CN116893227A - 车前子、盐车前子和炒车前子的指纹图谱的构建方法、其鉴别方法 - Google Patents
车前子、盐车前子和炒车前子的指纹图谱的构建方法、其鉴别方法 Download PDFInfo
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Abstract
本申请涉及中药检测技术领域，具体涉及车前子、盐车前子或炒车前子的指纹图谱的构建方法、其鉴别方法。该构建方法包括步骤：提供供试品溶液：将供试品用提取溶剂进行提取，得到提取物；将提取物分散于水，加入乙酸乙酯萃取；取供试品溶液进行色谱分析，包括条件：流动相A为乙腈，流动相B为体积浓度0.05％～0.2％的磷酸水溶液，采用梯度洗脱。本申请的构建方法制得的车前子、盐车前子和炒车前子的指纹图谱，其具有丰富的特征峰信息，涉及多种与中药材传统功效具有药效一致性的有效成分，可以从整体上反映车前子及其炮制品的质量，作为质量控制的依据。
Description
技术领域
本申请涉及中药检测技术领域，具体涉及车前子、盐车前子和炒车前子的指纹图谱的构建方法、其鉴别方法。
背景技术
传统中药车前子是车前科植物车前(Plantago asiatica L.)或平车前(Plantagodepressa Willd.)的干燥成熟种子，始载于《神农本草经》，味甘，性微寒，具有热利尿通淋、渗湿止泻、明目、祛痰之效，主治热淋涩痛、水肿胀满、暑湿泄泻、目赤肿痛、痰热咳嗽等。现代车前子的炮制方法主要为净制、炒制和盐制，生品长于利尿通淋，炮制后寒性减弱，盐车前子善于渗湿止泻，炒车前子善于祛痰止咳。中药发挥药效作用的基础是多种有效成分的合理、有机的组合，其模式是多途径作用于机体内与疾病相关的多靶点，发挥对机体的整体调节作用。因此，车前子生品与炮制品的功效不同可理解为内在化学成分存在差异。
2020版药典规定了车前子的质量检测项京尼平苷酸和毛蕊花糖苷。京尼平苷酸为环烯醚萜苷类化合物，毛蕊花糖苷又名类叶升麻苷、麦角甾苷，为苯乙醇苷类化合物。京尼平苷酸在车前子中占有较高的占比，因此在指纹图谱中京尼平苷酸的响应值较高，导致其他峰被隐藏或不能清晰地呈现，图谱反映的化学信息不够全面。以上两种化合物主要表现抗糖、抗氧化、抗炎等活性，而未见关于镇咳、平喘、祛痰、镇痛的相关功效报道。传统功效是对中药有效性的概括，也是临床用药的依据，有必要开发与传统功效具有药效一致性的质量标志物。
车前子的化学成分包括多糖类、苯乙醇苷类、环烯醚萜类、黄酮类、生物碱类、三萜类以及甾醇类等化合物，现代药理研究表明，车前子中苯乙醇苷类具有抗氧化、利尿、免疫调节、抗炎、抗菌、保肝等作用，黄酮类成分具有镇咳、平喘、祛痰、抗炎、镇痛作用，这几类化合物与车前子的传统功效一致，是车前子传统功效的主要药效物质基础，也是车前子质量标志物筛选主要途径和重要依据。中药指纹图谱系指中药经适当处理后，采用一定的分析方法得到的能够体现中药整体特性的图谱。根据质量控制目的，其可分为指纹图谱和特征图谱。指纹图谱是基于图谱的整体信息，用于中药质量的整体评价；特征图谱是选取图谱中某些重要的特征信息，作为控制中药质量的鉴别手段。中药指纹图谱、特征图谱技术可以整体、宏观地表征被测样品主要化学成分的特征，是目前公认的最适合中药及天然药物内在物质群质量控制的手段之一。可以通过建立车前子及其炮制品的指纹图谱，实现其检测和鉴别。
有研究表明，车前子经炮制后有机酸在整体中所占比例大大增加，同时苯乙醇苷、黄酮类等成分在炮制过程中易发生分解或转化，但采用常规的提取方式获得的指纹图谱中京尼平苷酸峰非常高，导致其他成分难以呈现，不利于对车前子或其炮制品进行鉴别。车前子传统入药方式为水煎服用，普遍认为应该对车前子煎液进行分析，研究其谱效关系。然而现代医学研究表明，车前子乙酸乙酯部位是起到利尿、消炎、止咳的功能的关键药效部位，还有研究报道乙酸乙酯提取部位具有很好的抗氧化活性，这与车前子的传统功效是相一致的，对车前子的乙酸乙酯部位进行质量控制具有重要意义。
有鉴于此，特提出本申请的技术方案。
发明内容
基于此，本申请的目的包括提供车前子、盐车前子或炒车前子的特征图谱的构建方法，以及车前子、盐车前子和炒车前子的鉴别方法。
具体而言，所述指纹图谱的构建方法，其包括如下步骤：
提供供试品溶液，包括如下步骤：将供试品用提取溶剂进行提取，得到提取物；将所述提取物分散于水，加入乙酸乙酯萃取；所述供试品为车前子、盐车前子或炒车前子；
取所述供试品溶液进行液相色谱分析，所述液相色谱分析的条件包括：
(1)流动相A为乙腈，流动相B为体积浓度0.05％～0.2％的磷酸水溶液，和
(2)采用梯度洗脱，所述梯度洗脱的程序包括：
0min～5min，所述流动相A的体积百分比由10％上升至16％，
5min～15min，所述流动相A的体积百分比由16％上升至18％，
15min～20min，所述流动相A的体积百分比由18％上升至25％，
20min～25min，所述流动相A的体积百分比由25％上升至45％，
25min～30min，所述流动相A的体积百分比由45％上升至60％，
30min～40min，所述流动相A的体积百分比由60％上升至70％，
40min～41min，所述流动相A的体积百分比由70％下降至10％，
41min～50min，所述流动相A的体积百分比维持10％。
所述鉴别方法，其包括如下步骤：
取车前子、盐车前子和炒车前子的标准品作为对照品，分别根据上文所述的构建方法制备对应的指纹图谱；
提供待测品溶液，包括如下步骤：将待测品用提取溶剂进行提取，得到提取物；将所述提取物分散于水，加入乙酸乙酯萃取；
取所述待测品溶液进行液相色谱分析，获得待测品色谱图谱，将所述待测品色谱图谱和所述车前子对照品指纹图谱、盐车前子对照品指纹图谱以及炒车前子对照品指纹图谱分别进行比对；
所述液相色谱分析的条件包括：
(1)流动相A为乙腈，流动相B为体积浓度0.05％～0.2％的磷酸水溶液，和
(2)采用梯度洗脱，所述梯度洗脱的程序包括：
0min～5min，所述流动相A的体积百分比由10％上升至16％，
5min～15min，所述流动相A的体积百分比由16％上升至18％，
15min～20min，所述流动相A的体积百分比由18％上升至25％，
20min～25min，所述流动相A的体积百分比由25％上升至45％，
25min～30min，所述流动相A的体积百分比由45％上升至60％，
30min～40min，所述流动相A的体积百分比由60％上升至70％，
40min～41min，所述流动相A的体积百分比由70％下降至10％，
41min～50min，所述流动相A的体积百分比维持10％。
本申请的构建方法制得的车前子、盐车前子和炒车前子的指纹图谱，其具有丰富的特征峰信息，涉及多种与中药材传统功效具有药效一致性的有效成分，包括黄酮类、环烯醚萜类、苯乙醇苷类等多种类别，可以从整体上反映车前子及其炮制品的质量，作为质量控制的依据，并且有助于建立具有实际意义的“谱效关系”，为临床药用提供理论依据。
本申请通过建立合适的色谱条件制备车前子、盐车前子和炒车前子的指纹图谱，分别获取车前子、盐车前子和炒车前子的特征性指标，彼此之间具有显著差异，可以很好的实现鉴别，其中，车前子的指纹图谱中指认成分包括京尼平苷酸、阿魏酸、大车前苷、木犀草苷、毛蕊花糖苷、车前草苷D、野漆树苷、芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸苷和芹菜素；盐车前子的指纹图谱中指认成分包括京尼平苷酸、原儿茶酸、阿魏酸、毛蕊花糖苷、木通苯乙醇苷B、车前草苷D、异毛蕊花糖苷、野漆树苷、芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸苷、木犀草素和芹菜素；炒车前子的指纹图谱中指认成分包括京尼平苷酸、原儿茶酸、阿魏酸、毛蕊花糖苷、木通苯乙醇苷B、车前草苷D、异毛蕊花糖苷、野漆树苷、芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸苷、木犀草素和芹菜素。该指纹图谱还可结合统计学分析、化学模式识别研究、色度值研究以及抗氧化活性的测定，实现从内在成分、外观颜色及药效活性上全面区分车前子及其炮制品盐车前子和炒车前子。
附图说明
为了更清楚地说明本申请具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本申请的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为实施例1中12批车前子UPLC图谱的叠加图；
图2为实施例1中12批炒车前子UPLC图谱的叠加图；
图3为实施例1中12批盐车前子UPLC图谱的叠加图；
图4为实施例1中车前子、盐车前子、炒车前子指纹图谱及其和对照品色谱图谱的对比结果，其中A为混合对照品的色谱图、B为车前子指纹图谱、C为炒车前子指纹图谱、D为盐车前子指纹图谱；
图5为实施例1中12批车前子、盐车前子、炒车前子UPLC检测结果的主成分分析得分图；
图6为实施例1中12批车前子、盐车前子、炒车前子UPLC检测结果的聚类分析结果图；
图7为实施例1中12批车前子、盐车前子、炒车前子UPLC检测结果的正交偏最小二乘判别分析结果图；
图8为实施例1中12批车前子、盐车前子、炒车前子UPLC检测结果的变量重要性投影分析结果图；
图9为实施例1中12批车前子、炒车前子及盐车前子UPLC检测结果的偏最小二乘回归分析标准化回归系数；
图10为对比例1中不同供试品溶液制备条件下制得的车前子、盐车前子和差车前子的指纹图谱对比图；
图11为对比例2中不同流动相洗脱条件下制得的车前子的指纹图谱对比图，其中的11A对应洗脱程序1～3、11B对应洗脱程序4～6。
具体实施方式
下面结合实施方式、实施例和附图，进一步阐述本申请。应理解，这些实施例仅用于说明本申请而不用于限制本申请的范围。此外应理解，在阅读了本申请讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本申请作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书的保护范围。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本申请的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本申请的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本申请。
术语
除非另外说明或存在矛盾之处，本文中使用的术语或短语具有以下含义：
本文所使用的术语“和/或”、“或/和”、“及/或”的选择范围包括两个或两个以上相关所列项目中任一个项目，也包括相关所列项目的任意的和所有的组合，所述任意的和所有的组合包任意的两个相关所列项目、任意的更多个相关所列项目、或者全部相关所列项目的组合。
本文中，“优选”、“较佳”、“更佳”等仅为描述效果更好的实施方式或实施例，应当理解，并不构成对本申请防护范围的限制。
本申请中，“进一步”、“更进一步”、“特别”等用于描述目的，表示内容上的差异，但并不应理解为对本申请保护范围的限制。
本申请中，以开放式描述的技术特征中，包括所列举特征组成的封闭式技术方案，也包括包含所列举特征的开放式技术方案。
本申请中，涉及到数值区间(也即数值范围)，如无特别说明，可选的数值分布在上述数值区间内视为连续，且包括该数值范围的两个数值端点(即最小值及最大值)，以及这两个数值端点之间的每一个数值。如无特别说明，当数值区间仅仅指向该数值区间内的整数时，包括该数值范围的两个端点整数，以及两个端点之间的每一个整数。此外，当提供多个范围描述特征或特性时，可以合并这些范围。换言之，除非另有指明，否则本文中所公开之范围应理解为包括其中所归入的任何及所有的子范围。
本申请中，重量可以是μg、mg、g、kg等化工领域公知的质量单位。
在本申请的一个方面，提供车前子、盐车前子和炒车前子的指纹图谱的构建方法，该方法制得的指纹图谱具系统性、特征性和稳定性，可更全面的反映车前子药材或其炮制品的内在化学信息，且图谱体现的特征信息与中药的传统功效具有相关性，可提供临床药用参考，该方法简单易于操作，耗时短，节省成本。
目前已公开的车前子或其炮制品的检测和/或鉴别方法中，普遍存在指标成分京尼平苷酸的响应值过高，导致其余成分的特征峰难以辨认的问题。由于京尼平苷酸在车前子中的含量较高，较难避免这一问题。此外，车前子炮制前后的化学成分已经发生了变化，经研究发现，盐制或炒制后的车前子中有机酸类大大增加，苯乙醇苷、黄酮类等成分也存在分解或转化的情况，而这些成分的变化较难同时体现于指纹图谱中。
为克服上述问题，本申请采用乙酸乙酯萃取的方式制备供试品溶液，在富集中小极性成分的同时减少京尼平苷酸的保留，使车前子指纹图谱呈现信息可以更加丰富。
在一些实施方式中，车前子、盐车前子或炒车前子的构建方法包括如下步骤：
提供供试品溶液，包括如下步骤：将供试品用提取溶剂进行提取，得到提取物；将提取物分散于水，加入乙酸乙酯萃取；供试品为车前子、盐车前子或炒车前子；
取供试品溶液进行液相色谱分析，液相色谱分析的条件包括：
(1)流动相A为乙腈，流动相B为体积浓度0.05％～0.2％的磷酸水溶液，和
(2)采用梯度洗脱，所述梯度洗脱的程序包括：
0～5min，流动相A的体积百分比由10％上升至16％，
5min～15min，流动相A的体积百分比由16％上升至18％，
15min～20min，流动相A的体积百分比由18％上升至25％，
20min～25min，流动相A的体积百分比由25％上升至45％，
25min～30min，流动相A的体积百分比由45％上升至60％，
30min～40min，流动相A的体积百分比由60％上升至70％，
40min～41min，流动相A的体积百分比由70％下降至10％，
41min～50min，流动相A的体积百分比维持10％。
优选地，采用超高效液相色谱分析仪(UPLC)进行液相色谱分析。
在一些实施方式中，提取溶剂包括甲醇，提取方式包括超声。
在一些实施方式中，超声的条件包括如下至少一种：
(1)超声的功率为200W～300W，
(2)超声的频率为30kHz～50kHz，和
(3)超声的时间为50min～70min。
在一些实施方式中，提供供试品溶液的条件包括如下至少一种：
(1)水和乙酸乙酯的体积比为1：(1～3)，
(2)供试品和提取溶剂的质量体积比为1g/(20～30)mL，和
(3)供试品和乙酸乙酯的质量体积比为1g/(20～60)mL。
在一些实施方式中，色谱分析中：
0min～10.5min，检测波长为240nm～250nm，
10.5min～35.5min，检测波长为320nm～340nm，
35.5min～50min，检测波长为240nm～250nm。
在一些实施方式中，色谱分析的条件还包括如下至少一种：
(1)色谱柱为C18色谱柱，
(2)色谱柱柱长为100mm～150mm、内径为2mm～2.2mm、粒径为1.6μm～1.9μm，
(3)流速为0.28mL/min～0.32mL/min，
(4)柱温为28℃～32℃，和
(5)进样量为1μL～3μL。
在一些实施方式中，色谱分析采用合适的对照品，对照品可以选自京尼平苷酸、原儿茶酸、阿魏酸、大车前苷、木犀草苷、毛蕊花糖苷、木通苯乙醇苷B、车前草苷D、异毛蕊花糖苷、野漆树苷、芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸苷、木犀草素、芹菜素中的一种或几种的组合。
可选地，供试品为车前子，对照品包括京尼平苷酸、阿魏酸、大车前苷、木犀草苷、毛蕊花糖苷、车前草苷D、野漆树苷、芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸苷和芹菜素中的至少一种。
可选地，供试品为盐车前子，对照品包括京尼平苷酸、原儿茶酸、阿魏酸、毛蕊花糖苷、木通苯乙醇苷B、车前草苷D、异毛蕊花糖苷、野漆树苷、芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸苷、木犀草素和芹菜素中的至少一种。
可选地，供试品为炒车前子，对照品包括京尼平苷酸、原儿茶酸、阿魏酸、毛蕊花糖苷、木通苯乙醇苷B、车前草苷D、异毛蕊花糖苷、野漆树苷、芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸苷、木犀草素和芹菜素中的至少一种。
在一些实施方式中，参照物用溶剂溶解，制得参照物溶液，取参照物溶液进行色谱分析。进一步，溶剂可以选自甲醇。
在一些实施方式中，参照物在溶剂中的质量浓度为30μg/mL～160μg/mL。
在本申请的再一方面，涉及车前子、盐车前子和炒车前子的鉴别方法，该方法是通过建立合适的色谱条件制备车前子、盐车前子和炒车前子炮制品的指纹图谱，获取车前子、盐车前子和炒车前子的特征性指标，该指纹图谱还可结合统计学分析、化学模式识别研究、色度值研究以及抗氧化活性的测定，实现从内在成分、外观颜色及药效活性上全面区分车前子及其炮制品盐车前子和炒车前子。
在一些实施方式中，车前子、盐车前子和炒车前子的鉴别方法包括如下步骤：
取车前子、盐车前子和炒车前子的标准品作为对照品，分别根据上述任一技术方案所述的构建方法制备对应的指纹图谱；
提供待测品溶液，包括如下步骤：将待测品用提取溶剂进行提取，得到提取物；将提取物分散于水，加入乙酸乙酯萃取；
取待测品溶液进行液相色谱分析，获得待测品色谱图谱，将待测品色谱图谱和车前子对照品指纹图谱、盐车前子对照品指纹图谱以及炒车前子对照品指纹图谱分别进行比对；
液相色谱分析的条件包括：
(1)流动相A为乙腈，流动相B为体积浓度0.05％～0.2％的磷酸水溶液，和
(2)采用梯度洗脱，梯度洗脱的程序包括：
0mm～5min，流动相A的体积百分比由10％上升至16％，
5mm～15min，流动相A的体积百分比由16％上升至18％，
15mm～20min，流动相A的体积百分比由18％上升至25％，
20mm～25min，流动相A的体积百分比由25％上升至45％，
25mm～30min，流动相A的体积百分比由45％上升至60％，
30mm～40min，流动相A的体积百分比由60％上升至70％，
40mm～41min，流动相A的体积百分比由70％下降至10％，
41mm～50min，流动相A的体积百分比维持10％。
优选地，采用超高效液相色谱分析仪(UPLC)进行液相色谱分析。
在一些实施方式中，提取溶剂包括甲醇，所述提取的方式包括超声。
在一些实施方式中，超声的条件包括如下至少一种：
(1)所述超声的功率为200W～300W，
(2)所述超声的频率为30kHz～50kHz，和
(3)所述超声的时间为50min～70min。
在一些实施方式中，提供待测品溶液的条件包括如下至少一种：
(1)水和乙酸乙酯的体积比为1：(1～3)，
(2)供试品和提取溶剂的质量体积比为1g/(20～30)mL，和
(3)供试品和乙酸乙酯的质量体积比为1g/(20～60)mL。
在一些实施方式中，色谱分析中：
0min～10.5min，检测波长为240nm～250nm，
10.5min～35.5min，检测波长为320nm～340nm，
35.5min～50min，检测波长为240nm～250nm。
在一些实施方式中，色谱分析的条件还包括如下至少一种：
(1)色谱柱为C18色谱柱，
(2)色谱柱柱长为100mm～150mm、内径为2mm～2.2mm、粒径为1.6μm～1.9μm，
(3)流速为0.28mL/min～0.32mL/min，
(4)柱温为28℃～32℃，和
(5)进样量为1μL～3μL。
在一些实施方式中，鉴别方法还包括对待测物进行色度值鉴别。
在一些实施方式中，色度值鉴别包括如下步骤：采用分光测色仪对车前子、盐车前子、炒车前子和待测品分别进行色度值测定；
测定方法举例如：取样品粉末适量，均匀平铺于玻片上，压制厚度约1mm，采用国际照明委员会认可的D65光源，以白色作为背景，测定孔径8mm，视角选择2度，经白板校正后，采集饮片粉末色彩图像，并测定色度值，平行三次，取平均值。
在一些实施方式中，鉴别方法还包括对待测物进行抗氧化活性测定，基于抗氧化活性的差异进一步实现鉴别。
在一些实施方式中，抗氧化活性测定的方法包括：在预试验的基础上，将供试品溶液的浓度设定为60μg/mL，按照格锐思试剂盒的规定方法进行测定。
测定的操作步骤举例如：
(1)试剂溶液的配制：
试剂一：临用前甩几下使粉剂落入底部，每支加0.49mL蒸馏水溶解。
试剂二：临用前甩几下使粉剂落入底部，每支加2.86mL蒸馏水，充分溶解备用。
ABTS工作液的配制：临用前根据样本量按试剂一：试剂二＝1:1比例混合，避光反应12h后(二天内用完)，再用无水乙醇稀释20～30倍备用，各试剂及其配方参见表1。
表1ABTS反应体系
将上述溶液充分混匀后避光静置6min，转移至玻璃比色皿(光径1cm)中，于734nm处读取吸光度值，分别记为A空白、A对照和A测定，并计算ABTS自由基清除率。ABTS自由基清除率％＝[1-(A测定-A对照)/A空白]×100％。
在一些实施方式中，构建指纹图谱的步骤还包括对指纹图谱的共有峰的峰面积进行多元统计分析。
在一些实施方式中，取车前子、盐车前子和炒车前子的指纹图谱，获取各图谱的共有峰峰面积并折算扣除水分，分别导入SPSS25.0软件进行单因素方差分析，并采用SIMCA14.l软件进行聚类分析、主成分分析以及正交偏最小二乘法判别分析，对车前子、盐车前子和炒车前子的指纹图谱的差异性进行多元统计分析。
在一些实施方式中，采用分光测色仪测定车前子药材及其炮制饮片粉末的色度值L*、a*、b*，按公式总色度值E*＝(L*2+a*2+b*2)1/2、ΔL*＝L*-L0*、Δa*＝a*-a0*、Δb*＝b*-b0*、色差ΔE*＝(ΔL*2+Δa*2+Δb*2)1/2，计算各自样品的E*、ΔL*、Δa*、Δb*及ΔE*值，用于表达生品到炮制品的颜色变化情况，当ΔE*为6～12时，其色差可被肉眼识别，当ΔE*>12时,色差显著。
在一些实施方式中，抗氧化活性的测定包括：稀释供试品溶液，按照格锐思试剂盒的规定方法测定车前子药材及其炮制饮片的抗氧化活性，根据公式：ABTS自由基清除率％＝[1-(A测定-A对照)/A空白]×100％计算样品的抗氧化能力。
在一些实施方式中，谱-效关系分析包括：(1)利用SIMCA14.1软件，以车前子药材及其炮制饮片的ABTS清除率为因变量，共有峰的峰面积经折算扣除水分后为自变量，采用偏最小二乘回归分析(PLSR)，进行相关性分析，建立回归方程，回归系数大于0，表明其与抗氧化活性呈正相关，回归系数小于0，表明其与与抗氧化活性呈负相关；(2)利用spssau23.0软件，以抗氧化活性均值化后的数据为母序列，共有峰的峰面积均值化后的数据为子序列计算关联度，当关联度大于0.8，则表示母序列与子序列关联度较大；当关联度介于0.6～0.8，则表示二者关联度一般；当关联度小于0.6，则表示二者关联度较小。
以下为一些具体实施例。
以下具体实施例中未写明的实验参数，优先参考本申请文件中给出的指引，还可以参考本领域的实验手册或本领域已知的其它实验方法，或者参考厂商推荐的实验条件。
以下具体实施例中涉及的原料和试剂，可以通过市售得到，或者本领域技术人员能够根据已知手段制备。
实施例1
1.仪器与材料
1.1.仪器
Waters ACQUITY型超高效液相色谱系统(美国沃特世公司)；Thermo Q-ExactiveFocus型液质联用仪(美国赛默飞公司)；ME204E型、XP26型分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；KQ-700DE型数控超声清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；HWS28型电热恒温水浴锅(上海一恒科技有限公司)；111B型二两装高速中药粉碎机(浙江瑞安市永历制药机械有限公司)；H22-X3型电陶炉(杭州九阳生活电器有限公司)；TS7700型分光测色仪(深圳市三恩时科技有限公司)；UV-2600型紫外分光光度计(日本岛津公司)。
1.2.材料
京尼平苷酸(批号：11828-201805，纯度98.1％，中国食品药品检定研究院)；阿魏酸(批号：110773-201915，纯度99.4％，中国食品药品检定研究院)；大车前苷(批号：111914-202105，纯度96.0％，中国食品药品检定研究院)；木犀草苷(批号：111720-202111，纯度96.6％，中国食品药品检定研究院)；毛蕊花糖苷(批号：111530-201914，纯度95.2％，中国食品药品检定研究院)；异毛蕊花糖苷(批号：FF17B039，纯度98％，成都普思生物科技有限公司)；车前草苷D(批号：CFS202101，纯度98.0％，ChemFaces公司)；芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸苷(批号：21062901，纯度98.29％，成都普菲德生物科技有限公司)；木犀草素(批号：111520-202006，纯度94.4％，中国食品药品检定研究院)；芹菜素(批号：111901-202004，纯度99.4％，中国食品药品检定研究院)；原儿茶酸(批号：110809-201906，纯度97.7％，中国食品药品检定研究院)；野漆树苷(批号：111919-201804，纯度95.5％，中国食品药品检定研究院)；木通苯乙醇苷B(批号：111910-201604，纯度98.2％，中国食品药品检定研究院)；色谱级甲醇、乙腈(德国默克股份有限公司)；色谱级磷酸(天津市科密欧化学试剂有限公司)；水为超纯水(取自实验室Milli-Q超纯水系统)，其余试剂均为分析纯；ABTS自由基清除能力检测试剂盒(货号：G0127F，苏州格锐思生物科技有限公司)。
12批车前子药材经广东一方制药有限公司孙冬梅主任中药师鉴定为车前科植物车前(Plantago asiatica L.)的干燥成熟种子，12批炒车前子和12批盐车前子为广东一方制药有限公司实验室自制。具体样品信息见表2。
表2样品来源信息表
2.方法与结果
2.1.炒车前子、盐车前子的制备
2.1.1.炒车前子
取净车前子，照《广东省中药饮片炮制规范》第一册炒车前子炮制项下规定，炒至略有爆声并有香气溢出时，取出摊凉，即得。
2.1.2.盐车前子
取净车前子，照2020年版《中国药典》2020年版一部盐车前子炮制项下规定，照盐水炙法(通则0213)炒至起爆裂声时，喷洒盐水，炒干，取出摊凉，即得。
2.2.车前子及其不同炮制品指纹图谱的建立
2.2.1.色谱条件
采用Waters ACQUITY UPLC HSS T3 Column(2.1mm×150mm，1.8μm)色谱柱；流动相为乙腈(A):0.1％磷酸水溶液(B)，梯度洗脱(0～5min，10％A；5～15min，16％～18％A；15～20min，18％～25％A；20～25min，25％～45％A；25～30min，45％～60％A；30～40min，60％～70％A；40～41min，70％～10％A；41～50min，10％A)；程序检测波长：245nm(0～10.5min)、330nm(10.5～35.5min)、245nm(35.5～50min)；流速0.3mL/min；柱温30℃；进样量2μL。
2.2.2.对照品溶液的制备
精密称取京尼平苷酸、原儿茶酸、阿魏酸、大车前苷、木犀草苷、毛蕊花糖苷、木通苯乙醇苷B、车前草苷D、异毛蕊花糖苷、野漆树苷、芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸苷、木犀草素、芹菜素对照品适量，精密称定，加甲醇制成质量浓度分别为53.0721、84.2174、86.1798、40.5120、42.1176、158.8888、69.0346、44.5900、57.2320、49.1825、48.5553、38.0432、62.6220μg/mL的混合对照品溶液。
2.2.3.供试品溶液的制备
取饮片粉末(过二号筛)约1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25mL，超声(250W，40kHz)60min，离心，过滤，滤液蒸干，残渣加20mL水使溶解，用乙酸乙酯萃取3次，每次20mL，合并乙酸乙酯，蒸干，残渣用甲醇溶解，定容到10mL量瓶，滤过，取续滤液，即得。
2.2.4.精密度试验
取车前子供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件连续进样测定6次，以17号毛蕊花糖苷色谱峰为参照峰(S)，计算各共有峰与S峰的相对保留时间RSD范围为0.06％～0.96％，相对峰面积RSD范围为0.09％～2.89％，表明仪器精密度良好。
2.2.5.稳定性试验
取车前子供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件，分别在制备后0，2，4，8，16，24h进样测定，以17号毛蕊花糖苷色谱峰为参照峰(S)，计算各共有峰与S峰的相对保留时间RSD范围为0.08％～1.20％，相对峰面积RSD范围为0.31％～2.53％，表明供试品溶液在24h内稳定性良好；
2.2.6.重复性试验
取车前子样品，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，平行6份，按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，以17号毛蕊花糖苷色谱峰为参照峰(S)，计算各共有峰与S峰的相对保留时间RSD范围为0.05％～1.07％，相对峰面积RSD范围为0.13％～2.52％，表明该方法重复性良好。
2.2.7.指纹图谱的建立及色谱峰的指认
取12批车前子、炒车前子及盐车前子样品，按照“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件进样检测，采集色谱图。采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012版”软件进行数据处理，建立指纹图谱，分别以S01、C01和Y01号图谱作为参照图谱，以“中位数”法作为对照图谱生成方式，全峰匹配分别生成12批车前子、炒车前子及盐车前子的对照指纹图谱。12批车前子共标定了19个共有峰，12批炒车前子和盐车前子共标定了27个共有峰，结果见图1～图3。通过质谱精确分子量、碎片离子对比分析，再与对照品保留时间及紫外吸收光谱比对，指认出其中13个主要成分，分别为峰4(京尼平甘酸)、峰5(原儿茶酸)、峰13(阿魏酸)、峰14(大车前苷)、峰16(木犀草苷)、峰17(毛蕊花糖苷)、峰18(木通苯乙醇苷B)、峰19(车前草苷D)、峰21(异毛蕊花糖苷)、峰22(野漆树苷)、峰23(芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸苷)、峰28(木犀草素)、峰29(芹菜素)，结果见图4。
2.2.8.相似度评价
分别以车前子、炒车前子及盐车前子的对照指纹图谱为参照，计算12批车前子、炒车前子及盐车前子指纹图谱的相似度，结果见表3。结果显示，12批车前子、炒车前子及盐车前子的相似度均大于0.9，说明不同批次的车前子样品批间差异较小，且炮制后的样品批间质量也较稳定。
表3样品相似度评价结果
2.3.车前子及其不同炮制品指纹图谱多元统计分析
2.3.1.单因素方差分析
将车前子及其不同炮制品的峰面积(部分缺失色谱峰峰面积以0计)分别导入SPSS25.0进行单因素方差分析，结果见表4。结果表明车前子炮制前后色谱峰变化明显。其中，相比于生品，车前子炮制品指纹图谱中新增了13个色谱峰，分别为峰1-3、峰6-12、峰18、峰20、峰28，缺失了4个峰，分别为峰14、峰16、峰23、峰31。此外，除峰25外，车前子炮制品各色谱峰的峰面积与车前子生品间的差异均具有统计学意义(P＜0.05)；炒车前子与盐车前子中峰6、峰8、峰12、峰15、峰17(毛蕊花糖苷)、峰19(车前草苷D)、峰21(异毛蕊花糖苷)、峰22(野漆树苷)、峰24、峰26、峰27、峰33的峰面积差异均具有统计学意义(P＜0.05)。
表4指纹图谱峰面积单因素方差分析结果(单位：mAU*min)
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表4中，与车前子比较，aP＜0.05；与炒车前子比较，bP＜0.05。
2.3.2.主成分分析(PCA)
将12批车前子、炒车前子及盐车前子的峰面积(部分缺失色谱峰峰面积以0计)导入SIMCA14.1，进行主成分分析。以特征值>1为标准，共提取了3个主成分，累计方差贡献率为83.5％，提示模型预测良好，可反映出12批车前子、炒车前子及盐车前子整体的信息，各主成分贡献率见表5。由前3个主成分建立坐标系，得到的车前子、炒车前子及盐车前子的PCA得分图如图5所示，由图可见，车前子生品与炮制品可明显分为2组，但炒车前子和盐车前子的部分样品相互重叠，无法较好地区分。
表5主成分特征值及方差贡献率
2.3.3.聚类分析(HCA)
将12批车前子、炒车前子及盐车前子的峰面积(部分缺失色谱峰峰面积以0计)导入SIMCA14.1，采用组间连接法，以平方Euclidean距离为分类依据，进行聚类分析。结果如见图6所示，当聚类距离为100时，车前子生品与炮制品可明显分为2类，但炒车前子和盐车前子无法较好地聚类，其中Y06、Y11、Y04和C01、C04聚在一起，Y09和其余批次炒车前子聚在一起，表明炒车前子和盐车前子样品相似度较高，与主成分分析结果基本一致。
2.3.4.正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)
为了筛选车前子、炒车前子及盐车前子成分差异的主要标志性成分，将12批车前子、炒车前子及盐车前子的峰面积(部分缺失色谱峰峰面积以0计)导入SIMCA14.1，进行进行正交偏最小二乘法判别分析。对各指标的变量投影重要度(Variable Importance forthe Projection，VIP值)进行大小排列，选择VIP值>1的指标作为区分车前子、炒车前子及盐车前子的主要差异性成分。
建立的车前子、炒车前子及盐车前子的OPLS-DA模型中，自变量累积解释能力参数R2X为0.985，因变量累积解释能力参数R2Y为0.938，预测能力参数Q2为0.807，均大于0.5，说明所建模型具有较强的解释率和预测率，得到的OPLS-DA得分图见图7，变量重要性投影(VIP)值见图8。由图7可知，车前子生品与炮制品呈现明显的分类聚集现象。由图8可知，以VIP值>1为标准共提取10个VIP值，重要程度排名依次为峰21(异毛蕊花糖苷)、峰24、峰19(车前草苷D)、峰26、峰22(野漆树苷)、峰8、峰4(京尼平苷酸)、峰27、峰7、峰15，以上成分可能是车前子、炒车前子与盐车前子的差异性标志物。
2.4.车前子及其不同炮制品色度值测定与分析
采用分光测色仪对车前子及其不同炮制品饮片粉末进行色度值测定。取12批车前子、炒车前子、盐车前子饮片粉末(过三号筛)适量，均匀平铺于玻片上，压制厚度约1mm，采用国际照明委员会认可的D65光源，以白色作为背景，测定孔径8mm，视角选择2度，经白板校正后，采集饮片粉末色彩图像，并测定色度值，平行三次，取平均值，结果见表6。
Lab色彩模式中L*值为明度指数，a*、b*为色度指数，其中a*为红绿轴，b*为黄蓝轴，样品颜色用总色度值(E*)表示，公式为E*＝(L*2+a*2+b*2)1/2。ΔL*＝L*-L0 *、Δa*＝a*-a0 *、Δb*＝b*-b0 *、色差ΔE*＝(ΔL*2+Δa*2+Δb*2)1/2，用于表达生品到炮制品的在明度、红绿、黄蓝、总体的颜色变化情况，计算结果见表6。当ΔE*为6～12时，其色差可被肉眼识别，当ΔE*>12时，色差显著。由表7可知，12批车前子与两种炮制品的色差值均>6.0，即同批次药材中可明显区分生品与炮制品，但炒车前子和盐车前子两种炮制品之间色差值较小，难以用肉眼区分。此外，车前子与炒车前子的ΔL*为-14.12～-2.52，均值-9.54，车前子与盐车前子的ΔL*为-15.06～-4.90，均值-10.87，表明车前子炮制后明度下降，颜色加深；车前子与炒车前子的Δa*为3.97～5.47，均值4.88，车前子与盐车前子的Δa*为4.48～5.78，均值5.26，表明车前子炮制后红色加深；车前子与炒车前子、盐车前子Δb*正负均有且数值不大，表明车前子炮制前后在黄蓝轴上颜色变化不大。
表6色度值结果
表7色度值变化结果
2.5.车前子及其不同炮制品体外抗氧化活性测定
2.5.1.测定方法
在预试验的基础上，本研究将供试品溶液的浓度用60％甲醇稀释成60μg/mL，按照格锐思试剂盒的规定方法进行测定，操作步骤具体如下。
试剂溶液的配制：
①试剂一：临用前甩几下使粉剂落入底部，每支加0.49mL蒸馏水溶解。
②试剂二：临用前甩几下使粉剂落入底部，每支加2.86mL蒸馏水，充分溶解备用。
③ABTS工作液的配制：临用前根据样本量按试剂一：试剂二＝1:1比例混合，避光反应12h后(二天内用完)，再用无水乙醇稀释20～30倍备用，各试剂及其配方如表8。
表8ABTS反应体系
将上述溶液充分混匀后避光静置6min，转移至玻璃比色皿(光径1cm)中，于734nm处读取吸光度值，分别记为A空白、A对照和A测定，并计算ABTS自由基清除率。
ABTS自由基清除率％＝[1-(A测定-A对照）/A空白]×100％。
2.5.2.测定结果
12批车前子、炒车前子及盐车前子的抗氧化活性测定结果见表9。由表9可知，12批车前子及其炮制品均具有清除ABTS自由基的能力，其中炒车前子最强，盐车前子与炒车前子差异不大，车前子生品清除能力最弱。
表9抗氧化活性测定结果
2.6.车前子及其不同炮制品谱-效关系分析
2.6.1.偏最小二乘回归法(PLSR)分析
利用SIMCA14.1软件，以12批车前子、炒车前子及盐车前子的ABTS清除率为因变量，共有峰的峰面积经折算扣除水分后为自变量(部分缺失色谱峰峰面积以0计)，采用偏最小二乘回归分析(PLSR)，进行相关性分析，建立回归方程。
建立的回归方程为Y＝0.059X1+0.095X2+0.001X3-0.016X4+0.048X5+0.058X6+0.030X7+0.090X8-0.036X9-0.007X10+0.075X11+0.066X12-0.095X13+0.008X14+0.061X15+0.084X16-0.008X17+0.047X18-0.112X19+0.007X20-0.051X21+0.005X22+0.013X23+0.080X24+0.131X25-0.060X26-0.018X27-0.164X28-0.066X29-0.052X30-0.055X31-0.092X32-0.114X33-0.114X34+40761，得到的标准化回归系数见图9。其中，峰1-3、峰5-8、峰11、峰12、峰14-16、峰18、峰20、峰22-26的回归系数大于0，表明其与抗氧化活性呈正相关，其余峰的回归系数为负值，与抗氧化活性呈负相关。
2.6.2.灰色关联度(GRA)分析
将车前子、炒车前子及盐车前子共有峰的峰面积经折算扣除水分后的数据(部分缺失色谱峰峰面积以0计)和抗氧化活性数据进行均值化处理。将处理后的抗氧化活性数据设置为母序列x0(k)，峰面积数据为子序列xi(k)(k为峰号)，根据公式(1)计算母序列与子序列的灰色关联系数。其中ρ为分辨系数，ρ越小，则分辨力越大，一般ρ的取值区间为[0，1]，当ρ≤0.5463时，分辨力最好，通常取ρ＝0.5。根据公式(2)计算关联系数的算术平均值，即为关联度，结果见表10。
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当关联度大于0.8，则表示母序列与子序列关联度较大；当关联度介于0.6～0.8，则表示二者关联度一般；当关联度小于0.6，则表示二者关联度较小。由表10可知，峰1-12、峰15、峰18-22、峰24-26、峰28、峰29、峰34与抗氧化活性贡献作用关联度较大。与PLSR结果结合分析，可综合得出峰1-3、峰5-8、峰11、峰12、峰15、峰18、峰20、峰22、峰24-26是与车前子及其炮制品的抗氧化活性关联度较大的正相关色谱峰，即为主要起抗氧化作用的成分，其中峰5为原儿茶酸、峰18为木通苯乙醇苷B、峰22为野漆树苷，其余色谱峰所对应的物质成分还有待进一步探索研究。
表10关联度结果
对比例1
采用与实施例1基本相同的方式构建车前子、盐车前子和炒车前子的指纹图谱，区别在于，供试品溶液的制备方法如下：
取各供试品粉末(过二号筛)约1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入60％甲醇25mL，称定重量，加热回流2小时，放冷，再称定重量，用60％甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
获得的相应特征图谱的对比图如图10。根据图10可以发现，用60％甲醇进行提取，保留时间约3min的峰(经确认为京尼平苷酸)由于其响应值过大，导致其余特征峰信号不明显，且图谱中特征峰数量明显降低，与图10相比，图4的中小极性成分信息更加丰富，同时通过萃取纯化，减少杂质的影响，使图谱分离效果更好。
对比例2
采用与实施例1基本相同的方式构建车前子的指纹图谱，区别在于，调整了洗脱程序(表11)，表11中各洗脱程序对应的检测结果参见图11。
表11
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在本申请提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。除非和本申请的申请目的和/或技术方案相冲突，否则，本申请涉及的引用文献以全部内容、全部目的被引用。本申请中涉及引用文献时，相关技术特征、术语、名词、短语等在引用文献中的定义也一并被引用。本申请中涉及引用文献时，被引用的相关技术特征的举例、优选方式也可作为参考纳入本申请中，但以能够实施本申请为限。应当理解，当引用内容与本申请中的描述相冲突时，以本申请为准或者适应性地根据本申请的描述进行修正。
以上所述实施方式和实施例的各技术特征可以进行任意合适方式的组合，为使描述简洁，未对上述实施方式和实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为在本说明书记载的范围中。
以上所述实施例仅表达了本申请的几种实施方式，但并不能因此理解为对申请专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。此外应理解，在阅读了本申请的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本申请作各种改动或修改，得到的等价形式同样落于本申请的保护范围。还应当理解，本领域技术人员在本申请提供的技术方案的基础上，通过合乎逻辑的分析、推理或者有限的试验得到的技术方案，均在本申请所附权利要求的保护范围内。因此，本申请专利的保护范围应以所附权利要求为准，说明书和附图可用于解释权利要求的内容。
Claims (12)
1.车前子、盐车前子或炒车前子的指纹图谱的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
提供供试品溶液，包括如下步骤：将供试品用提取溶剂进行提取，得到提取物；将所述提取物分散于水，加入乙酸乙酯萃取；所述供试品为车前子、盐车前子或炒车前子；
取所述供试品溶液进行液相色谱分析，所述液相色谱分析的条件包括：
(1)流动相A为乙腈，流动相B为体积浓度0.05％～0.2％的磷酸水溶液，和
(2)采用梯度洗脱，所述梯度洗脱的程序包括：
0～5min，所述流动相A的体积百分比由10％上升至16％，
5min～15min，所述流动相A的体积百分比由16％上升至18％，
15min～20min，所述流动相A的体积百分比由18％上升至25％，
20min～25min，所述流动相A的体积百分比由25％上升至45％，
25min～30min，所述流动相A的体积百分比由45％上升至60％，
30min～40min，所述流动相A的体积百分比由60％上升至70％，
40min～41min，所述流动相A的体积百分比由70％下降至10％，
41min～50min，所述流动相A的体积百分比维持10％。
2.根据权利要求1所述的指纹图谱的构建方法，其特征在于，所述提取溶剂包括甲醇，所述提取的方式包括超声。
3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述超声的条件包括如下至少一种：
(1)所述超声的功率为200W～300W，
(2)所述超声的频率为30kHz～50kHz，和
(3)所述超声的时间为50min～70min。
4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述提供供试品溶液的条件包括如下至少一种：
(1)所述水和所述乙酸乙酯的体积比为1：(1～3)，
(2)所述供试品和所述提取溶剂的质量体积比为1g/(20～30)mL，和
(3)所述供试品和所述乙酸乙酯的质量体积比为1g/(20～60)mL。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的构建方法，其特征在于，所述液相色谱分析中：
0min～10.5min，检测波长为240nm～250nm，
10.5min～35.5min，检测波长为320nm～340nm，
35.5min～50min，检测波长为240nm～250nm。
6.根据权利要求1～4中任一项所述的构建方法，其特征在于，所述液相色谱分析的条件还包括如下至少一种：
(1)色谱柱为C18色谱柱，
(2)色谱柱柱长为100mm～150mm、内径为2mm～2.2mm、粒径为1.6μm～1.9μm，
(3)流速为0.28mL/min～0.32mL/min，
(4)柱温为28℃～32℃，和
(5)进样量为1μL～3μL。
7.车前子、盐车前子和炒车前子的鉴别方法，其特征在于，包括如下步骤：
取车前子、盐车前子和炒车前子的标准品作为对照品，分别根据权利要求1～6中任一项所述的构建方法制备对应的指纹图谱；
提供待测品溶液，包括如下步骤：将待测品用提取溶剂进行提取，得到提取物；将所述提取物分散于水，加入乙酸乙酯萃取；
取所述待测品溶液进行液相色谱分析，获得待测品色谱图谱，将所述待测品色谱图谱和所述车前子对照品指纹图谱、盐车前子对照品指纹图谱以及炒车前子对照品指纹图谱分别进行比对；
所述液相色谱分析的条件包括：
(1)流动相A为乙腈，流动相B为体积浓度0.05％～0.2％的磷酸水溶液，和
(2)采用梯度洗脱，所述梯度洗脱的程序包括：
0mm～5min，所述流动相A的体积百分比由10％上升至16％，
5mm～15min，所述流动相A的体积百分比由16％上升至18％，
15mm～20min，所述流动相A的体积百分比由18％上升至25％，
20mm～25min，所述流动相A的体积百分比由25％上升至45％，
25mm～30min，所述流动相A的体积百分比由45％上升至60％，
30mm～40min，所述流动相A的体积百分比由60％上升至70％，
40mm～41min，所述流动相A的体积百分比由70％下降至10％，
41mm～50min，所述流动相A的体积百分比维持10％。
8.根据权利要求7所述的指纹图谱的构建方法，其特征在于，所述提取溶剂包括甲醇，所述提取的方式包括超声。
9.根据权利要求8所述的构建方法，其特征在于，所述超声的条件包括如下至少一种：
(1)所述超声的功率为200W～300W，
(2)所述超声的频率为30kHz～50kHz，和
(3)所述超声的时间为50min～70min。
10.根据权利要求7所述的构建方法，其特征在于，所述提供待测品溶液的条件包括如下至少一种：
(1)所述水和所述乙酸乙酯的体积比为1：(1～3)，
(2)所述供试品和所述提取溶剂的质量体积比为1g/(20～30)mL，和
(3)所述供试品和所述乙酸乙酯的质量体积比为1g/(20～60)mL。
11.根据权利要求7～10中任一项所述的构建方法，其特征在于，所述色谱分析中：
0min～10.5min，检测波长为240nm～250nm，
10.5min～35.5min，检测波长为320nm～340nm，
35.5min～50min，检测波长为240nm～250nm。
12.根据权利要求7～10中任一项所述的构建方法，其特征在于，所述色谱分析的条件还包括如下至少一种：
(1)色谱柱为C18色谱柱，
(2)色谱柱柱长为100mm～150mm、内径为2mm～2.2mm、粒径为1.6μm～1.9μm，
(3)流速为0.28mL/min～0.32mL/min，
(4)柱温为28℃～32℃，和
(5)进样量为1μL～3μL。
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