶液的体积比＜40：60(如20:80)时，磺胺硝苯、磺胺喹噁啉等化合物不能完全溶解，试管底部有肉眼可见的未溶解固体。

比较例5：

以实施例4为例，仅调整步骤2)超声时间，其它步骤和参数不变。考察回收率来比较超声时间对提取效率的影响，发现：当超声时间大于3分钟时，上述31种药物的回收率均大于95％。当超声时间小于3min，即2分钟时，磺胺喹噁啉、磺胺地索辛、磺胺苯吡唑的回收率低于40％，这是由于这些化合物未能完全溶解造成的。

比较例6：

以实施例4为例，仅调整步骤3)中所用的色谱柱，用Hypersil Gold C₁₈(2.1mm×100mm，1.9μm)和Waters Hss T3(2.1mm×100mm，1.8μm)替换本发明的Agilent ZORBAX SB-C₁₈HD(2.1mm×150mm，1.8μm)，其它步骤和参数不变，结果见图12和图13。结果显示：使用Hypersil Gold C₁₈(2.1mm×100mm，1.9μm)或Waters Hss T3(2.1mm×100mm，1.8μm)都会发生部分色谱峰重叠，完全分不开的情况，对Hypersil Gold C₁₈(2.1mm×100mm，1.9μm)来说，在保留时间为13-15min和16-19min期间的峰发生大量地重叠，分离度变差；对Waters HssT3(2.1mm×100mm，1.8μm)来说，在保留时间为11-14min期间的峰发生大量地重叠，分离度变差，这两种常用的色谱柱分离效果较差，无法将31种药物全部分开，均不适用于分离磺胺类药物和喹诺酮类药物。

比较例7：

以实施例4为例，合并步骤3)中度洗脱程序的原阶段③和原阶段④，将步骤3)中梯度洗脱程序改为：阶段①：0-7min,9％-14％B；阶段②：7-20min，14％-15.5％B；阶段③：20-30min，15.5％-24％B；阶段④：30-37min，24％-30％B；阶段⑤：37-39min，30％-50％B；阶段⑥：39-39.5min，50％-9％B；阶段⑦：39.5-42min，9％-9％B，按照该程序进行梯度洗脱，其他步骤和参数不变，得到图19。从图19中得知，按照上述程序进行梯度洗脱后，磺胺多辛和沙拉沙星之间的分离度降低(见图19中保留时间为23min附近的两个重叠峰)。

比较例8：

以实施例4为例，调整步骤3)中梯度洗脱程序各阶段的保留时间和流动相配比，将步骤3)中梯度洗脱程序改为：阶段①：0-7min,9％-12.5％B；阶段②：7-14min，12.5％-15％B；阶段③：14-18min，15％-18％B；阶段④：18-25min，18％-20％B；阶段⑤：25-30min，20％-24％B；阶段⑥：30-37min，24％-30％B；阶段⑦：37-39min，30％-50％B；阶段⑧：39-39.5min，50％-9％B；阶段⑨：39.5-42min，9％-9％B，按照该程序进行梯度洗脱，其他步骤和参数不变，得到图20。从图20中得知，按照上述程序进行梯度洗脱后，环丙沙星和磺胺二甲嘧啶之间的分离度降低(见图20中保留时间为13min附近的两个重叠峰)；二氟沙星和磺胺多辛之间的分离度降低(见图20中保留时间为22min附近的两个重叠峰)，不适用于这几种物质的检测。

比较例9：

以实施例4为例，缩短步骤3)中梯度洗脱程序的运行时间，将步骤3)的梯度洗脱程序改为：阶段①：0-7min,9％-13％B；阶段②：7-13min，13％-20％B；阶段③：13-18min，20％-24％B；阶段④：18-25min，24％-30％B；阶段⑤：25-27min，30％-50％B；阶段⑥：27-27.5min，50％-9％B；阶段⑦：27.5-30min，9％-9％B，按照该程序进行梯度洗脱，其他步骤和参数不变，得到图21。从图21中得知，按照上述程序进行梯度洗脱后，磺胺二甲嘧啶和洛美沙星之间的分离度降低(见图21中保留时间为12min附近的两个重叠峰)；达氟沙星、磺胺甲二唑、磺胺对甲氧嘧啶和磺胺甲氧哒嗪之间的分离度降低(见图21中保留时间为12.5-14min附近的重叠峰)；二氟沙星和磺胺多辛之间的分离度降低(见图21中保留时间为16min附近的两个重叠峰)，不适用于这几种物质的检测。

比较例10：

以实施例4为例，缩短步骤3)中梯度洗脱程序的运行时间，将步骤3)的梯度洗脱程序改为：阶段①：0-18min,10％-24％B；阶段②：18-30min，24％-35％B；阶段③：30-30.5min，35％-10％B；阶段④：30.5-33min，10％-10％B，按照该程序进行梯度洗脱，其他步骤和参数不变，得到图22。从图22中得知，按照上述程序进行梯度洗脱后，磺胺甲二唑、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺甲氧哒嗪和恩诺沙星之间的分离度降低(见图22中保留时间为11-12min附近的重叠峰)；二氟沙星和磺胺氯哒嗪钠之间的分离度降低(见图22中保留时间为15min附近的两个重叠峰)，不适用于这几种物质的检测。

实验一：精密度

按照实施例1-6的色谱条件，在同一天、由同一实验员用同一台UPLC对浓度为0.01mg/mL的同一对照品溶液连续进样5次进行测定，计算保留时间和峰面积的RSD，即得到日内精密度结果；分别在两天、由两名实验员用两台UPLC对浓度为0.01mg/mL的同一对照品溶液连续进样5次进行测定，计算保留时间和峰面积的RSD，即得到日间精密度结果。以实施例4为例，具体结果见表2，表2中所列保留时间为5次测定的平均值；由于在对色谱峰定性鉴别时，只需要利用峰的保留时间，所以表中结果中只列出了保留时间，而无峰面积结果。

表2 31种化合物精密度考察结果

表2显示，保留时间的日内精密度均不大于0.5％，峰面积的日内精密度均小于0.5％。保留时间和峰面积的日间精密度均小于1.0％。在兽药检测领域，通常要求检测方法的日内精密度的RSD≤2％，日间精密度的RSD≤4％(《中国兽药典》二〇一五年版一部)。该结果表明本发明检测方法的精密度良好，可以用来检测兽药中的磺胺类药物和喹诺酮类药物。

实验二：线性关系和检出限

精密量取31种对照品储备液适量，用溶剂A(乙腈：0.1％甲酸水溶液＝60:40)稀释，制得浓度分别为0.005mg/mL、0.01mg/mL、0.05mg/mL、0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.5mg/mL、1mg/mL的对照品溶液。按照实施例1-6的色谱条件，进样测定，以信噪比＝3时的浓度作为检出限，记录色谱图，以浓度x(mg/mL)对峰面积y作图，并进行统计学处理，得到31种抗菌成分的回归方程，并计算得到相关系数R²，以实施例4的色谱条件为例，具体结果见表3。

表3 31种抗菌成分的对照品溶液的线性关系和检出限

峰编号	R²	检出限(μg/L)	峰编号	R²	检出限(μg/L)
						1	0.9996	13.8	17	1.0000	19.7
2	1.0000	10.6	18	0.9999	23.5
						3	1.0000	14.8	19	0.9996	45.5
4	0.9996	12.6	20	0.9998	61.9
						5	0.9997	17.7	21	0.9998	68.5
6	0.9997	78.8	22	1.0000	57.0
						7	0.9999	23.4	23	0.9997	68.5
8	0.9999	30.6	24	1.0000	50.5
						9	0.9999	19.5	25	1.0000	40.5
10	0.9999	25.7	26	0.9999	40.7
						11	1.0000	21.1	27	1.0000	41.7
12	1.0000	17.4	28	0.9998	8.1
						13	1.0000	29.3	29	0.9996	35.7
14	0.9999	23.9	30	1.0000	52.5
						15	0.9998	30.7	31	0.9995	9.6
16	0.9999	34.4

表3的结果显示当样品中抗菌成分的浓度在0.005mg/mL-1mg/mL的范围内线性关系良好，可见，本发明方法用于检测31种抗菌成分时，其线性关系范围大，对0.005mg/mL-1mg/mL的浓度范围的样品均能准确测定，表明本发明方法的适用性广。

本发明检测方法的检出限最低能够不到10μg/L，最高不超过80μg/L，而本发明方法的线性关系的浓度范围为5000-10⁶μg/L，远超过检出限；该检出限也远低于抗菌成分的起效浓度1250μg/L(此数值为31种抗菌成分中最低的起效浓度，出自《兽药使用指南化学药品卷》)，说明本发明方法能够满足兽药制剂中抗菌成分检测的要求。

实验三：回收率

向不含抗菌成分的兽药制剂中添加两种不同浓度水平的以上31种抗菌成分，添加量见表4，按照实施例1-6的色谱条件平行测定5次，计算平均回收率，以实施例4的色谱条件为例，具体结果见表4。

表4 31种抗菌成分的回收率考察结果

兽药检测领域用回收率来评价检测结果与真实值的接近程度，通常规定：在μg/L的数量级浓度下，其回收率应在75％-120％之间(出自《中国兽药典》二〇一五年版一部)。表4的结果显示在添加量较少的情况下(μg/L的数量级)，31种抗菌成分的平均回收率为87.7％-114.7％；在添加量较大的情况下，31种抗菌成分的平均回收率为92.9％-105.1％，满足兽药检测中对回收率的要求，适合用于兽药中31种抗菌成分的检测。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的内容。

Claims

1.一种同时检测兽药中多种抗菌成分的方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述抗菌成分为磺胺类药物和/或喹诺酮类药物。

3.根据权利要求2所述方法，其特征在于，所述磺胺类药物包括磺胺脒、磺胺、苯磺酰胺、磺胺醋酰、磺胺嘧啶、甲氧苄啶、磺胺吡啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺甲氧哒嗪、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺氯哒嗪钠、磺胺多辛、磺胺甲恶唑、磺胺异噁唑、磺胺苯甲酰、磺胺氯吡嗪钠、磺胺地索辛、磺胺喹噁啉、磺胺苯吡唑、磺胺硝苯。

4.根据权利要求2或3所述方法，其特征在于，所述喹诺酮类药物包括马波沙星、氧氟沙星、洛美沙星、二氟沙星、培氟沙星、环丙沙星、达氟沙星、恩诺沙星、沙拉沙星。

5.根据权利要求1-4任一所述方法，其特征在于，所述步骤3)UPLC-PDA检测的色谱柱选用Agilent ZORBAX SB-C18 HD(2.1mm×150mm，1.8μm)；流速：0.2mL/min；柱温：25℃；进样量：1μL。

6.根据权利要求5所述方法，其特征在于，所述步骤3)UPLC-PDA检测的流动相为：流动相A为0.05％-0.2％(体积百分含量，v/v)甲酸水溶液(pH＝3.35-3.45)，流动相B为乙腈。

7.根据权利要求5或6所述方法，其特征在于，所述步骤3)UPLC-PDA检测的梯度洗脱程序分为八个阶段：阶段①：0-7min,9％-14％流动相B；阶段②：7-20min，14％-15.5％流动相B；阶段③：20-25min，15.5％-20％流动相B；阶段④：25-30min，20％-24％流动相B；阶段⑤：30-37min，24％-30％流动相B；阶段⑥：37-39min，30％-50％流动相B；阶段⑦：39-39.5min，50％-9％流动相B；阶段⑧：39.5-42min，9％-9％流动相B。

8.根据权利要求1-7任一所述方法，其特征在于，所述步骤4)的比对图谱具体为：先比对样品色谱图与对照色谱图中是否有保留时间相同的峰；如果没有，说明样品中未添加对照图谱对应的抗菌成分，如果有，再进一步比对该保留时间相同的峰在样品光谱图和对照光谱图中的整体峰型、最大吸收波长是否一致，如果一致，则判断样品中含有对照图谱对应的抗菌成分，得到样品中添加的抗菌成分的种类，如果不一致，则判断样品中不含有对照图谱对应的抗菌成分；进一步计算样品色谱图中该峰的峰面积，得到该抗菌成分的添加量。

9.根据权利要求1-8任一所述方法，其特征在于，所述溶剂A为乙腈与0.1％(体积百分含量，v/v)甲酸水溶液的混合液，其中，乙腈：0.1％甲酸水溶液的体积比为(40:60)-(70:30)。

10.根据权利要求1-9任一所述方法，其特征在于，所述步骤2)制备样品溶液具体为：称取兽药样品，加入溶剂A，摇匀，超声3分钟以上，室温下0.22μm滤膜过滤，即得。