CN115541507A - 一种丹参药材色度质量检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种丹参药材色度质量检测方法,包括以下步骤:1)将待检丹参提取溶液置于比色皿中,采用测色仪,测定出三刺激值X、Y、Z,2)将三刺激值X、Y、Z计算给出L*,a*,b*;3)通过测色仪照射光线下的L*,a*,b*在坐标的位置判断丹参品质。本发明克服了丹参药材进行传统的鉴别中遇到的,解决了药材复杂形状,进行色度测量,误差较大的问题;获得能够更准确地评价丹参质量的方法;另外本方法还可应用于丹参中药饮片、片剂、颗粒剂、散剂、浸膏、水剂等中药制剂,假冒产品、有无混淆物等质量评价方面。
Description
技术领域
本发明提供了一种中药快速质量检测方法,根据具体的说涉及一种丹参药材色度质量检测方法检测方法。
背景技术
中药材具有悠久的药用历史,是中华民族的历史瑰宝,是来源于植物类、动物类及矿物类的新鲜品或经过简单加工的药用部位,直接用于医疗保健或作为医药用原料的天然药物。利用中药材的优点:对应病症和体质作用,缓慢、持续、缓和;副作用少,停药后的症状是稳定。利用中药材的缺点:同一品种中,每一个体的品质不同,如“天然中药材”和“栽培中药材”的疗效程度不一定,即,品质不稳定;大部分的中药材“产量”不可控制;产量、价格也不稳定,难以保持价格的稳定性。中药材作为医药品获得批准需要解决的问题:使用药食同源类的中药材应该选用基源正、且在质量上,必须保证质量的稳定性。中药材为多成分的复合体,通过成分之间的相互作用显现出药效。准确鉴别、评价某种中药材并非易事。
中药材的鉴别与评价方法:中药材的鉴别和评价以观察为主,进而通过化学反应、病理造模反应以及化学成分和基因等加以解析。目前正处于研究的评价方法涉及多方面,但可以说决定性的有效的评价方法仍在摸索之中。此时采用自古以来的评价方法就有一定的道理。
自古以来对中药材的鉴定和质量评价是通过经验丰富而熟练者以中药材的颜色、气味、味觉、触感、形状、大小、轻重为依据鉴别、评价质量。中药材因其基源不同,其颜色、气味、味觉、触感等都有特征。古人从积累的经验中领会并能鉴别出各品种特征的差异,再基于丰富的行医经验以同种药材细微的差异为线索选择有疗效的中药材。
在现代中药产业中,随着经验丰富、技术熟练者的高龄化,熟练者不充分,而且个人感觉器官的感官能力不同,而且个人的身体状况和环境状况也不同,这也影响判定结果。从人的颜色、气味、味觉、触感等感觉去判断,判断结果可有错误。
另外,虽然各国的现行药典也登载有颜色、气味、味觉,作为鉴别时的可用信息。但,几乎所有的药典中的颜色、气味、味觉表述都是习惯用句表述的,即不存在统一的表述方法。
在现代为了活用传统的鉴别方法思想,必须客观认识感觉、表现出统一的表示法。而中药材已经在世界领域流通的药用资源,该问题不仅仅只是国内的问题。因此期望世界统一水平的中药材感觉信息表示方法出台。
本发明记述针对颜色。
显示中药材的颜色需要「中药材」、「光源」、「視覚」。
中药材从照射的光源处吸收一部分光,反射多余的光,溶液是其照射光源透过的光,反射光、透过光进入视线范围,人们就会将特定波长的光作为颜色加以感受。因物体发生反射,溶液透过的光线视觉才能辨析带色的光,这种光与各种波长成分相交集。人们可以看到的可视光线领域波长(380nm~780nm)的反射光或透过光。但,光不是色,色的定义是「刺激的视网膜引起视觉反应」,即进入眼睛的反射光或透过光,应对波长的强度对应于光谱中的“红色”、“蓝色”和“绿色”,通过人的视网膜反应,到即反应在大脑中产生颜色的概念。
但,人类颜色的感知时受到很多因素影响,如物体的不同表面形状、质地、照射光源的种类、照明位置等的光反射和吸收的差异,观察场所的明暗、温度等不同的环境、对象物的大小、不同的观察角度、观察者的视觉感觉的差异和错觉等。
而且,随着时代的发展,颜色的术语会发生变化。一般颜色用习惯色名表示如珊瑚色、粉红色等。在体系色名之前冠以形容词构成的体系色名如暗红、鲜红等,可将所有的颜色系统地分类加以表示。总之,目前颜色的准确表示非常难以,容易产生认识上的误解,所以色度理论的基础上,进行科学的颜色的数字化很重要。
以颜色为体系建立数值表示法:颜色量化是通过模仿人类颜色识别机制的精密机器测量,然后按照色度空间系统进行数字化。
目前目测法最为常用,成本低,操作简便,但这一方法仅仅凭借实验者的感官判断药品质量,容易受实验者主观的影响,故不够科学严谨;紫外-可见分光光度法通常选择在某一特定波长处测定药品溶液颜色,而实际上,中药成分复杂,药品溶液的颜色是不同波长共同作用的结果,故单凭借一特定波长吸光值无法准确反映药材溶液颜色。
颜色标准化研究于1905年由美国画家阿尔巴特H.曼瑟尔首次提出,其后创作出[色调][明度][彩度]各不相同的色纸,以此对比进行分类表示颜色的“曼瑟尔表色系统”使用色调(H)、明度(V)、彩度(C)分类色票以代码解读颜色。1976年“CIE Lab色空间”问世,是间隔均匀的色空间系统,颜色以明度(L*)和两种色调(a*、b*)的共三个数值表示。色调由红-绿轴上的a*、黄-蓝轴上的b*以及两个元素a*和b*的交点表示。CIE Lab的优点是容易想象色度量,而且复数的颜色比较处理很容易,CIE Lab是近年来的主流色空间系统。
但,CIELab色空间系统依照人们视觉的色空间系统,由于其特性,并非所有溶液和色度关系都具有线性,为了通过溶液颜色质量评价,色度曲线内的直线性范围是重要。要获得合适的测量值,首先需要设定色度的定量容差。
2000年版的《中华人民共和国药典》开始,比色法被列为溶液比色法之一称为“色差法”。近年来,已证实色差法可有效检测沙星类、头孢类、维生素C等的药剂质量变化。色差法是从个体之间的色差来判断质量差异的方法,用CIELab色空间系统,用三种数字来表现色度,例如L*值是非常接近人类对亮度的感知,a*值和b*值是色相的感知。用色差法可以表示接近中药材的真实质量,是似乎是评价由复杂成分系统组成的中药整体质量的合适方法。使用L*、a*和b*这三个测量值,应用于色度表达和色度调整,而也可以三种指标独立使用。
丹参是唇形植物丹参的根,是一种重要的活血中药。其主要成分为水溶性丹酚酸B和脂溶性丹参酮2A、隐丹参酮、丹参酮1等,菲醌类化合物。丹参中的菲醌类化合物具有明显抗动脉粥样硬化、保护心肌、减少心律失常等作用,是丹参的重要有效成分。目前使用丹参酮IIA磺酸钠注射液等用于冠心病、心绞痛、心肌梗死等治疗。丹参菲醌类呈红色至黄色,因为其化学结构中存在的共轭双键具有π电子。丹参之名就是由这颜色而来的。古来中药材颜色是质量评价的一个指标,迄今,已有报道丹参表面色、粉末色、甲醇提取液色与成分含量呈正相关。但以不同产地、不同年龄的原料药为实验材料时,菲醌化合物含量与颜色的相关系数较低,说明仍有方法改进的空间。为了更准确体现中药材内在质量,使用提取液的颜色判断比表面色、粉末色更直接而有效。但,由于中药材组成成分复杂,目前尚未应用于中药材色度质量评价。
发明内容
为解决上述问题,实现中药更科学合理的应用,本发明通过丹参菲醌类化合物标准品溶液研讨浓度、透光率和不同光线下的颜色关系,提出了应用色度法对丹参提取液最佳制备与测定方法,并用在市场的丹参样品其进行了验证,提供丹参提取液色度快速质量评价方法依据。所述丹参中的菲醌类化合物如下:
本方法的具体包括以下步骤:
1)将待检丹参提取溶液置于比色皿中,采用测色仪,测定出三刺激值X、Y、Z;
2)将三刺激值X、Y、Z计算给出L*,a*,b*;
3)通过测色仪照射光线下的L*,a*,b*在坐标的位置判断丹参品质。
步骤3)所述的测色仪照射光线D65光(人工日光,色温为6500K)、A光(钨丝光,色温2856K)、C光,荧光F2光、F7光、F11光,观察视野为10°,可以测定450nm处的透光率。
步骤4)通过读取测色仪照射光线下L*,a*,b*的值,判断丹参中的总菲醌类化合物成分含量。
所述最优选的测色仪照射光线为A光。
所述A光为测色仪照射光线时,在混合3种菲醌类化合物标准品溶液色度与总菲醌类成分含量之间显示了较高的相关性:混合3种标准品溶液色度a*,b*(0,0)~a*,b*(30,97)范围中a*值与b*值之间的关系为A光下r=0.997,D65光下r=0.964;在丹参提取液中也观察到了同样的趋势,a*,b*(0,0)~a*,b*(34,98)范围中,A光下r=0.998,D65光下r=0.966,所相关系数确率为p<0.01。
所述步骤1)所述的待检丹参提取溶液的制备方法为:将丹参药材粉碎,得到丹参粉末,然后粉末加乙醇,超声提取,离心后的上清液稀释作为待检丹参提取溶液,这时的提取液色度,在A光下其提取液色度为a*值必须少于27.0而b*值少于80.0;待检丹参提取溶液装入光程10mm玻璃比色皿,观察视野为10°,丹参总菲醌类成分含量与色度之间得到r=0.931的相关性。根据提取液色度b*值设定了丹参质量标准。
本发明的有益技术效果是:1、本发明克服了丹参药材进行传统的鉴别中遇到的,由于复杂形状,进行色度测量,误差较大;粉末含有活性无关的因素多;难以获得质量反映的色度的问题。
2、本发明将中药材提取液的颜色直接反映在成分含量的基础上,用提取液的颜色可实现丹参质量评价,在于几乎表现了中药材的整体质量。获得能够更准确地评价丹参质量的方法。
3、本发明由于无关药材外观、产地、生长年限,除中药材外,还可应用于丹参中药饮片、片剂、颗粒剂、散剂、浸膏、水剂等中药制剂,假冒产品、有无混淆物等质量评价方面。
4、本检测方法的检测成本远低于采用色谱方法的检测成本,并且检测速度更快。
附图说明
图1标准品溶液色度曲线1;
图2标准品溶液的光谱曲线;
图3标准品溶液的透光率-色度曲线;
图4溶液浓度-透光率曲线;
图5溶液浓度-色度曲线;
图6不同光线下色度E*ab、a*、b*差异;
图7标准品混合溶液色度(a*值与b*值)分布;
图8标准品混合溶液的浓度与D65光及A光下的色度;
图9总菲醌类成分含量与的色度(b*)之间的相关性。
具体实施方式
实施例1色度定量检测方法
1溶液测色条件
使用分光测色计结合应用程序软件Spectra Magic测量并采集溶液颜色,该实验中使用乙醇作为溶剂,故乙醇的颜色作为空白对照。脉冲氙灯作为照射灯源,使用光程为10mm的玻璃比色皿,观察视野为10°,测量值为自动测量5次所得到的平均值。每一批样品平行制备5份,测量并计算平均值。
测量值由L*、a*、b*、E*ab表示,L*代表明度,从0到100表示颜色的明暗变化,0为黑,100为白,a*代表红绿轴的色度值,+a*为红色系,-a*为绿色系,b*代表黄蓝轴的色度值,+b*为黄色系,-b*为蓝色系,E*ab代表总色度。总色度(E*ab)由以下公式计算。
总色度:E*ab=√L*2+a*2+b*2
2供试品制备
标准品溶液:精密称量丹参酮ⅡA(称Ta2A)、隐丹参酮(称CTa)和丹参酮Ⅰ(称Ta1)标准品,分别用乙醇溶解配制成0.4mg/ml的溶液,连续2倍稀释直至浓度达到3μg/ml左右,分别得到8种不同浓度的标准品溶液(图2)。将三种标准物(Ta2A、CTa、Ta1)以5:3:2和1:1:1两种比例混合分别得到溶液B1和溶液B2,B1中三个化合物的比例与文献报道中三者在样品中的比例相似,混合标准品溶液同样通过连续2倍稀释,分别得到8种不同浓度的混合标准品溶液(图3)。
丹参药材提取液:取批号14丹参药材0.1~5.0g粉末,分别加入50ml乙醇,超声提取30分钟,离心取上清液,得到20份样品提取液。
3创建色度曲线
测量上述标准品溶液的颜色,并以E*ab、a*、b*(D65光下)为指标创建浓度-色度曲线。结果显示对于单个标准品的色度曲线,Ta2A和CTa的标准品溶液在E*ab色度值上表现出几乎相同的色度曲线,Ta1则出现明显差异。当三个标准品按两种不同比例混合,所得混合标准品溶液的色度曲线几乎一致,而样品提取液的模式也很类似(具体如图1所示,注:Ⅰ:标准品溶液a*值;Ⅱ:标准品溶液b*值;Ⅲ:混合标准品溶液a*值;Ⅳ:混合标准品溶液b*值:Ⅴ:样品提取液a*值;Ⅵ:样品提取液b*值;)。因此,在研究中,首先使用混合标准溶液研讨可测量色度的范围。
4研讨可定量色度的范围
溶液吸收波长:
不同吸收波长直接影响提取液颜色的透光率,从而影响颜色的测定值。本发明中浓度分别为0.1mg/ml的Ta2A、Ta1和CTa标准品溶液最大吸收波长分别是450nm、420nm和440nm处,3种标准品存在吸光度的差异。混合标准品溶液和样品提取液的最大吸收波长则较为接近,其中混合标准品溶液B1模拟了样品溶液中三个主要成分的比例,与样品溶液的最大吸收波长都为450nm(具体如图2所示,其中,Ⅰ:标准品溶液;Ⅱ:混合标准品溶液与样品提取液),因此450nm是分析丹参提取液透过率及颜色的最佳波长。
透光率(%T)与色度的关系:
本发明考察了不同浓度的混合标准品溶液在450nm下的透光率与色度的关系,随着浓度变化,透光率与颜色呈负相关(具体如图3所示,Ⅰ:a*值B1 y=-0.2039x+17.752,r=0.9577,B2y=-0.1679x+14.585,r=0.96411;Ⅱ:b*值B1:y=-0.7489x+69.662,r=0.9876,B2.)。说明一定范围的透光率直接影响颜色测定值,溶液若透光性不足则不能得到准确的色度测量值。
浓度与透光率:通过透光率曲线发现两个高浓度标准品溶液和五个高浓度样品溶液的透光率皆小于10%,此时浓度对透光率的影响逐渐减弱,说明高浓度下测定溶液透光率和颜色的敏感度减弱(具体如图4所示,红色筐子里的相关系数,Ⅰ:B1:y=-528.35x+85.301,r=0.9696;B2:y=-678.38x+85.378,r=0.9745:Ⅱ:sample:y=-26.08x+72.542,r=0.9751)。通过排除透光率为10%以下的溶液,混合标准品溶液和样品溶液的浓度与透光率之间皆得到良好的线性关系(具体如图4所示)。浓度和色度:此时标准品混合溶液B1、B2以及样品提取物液的浓度和溶液颜色液分别获得了良好的线性关系(具体如图5所示,Ⅰ:B1,y=62.976x+2.2278,r=0.9976;B2,y=65.011x+2.5738、r=0.997,Ⅱ:B1y=16.327x-0.6504,r=0.9988;B2:y=14.549x-0.6538、r=0.9937;Ⅲ:B1,y=59.587x+2.2699,r=0.99;B2,y=62.04x+2.6169、r=0.9970;Ⅳ:样品提取液y=26.654x+6.081,r=0.9975;Ⅴ:样品提取液,y=8.658x-0.909,r=0.9999;Ⅵ:样品提取液:y=24.488x+6.206,r=0.9964.)。
所以在450nm波长下,当透射率大于10%,溶液的色度-透光率-浓度三者之间存在显着相关规律,在该范围内可准确地测量丹参溶液的颜色信息。
比较不同光源,选择最佳照射光:
色度测定一般用于D65光(人工日光,色温为6500K),是被称为国际标准人工日光,目前主要用于评价物体颜色常用的光源。但测定物体颜色的光源有许多类型,每一种都有不同的光谱能量。由于样品受到不同光谱能量所反射规律不同,并且溶液中的分子在吸收不同波长能量之后,亦可能会发生异构体转换,呈现出不同的显色规律。考察了六种不同光源下的色度值,以确定最能揭示丹参提取液质量差异的光源(表1)。
表1使用的光源类型
6种光源下混合标准品溶液浓度与色度值a*、b*、E*ab均得到了显著相关性,其中的A光下浓度与色度a*之间的相关性最高(r=0.9988)(表2)。
在比较不同光源对混合标准品溶液B1与溶液B2之间的颜色差异时,发现D65光下,E*ab、a*、b*差异为分别4.4、3.3、3.6,而A光下,其差异为5.7、1.9、5.4。在A光照射下,溶液B1和B2的E*ab值与b*值差异最为明显大(具体如图6所示其中,Ⅰ:E*ab值;Ⅱ:a*值;Ⅲ:b*值),而且溶液浓度与色度值之间的直线性,A光比D65光稍微好,说明A光更利于区分不同质量丹参溶液的颜色差异,(具体如图7所示,其中,Ⅰ:a*值,A光为y=19.005x+0.5053,r=0.9987,D65光为y=15.573x-0.6828,r=0.9938;Ⅱ:b*值,A光为y=66.292x+2.8194,r=0.9966,D65光为y=60.603x+2.494,r=0.9964)
考察a*值和b*值之间的规律性,尤其是D65光与A光下溶液的a*值和b*值之间存在较好相关性,A光下为y=19.007x+0.5046,r=0.9992,而D65光下为y=2.3838x+13.645,r=0.9938(具体如图8所示)。即A光照射下a*值的增减将直接影响b*值的变化。因此,虽然色度测定的常用的光源是D65光,但对丹参提取液的色度来质量评价时,使用A光更合适(具体如图8所示,其中,Ⅰ:混合标准品溶液;Ⅱ:样品提取液)。
可测溶液的色度容差范围决定:提取液%T>10,A光照射下,标准品混合溶液色度为E*ab值<81.05,a*值<26.04,b*值<78.53,样品提取液E*ab值<77.72,a*值<24.22,b*值<72.80,在D65光下,标准品混合溶液色度为E*ab值<76.03,a*值<24.71,b*值<75.15,样品提取液E*ab值<71.27,a*值<20.82,b*值<65.81。
综上,采用A光照射,结合上述测定溶液颜色条件,确定丹参提取液色度的范围,颜色指标为a*(A光)<27.0,b*(A光)<80.0。
表2不同光线下的标准溶液浓度与色度L*、a*、b*、E*ab的相关系数
p<0.01
实施例2样品丹参颜色测量
检测条件
称取干燥到恒重的丹参粉末0.2g,加乙醇50ml,超声提取30分钟,离心后取上清液4ml加乙醇到10ml定容,为a*值不超过27.0而b*值不超过80.0范围内。采用实施例1溶液测色条件条件,A光下的提取液颜色测定。
结果(具体见表3)
表3丹参提取液色度
实施例3供试丹参样品的成分检测
1色谱条件
C18色谱柱(Welch XB,4.6×150mm,5μm),流动相乙腈(A)-0.02%磷酸溶液(B),梯度洗脱流动相比例:0~20min,A25%,20~40,A25~90%,40~45,A90~60%,检测波长270nm,流速1.0ml/min,柱温20℃,进样量10ul。
2标准品溶液的制备
分别精密称取丹酚酸B(SAB),隐丹参酮(CTa),丹参酮Ⅰ(Ta1),丹参酮IIA(Ta2A)对照品适量,加甲醇溶解制成对照品溶液,按不同体积混合,制成每1ml中含SAB 0.1618mg,CTa0.0078mg,Ta1 0.0028 mg,Ta2A 0.0124mg的混合对照品溶液。
3样品溶液的制备
称取干燥到恒重的丹参粉末0.2g,加乙醇50ml,超声提取30分钟,离心后取上清液,0.45μm滤膜过滤后备用。
4方法学试验
精密度:取混合标准品溶液,重复测定6次,计算标准偏差系数(RSD%);重复性:平行制备6份样品溶液并测定,计算RSD%;稳定性:取制备好的供试品溶液,分别在制备好的0h,2h,4h,8h,10h,12h,24h后进行测定并计算RSD%;加样回收率:平行制备6份供试品溶液与对照溶液的成分含量比率为1:0.8的混合溶液,根据测得的化合物含量计算加样回收率,并计算RSD%。
化合物SAB,CTa,Ta1和Ta2A在一定浓度范围内,浓度与峰面积之间均表现出良好的线性关系,方法学验证结果显示该方法的精密度、重复性和稳定性都非常好,且加样回收率结果也满足要求。该方法可以用于丹参样品溶液中SAB,CTa,Ta1和Ta2A四个化合物的含量测定(具体如表4所示)。
表4方法验证结果
实施例4样品丹参检测
采用实施例2中优化的检测条件检测实施例1所述16个样品。
样品含量测定结果(具体见表5):
表5样品丹参药材中的成分含量
实施例5样品中成分含量与提取液色度的相关性分析与建立色度质量标准
根据16个样品的含量与颜色结果,在A光照射下,丹参总菲醌类化合物含量与样品提取液颜色a*值(A光)的相关性r=0.888,与b*值(A光)的相关性r=0.931,丹参总菲醌类成分含量与提取液稀释后的溶液色度b*值之间建立了良好关系(具体如表6与图9所示,其中,Ⅰ:a*值;Ⅱ:b*值)。进而,基于提取液色度b*创建了丹参质量的标准(表7)。
另外,丹酚酸含量与提取液色度之间无关,与粉末色度L*、a*、b*值之间分别具有r=0.737、-0.770、-0.658,p<0.01的相关性。(表6所示)。
表6丹参菲醌类化合物含量与色度之间的相关系数
表7根据提取液色度b*值的质量标准
总菲醌类含量为水平C:~0.15%;水平B:0.15~0.25%;水平A:0.25%~。
Claims (6)
1.一种丹参药材色度品色度质检测方法,其特征在于:包括以下步骤:
1)将待检丹参提取溶液置于比色皿中,采用测色仪,测定出三刺激值X、Y、Z;
2)将三刺激值X、Y、Z计算给出L*,a*,b*;
3)通过测色仪照射光线下的L*,a*,b*在坐标的位置判断丹参品质。
2.根据权利要求1所述的一种丹参药材色度品色度质检测方法,其特征在于:步骤3)所述的测色仪照射光线D65光、A光、C光,荧光F2光、F7光、F11光,观察视野为10°,可以测定450nm处的透光率。
3.根据权利要求2所述的一种丹参药材色度品色度质检测方法,其特征在于:步骤4)通过读取测色仪照射光线下L*,a*,b*的值,判断丹参中的总萘醌类化合物成分含量。
4.根据权利要求3所述的丹参药材色度品质检测方法,其特征在于:最优选的测色仪照射光线为A光。
5.根据权利要求4所述的一种丹参药材色度品色度质检测方法其特征在于:所述A光为测色仪照射光线时,总萘醌类成分含量与的色度之间的相关性为:y=0.0039x–0.0014,r=0.962。
6.根据权利要求1所述的一种丹参药材色度品色度质检测方法,其特征在于:步骤1)所述的待检丹参提取溶液的制备方法为:将丹参药材粉碎,得到丹参粉末,然后粉末加乙醇,超声提取,离心后的上清液稀释作为待检丹参提取溶液;待检丹参提取溶液装入光程10mm玻璃池,观察视野为10°,A光下的提取液色度为Da*值不超过27.0而Db*值不超过80.0范围内,丹参总成分含量与色度之间具有r=0.931的相关性。
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