CN115856108A - 车前草中药配方颗粒的指纹图谱的构建方法及鉴别方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种中药检测技术领域，特别涉及车前草中药配方颗粒的指纹图谱的构建方法及鉴别方法。所述指纹图谱的构建方法包括以下步骤：取车前草中药配方颗粒，加提取溶剂进行提取处理，收集提取液，制备供试品溶液，取所述供试品溶液进行超超高效液相色谱测定；色谱条件包括：流动相包括流动相A和流动相B，所述流动相A包括乙腈，所述流动相B包括磷酸水溶液，梯度洗脱。本发明所构建的指纹图谱，可以用于解决车前、平车前以及市售混用基原车前草配方颗粒的区分鉴别问题。
Description
技术领域
本发明涉及中药检测技术领域，特别涉及车前草中药配方颗粒的指纹图谱的构建方法及其应用，具体涉及车前草中药配方颗粒的指纹图谱的构建方法和车前草中药配方颗粒的鉴别方法。
背景技术
车前草为车前科植物车前Plantago asiatica L.或平车前Plantago depressaWilld.的干燥全草，其性寒，味甘，具有清热利尿通淋、祛痰、凉血、解毒等功效。车前草配方颗粒是以单味车前草药材为原料，经过前处理炮制成饮片后，采用现代制药技术经水提取、浓缩、制粒而成，供中医临床配方使用，可直接冲服，具有服用量少、卫生安全、携带保存方便等特点。
但车前草配方颗粒已失去原有药材的性味特征，且市面上车前草药材较多出现基原混用的情况，使车前草配方颗粒上也存在同样的混用现象，再加上车前草药材经过水提取之后，车前草配方颗粒的成分多以水溶性成分为主，与药材所含的化学成分存在一定差异。因此，有必要对车前草配方颗粒进行质量研究。
目前指纹图谱广泛地应用于获取全面的中药化学成分特征信息，也是配方颗粒重要质量控制指标之一。但能够获得区分不同基原的车前草配方颗粒的指纹图谱的难度仍然较大。
发明内容
基于此，本发明第一方面提供一种车前草中药配方颗粒的指纹图谱的构建方法。其技术方案如下：
一种车前草中药配方颗粒的指纹图谱的构建方法，其特征在于，
取车前草中药配方颗粒，加提取溶剂进行提取处理，收集提取液，制备供试品溶液，所述车前草中药配方颗粒分别为平车前中药配方颗粒、车前中药配方颗粒或混合基原车前草中药配方颗粒；
取所述供试品溶液进行超高效液相色谱测定；
所述超高效液相色谱的色谱条件包括：
流动相包括流动相A和流动相B，所述流动相A包括乙腈，所述流动相B 包括磷酸水溶液，梯度洗脱；
所述梯度洗脱包括以下程序：
0～2min，所述流动相A的体积分数保持10％，所述流动相B的体积分数保持90％；
2min～4min，所述流动相A的体积分数由10％升高至13％，所述流动相B 的体积分数由90％降低至87％；
4min～14min，所述流动相A的体积分数保持13％，所述流动相B的体积分数保持87％；
14min～24min，所述流动相A的体积分数由13％升高至15％，所述流动相B 的体积分数由87％降低至85％；
24min～25min，所述流动相A的体积分数由15％升高至17％，所述流动相B 的体积分数由85％降低至83％；
25min～31min，所述流动相A的体积分数由17％升高至22％，所述流动相B 的体积分数由83％降低至78％；
31min～41min，所述流动相A的体积分数由22％升高至40％，所述流动相B 的体积分数由78％降低至60％；
41min～48min，所述流动相A的体积分数由40％升高至68％，所述流动相B 的体积分数由60％降低至32％。
在其中一些实施例中，所述超高效液相色谱的色谱条件还包括：
0～3min，检测波长为240nm～250nm；3min～48min，检测波长为 320nm～340nm。
在其中一些实施例中，所述超高效液相色谱的色谱条件还包括：柱温为28℃～32℃。
在其中一些实施例中，所述超高效液相色谱的色谱条件还包括：流速为 0.25mL/min～0.35mL/min。
在其中一些实施例中，所述超高效液相色谱的色谱条件还包括：进样量为 1μL～2μL。
在其中一些实施例中，所述超高效液相色谱的色谱条件还包括：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂。
在其中一些实施例中，所述超高效液相色谱的色谱条件还包括：所述磷酸水溶液中磷酸的体积分数为0.05％～0.2％。
在其中一些实施例中，所述提取溶剂为甲醇水溶液。
在其中一些实施例中，每0.15g所述车前草中药配方颗粒对应加入 20mL～30mL的所述提取溶剂。
在其中一些实施例中，所述提取处理的方法为超声处理。
在其中一些实施例中，所述甲醇水溶液中甲醇的体积分数为40％～80％。
在其中一些实施例中，所述超声处理的时间为20min～40min。
本发明第二方面提供一种车前草中药配方颗粒的鉴别方法。其技术方案如下：
一种车前草中药配方颗粒的鉴别方法，其特征在于，
取待测中药配方颗粒，加提取溶剂进行提取处理，收集提取液，制备待测样品溶液；
按照上述的色谱条件对所述待测样品溶液进行超高效液相色谱测定，将所得色谱图与上述的指纹图谱对应，记录相对应的特征峰以及所述特征峰的峰面积，确定所述待测中药配方颗粒的种类。
在其中一些实施例中，鉴别标准包括：
记大车前苷的特征峰为峰14，以其作为参照峰，与峰14的保留时间的比值为1.282～1.314的特征峰记为峰18，与峰14的保留时间的比值为0.593～0.599 的特征峰记为峰10，与峰14的保留时间的比值为1.730～1.750的特征峰记为峰 22，与峰14的保留时间的比值为0.154～0.155的特征峰记为峰4，与峰14的保留时间的比值为1.113～1.128的特征峰记为峰16；
若待测中药配方颗粒的色谱图出现与权利要求1～4任一项所述的平车前中药配方颗粒的指纹图谱保留时间一致的特征峰，且满足以下条件中的至少一个： a)峰18与峰14的峰面积的比值为0～1.215；b)峰10与峰14的峰面积的比值为0.996～13.247；c)峰22与峰14的峰面积的比值为0.919～12.505；d)峰4与峰14的峰面积的比值为0～0.029；e)峰16与峰14的峰面积的比值为 3.162～50.253；则所述待测中药配方颗粒为平车前中药配方颗粒；
若待测中药配方颗粒的色谱图出现与权利要求1～4任一项所述的车前中药配方颗粒的指纹图谱保留时间一致的特征峰，且满足以下条件中的至少一个：a) 峰18与峰14的峰面积的比值为0.237～0.354；b)峰10与峰14的峰面积的比值为0～0.107；c)峰22与峰14的峰面积的比值为0～0.06；d)峰4与峰14的峰面积的比值为0.140～0.195；e)峰16与峰14的峰面积的比值为0～0.335；则所述待测中药配方颗粒为车前中药配方颗粒；
若待测中药配方颗粒的色谱图出现与权利要求1～4任一项所述的混合基原车前中药配方颗粒的指纹图谱保留时间一致的特征峰，且满足以下条件中的至少一个：a)峰18与峰14的峰面积的比值为0.381～1.219；b)峰10与峰14的峰面积的比值为0.061～0.983；c)峰22与峰14的峰面积的比值为0.208～3.003； d)峰4与峰14的峰面积的比值为0.195～0.808；e)峰16与峰14的峰面积的比值为0.140～0.375；则所述待测中药配方颗粒为混合基原车前中药配方颗粒。
在其中一些实施例中，所述提取溶剂为甲醇水溶液。
在其中一些实施例中，每0.15g所述待测中药配方颗粒对应加入 20mL～30mL的所述提取溶剂。
在其中一些实施例中，所述提取处理的方法为超声处理。
在其中一些实施例中，所述甲醇水溶液中甲醇的体积分数为40％～80％。
在其中一些实施例中，所述超声处理的时间为20min～40min。
与传统方案相比，本发明具有以下有益效果：
本发明通过合理控制超高效液相色谱的流动相条件，构建的平车前配方颗粒的指纹图谱、车前配方颗粒的指纹图谱及混合基原车前草配方颗粒的指纹图谱，能够区分不同基原的车前草配方颗粒，其中，不仅能够区分平车前配方颗粒与车前配方颗粒，还能够将两者与混合基原车前草配方颗粒区分，是一种针对性强的分析方法，能够客观全面地反映车前草配方颗粒的质量。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案、更完整地理解本申请及其有益效果，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单的介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对本领域技术人员来说，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为6批平车前配方颗粒的色谱叠加图；
图2为6批车前配方颗粒的色谱叠加图；
图3为5批混合基原车前草配方颗粒的色谱叠加图；
图4为平车前配方颗粒、车前配方颗粒与混合基原车前草配方颗粒的对照指纹图谱；
图5为混合对照品色谱图(峰1：京尼平苷酸，峰2：1-咖啡酰奎宁酸，峰 14：大车前苷，峰19：毛蕊花糖苷；峰20：车前草苷D；峰21：异毛蕊花糖苷；峰22：芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸苷)；
图6为平车前配方颗粒、车前配方颗粒与混合基原车前草配方颗粒的各成分方差分析图；
图7为平车前配方颗粒、车前配方颗粒与混合基原车前草配方颗粒PCA得分图；
图8为平车前配方颗粒、车前配方颗粒与混合基原车前草配方颗粒HCA图；
图9为平车前配方颗粒、车前配方颗粒与混合基原车前草配方颗粒PLS-DA 图；
图10为平车前配方颗粒、车前配方颗粒与混合基原车前草配方颗粒VIP值图。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步详细的说明。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施方式。相反地，提供这些实施方式的目的是使对本发明公开内容理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
1仪器与材料
1.1仪器
赛默飞超高效液相色谱仪(美国Waters公司)；KQ-700DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；Milli-QDirect超纯水系统(默克股份有限公司)；ME204E型万分之一天平(METTLERTOLEDO公司)；DHG-9147A 型电热恒温干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)。
1.2材料
对照品：京尼平苷酸(批号111828-201805，质量分数，98.1％)；大车前苷(批号111914-202105，质量分数≥96.0％)；毛蕊花糖苷(批号11530-201914，质量分数≥95.2％)均购自中国食品药品检验研究所；1-咖啡酰奎宁酸(批号 DST202101质量分数≥98％)购自乐天美医药公司；车前草苷D(批号 CFS202101，质量分数≥98.0％)购自武汉天植生物技术有限公司；异毛蕊花糖苷(批号19092702，质量分数≥92.6％)购自成都格利普生物科技有限公司；芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸苷(批号21062901，质量分数≥98.3％)购自成都普菲德生物科技有限公司。
甲醇(分析纯，天津富宇精细化工有限公司)，乙腈(色谱纯，默克股份有限公司)，磷酸(色谱纯，佛山西陇化学有限公司)，水为超纯水(取自实验室Milli-Q超纯水系统)。
车前草药材共17批，分别为6批平车前、6批车前以及5批混合基原车前草药材，分别进行前处理炮制、提取、浓缩、喷干、干法制粒，得到相应的17 批车前草配方颗粒，具体如表1所示。
表1
| 序号 | 批号 | 拉丁名 | 按工艺制备得配方颗粒 |
| 1 | P1 | Plantago depressa Willd. | 车前草(平车前)配方颗粒 |
| 2 | P2 | Plantago depressa Willd. | 车前草(平车前)配方颗粒 |
| 3 | P3 | Plantago depressa Willd. | 车前草(平车前)配方颗粒 |
| 4 | P4 | Plantago depressa Willd. | 车前草(平车前)配方颗粒 |
| 5 | P5 | Plantago depressa Willd. | 车前草(平车前)配方颗粒 |
| 6 | P6 | Plantago depressa Willd. | 车前草(平车前)配方颗粒 |
| 7 | C1 | Plantago asiatica L. | 车前草(车前)配方颗粒 |
| 8 | C2 | Plantago asiatica L. | 车前草(车前)配方颗粒 |
| 9 | C3 | Plantago asiatica L. | 车前草(车前)配方颗粒 |
| 10 | C4 | Plantago asiatica L. | 车前草(车前)配方颗粒 |
| 11 | C5 | Plantago asiatica L. | 车前草(车前)配方颗粒 |
| 12 | C6 | Plantago asiatica L. | 车前草(车前)配方颗粒 |
| 13 | H1 | Plantago depressa Willd.&Plantago asiatica L. | 车前草配方颗粒(混合基原) |
| 14 | H2 | Plantago depressa Willd.&Plantago asiatica L. | 车前草配方颗粒(混合基原) |
| 15 | H3 | Plantago depressa Willd.&Plantago asiatica L. | 车前草配方颗粒(混合基原) |
| 16 | H4 | Plantago depressa Willd&Plantago asiatica L. | 车前草配方颗粒(混合基原) |
| 17 | H5 | Plantago depressa Willd.&Plantago asiatica L. | 车前草配方颗粒(混合基原) |
2方法与结果
2.1平车前中药配方颗粒的指纹图谱的构建方法、车前中药配方颗粒的指纹图谱的构建方法、混合基原车前草中药配方颗粒的指纹图谱的构建方法
2.1.1色谱条件
色谱柱Aglient SB C18色谱柱(2.1×100mm，1.6μm)；流动相：乙腈(流动相A)-体积分数为0.1％的磷酸水溶液(流动相B)，梯度洗脱：0～2min，10％(A)； 2～4min，10％～13％(A)；4～14min，13％(A)；14～24min，13％～15％(A)；24～25min， 15％～17％(A)；25～31min，17％～22％(A)；31～41min，22％～40％(A)；41～48min，40％～68％(A)；检测波长：0～3min，245nm；3～48min，330nm；柱温30℃；流速0.3mL/min；进样量1μL。
2.1.2对照品溶液的制备
取京尼平苷酸、1-咖啡酰奎宁酸、大车前苷、毛蕊花糖苷、车前草苷D、异毛蕊花糖苷、芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸苷对照品适量，精密称定，加体积分数为 60％的甲醇水溶液制成每1mL含京尼平苷酸25μg、1-咖啡酰奎宁酸18μg、大车前苷50μg、毛蕊花糖苷60μg、车前草苷D 65μg、异毛蕊花糖苷40μg、芹菜素 -7-O-葡萄糖醛酸苷40μg的混合对照品溶液，经0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得对照品溶液。
2.1.3供试品溶液的制备
取本品研细，取0.15g，精密称定，加体积分数为60％的甲醇水溶液25mL，称定质量，超声30分钟，取出，放至室温，用体积分数为60％的甲醇水溶液补足减失质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。
2.1.4方法学考察
按“2.1.3”项下的方法制备供试品溶液，按“2.1.1”项下的色谱条件进样测定，分别考察精密度、重复性和稳定性。
结果表明，各项试验下，各特征峰的相对保留时间的RSD值＜1.0％，各特征峰的相对峰面积RSD值<4.0％，表明该方法客观、准确可靠。
2.1.5指纹图谱的标定
取P1～P6批次的平车前配方颗粒，按“2.1.3”项下的方法制备供试品溶液，按“2.1.1”项下的色谱条件进样测定，得到6份样品的色谱图，其中，6批平车前配方颗粒的色谱叠加图如图1所示，共标记有16个共有峰，分别为峰1、2、 3、6、9、10、14、16、17、19、21、22、23、24、25、26。
取C1～C6批次的车前配方颗粒，按“2.1.3”项下的方法制备供试品溶液，按“2.1.1”项下的色谱条件进样测定，得到6份样品的色谱图，其中，6批车前配方颗粒的色谱叠加图如图2所示，共标记有20个共有峰，分别为峰1、2、4、 5、6、7、8、9、11、12、13、14、15、18、19、20、23、24、25、26。
取H1～H5批次的混合基原车前草配方颗粒，按“2.1.3”项下的方法制备供试品溶液，按“2.1.1”项下的色谱条件进样测定，得到5份样品的色谱图，其中，5批混合基原车前草配方颗粒的色谱叠加图如图3所示，共标记有26个共有峰，分别为峰1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、 17、18、19、20、21、22、23、24、25、26。
平车前配方颗粒、车前配方颗粒与混合基原车前草配方颗粒的对照指纹图谱见图4。
混合对照品色谱图见图5，共指认7个色谱峰，分别为峰1：京尼平苷酸，峰2：1-咖啡酰奎宁酸，峰14：大车前苷，峰19：毛蕊花糖苷；峰20：车前草苷D；峰21：异毛蕊花糖苷；峰22：芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸苷。
上述17批车前草配方颗粒的图谱的特征峰的保留时间如表2所示，峰面积如表3所示。
表2
表3
2.1.6相似度评价
2.1.6.1以平车前配方颗粒、车前配方颗粒与混合基原车前草配方颗粒的对照指纹图谱R作为参照图谱，经中药色谱指纹图谱相似度评价系统分析得到相似度结果，其中6批平车前配方颗粒的相似度依次为0.998，0.995，0.994，0.995， 0.993，0.996；6批车前配方颗粒的相似度依次为0.994，0.985，0.935，0.991， 0.993，0.998；5批混合基原车前草配方颗粒的相似度依次为0.915，0.943，0.956， 0.982，0.828。6批平车前配方颗粒、6批车前配方颗粒的批次间相似度均>0.93，表明6批平车前配方颗粒、6批车前配方颗粒的批次间的各化学成分稳定，而5 批混合基原车前草配方颗粒的批次间有1批的相似度为0.828，为＜0.9，且整体相似度相较基原明确的车前草配方颗粒均低，表明混合基原车前草配方颗粒各批次间存在一定的差异，推测可能与药材的来源比例有关。
2.1.6.2如上所示，6批平车前配方颗粒的相似度依次为0.998，0.995，0.994，0.995，0.993，0.996，范围在0.99～1.00。以平车前配方颗粒对照指纹图谱为参照图谱，分别与5批混合基原车前草配方颗粒进行全谱峰匹配，相似度依次为 0.309、0.304、0.481、0.655、0.801，范围在0.30～0.80；以平车前配方颗粒对照指纹图谱为参照图谱，分别与6批车前配方颗粒进行全谱峰匹配，相似度依次为0.226、0.185、0.487、0.089、0.120、0.156，范围在0.09～0.49。结果表明，与6批车前配方颗粒的相似度值较大，与5批混合基原车前草配方颗粒确定的范围存在交集，较难区分，因此通过将测定的车前草配方颗粒与平车前配方颗粒的指纹图谱比对，通过相似度值所在的区间，对评判相对应配方颗粒来源会产生一定的误差。
2.1.6.3如上所示，6批车前配方颗粒的相似度依次为0.994，0.985，0.935，0.991，0.993，0.998，范围在0.94～1.00。以车前配方颗粒对照指纹图谱为参照图谱，分别与5批混合基原车前草配方颗粒进行全谱峰匹配，相似度依次为 0.778、0.870、0.923、0.755、0.413，范围在0.41～0.92；以车前配方颗粒对照指纹图谱为参照图谱，分别与6批平车前配方颗粒进行全谱峰匹配，相似度依次为0.218、0.151、0.164、0.148、0.152、0.143，范围在0.14～0.22。结果表明，通过将测定的车前草配方颗粒与车前配方颗粒的指纹图谱比对，通过相似度值所在的区间，可粗略评判相对应配方颗粒来源。
2.2平车前中药配方颗粒、车前中药配方颗粒、混合基原车前草中药配方颗粒的鉴别方法
2.2.1平车前配方颗粒、车前配方颗粒、混合基原车前草配方颗粒的峰面积方差分析
将“2.1.5”项下P1～P6、C1～C6、H1～H5批次的17份样品的色谱图的峰面积经数据处理后分别导入SPSS25.0进行单因素ANOVA方差分析，根据方差齐性检验的结果，大部分色谱峰峰面积方差齐性，将这部分方差齐性的色谱峰峰面积采用Bonferroni进行多重比较显著性分析，少数方差不齐的采用Tamhane T2进行非参数的多重比较分析。峰面积方差分析图如图6所示，图6中“#”表示P<0.05,具有显著性差异。根据峰面积值(未检测到的峰面积以0计)差异具有统计学意义的色谱峰对不同来源的车前草配方颗粒进行分类，峰面积越大，重要程度越大，可知：
第一类，峰10、峰22，在平车前配方颗粒与车前配方颗粒具有显著性差异，在混合基原车前草配方颗粒与车前配方颗粒中也具有显著性差异。其中，峰10 中平车前配方颗粒峰面积>>混合基原车前草配方颗粒>>车前配方颗粒(部分批次测不出)，峰22中平车前配方颗粒峰面积>>混合基原车前草配方颗粒>>车前配方颗粒(基本测不出)，当以峰14(大车前苷)作为参照峰，峰10、峰22 与峰14的保留时间比值分别为0.593～0.599、1.730～1.750，即此二峰可直接用来评判车前草配方颗粒的来源为车前或平车前或混用。
第二类，峰4、峰5、峰8、峰11、峰12、峰18、峰20，车前配方颗粒与平车前配方颗粒具有显著性差异，混合基原车前草配方颗粒与平车前配方颗粒具有显著性差异，当以峰14(大车前苷)作为参照峰，峰4、峰5、峰8、峰11、峰12、峰18、峰20与峰14的保留时间比值分别为0.154～0.155、0.244～0.246、 0.492～0.493、0.633～0.637、0.653～0.655、1.282～1.314、1.426～1.437，以上7个色谱峰中，平车前配方颗粒基本均检测不到或峰面积极低，可用来作为平车前配方颗粒来源的重要区别，与车前配方颗粒或混合基原车前草配方颗粒进行区分；
第三类，峰2、峰3、峰9、峰16、峰19、峰21、峰24，车前配方颗粒与平车前配方颗粒具有显著性差异，混合基原车前草配方颗粒与平车前配方颗粒具有显著性差异，当以峰14(大车前苷)作为参照峰，峰2、峰3、峰9、峰16、峰19、峰21、峰24与峰14的保留时间比值分别为0.101～0.104、0.125～0.133、0.577～0.579、1.113～1.128、1.357～1.364、1.615～1.628、2.142～2.170，以上7个色谱峰中，平车前配方颗粒最高，可用来作为平车前配方颗粒来源的重要区别，与车前配方颗粒或混合基原车前草配方颗粒进行区分；
第四类，峰7、峰14、峰15，车前配方颗粒与平车前配方颗粒具有显著性差异，当以峰14(大车前苷)作为参照峰，峰7、峰15与峰14的保留时间比值分别为0.475～0.477、1.026～1.031，峰14则与对照品保留时间相一致，以上3 个色谱峰中，平车前配方颗粒峰面积最低，可用来作为平车前配方颗粒来源的重要区别，只能与车前配方颗粒进行区分。
第五类，峰17、峰25，车前配方颗粒与平车前配方颗粒具有显著性差异，当以峰14(大车前苷)作为参照峰，峰17、峰25与峰14的保留时间比值分别为1.149～1.160、2.679～2.714，以上2个色谱峰中，平车前配方颗粒峰面积最高，可用来作为平车前配方颗粒来源的重要区别，只能与车前配方颗粒进行区分。
2.2.2平车前中药配方颗粒、车前中药配方颗粒及混合基原车前草中药配方颗粒的指纹图谱化学模式识别研究
2.2.2.1平车前配方颗粒、车前配方颗粒与混合基原车前草配方颗粒主成分分析(PCA)
将“2.1.5”项下P1～P6、C1～C6、H1～H5批次的17份样品的色谱图的峰面积数据经标准化处理后导入Origin 2018，进行主成分分析，得到的主成分得分图如图7所示，以特征值>1共提取了5个主成分，总方差解释表如表4所示。累计方差贡献率为92.44％，可反映出17批次平车前配方颗粒、车前配方颗粒、混合基原车前草配方颗粒整体的信息。
表4
2.2.2.2平车前、车前与混批基原车前草聚类分析(HCA)
“2.1.5”项下P1～P6、C1～C6、H1～H5批次的17份样品的聚类分析图如图 8所示，图8显示：6批次的平车前配方颗粒明显聚为一类；6批次的车前配方颗粒与5批次基原混合车前草配方颗粒明显聚为一类(其中，6批次的车前配方颗粒可再聚为1类，5批次基原混合车前草配方颗粒可再聚为1类)。由此可知，基原混合车前草配方颗粒的整体质量与车前配方颗粒较相近。
2.2.2.3平车前、车前与混批基原车前草偏最小二乘回归分析(PLS-DA)
将“2.1.5”项下P1～P6、C1～C6、H1～H5批次的17份样品的色谱图的峰面积经数据处理后分别导入SIMCA进行PLS-DA分析，对17批样品按已知的类别进行主观的分类，见图9所示，由图9可知，样品可明显地分为3类。其中R2Y达到0.818，表示模型拟合程度好，Q2达到0.61，表示该模型预测能力较强。进一步对模型中29个变量的投影重要度(VIP)进行分析，结果见图10。选择VIP值大于1的变量作为平车前、车前与混合基原车前草样品分类的重要质量指标，共提取了11个重要的特征性指标，重要程度排名依次为峰18、峰1、峰10、峰22、峰4、峰16、峰15、峰2、峰12、峰19、峰5。其中峰1在方差分析中不具有显著性，结合方差分析与PLS-DA的结果，最终确定三种不同来源的车前草配方颗粒中具有中药鉴别意义的色谱峰共10个，依次为峰18、峰 10、峰22、峰4、峰16、峰15、峰2、峰12、峰19、峰5。
2.2.3鉴别标准
综上，平车前中药配方颗粒的鉴别标准可以是：
若待测中药配方颗粒的色谱图出现与上述构建的平车前中药配方颗粒的指纹图谱保留时间一致的特征峰，即若待测中药配方颗粒的色谱图的特征峰有16 个，分别为峰1、2、3、6、9、10、14、16、17、19、21、22、23、24、25、26，其中峰1：京尼平苷酸，峰2：1-咖啡酰奎宁酸，峰14：大车前苷，峰19：毛蕊花糖苷，峰21：异毛蕊花糖苷；峰22：芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸苷，且16个峰的保留时间与上述构建的平车前中药配方颗粒的指纹图谱保留时间一致。且以峰14其作为参照峰，满足以下条件中的至少一个：a)峰18与峰14的峰面积的比值为0～1.215；b)峰10与峰14的峰面积的比值为0.996～13.247；c)峰22 与峰14的峰面积的比值为0.919～12.505；d)峰4与峰14的峰面积的比值为 0～0.029；e)峰16与峰14的峰面积的比值为3.162～50.253；则所述待测中药配方颗粒为平车前中药配方颗粒。
进一步地，以峰14作为参照峰，若峰4与峰14的峰面积的比值为0～0.029，则确定为平车前中药配方颗粒；以峰14作为参照峰，若峰10与峰14的峰面积的比值为0.996～13.247，且峰22与峰14的峰面积的比值为0.919～12.505，则确定为平车前中药配方颗粒；以峰14作为参照峰，若峰16与峰14的峰面积的比值为3.162～50.253，且峰22与峰14的峰面积的比值为0.919～12.505，则确定为平车前中药配方颗粒；以峰14作为参照峰，若峰18与峰14的峰面积的比值为 0～1.215，且峰22与峰14的峰面积的比值为0.919～12.505，则确定为平车前中药配方颗粒。
车前中药配方颗粒的鉴别标准可以是：
若待测中药配方颗粒的色谱图出现与上述构建的车前中药配方颗粒的指纹图谱保留时间一致的特征峰，即若待测中药配方颗粒的色谱图的特征峰有20个，分别为峰1、2、4、5、6、7、8、9、11、12、13、14、15、18、19、20、23、24、25、26，其中峰1：京尼平苷酸，峰2：1-咖啡酰奎宁酸，峰14：大车前苷，峰19：毛蕊花糖苷；峰20：毛蕊花糖苷，且20个峰的保留时间与上述构建的车前中药配方颗粒的指纹图谱保留时间一致。且以峰14其作为参照峰，满足以下条件中的至少一个：a)峰18与峰14的峰面积的比值为0.237～0.354；b)峰 10与峰14的峰面积的比值为0～0.107；c)峰22与峰14的峰面积的比值为0～0.06； d)峰4与峰14的峰面积的比值为0.140～0.195；e)峰16与峰14的峰面积的比值为0～0.335；则所述待测中药配方颗粒为车前中药配方颗粒。
进一步地，以峰14作为参照峰，若峰4与峰14的峰面积的比值为 0.140～0.195，则确定车前中药配方颗粒；以峰14作为参照峰，若峰10与峰14 的峰面积的比值为0～0.107，且峰22与峰14的峰面积的比值为0～0.06，则确定车前中药配方颗粒；以峰14作为参照峰，若峰16与峰14的峰面积的比值为 0～0.335，且峰22与峰14的峰面积的比值为0～0.06，则确定车前中药配方颗粒；以峰14作为参照峰，若峰18与峰14的峰面积的比值为0.237～0.354，且峰22 与峰14的峰面积的比值为0～0.06，则确定车前中药配方颗粒。
混合基原车前草配方颗粒的鉴别标准可以是：
若待测中药配方颗粒的色谱图出现与上述构建的混合基原车前中药配方颗粒的指纹图谱保留时间一致的特征峰，即若待测中药配方颗粒色谱图的特征峰有26个，分别为峰1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、 16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26，其中峰1：京尼平苷酸，峰2： 1-咖啡酰奎宁酸，峰14：大车前苷，峰19：毛蕊花糖苷，峰20：毛蕊花糖苷，峰21：异毛蕊花糖苷；峰22：芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸苷，且26个峰的保留时间与上述构建的混合基原车前中药配方颗粒的指纹图谱保留时间一致。且满足以下条件中的至少一个：a)峰18与峰14的峰面积的比值为0.381～1.219；b) 峰10与峰14的峰面积的比值为0.061～0.983；c)峰22与峰14的峰面积的比值为0.208～3.003；d)峰4与峰14的峰面积的比值为0.195～0.808；e)峰16与峰 14的峰面积的比值为0.140～0.375；则所述待测中药配方颗粒为混合基原车前中药配方颗粒。
进一步地，以峰14作为参照峰，若峰4与峰14的峰面积的比值为 0.195～0.808，则确定为混合基原车前中药配方颗粒；以峰14作为参照峰，若峰 10与峰14的峰面积的比值为0.061～0.983，且峰22与峰14的峰面积的比值为 0.208～3.003，则确定为混合基原车前中药配方颗粒；以峰14作为参照峰，若峰 16与峰14的峰面积的比值为0.140～0.375，且峰22与峰14的峰面积的比值为 0.208～3.003，则确定为混合基原车前中药配方颗粒；以峰14作为参照峰，若峰 18与峰14的峰面积的比值为0.381～1.219，且峰22与峰14的峰面积的比值为 0.208～3.003，则确定为混合基原车前中药配方颗粒。
本发明构建了车前草配方颗粒不同基原的指纹图谱，根据车前草不同来源所含成分存在差异的特点，可用于对车前草配方颗粒的来源组成进行真伪鉴别。
本发明通过进行了方差分析以及进行化学识别模式(PCA、HCA以及 PLS-DA)分析，针对平车前、车前及混合基原车前草配方颗粒的鉴别，分别筛选出了各自鉴别模型的鉴别指标及重要程度排序，可以用于不同基原的车前草配方颗粒的分析鉴别工作。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.一种车前草中药配方颗粒的指纹图谱的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
取车前草中药配方颗粒，加提取溶剂进行提取处理，收集提取液，制备供试品溶液，所述车前草中药配方颗粒分别为平车前中药配方颗粒、车前中药配方颗粒或混合基原车前草中药配方颗粒；
取所述供试品溶液进行超高效液相色谱测定；
所述超高效液相色谱的色谱条件包括：
流动相包括流动相A和流动相B，所述流动相A包括乙腈，所述流动相B包括磷酸水溶液，梯度洗脱；
所述梯度洗脱包括以下程序：
0～2min，所述流动相A的体积分数保持10％，所述流动相B的体积分数保持90％；
2min～4min，所述流动相A的体积分数由10％升高至13％，所述流动相B的体积分数由90％降低至87％；
4min～14min，所述流动相A的体积分数保持13％，所述流动相B的体积分数保持87％；
14min～24min，所述流动相A的体积分数由13％升高至15％，所述流动相B的体积分数由87％降低至85％；
24min～25min，所述流动相A的体积分数由15％升高至17％，所述流动相B的体积分数由85％降低至83％；
25min～31min，所述流动相A的体积分数由17％升高至22％，所述流动相B的体积分数由83％降低至78％；
31min～41min，所述流动相A的体积分数由22％升高至40％，所述流动相B的体积分数由78％降低至60％；
41min～48min，所述流动相A的体积分数由40％升高至68％，所述流动相B的体积分数由60％降低至32％。
2.根据权利要求1所述的车前草中药配方颗粒的指纹图谱的构建方法，其特征在于，所述超高效液相色谱的色谱条件还包括以下条件中的至少一个：
0～3min，检测波长为240nm～250nm；3min～48min，检测波长为320nm～340nm；
柱温为28℃～32℃；
流速为0.25mL/min～0.35mL/min；
进样量为1μL～2μL；
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；
所述磷酸水溶液中磷酸的体积分数为0.05％～0.2％。
3.根据权利要求1或2任一项所述的车前草中药配方颗粒的指纹图谱的构建方法，其特征在于，还包括以下特征中的至少一项：
所述提取溶剂为甲醇水溶液；
每0.15g所述车前草中药配方颗粒对应加入20mL～30mL的所述提取溶剂；
所述提取处理的方法为超声处理。
4.根据权利要求3所述的车前草中药配方颗粒的指纹图谱的构建方法，其特征在于，还包括以下特征中的至少一项：
所述甲醇水溶液中甲醇的体积分数为40％～80％；
所述超声处理的时间为20min～40min。
5.一种车前草中药配方颗粒的鉴别方法，其特征在于，包括以下步骤：
取待测中药配方颗粒，加提取溶剂进行提取处理，收集提取液，制备待测样品溶液；
按照权利要求1～4任一项所述的色谱条件对所述待测样品溶液进行超高效液相色谱测定，将所得色谱图与权利要求1～4任一项所述的指纹图谱对应，记录相对应的特征峰以及所述特征峰的峰面积，确定所述待测中药配方颗粒的种类。
6.根据权利要求5所述的车前草中药配方颗粒的鉴别方法，其特征在于，鉴别标准包括：
记大车前苷的特征峰为峰14，以其作为参照峰，与峰14的保留时间的比值为1.282～1.314的特征峰记为峰18，与峰14的保留时间的比值为0.593～0.599的特征峰记为峰10，与峰14的保留时间的比值为1.730～1.750的特征峰记为峰22，与峰14的保留时间的比值为0.154～0.155的特征峰记为峰4，与峰14的保留时间的比值为1.113～1.128的特征峰记为峰16；
若待测中药配方颗粒的色谱图出现与权利要求1～4任一项所述的平车前中药配方颗粒的指纹图谱保留时间一致的特征峰，且满足以下条件中的至少一个：a)峰18与峰14的峰面积的比值为0～1.215；b)峰10与峰14的峰面积的比值为0.996～13.247；c)峰22与峰14的峰面积的比值为0.919～12.505；d)峰4与峰14的峰面积的比值为0～0.029；e)峰16与峰14的峰面积的比值为3.162～50.253；则所述待测中药配方颗粒为平车前中药配方颗粒；
若待测中药配方颗粒的色谱图出现与权利要求1～4任一项所述的车前中药配方颗粒的指纹图谱保留时间一致的特征峰，且满足以下条件中的至少一个：a)峰18与峰14的峰面积的比值为0.237～0.354；b)峰10与峰14的峰面积的比值为0～0.107；c)峰22与峰14的峰面积的比值为0～0.06；d)峰4与峰14的峰面积的比值为0.140～0.195；e)峰16与峰14的峰面积的比值为0～0.335；则所述待测中药配方颗粒为车前中药配方颗粒；
若待测中药配方颗粒的色谱图出现与权利要求1～4任一项所述的混合基原车前中药配方颗粒的指纹图谱保留时间一致的特征峰，且满足以下条件中的至少一个：a)峰18与峰14的峰面积的比值为0.381～1.219；b)峰10与峰14的峰面积的比值为0.061～0.983；c)峰22与峰14的峰面积的比值为0.208～3.003；d)峰4与峰14的峰面积的比值为0.195～0.808；e)峰16与峰14的峰面积的比值为0.140～0.375；则所述待测中药配方颗粒为混合基原车前中药配方颗粒。
7.根据权利要求5或6任一项所述的车前草中药配方颗粒的鉴别方法，其特征在于，所述提取溶剂为甲醇水溶液。
8.根据权利要求7所述的车前草中药配方颗粒的鉴别方法，其特征在于，所述甲醇水溶液中甲醇的体积分数为40％～80％。
9.根据权利要求5或6任一项所述的车前草中药配方颗粒的鉴别方法，其特征在于，每0.15g所述待测中药配方颗粒对应加入20mL～30mL的所述提取溶剂。
10.根据权利要求5或6任一项所述的车前草中药配方颗粒的鉴别方法，其特征在于，所述提取处理的方法为超声处理；优选地，所述超声处理的时间为20min～40min。
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| CN116893227A (zh) * | 2023-06-14 | 2023-10-17 | 广东一方制药有限公司 | 车前子、盐车前子和炒车前子的指纹图谱的构建方法、其鉴别方法 |
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| CN109444290A (zh) * | 2018-12-21 | 2019-03-08 | 广东方制药有限公司 | 车前草药材uplc特征图谱的构建方法和检测方法 |
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