CN108169375B - 一种指纹图谱与抗氧化活性联合鉴别蜂胶真伪的方法 - Google Patents

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    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G01N21/643—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes" non-biological material

Abstract

本发明公开了一种指纹图谱与抗氧化活性联合鉴别蜂胶真伪的方法，属中药原料质量控制范畴中蜂胶原料的质量鉴别，特别涉及以高压液相指纹图谱与蜂胶特有的抗氧化特性，联合鉴定蜂胶原料及其产品的真伪的方法。该方法包括指纹图谱测定、氧自由基吸收能力测定和样品鉴定三个步骤，在相同试验条件下，将供试样品指纹图谱与同时检测的蜂胶、杨树树胶样品指纹图谱进行比较，并选定供试样品指纹图谱中的几个特征峰，以方便比较和结果判定蜂胶为“真”、“伪”或“掺伪”。同时以抗氧化特定指数的限定，与指纹图谱联合鉴定蜂胶为“真”、“伪”或“掺伪”。

Description

一种指纹图谱与抗氧化活性联合鉴别蜂胶真伪的方法
技术领域
本发明属中药原料质量控制范畴中蜂胶原料的质量鉴别，特别涉及以高压液相指纹图谱与蜂胶特有的抗氧化特性，联合鉴定蜂胶原料及其产品的真伪的方法。
背景技术
近代研究证明，蜂胶所含有的丰富而独特的活性成分使其具有抗菌、消炎、止痒、抗氧化、增强免疫、降血糖、降血脂等多种功能。蜂胶有天然免疫刺激剂，天然抗氧化剂和天然抗菌素之称。由于其具有广泛和显著的生理活性，且相对毒性较小，因此市场规模不断扩大。又由于蜂胶是蜜蜂从植物芽苞或树干上采集的树脂(树胶)，混入蜜蜂自身消化腺、上腭蜡腺等腺体的分泌物加工而成的。因此蜂胶主要是由植物幼芽、愈伤组织等分泌的树脂状物质、工蜂自身消化腺、蜡腺等腺体的分泌物及这两类物质相互作用后形成的物质三个部分组成。故蜂胶中很大部分的成分与树胶是相同的。且蜂胶的产量又很低.因此蜂胶市场出现了许多掺杂使假现象：在蜂胶原料中，出现许多伪劣蜂胶。这类所谓蜂胶其中有直接用树胶制成，但相对于真蜂胶，其生物活性有天壤之别。
由于这类假蜂胶有很大部分成分与真蜂胶相似，都能符合国家标准GB/T24286《蜂胶》的各项指标要求。在鉴别蜂胶的现有技术中，有用液相色谱法、液相色谱串联质谱法、气相色谱质谱法、紫外光谱法、甚至远红外的指纹区图谱等，建立具有蜂胶特征指纹图谱.以鉴别蜂胶的真伪。也有以其中的某些成分，诸如水杨苷、槲皮素、高良姜素，甚至叶绿素等等的不同含量，鉴定蜂胶的真伪，更有用经典的茚三酮蛋白质显色反应鉴定蜂胶的真伪。
基于蜂胶的来源，我们知道，蜂胶的化学成分取决于蜂胶的植物来源，即蜂胶产地的植被。由于蜂胶中的许多成分是由于养蜂基地的植被不同而异。因此国外蜂胶与国内蜂胶的成分有很大差异。当然任何一种指纹图谱都不可能用与鉴别国内外所有蜂胶的真伪。我们在研发过程中发现，即使国内蜂胶，大部分是杨树类植被形成的蜂胶，其中不但不同地域植被的成分有很大差异，且蜂胶的主要类成分总黄酮含量也有很大不同。就如同一种中药生药，不同产地其成分和活性会有很大差异一样。因此即使在国内，不同地域植被所产的蜂胶其成分也有较大差异，即使在高效液相指纹图谱中，其出峰时间、峰型和峰面积及其比例也有较大差异，也基本不可能用一种指纹图，严格的对照鉴别所有国产蜂胶、蜂胶提取物及其产品的真伪。而利用蜂胶中某些成分，用以普遍性的鉴定所有产地蜂胶，其实用性更是有待商榷。更何况不同植被种类所产的蜂胶，其针对某些成分的含量高低更是大相径庭。
但研究表明，虽然不同地区的蜂胶甚至国外蜂胶，由于其植物来源不同，他们的成分有很大差别，他们都具有相同的活性类型甚至是相同的活性剂量。从而说明蜂胶的主要活性作用是来源于蜂胶自身消化腺、蜡腺等腺体的分泌物及其与植物树胶相互作用后形成的成分。而非树胶本身。
有大量研究论文表明，蜂胶的诸多生物活性，大都来源于其较强的抗氧化活性，或与其抗氧化性活性有着密切的关系。
近年来,越来越多的研究发现,人体的衰老和很多疾病都与活性氧(ROS)有关。ROS可以促发自由基介导的氧化反应,通过破坏细胞膜稳定性,损伤DNA,氧化低密度脂蛋白(LDL)等,诱发细胞衰老,变异,癌变和形成各种心脑血管疾病。在酶或抗氧化剂的作用下，可以清除自由基或终止这类自由基反应。而通过从食物中获取某些抗氧化剂，可以帮助我们促进健康和延缓衰老。
关键在于如何客观真实地评价各种食品原料的抗氧化性水平。近年来建立起了多种方法对各种样品的相对总抗氧化能力(total antioxidant capacity,TAC)进行评价。
最常用的几种主要测定方法有：电极电位法；HPLC法；电子自旋共振仪(ESR)；化学滴定法；化学反应分光光度法等等。
上述这些方法都是测定样品在反应终态的抗氧化或抗自由基的能力。各有特点及不足之处。但因为是测定反应终态，因此缺乏对所测样品的单一性真实评价。
近年发展起来的荧光法及化学发光法都测定样品反应过程中产生的自由基。能较真实地反应所测样品单一性的抗氧化活性，但化学发光法由于灵敏度很高，其稳定性成了很突出的问题。因此较难达到测定方法的线性、重现性。加样回收等方法学考察的要求。
从测定方法简便、测定成本、符合方法学考察要求等因素考虑，目前国际上比较常用的是荧光衰减法，即ORAC(Oxygen Radical Absorbance Capacity)法，该方法是通过间接的途径直接测定脂质过氧化过程中产生的自由基，因此能比较客观的反应即时的脂质过氧化程度，是目前评价抗氧化物质的抗氧化活性的最为简单、准确、灵敏度高、应用范围广并在国际上被唯一认可的抗氧化能力研究方法。
美国食品和药物管理局(FDA)已将该方法作为评价食品抗氧化能力的重要标准。
鉴于上述现有技术，本发明提出了以高压液相指纹图谱与ORAC抗氧化活性评估，联合鉴定蜂胶的真伪的鉴定方法。但如上所述，即使国内同为杨树胶植被所产的蜂胶，不同地区的植物来源其成分有很大差异。本发明方法中的高压液相指纹图谱鉴定仅限于中国华东地区的杨树胶植被所产的蜂胶。其他区域植被所产蜂胶真伪鉴定也可用相应的HPLC指纹图谱结合ORAC抗氧化活性强弱限定进行鉴别。
为了蜂胶原料指纹图谱的真实性、普遍性和实用性，我们科研人员在华东地区各省蜂胶产地，直接从各养蜂基地中分别采集不同的蜂房、不同批次的毛胶，以这些毛胶为基础，建立高效液相指纹图谱。这些毛胶在高效液相指纹图谱中各峰的出峰时间、峰型、峰面积及其比例非常相似。按照建立指纹图谱方法和规则，建立了蜂胶指纹图谱。掺树胶的或添加其他黄酮的蜂胶原料或其产品，在此图谱中能很容易的鉴别出来。这样的指纹图谱针对性、适用性更强，完全可用于实际操作。
发明内容
针对现有蜂胶真伪鉴别的难点，有各种图谱、成分等鉴别，不一而足，但如上所述，基于遗传、各地区地理、气候环境等因素形成的生物多样性，仅按蜂胶的某种指纹图谱对照相应植物指纹图谱鉴别，很难具有普遍及实用意义。针对现有技术不足，本发明所要解决的技术问题是提供一种仅限于华东地区蜂胶的高压液相指纹图谱并结合蜂胶特有的抗氧化活性联合鉴别蜂胶的真伪方法。
通常一种中药鉴别用外形特征及理化鉴别加上特定成分含量限定就能确定该中药的真伪。蜂胶鉴别之所以要建立指纹图谱是由于蜂胶及其乙醇提取物，由于特殊的形成过程，其外形、理化鉴别或者含量限定都与伪蜂胶(大都是蜂胶所在产地的植被)极其相似。有些部分掺伪的蜂胶与真蜂胶甚至指纹图谱也非常相似。又由于蜂胶不同产地的植被广阔并多样性，其中所含成分极为复杂，不可能一一确定。因此，如上所述众多的现有技术蜂胶鉴别的方法应该基本没有普遍意义上的实用性。本发明提出的是以严格的指纹图谱鉴别真伪蜂胶的差别，同时以真蜂胶特有的强抗氧化生物活性，联合鉴别伪蜂胶甚至掺伪蜂胶与真蜂胶的区别。
本发明的技术方案是:
一种指纹图谱与抗氧化活性联合鉴别蜂胶真伪的方法，其特征在于：该方法包括指纹图谱测定、氧自由基吸收能力测定和样品鉴定三个步骤，在相同试验条件下，将供试样品指纹图谱与同时检测的蜂胶、杨树树胶样品指纹图谱进行比较，并选定供试样品指纹图谱中的几个特征峰，以方便比较和结果判定蜂胶为真、伪或掺伪；同时以抗氧化特定指数的限定，与指纹图谱联合鉴定蜂胶为真、伪或掺伪。
具体的：
一.蜂胶指纹图谱的建立
1.试剂：分析纯磷酸、色谱纯甲醇、0.4％(V/V)磷酸水溶液。
2.主要仪器和设备:电子天平(感量0.0001g)、高效液相色谱仪配紫外检测器、离心机10000转、移液枪(100-1000μl)。
3.测定步骤
3.1样品前处理
取蜂胶样品，冷冻过夜，次日碾碎，精密称取一定量，置于25ml容量瓶中，加入95％乙醇至刻度，常温下超声提取30min，用95％乙醇定容，离心(5000rpm，15分钟)，吸取一定量，至10ml容量瓶，用95％乙醇定容，制得蜂胶待测样品乙醇溶液，过0.45um滤膜于样品瓶中，待HPLC分析。
3.2测定
3.2.1色谱条件
色谱柱：Venusil MP C18 250mm×4.6mm×5μm或相当者；
流动相：甲醇+0.4％磷酸(V/V)＝65+35
柱温：25℃；
进样量：10μl；
流速：1ml/min；
检测波长：360nm。
3.2.2指纹图谱测定
向高效液相色谱仪注入10μl样液，按色谱条件检测，收集0至60～70min的色谱图。见下图1蜂胶HPLC指纹图谱及表1相应出峰时间及积分面积
表1相应出峰时间，峰面积、峰面积％、峰高、峰高％
Detector A(360nm)
Figure BDA0001526598970000041
Figure BDA0001526598970000051
Figure BDA0001526598970000061
Totals 8276546 100.000 268305 100.000
3.2.3方法精密度考察：
在重复性条件下对同一试样连续进行两次以上测定，要求保留时间的RSD<1.5％，峰面积的RSD<5％。
二、氧自由基吸收能力(Oxygen Radical Absorbance Capacity,简称ORAC)测定方法建立
1.测定原理
一个自由基氧化反应包含自由基的产生、链式反应传播、分支、终止等多个步骤。抗氧化剂可以通过抑制自由基生成或阻断自由基链式反应的过程实现抗氧化作用。大多数抗氧化剂通过第二种方式起作用，其作用机理多为氢转移机制。发生氢转移的动力主要来自于氢转移后形成的自由基稳定性更高，且该自由基不能使链反应继续进行或者仅以极低的速率继续进行。目前，氢转移反应作为自由基氧化反应发生的主要机制已经得到公认。ORAC 方法所测定的是能够打破自由基链式反应的抗氧化剂的抗氧化活性。
该方法以偶氮类化合物AAPH(2,2’-azobis-2-amidinopropane-dihydrochloride) 作为过氧自由基来源，以合成荧光素(Sodum Fluorescence，3’,6’-dihydroxyspiro [isobenzofuran-1[3H],9’[9H]-xanthen]-3-one，FL)为荧光指示剂，维生素E水溶性类似物，商品名Trolox(6-hydro-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid) 为抗氧化性能定量标准对照(见图1)，
反应在37℃恒温条件下，75mmol/L磷酸缓冲液(pH＝7.4)环境中进行，使用荧光分析仪(激发波长485nm,发射波长538nm)进行荧光强度测定。
在仅含有荧光素FL的溶液中，荧光强度不随时间变化；若加入了过氧自由基启动剂 AAPH，过氧自由基破坏荧光探针，使FL荧光强度衰减，在抗氧化剂存在时，它以抑制由自由基方式减缓荧光衰减，而抑制程度则反映了它对自由基的抗氧化能力(图2)。
采用荧光强度～时间曲线(荧光衰减曲线)下的面积(AUC)反应这种变化。样品的抗氧化性越强，AUC越大，也即样品AUC与空白AUC的差(net AUC)越大，通过样品的net AUC值和Trolox的net AUC值比较，即可得出ORAC结果。ORAC值越高，表明样品的抗氧化能力越强。
曲线下面积(AUC)计算方法：采用梯形法计算(见图3)，计算公式为：
Figure BDA0001526598970000071
2.主要试剂材料：
过氧自由基：偶氮类化合物(2,2′2偶氮(22甲基丙基脒)·二盐酸盐 (2,2’-azobis-2-amidinopropane-dihydrochloride，AAPH)；合成荧光素Sodum Fluorescence(3’,6’-dihydroxyspiro[isobenzofuran-1[3H],9’[9H]-xanthen] -3-one，FL)为荧光指示剂；抗氧化剂对照品：维生素E水溶性类似物(6一经基一2、5、7、 8一四甲基色满一一竣酸(6-hydro-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid商品名Trolox)均购自美国SIGMA标准品；
分析纯：荧光素钠、磷酸氢钾、磷酸二氢钾等试剂。
Ph7.4磷酸缓冲液。
3.主要仪器
上海智诚仪器有限公司多功能ORAC荧光测定仪。
4.测定步骤
4.1样品处理：
取蜂胶毛胶或蜂胶提取物或蜂胶产品样品，冷冻过夜，次日碾碎，精密称取一定量，以适量95％乙醇超声提取、高速离心两次，取上清液合并，用磷酸缓冲液稀释，根据样品抗氧化性能强弱，配制成不同浓度。
4.2.测定
4.2.1测定条件：
测定仪器设定温度：35℃～37℃；激发光波长，485nm；发射光波长，538nm；测定时间:60min。测定频率：1min/once.
4.2.2试剂配制：FL浓度：0.63～0.67nmol/ml；AAPH浓度：20-30mg/ml；Trolox浓度：0.01～0.07μmol/ml。抗氧化剂样品：按该样品的抗氧化性能强弱选择配制浓度，通常配制浓度范围：6.5μg/ml～15μg/ml溶液。水溶性较好的样品用磷酸缓冲液(pH＝7.4) 配制和稀释，水溶性差的样品用乙醇溶解后再用磷酸缓冲液稀释。
4.2.3测定方法：在试管中加入1.25ml磷酸缓冲液，0.2ml的FL溶液，0.2ml的样品溶液，混匀后再加入0.35ml的AAPH溶液(总共2ml)，震荡混匀后立即取1.3ml于测试管中，置荧光分析仪中，按测定条件测定其荧光强度随时间的变化。
ORAC值计算式：
Figure BDA0001526598970000081
ORAC单位：umol Trolox/g样品。
AUCsample——样品+AAPH+FL荧光衰减曲线下面积；
AUCTrolox——Trolox+AAPH+FL莹光衰减曲线下面积(标准对照)；
AUCblack——AAPH+FL荧光衰减曲线下面积(空白对照)；
式中浓度都为测定浓度。
4.3浓度、线性及稳定性考察
4.3.1 Trolox线性考察
FL测定浓度：0.063umol/ml，AAPH测定浓度：3.5mg/ml,Trolox测定浓度在0.0～0.008μmol/ml范围内，考察Trolox浓度～AUC线性关系。
试验结果表明，trolox的测定浓度在0.00104－0.00732μmol/ml范围内，能与AUC成很良好的线性关系r＝0.9992
4.3.2批内稳定性考察
测定浓度：FL：0.063nmol/ml；AAPH：3.5mg/ml，以相同浓度的Trolox：0.004μmol/ml，平行测定8个测定管，结果显示：荧光衰减曲线平稳，各测定管管变异系数＝2.6％。
4.3.3批间稳定性考察测定浓度：FL：0.063nmol/ml；AAPH：3.5mg/ml，以线性范围内不同浓度的Trolox溶液，测定8个测定管，结果显示：荧光衰减曲线平稳，各测定管管变异系数＝7.7％(国际ORAC分析要求：批间变异系数≤15％)。
4.3.4样品测定
考察其净积分面积(AUC)与浓度之间的线性范围。取线性范围内不同浓度测定5个样品，做批间稳定性分析，再取线性范围内相同浓度测定3个样品，做批内稳定性分析，并取平均值作为其ORAC值。
三、定性判定
在相同试验条件下，将供试样品指纹图谱与同时检测的蜂胶、杨树树胶样品指纹图谱进行比较。同时将供试样品指纹图谱选定其中几个特征峰，以方便比较和结果判定，指纹图谱及其出峰积分表分别见图1和表1。
1、蜂胶定性鉴别
供试样品的主要特征色谱峰与蜂胶质控样品相比均含有，峰强度相似。
1.1出峰时间在18～22min之间有一个主峰，与该主峰紧密相连的前一个峰的相对峰面积比值(后峰比前峰)＞3。
1.2在上述主峰后与后一个主峰之间最大峰相对峰面积<0.2％。
1.3在35.0～43.5之间，最大峰相对峰面积＜2％。
1.4抗氧化指数：蜂胶毛胶ORAC(μmol TE/g)>4000，蜂胶乙醇提取物ORAC(μmolTE/g)>7500，如果蜂胶产品，其ORAC比较按所用蜂胶原料的比例，再与此限量进行比较。符合上述1.1～1.4四条，可判定为“真”。
2.杨树树胶定性鉴别
供试样品的主要特征色谱峰与杨树树胶质控样品相比均含有，峰强度相似，
2.1出峰时间在18～22min之间有一个主峰，与该主峰紧密相连的前一个峰的相对峰面积比值(后峰比前峰)＜3。
2.2在上述主峰后与后一个主峰之间最大峰相对峰面积>0.5％。
2.3在35.0～43.5之间，最大峰相对峰面积应大于10％。
2.4抗氧化指数：该胶毛胶ORAC(μmol TE/g)＜1500，乙醇提取物ORAC(μmol TE/g)＜2500。如果该胶产品，其ORAC比较，按所用该胶原料的比例，再与此限量进行比较。符合上述2.1～2.4四条，可判定样品为“伪”。
3.蜂胶中掺入杨树树胶定性鉴别
供试样品的主要特征色谱峰与蜂胶质控样品相比，均含有。
3.1出峰时间在18～22min之间有一个主峰，与该主峰紧密相连的前一个峰的相对峰面积比值(后峰比前峰)＞2.5。
3.2在上述主峰后与后一个主峰之间最大峰相对峰面积>0.2％。
3.3在35.0～43.5之间，最大峰相对峰面积＞2％。
3.4抗氧化指数：该胶乙醇提取物ORAC(μmol TE/g)＜4000。如果该胶产品，其ORAC比较，按所用蜂胶原料的比例，再与此限量进行比较。
符合上述3.1～3.4四条，可判定为“掺伪”。
4.蜂胶中掺入黄酮类化合物定性鉴别
供试样品的主要特征色谱峰与蜂胶质控样品相比均含有，但是某个特征峰峰高异常，其相对峰面积超过相应位置真蜂胶样品相对积分面积2倍以上。可判定为“掺伪”。再与芦丁、槲皮素等标准对照物质色谱图比较，可以判断添加黄酮类化合物的种类。
5.非蜂胶物质的定性鉴别
供试样品的主要特征色谱峰与蜂胶质控样品相比，不具有大部分蜂胶的主要特征色谱峰。可判定为“伪”。
附图说明
图1是蜂胶HPLC指纹图谱。
图2是AUC的计算示意图。
图3是荧光衰减图(blank：AAPH+FL；sample：AAPH+FL+抗氧化剂)。
图4是实施例1的指纹图谱。
图5是实施例2的指纹图谱。
图6是实施例3的指纹图谱。
图7是实施例4的指纹图谱。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例应理解为仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等效变化和修改同样落入本发明权利要求所限定的范围。
实施例1
一.指纹图谱测定步骤
1样品前处理
取实施例1样品，冷冻过夜，次日碾碎，精密称取1315.2g，置于25ml容量瓶中，加入95％乙醇至刻度，常温下超声提取30min，用95％乙醇定容，离心(5000rpm，15分钟)，吸取0.5ml，至10ml容量瓶，用95％乙醇定容，制得蜂胶待测样品乙醇溶液2.63mg/ml，过 0.45um滤膜于样品瓶中，待HPLC分析。
3.2指纹图谱测定测定
3.2.1色谱条件
色谱柱：Venusil MP C18 250mm×4.6mm×5μm；
流动相：甲醇+0.4％磷酸(V/V)＝65+35；
柱温：25℃；进样量：10μl；流速：1ml/min；检测波长：360nm。
3.2.2测定
向高效液相色谱仪注入10μl样液，收集0至60min的色谱图。指纹图谱和相应峰面积积分表见图4和表2。
表2实施例1指纹图谱峰面积积分表
Detector A(360nm)
Figure BDA0001526598970000111
Figure BDA0001526598970000121
Figure BDA0001526598970000131
Totals 8507835 100.000 282514 100.000
二.氧自由基吸收能力(ORAC)测定步骤
1.样品处理：
取实施例1样品，冷冻过夜，次日碾碎，精密称取1081.5mg，置25ml容量瓶中，用95％乙醇至刻度，超声、离心提取两次，，取上清液合并置50ml容量瓶中，用95％乙醇至刻度，得21.63mg/ml样品乙醇溶液。再用磷酸缓冲液稀释1600倍，配制成浓度为13.52ug/ml的样品缓冲溶液，为待测样品。
2.测定步骤
2.1测定条件：
测定仪器设定温度：35℃；激发光波长，485nm；发射光波长，538nm；测定时间:60min。测定频率：1min/once.
2.2试剂配制：
FL浓度：0.63nmol/ml；AAPH浓度：20mg/ml；Trolox浓度：0.0376μmol/ml。
2.3测定：
在试管中加入1.25ml磷酸缓冲液，0.2ml的FL溶液，0.2ml的样品溶液，混匀后再加入0.35ml的AAPH溶液(总共2ml)，震荡混匀后立即取1.3ml于各测试管中，置荧光分析仪中，按测定条件测定其荧光强度随时间的变化。
采用梯形法分别计算：空白、Trolox及样品曲线下积分面积AUC.
其计算公式为：
Figure BDA0001526598970000141
ORAC值计算式：
Figure BDA0001526598970000142
ORAC单位：umol Trolox/g样品。
AUCsample——样品+AAPH+FL荧光衰减曲线下面积；
AUCTrolox——Trolox+AAPH+FL莹光衰减曲线下面积(标准对照)；
AUCblack——AAPH+FL荧光衰减曲线下面积(空白对照)；
2.4测定结果：氧自由基吸收能力(ORAC):5415umoleTE/g
三、样品鉴定
实施例1样品指纹图谱(图4)的主要特征色谱峰与蜂胶质控样品相比均含有，峰强度相似。
1出峰时间在18～22min之间有一个主峰，与该主峰紧密相连的前一个峰的相对峰面积比值(后峰比前峰)＞3。表2中第25#和24#峰，25#面积/24#峰面积＝8.6＞3。
2在上述主峰后与后一个主峰之间，最大峰相对峰面积<0.2％。表2中25#主峰与后一个27#主峰之间，只有一个小峰26#峰，其相对峰面积为0.01％，远小于0.2％。
3在35.0～43.5之间，最大峰相对峰面积＜2％。上图中32#、33#、34#和35#峰，相对峰面积分别都远小于2％。
4抗氧化指数：蜂胶毛胶ORAC(μmol TE/g)>4500，蜂胶乙醇提取物ORAC(μmol TE/g)>7500。本实施例1样品抗氧化指数ORAC(μmol TE/g)＝5415
符合上述1～4四条，本鉴定样品可判定为真蜂胶毛胶。
实施例2
一.指纹图谱测定步骤
1样品前处理
取实施例2样品，冷冻过夜，次日碾碎，精密称取705.2mg，置于25ml容量瓶中，加入95％乙醇至刻度，常温下超声提取30min，用95％乙醇定容，离心(5000rpm，15分钟)，吸取0.5ml，至10ml容量瓶，用95％乙醇定容，制得蜂胶待测样品乙醇溶液1.41mg/ml，过 0.45um滤膜于样品瓶中，待HPLC分析。
3.2指纹图谱测定测定
3.2.1色谱条件
色谱柱：Venusil MP C18 250mm×4.6mm×5μm；
流动相：甲醇+0.4％磷酸(V/V)＝65+35；
柱温：28℃；进样量：10μl；流速：1.2ml/min；检测波长：360nm。
3.2.2测定
向高效液相色谱仪注入10μl样液，收集0至70min的色谱图。指纹图谱和相应峰面积积分表见图5和表3。
表3实施例2指纹图谱峰面积积分表
Detector A(360nm)
Figure BDA0001526598970000151
Figure BDA0001526598970000161
Figure BDA0001526598970000171
Figure BDA0001526598970000172
二.氧自由基吸收能力(ORAC)测定步骤
1.样品处理：
取实施例2样品，冷冻过夜，次日碾碎，精密称取1172.1mg，置25ml容量瓶中，用95％乙醇至刻度。超声、离心提取两次，，取上清液合并置50ml容量瓶中，用95％乙醇至刻度，得23.4mg/ml样品乙醇溶液。再用磷酸缓冲液稀释1600倍，配制成浓度为14.7ug/ml 的样品缓冲溶液，为待测样品。
2.测定步骤
2.1测定条件：
测定仪器设定温度：35℃；激发光波长，485nm；发射光波长，538nm；测定时间:60min。测定频率：1min/once.
2.2试剂配制：
FL浓度：0.63nmol/ml；AAPH浓度：20mg/ml；Trolox浓度：0.0376μmol/ml。
2.3测定：
在试管中加入1.25ml磷酸缓冲液，0.2ml的FL溶液，0.2ml的样品溶液，混匀后再加入0.35ml的AAPH溶液(总共2ml)，震荡混匀后立即取1.3ml于各测试管中，置荧光分析仪中，按测定条件测定其荧光强度随时间的变化。
采用梯形法分别计算：空白、Trolox及样品曲线下积分面积AUC.
其计算公式为：
Figure BDA0001526598970000181
ORAC值计算式：
Figure BDA0001526598970000182
ORAC单位：umol Trolox/g样品。
AUCsample——样品+AAPH+FL荧光衰减曲线下面积；
AUCTrolox——Trolox+AAPH+FL莹光衰减曲线下面积(标准对照)；
AUCblack——AAPH+FL荧光衰减曲线下面积(空白对照)；
2.4测定结果：氧自由基吸收能力(ORAC):1100umoleTE/g
三、样品鉴定
实施例2样品指纹图谱(见图5)的主要特征色谱峰与蜂胶质控样品相比均含有，峰强度相似。
1出峰时间在18～22min之间有一个主峰，与该主峰紧密相连的前一个峰的相对峰面积
比值(后峰比前峰)＜3。表3中第30#和29#峰，30#面积/29#峰面积＝2.22＜3。
2在上述主峰后与后一个主峰之间，最大峰相对峰面积>0.5％。表3中第30#与后一个 33#主峰之间，有2个小峰31#峰和32#峰，相对峰面积分别为0.546％和2.141％
3在35.0～43.5之间，最大峰相对峰面积大于10％。上图5中(红笔标注)41#峰，相对峰面积为18.265％。
4抗氧化指数：该胶毛胶ORAC(μmol TE/g)＜1500，乙醇提取物ORAC(μmol TE/g)＜2500
本实施例2样品抗氧化指数ORAC(μmol TE/g)＝1100
符合上述1～4四条，本实施例2样品鉴定为杨树胶毛胶。
实施例3
一.指纹图谱测定步骤
1样品前处理
取实施例1样品，冷冻过夜，次日碾碎，精密称取606.1g，置于25ml容量瓶中，加入95％乙醇至刻度，常温下超声提取30min，用95％乙醇定容，离心(5000rpm，15分钟)，吸取0.5ml，至25ml容量瓶，用95％乙醇定容，制得蜂胶待测样品乙醇溶液0.48mg/ml，过 0.45um滤膜于样品瓶中，待HPLC分析。
3.2指纹图谱测定测定
3.2.1色谱条件
色谱柱：Venusil MP C18 250mm×4.6mm×5μm；
流动相：甲醇+0.4％磷酸(V/V)＝65+35；
柱温：25℃；进样量：10μl；流速：0.7ml/min；检测波长：360nm。
3.2.2测定
向高效液相色谱仪注入10μl样液，收集0至60min的色谱图。指纹图谱和相应峰面积积分表见图6和表4
表4.实施列3样品指纹图谱峰面积积分表
Detector
A(360nm)
Figure BDA0001526598970000191
Figure BDA0001526598970000201
Totals 2084049 100.000 88503
二.氧自由基吸收能力(ORAC)测定步骤
1.样品处理：
取实施例2样品，冷冻过夜，次日碾碎，精密称取1055.2mg，置25ml容量瓶中，用95％乙醇至刻度，超声、离心提取两次，，取上清液合并置50ml容量瓶中，用95％乙醇至刻度，得23.4mg/ml样品乙醇溶液。再用磷酸缓冲液稀释1600倍，配制成浓度为13.19ug/ml 的样品缓冲溶液，为待测样品。
2.测定步骤
2.1测定条件：
测定仪器设定温度：35℃；激发光波长，485nm；发射光波长，538nm；测定时间:60min。测定频率：1min/once.
2.2试剂配制：
FL浓度：0.63nmol/ml；AAPH浓度：20mg/ml；Trolox浓度：0.0376μmol/ml。
2.3测定：
在试管中加入1.25ml磷酸缓冲液，0.2ml的FL溶液，0.2ml的样品溶液，混匀后再加入0.35ml的AAPH溶液(总共2ml)，震荡混匀后立即取1.3ml于各测试管中，置荧光分析仪中，按测定条件测定其荧光强度随时间的变化。
采用梯形法分别计算：空白、Trolox及样品曲线下积分面积AUC.
其计算公式为：
Figure BDA0001526598970000211
ORAC值计算式：
Figure BDA0001526598970000212
ORAC单位：umol Trolox/g样品。
AUCsample——样品+AAPH+FL荧光衰减曲线下面积；
AUCTrolox——Trolox+AAPH+FL莹光衰减曲线下面积(标准对照)；
AUCblack——AAPH+FL荧光衰减曲线下面积(空白对照)；
2.4测定结果：氧自由基吸收能力(ORAC):3200umoleTE/g
三、样品鉴定
实施例3样品指纹图谱(见图6)的主要特征色谱峰与蜂胶质控样品相比均含有，峰强度相似。
1出峰时间在18～22min之间有一个主峰，与该主峰紧密相连的前一个峰的相对峰面积
比值(后峰比前峰)>2.5。表4中第21#和20#峰，21#峰面积/20#峰面积＝14.2>2.5。
2在上述主峰后与后一个主峰之间，最大峰相对峰面积>0.2％。表4中第21#与后一个 23#主峰之间，有1个小峰22#峰，其相对峰面积为0.458％>0.2％
3在35.0～43.5之间，最大峰相对峰面积大于2％。图6中和表4中(红笔标注)28#峰，相对峰面积为6.815％>2％。
4抗氧化指数：该胶乙醇提取物ORAC(μmol TE/g)＜4000
本实施例3样品抗氧化指数ORAC(μmol TE/g)＝3200
本实施例3样品符合上述1～4四条，本实施例3样品鉴定为掺入杨树胶蜂胶的乙醇提取物。
实施例4
一.指纹图谱测定步骤
1样品前处理
取实施例4样品为某蜂胶硬胶囊产品，精密称取1049.4g，置于25ml容量瓶中，加入95％乙醇至刻度，常温下超声提取30min，用95％乙醇定容，离心(5000rpm，15分钟)，吸取0.5ml，至10ml容量瓶，用95％乙醇定容，制得蜂胶待测样品乙醇溶液2.1mg/ml，过0.45um滤膜于样品瓶中，待HPLC分析。
3.2指纹图谱测定测定
3.2.1色谱条件
色谱柱：Venusil MP C18 250mm×4.6mm×5μm；
流动相：甲醇+0.4％磷酸(V/V)＝65+35；
柱温：25℃；进样量：10μl；流速：1ml/min；检测波长：360nm。
3.2.2测定
向高效液相色谱仪注入10μl样液，收集0至60min的色谱图。指纹图谱和相应峰面积积分表见图7和表5。
表5.实施列4样品指纹图谱峰面积积分表
DetectorA
(360nm)
Figure BDA0001526598970000221
Totals 635859 100.000 38160
二、样品鉴定
某个特征峰峰高异常，峰相对积分面积超过相应位置真蜂胶样品峰相对积分面积2倍以上。可判定为“掺伪”，再与芦丁槲皮素等标准物质色谱图比较，可以判断添加黄酮类化合物的种类。
实施例4样品中有一个5#峰(出峰时间5.42分钟)特别大，与真蜂胶质控样品比较，其相应位置峰相对积分面积比是真蜂胶的96倍。且经与各不同对照品加样图谱比较，确定实施例4样品中添加了槲皮素。
实施例4某蜂胶硬胶囊样品鉴定为掺入黄酮类化合物槲皮素的伪蜂胶产品。
本专利是根据样品高压液相指纹图谱特性和样品的抗氧化特性结合鉴定蜂胶的“真”“伪”“掺伪”。在一定检测条件下，样品的高压液相指纹图谱特性和样品的抗氧化特性是样品的物质属性，与其在溶液中的溶度无关。实施例中所用样品浓度，以及权利要求中所列范围，都是考虑检测成本和浓度范围的线性等因素。仅仅是为了测定被鉴定样品的“指纹图谱特性”和“抗氧化特性”这两个物质属性。

Claims (3)

1.一种指纹图谱与抗氧化活性联合鉴别蜂胶真伪的方法，其特征在于：该方法适用于中国华东地区的杨树胶植被所产的蜂胶；该方法包括指纹图谱测定、氧自由基吸收能力测定和样品鉴定三个步骤，在相同试验条件下，将供试样品指纹图谱与同时检测的蜂胶、杨树树胶样品指纹图谱进行比较，并选定供试样品指纹图谱中的几个特征峰，以方便比较和结果判定蜂胶为真、伪或掺伪；同时以抗氧化特定指数的限定，与指纹图谱联合鉴定蜂胶为真、伪或掺伪；
具体包括如下步骤：
(一)指纹图谱测定
1)供试样品前处理：取样品，冷冻过夜，次日碾碎，精密称定，用该样品重量20倍以上体积的95％乙醇室温下超声提取30min以上，5000rpm以上离心15分钟，用95％乙醇配制成0.4～3mg/ml待测样品乙醇溶液，过0.45um滤膜于样品瓶中，待HPLC分析；
2)指纹图谱测定：向高效液相色谱仪注入10μl样液，在下述色谱条件下，收集0至60min的指纹色谱，积分收集相应峰面积积分表；
步骤2相应色谱条件：色谱柱：Venusil MP C18 250mm×4.6mm×5μm；流动相：甲醇+0.4％磷酸＝65+35；柱温：25℃～30℃；进样量：10μl；流动相流速：0.6～1.2ml/min；检测波长：360nm；
(二)氧自由基吸收能力测定
1)供试样品处理：取样品，冷冻过夜，次日碾碎，精密称定，用该样品重量20倍以上体积的95％乙醇室温下超声提取20min以上、5000rpm以上离心15分钟，提取两次，取上清液合并，水溶性样品用蒸馏水，脂溶性样品用95％乙醇，稀释至10.4mg/ml～24mg/ml水溶液或乙醇溶液，再用pH＝7.4磷酸缓冲液稀释1600倍，配制成浓度为6.5μg/ml～15μg/ml的样品缓冲溶液，为待测样品；
2)氧自由基吸收能力测定
(1)测定条件：测定仪器设定温度：35-37℃；激发光波长：485nm；发射光波长：538nm；测定时间:60min；测定频率：1min/once；
(2)试剂配制：FL浓度：0.63-0.67nmol/ml；AAPH浓度：20-30mg/ml；Trolox浓度：0.01～0.07μmol/ml；并按该样品的抗氧化性能强弱选择步骤1样品浓度范围中配制浓度；
(3)氧自由基吸收能力测定：在试管中加入1.25ml磷酸缓冲液，0.2ml的FL溶液，0.2ml的样品溶液，混匀后再加入0.35ml的AAPH溶液，震荡混匀后立即取1.3ml于各测试管中，置荧光分析仪中，按测定条件测定其荧光强度随时间的变化；
采用梯形法分别计算：空白、Trolox及样品曲线下积分面积AUC
其计算公式为：
Figure FDA0002937975370000021
ORAC值计算式：
Figure FDA0002937975370000022
ORAC单位：umol Trolox/g样品；
AUC样品——样品+AAPH+FL荧光衰减曲线下面积；
AUCTrolox——Trolox+AAPH+FL莹光衰减曲线下面积；
AUC空白——AAPH+FL荧光衰减曲线下面积；
(4)计算获得氧自由基吸收能力的测定结果：考察其净积分面积AUC与浓度之间的线性范围；取线性范围内不同浓度测定5个样品，做批间稳定性分析，再取线性范围内相同浓度测定3个样品，做批内稳定性分析，并取平均值作为其ORAC值；
(三)样品鉴定
在相同试验条件下，将供试样品指纹图谱与同时检测的蜂胶、杨树树胶样品指纹图谱进行比较，同时选定供试样品指纹图谱中的几个特征峰，以方便比较和结果判定：
1)蜂胶定性鉴别
供试样品与蜂胶质控样品相比，均含有主要特征色谱峰，且峰强度相似：
(1)出峰时间在18～22min之间有一个主峰，与该主峰紧密相连的前一个峰的相对峰面积比值，后峰比前峰＞3；
(2)在上述主峰后与后一个主峰之间最大峰相对峰面积<0.2％；
(3)在35.0～43.5之间，最大峰相对峰面积＜2％；
(4)抗氧化指数：蜂胶毛胶ORAC>4000μmolTE/g，蜂胶乙醇提取物ORAC>7500μmol TE/g；
符合上述(1)-(4)，可判定供试样品为“真”；
2)杨树树胶定性鉴别
供试样品与蜂胶质控样品相比，均含有主要特征色谱峰，且峰强度相似：
(1)出峰时间在18～22min之间有一个主峰，与该主峰紧密相连的前一个峰的相对峰面积比值，后峰比前峰＜3；
(2)在上述主峰后与后一个主峰之间最大峰相对峰面积>0.5％；
(3)在35.0～43.5之间，最大峰相对峰面积应大于10％；
(4)抗氧化指数：该胶毛胶ORAC＜1500μmol TE/g，乙醇提取物ORAC＜2500μmol TE/g；
符合上述(1)-(4)，可判定供试样品为“伪”；
3)蜂胶中掺入杨树树胶定性鉴别
供试样品与蜂胶质控样品相比，均含有主要特征色谱峰：
(1)出峰时间在18～22min之间有一个主峰，与该主峰紧密相连的前一个峰的相对峰面积比值，后峰比前峰＞2.5；
(2)在上述主峰后与后一个主峰之间最大峰相对峰面积>0.2％；
(3)在35.0～43.5之间，最大峰相对峰面积＞2％；
(4)抗氧化指数：该胶乙醇提取物ORAC＜4000μmol TE/g；
符合上述(1)-(4)，可判定供试样品为“掺伪”；
4)蜂胶中掺入黄酮类化合物定性鉴别
供试样品的主要特征色谱峰与蜂胶质控样品相比均含有，但是某个特征峰峰高异常，其相对峰面积超过相应位置真蜂胶样品相对积分面积2倍以上，可判定样品为“掺伪”；再与芦丁、槲皮素标准对照物质色谱图比较，可以判断添加黄酮类化合物的种类；
5)非蜂胶物质的定性鉴别
供试样品的主要特征色谱峰与蜂胶质控样品相比，不具有大部分蜂胶的主要特征色谱峰，可判定供试样品为“伪”。
2.根据权利要求1所述的指纹图谱与抗氧化活性联合鉴别蜂胶真伪的方法，其特征是，步骤(一)中，蜂胶质控样品指纹图谱出峰时间及积分面积为：
Figure FDA0002937975370000041
Figure FDA0002937975370000051
Figure FDA0002937975370000061
3.根据权利要求2所述的指纹图谱与抗氧化活性联合鉴别蜂胶真伪的方法，其特征是，步骤(一)中，在重复性条件下对同一试样连续进行两次以上测定，要求保留时间的RSD<1.5％，峰面积的RSD<5％。
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